RESISTENCIA BACTERIANA EN

BACTERIAS GRAM POSITIVAS:

Oscar Rios Rios, MIC, MSc(c), MPH, Dr.

oscar_rios27@hotmail.com
Bactéria Gram-positiva Bactéria Gram-negativa
MECANISMOS DE RESISTENCIA BACTERIANA

Alteración de la -LACTÁMICOS
Inhibición AMINOGLUCÓSIDOS
 - LACTÁMICOS Proteína enzimática
Fijadora (PBP) CLORANFENICOL
ERITROMICINA

QUINOLONAS Modificación de
las DNA-girasas Modificación
de la RNA RIFAMPICINA
polimerasa

Modificación de
COTRIMOXAZOL
la enzima blanco

MACRÓLIDOS
Modificación
Modificación LINCOSAMIDAS
del “blanco” TETRACICLINAS
QUINOLONAS Modificaciones ribosomal AMINOGLUCÓSIDOS
VANCOMICINA en la
membrana externa

Modificaciones en Eflujo activo TETRACICLINA

AMINOGLUCÓSIDOS QUINOLONAS
la membrana interna
 Evolución de la Resistencia
S. aureus

1941 1941: Penicilina

B-lactamasa

1950: 50% S.aureus

Resistentes a Penicilina
1956
Vancomicina 1960
Meticilina
1961
gen MecA
MRSA

1986 : VRE

1996: gen VanA

Primeras cepas VISA

2002: Primer caso VRSA

Mecanismos en Gram positivos

▪ Alteración de órgano blanco

 PBP: penicilina
 DNA girasa: Quinolonas
 Ribosomas: Macrólidos y AG
▪ Inactivación enzimática
 Betalactamasas: penicilinas y cefalosporinas
 Enz modificadoras: AG, Cloranfenicol
▪ Disminución del acceso al órgano blanco
 Disminución de la permeabilidad: OMP para BL y Q
 Eflujo: macrólidos, tetraciclinas, Q
▪ Otros
 Vías metabólicas alternas
Detecção de -lactamases

+ -

Disco de Nitrocefin
+ -
Rpta:

▪ Las cepas de S.aureus con resistencia de bajo nivel o

resistencia bordeline a la oxacilina se caracterizan por
una resistencia intermedia a oxacilina y CIM de
oxacilina en el punto de corte de resistencia.
▪ Por lo tanto este aislamiento es meticilino sensible,
porque la sensibilidad a cefoxitin descarta la presencia
del gen mecA. La utilizacion del disco de cefoxitin en
util y se prefiere su uso en vez de oxacilina para
detectar la resistencia a oxacilina mediada por el gen
mecA.
Detecção da VISA/VRSA
Detecção de VISA/VRSA
Screening

CIM Difusão com disco + placa de

Vancomicina BHI com vancomicina 6 μg/mL

 2 μg/mL 4-16 μg/mL  32 μg/mL  14 mm, > 14 mm, e

e/ou cresce não cresce

Relatar Possível Possível Possível Relatar

como como
VISA VRSA VISA/VRSA
VSSA VSSA

Checar Pureza da cepa e revisar resultados

Notificar o médico e CCIH sobre possível identificação
de VISA/VRSA, aguardar repetição dos testes
 Detecção de VISA/VRSA
Confirmação

CIM placa com vancomicina (BHI

Vancomicina + vancomicina 6 μg/mL

 2 μg/mL 4-16 μg/mL  32 μg/mL cresce Não cresce

Relatar Relatório Relatório Relatório Relatar

como Presuntivo Presuntivo Presuntivo como
VSSA VISA VRSA VISA/VRSA VSSA

Salvar o isolado
Notificar o médico e CCIH sobre o resultado presuntivo
de VISA/VRSA e enviar a cepa para Laboratório de
Referência
Pruebas adicionales
Que
informas?
Resistencia a Aminoglicósidos

▪ Disminución de unión al ribosoma

▪ Disminución de la permeabilidad
▪ Producción de enzimas modificadoras
 Fosforilación
 Nucleotidación
 acetilación
Resistencia a Tetraciclinas
▪ Bloqueo de unión al ribosoma
 tetM, tetO, tetQ
 Amino-acil-tRNA al ribosoma
▪ Eflujo
 tetA, tetG (G-) tetK, tetL (G+)
▪ Disminución de la permeabilidad
▪ Enzimas modificadoras
 Eflujo a Tetraciclinas

Proton antiport tet-Mg++

 Resistencia a Quinolonas

▪ Cambios en la DNA girasa

▪ Disminución de la permeabilidad
▪ Eflujo
Resistencia a Quinolonas
Mutaciones de genes
▪ Topoisomerasa II = DNA girasa
 gyrA – gyrB
▪ Topoisomerasa IV
 parC – parD
▪ Gram – gyrA
 RESISTENCIA A TODAS
▪ Gram + : primero parC y despues gyrA
 No a todas – probrar sensi
 Mecanismos de resistencia a Macrólidos a
Streptococos
TOTAL Fenotipo MLSB (gen ermB) PARCIAL Fenotipo M (gen mefA)
Acción de las metilasas, sobre la subunidad 23S Alteraciones en los mecanismos de expulsión
del ARN ribosomal Unión deficiente a la molécula activa o bombeo del antibiótico.
diana
Resistencia de alto nivel (CMI > 64 µg/ml). Resistencia de nivel bajo-intermedio.
No se vence aumentado la dosis del macrólido Podría compensarse aumentando de las dosis del
macrólido
Resistencia TOTAL: cruzada a todos los • Resistencia PARCIAL: Macrólidos 14 y 15
macrólidos (M), Lincosamidas (L) y átomos (eritro/claritro/ azitromicina)
estreptograminas B (SB). • Sensibilidad: Macrólidos 16 átomos
(josa/midecamicina), lincosamidas y
estreptograminas.

No resistencia frente a Ketólidos No resistencia frente a Ketólidos

Neumococo: 80%-90% Neumococo: 10%-20%
S. pyogenes: 30.5% S. pyogenes: 67.8%
Asociado a fracasos terapéuticos (neumococo) Asociado a fracasos terapéuticos (neumococo)
 E 15: Disco de ERY de 15 μg; DA 2: disco de CLI de 2
μg
(“D-Test
positivo)

Achatamiento del halo de CLI

iMLSB
en la proximidad del disco de Metilación ribosomal (inducible
RESISTENCIA MACROLIDOS, LINCOSAMIDAS Y
ESTREPTOGRAMINAS B EN COCOS +

ERY CLI
ERY CLI

INFORME MLS + : ERI R y CLI R

RESISTENCIA MACROLIDOS, LINCOSAMIDAS Y
ESTREPTOGRAMINAS B EN COCOS +

ERY CLI
ERY CLI

S. aureus S. aureus
Eflujo MLSB inducible
INFORME MS +: INFORME MLS +:
ERI R y CLI S ERI R y CLI R
 E 15: Disco de ERY de 15 μg; DA 2: disco de CLI de 2
μg
No hay halos de
inhibición

cMLSB
Metilación ribosomal (constitutivo
)
 E 15: Disco de ERY de 15 μg; DA 2: disco de CLI de 2
μg
Zonas de inhibicón
en la categoría
“sensible” para CLI

Eflujo
MSB
 E 15: Disco de ERY de 15 μg; DA 2: disco de CLI de 2
(D-Test “ negativo). μg

Zonas de
inhibición en la
categoría
“sensible” para
ERY y CLI
 Resistencia en Enterococos

▪ Betalactámicos - alterar PBP

- Betalactamasas
▪ Glicopeptidos - inh transglicolasa
 Vancomicina – van A, B, C
 Teicoplanina
▪ Quinolonas
 mutación DNA gir
 Eflujo
Resistência de Enterococcus a Antimicrobianos

Resistência Intrínseca
• Aminoglicosídeos (níveis baixos)
• b-lactâmicos (valores de CIM relativamente elevados)
• Lincosaminas (níveis baixos)
• Trimetoprim-Sulfametoxazol (somente “in vivo”)
• Vancomicina (E. casseliflavus, E. gallinarum)

Resistência adquirida (plasmídeos e transposons)

• Aminoglicosídeos (níveis elevados)
• Estreptomicina: ribossômica / adenil-transferase
• Gentamicina: acetil-transferase + fosfo-transferase
• b-lactâmicos (alteração das PBPs; produção de b-lactamases; tolerância)
• Glicopeptídeos ( VanA, VanB, VanD, VanE)
• Fluoroquinolonas
• Lincosaminas (níveis elevados)
• Macrolídeos
• Rifampicina
• Tetraciclinas
 Resistência a Níveis Elevados de
Aminoglicosídeos

CMIs > 2000 µg/ml : resistência ao sinergismo

Mecanismos de resistência:
(plasmídios/transposons):
• Enzimas modificadoras de aminoglicosídeos (EMAS)
AAC(6’)-Ie + APH(2’’)-Ia
AAC(6’)-Ii
APH(2’’)-Ib ; APH(2’’)-Ic ; APH(2’’)-Id
APH(3’)-IIIa
ANT(3’)-Ia ; ANT(4’)-Ia ; ANT(6’)-Ia

• Alteração do sítio alvo

(Resistência ribossômica/estreptomicina)
 Resistência a Níveis Elevados
de b-lactâmicos

Modificação das proteínas ligadoras de penicilina (PBPs)

• Amostras resistentes à penicilina (E. faecium) têm sido

relatadas há décadas (CMIs 8-64 µg/ml)
• Amostras resistentes a níveis mais elevados têm sido
relatadas com mais freqüência atualmente

Produção de b-lactamase

• 1981, 1o relato de amostra produtora de b-lactamase

• Gene tem localização plasmidial (associado a HLR-GE)
 Resistência a Glicopeptídeos em
Enterococcus

Fenótipo Van A Van B Van C

CMI (mg/ml):
Vancomicina 64 - >1000 4 - >1000 2-32
Teicoplanina 16 - 512 0,5 - 1 0,5-1

Expressão Induzida Induzida Constitutiva

Localização Plasmídeos Cromossomo Cromossomo

dos genes Cromossomo Plasmídeos

Genótipo vanA vanB vanC

Produtos D-Ala-D-Lac D-Ala-D-Lac D-Ala-D-Ser

Espécies E. faecium E. faecium E. gallinarum

E. faecalis E. faecalis E. casseliflavus
E. avium
E. durans
E. mundtii
E. casseliflavusE. gallinarum
 Resistência a Glicopeptídeos em
Enterococcus

Fenótipo Van D Van E Van G

CMI (µg/ml):
Vancomicina 64-128 16 16
Teicoplanina 4-64 0,5 0,5

Expressão Constitutiva Induzida ?

Localização Cromossoma ? ?
dos genes

Genótipo vanD vanE vanG

Produtos D-Ala-D-Lac D-Ala-D-Ser ?

Espécies E. faecium E. faecalis E faecalis

 Testes de Susceptibilidade aos
Antimicrobianos

TSA para Enterococcus

• Importância da Aderência a Padronização

Execução, Controle de Qualidade

Interpretação

• Importância de Manutenção Constante de Atualização no Tema

• Importância de Avaliação Crítica dos Resultados

 Métodos de triagem

Interpretação dos resultados

Gentamicina e Estreptomicina:
> 1 colônia / cresc. em caldo = resistente

O sinergismo obtido entre gentamicina ou estreptomicina e

antimicrobianos de ação na parede (ampicilina, penicilina e
glicopeptídeos) não ocorrerá.

Vancomicina:
>1 colônia = resistência presuntiva

Realizar testes de motilidade e pigmento para distinguir

espécies com resistência adquirida (VanA e VanB) daqueles
com resistência intrínseca a níveis intermediários de
vancomcina (E. gallinarum, E. casseliflavus)
 Métodos de triagem

Meio de cultura
BHI Agar ou caldo suplementado com:
• 500 µg /ml de Gentamicina (agar ou caldo)
• 2000 µg /ml (agar) / 1000 µg/ml (caldo) de Estreptomicina
• 6 µg /ml de Vancomicina (agar)
Inóculo
• Suspensão a partir de um crescimento de 18-24h
com turvação padrão 0.5 McFarland (108 UFC/ml)
• “Spot” de 10 ml na superfície do agar = 106 UFC/ml (genta e estrepto)
• “Spot” de 1-10 ml na superfície do agar = 106 UFC/ml (vanco)

Incubação
• 24h, 35oC, ar ambiente (Genta e Vanco)
• 24-48h, 35oC, ar ambiente (Estreptomicina)
 Métodos de Triagem para a Detecção de
Resistência a Níveis Elevados de
Aminoglicosídeos (HLR-A) em enterococos

Parâmetro Triagem Triagem Disco

Agar Caldo

Meio BHI agar BHI caldo MHA

Antimicrobiano (conc.)
Gentamicina 500 µg/ml 500 µg/ml 120 µg/ml
Estreptomicin 2000 µg/ml 1000 µg/ml 300 µg/ml

Inóculo 106 CFU/spot 5x104 CFU/0.1ml 0.5 McFarland

Incubação (h) 24 24 18 - 24

Leitura > 1 colônia Qualquer > 10mm = susceptível

(Interpretação) crescimento 7-9mm = intermediário
< 6mm = resistente
 Métodos de triagem para a detecção de
resistência a vancomicina em enterococos

Parâmetro Triagem em Agar Difusão (disco)

Meio BHI agar MHA

Antimicrobianol
(Concentração) 6 µg/ml 30 µg/ml

Inóculo 105 - 106 CFU/spot 0.5 McFarland

Incubação (h) 24 24

Leitura > 1 colônia > 17mm = susceptível

(Interpretação) 15-16mm = intermediário
< 14mm = resistente
Oscar Rios Rios, MIC, MSc(c), MPH, Dr.
oscar_rios@fach.cl