METODOLOGIA:

Al inicio del trabajo en el laboratorio, establecer una zona aséptica.

Para la dilución primaria:

Pesamos 10 g del alimento o muestra sólida en condiciones asépticas y movemos a

un vaso de licuadora previamente lavado y desinfectado con alcohol, agregamos 90
ml de solución salina estéril (0.9 % p/v) y licuar por un minuto. Si el alimento no
necesita licuarse pesamos 10 g de producto o 10 ml directamente en un frasco de
dilución con 90 ml de solución salina estéril y agitamos vigorosamente para
homogenizar la muestra. Esta dilución corresponderá a 10-1 .

Para diluciones decimales:

Se tomará 1 ml de la dilución 10-1 y se transferirán a un tubo que contiene 9.0 ml de

agua peptonada al 0.1% (10-2). Esta operación se repetirá para preparar tantas
diluciones decimales como sea necesario (10-3, 10-4, 10-5).

Prueba presuntiva para coliformes:

Inoculamos una serie de tres tubos conteniendo 10 ml de caldo lauril sulfato y

campana de Durham, con 1 ml de dilución 10-1. Procedemos de igual manera con las
diluciones 10-2 y 10-3. En total deberán ser nueve tubos por muestra. Incubamos los
tubos a 37° C por 48 h.

Prueba confirmativa de coliformes totales:

De los tubos positivos (producción de gas y turbidez) transferir asépticamente una

asada de los cultivos a tubos con 10 ml de caldo Brilla con campanas de Durham,
repetir la operación tres veces. Incubar por 37° C por 48 hrs. La presencia de gas en
los tubos de fermentación de caldo Bilis Verde Brillante significa test confirmativo
positivo para coliformes, ausencia de gas constituye un test negativo para coliformes.

Prueba confirmativa de coliformes fecales:

De los tubos positivos (producción de gas y turbidez) transferir asépticamente una

asada de los cultivos a tubos con 10 ml de caldo EC con campanas de Durham, repetir
la operación tres veces. Incubar por 44.5° C por 24 h. La presencia de gas en los
tubos de fermentación de caldo EC significa test confirmativo positivo para coliformes
fecales, ausencia de gas constituye un test negativo para coliformes fecales.

Cálculo y expresión de resultados coliformes totales:

La combinación de tubos positivos y/o negativos en los test confirmativos de caldo Bilis
Verde Brillante es referida a la Tabla N° 1 (NMP POR GRAMO DE MUESTRA E
INTERVALOS DE CONFIANZA DEL 95% UTILIZANDO 3 TUBOS CON 0.1, 0.01 Y
0.001g DE MUESTRA) y se expresa como: NMP de coliformes/g o mL. De muestra Si
en vez de las porciones de muestra 0,1 - 0,01 - 0,001, se utiliza 0,01 - 0,001 - 0,0001,
se lee el resultado de la tabla y se multiplica por 10. Cuando se utilizan más de 3
series de diluciones decimales, se considera el resultado de 3 series, eligiendo la
dilución más alta que da resultados positivos en los 3 tubos ensayados y las dos
diluciones siguientes. Utilizando el resultado de estas 3 series, leer en la Tabla de
N.M.P. y multiplicar por 10, 100, 1000, etc. Según las porciones de muestra
consideradas.