Práctica de Laboratorio: Nº 5

Título: CLONACION DE RATONES (APLICACIÓN DE ADN Y GENES)

Materia: Bioquímica

1. Objetivos

 Aplicar conocimientos de síntesis de ADN y genes en procesos de genéticos.

 Realizar el estudio de trabajos genéticos en laboratorio.

2. Fundamento Teórico

ADN

El ácido desoxirribonucleico, conocido también por las siglas ADN, es un ácido nucleico que
contiene las instrucciones genéticas usadas en el desarrollo y funcionamiento de todos
los organismos vivos y algunos virus; también es responsable de la transmisión hereditaria. La
función principal de la molécula de ADN es el almacenamiento a largo plazo
de información para construir otros componentes de las células, como las proteínas y las
moléculas de ARN. Los segmentos de ADN que llevan esta información genética son
llamados genes, pero las otras secuencias de ADN tienen propósitos estructurales o toman
parte en la regulación del uso de esta información genética.
Desde el punto de vista químico, el ADN es un polímero de nucleótidos, es decir,
un polinucleótido. Cada nucleótido, a su tiempo, está formado por un glúcido
(la desoxirribosa), una base nitrogenada (que puede
ser adenina→A, timina→T, citosina→C o guanina→G) y un grupo fosfato (derivado del ácido
fosfórico). Lo que distingue a un polinucleótido de otro es, entonces, la base nitrogenada, y
por ello la secuencia del ADN se especifica nombrando solo la secuencia de sus bases. La
disposición secuencial de estas cuatro bases a lo largo de la cadena es la que codifica la
información genética, siguiendo el siguiente criterio de complementariedad: A-T y G-C. Esto
se debe a que la adenina y la guanina son de mayor tamaño que la timina y la citosina, por lo
que este criterio permite cumplir una uniformidad. En los organismos vivos, el ADN se presenta
como una doble cadena de nucleótidos, en la que las dos hebras están unidas entre sí por
unas conexiones denominadas puentes de hidrógeno.

Replicación de ADN

El proceso de replicación, autorreplicación, duplicación o autoduplicación de ADN es el

mecanismo que permite al ADN duplicarse (es decir, sintetizar una copia idéntica). De esta
manera de una molécula de ADN única, se obtienen dos o más "réplicas" de la primera y la
última. Esta duplicación del material genético se produce de acuerdo con un
mecanismo semiconservador, lo que indica que los dos polímeros complementarios del ADN

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original, al separarse, sirven de molde cada una para la síntesis de una nueva cadena
complementaria de la cadena molde, de forma que cada nueva doble hélice contiene una de
las cadenas del ADN original. Gracias a la complementación entre las bases que forman la
secuencia de cada una de las cadenas, el ADN tiene la importante propiedad de reproducirse
idénticamente, lo que permite que la información genética se transmita de una célula madre a
las células hijas y es la base de la herencia del material genético.
La molécula de ADN se abre como una cremallera, por ruptura de los puentes de
hidrógeno entre las bases complementarias en puntos determinados: los orígenes de
replicación. Las proteínas iniciadoras reconocen secuencias de nucleótidos específicas en
esos puntos y facilitan la fijación de otras proteínas que permitirán la separación de las dos
hebras de ADN formándose una horquilla de replicación. Un gran número
de enzimas y proteínas intervienen en el mecanismo molecular de la replicación, formando el
llamado complejo de replicación o replisoma. Estas proteínas y enzimas son homólogas
en eucariotas y arqueas, pero difieren en bacterias.
Clonación

La clonación (del griego: κλών, ‘retoño, rama’;1 copia idéntica de un organismo a partir de
su ADN) se puede definir como el proceso por el que se consiguen, de forma asexual, copias
idénticas de un organismo, célula o molécula ya desarrollado.
Se deben tomar en cuenta las siguientes características:

 En primer lugar se necesita clonar las células (producto embrionario), porque no se puede
hacer un órgano o parte del "clon" si no se cuenta con las células que forman dicho cuerpo.
 Ser parte de un organismo ya "desarrollado", porque la clonación responde a un interés
por obtener copias de un determinado organismo, y sólo cuando es adulto se pueden
conocer sus características.
 Por otro lado, se trata de crearlo de forma asexual. La reproducción sexual no permite
obtener copias idénticas, ya que este tipo de reproducción por su misma naturaleza genera
diversidad múltiple.

Clonación molecular
La clonación molecular se utiliza en una amplia variedad de experimentos biológicos y las
aplicaciones prácticas van desde la toma de huellas dactilares a producción de proteínas a
gran escala.
En la práctica, con el fin de amplificar cualquier secuencia en un organismo vivo, la secuencia
a clonar tiene que estar vinculada a un origen de replicación; que es una secuencia de ADN.
Transfección
Se introduce la secuencia formada dentro de células.
Selección
Finalmente se seleccionan las células que han sido transfectadas con éxito con el nuevo ADN.
Inicialmente, el ADN de interés necesita ser aislado de un segmento de ADN de tamaño
adecuado. Posteriormente, se da el proceso de ligación cuando el fragmento amplificado se
inserta en un vector de clonación: El vector se linealiza (ya que es circular), usando enzimas de
restricción y a continuación se incuban en condiciones adecuadas el fragmento de ADN de
interés y el vector con la enzima ADN ligasa.

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 Tras la ligación del vector con el inserto de interés, se produce la transfección dentro
de las células, para ello las células transfectadas son cultivadas; este proceso, es el
proceso determinante, ya que es la parte en la que vemos si las células han sido
transfectadas exitosamente o no.
Tendremos que identificar por tanto las células transfectadas y las no transfectadas,
existen vectores de clonación modernos que incluyen marcadores de resistencia a
los antibióticos con los que sólo las células que han sido transfectadas pueden crecer.
Hay otros vectores de clonación que proporcionan color azul/ blanco cribado. De modo,
que la investigación de las colonias es necesaria para confirmar que la clonación se
ha realizado correctamente.

Clonación celular
Clonar una célula consiste en formar un grupo de ellas a partir de una sola. En el caso
de organismos unicelulares como bacterias y levaduras, este proceso es muy sencillo,
y sólo requiere la inoculación de los productos adecuados.
Sin embargo, en el caso de cultivos de células en organismos pluricelulares, la
clonación de las células es una tarea difícil, ya que estas células necesitan unas
condiciones del medio muy específicas.
Una técnica útil de cultivo de tejidos utilizada para clonar distintos linajes de células es
el uso de aros de clonación (cilindros).
De acuerdo con esta técnica, una agrupación de células que han sido expuestas a un
agente mutagénico o a un medicamento utilizado para propiciar la selección se ponen
en una alta dilución para crear colonias aisladas; cada una proviniendo de una sola
célula potencialmente y clónicamente diferenciada.
En una primera etapa de crecimiento, cuando las colonias tienen solo unas pocas
células; se sumergen aros estériles de poliestireno en grasa, y se ponen sobre una
colonia individual junto con una pequeña cantidad de tripsina.
Las células que se clonan, se recolectan dentro del aro y se llevan a un nuevo
contenedor para que continúe su crecimiento en forma natural.

3. Procedimiento

1.- Ingrese al link

https://learn.genetics.utah.edu/content/cloning/clickandclone/
Tome las siguientes consideraciones.

 Cuando la plataforma le dé la instrucción mueva la muestra y opere algunos equipos

con la ayuda del mouse y prosiga con el procedimiento que indica la plataforma.

4. Datos

 Realice el diagrama de flujo del proceso experimental.

 Realice el listado de materiales, reactivos y equipos.
 Realice un comentario sobre el laboratorio realizado

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6. Conclusiones

 Organice los resultados obtenidos durante el experimento; en función de estos exprese

sus conclusiones.

7. Cuestionario

1. Explique que son los cromosomas y como se forman.

2. Explique el procesado de duplicación de ADN.
3. Nombre y explique 3 estudios genéticos realizados a la fecha.

8. Bibliografía.

 Indique en orden alfabético la bibliografía consultada, bajo el siguiente formato:

Autor/ Título / Editorial/ Edición/ # de páginas consultadas
 En caso de haber consultado páginas web, indicar la dirección electrónica.

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