ACTIVIDAD II.

Lea las situaciones que se le plantean y responda lo que se le pide

1. De una muestra de 2 mL proveniente de un paciente diagnosticado como positivo a SARS-

CoV-2, usted debe realizar el aislamiento y purificación de virus, además de obtener un
abasto viral suficiente y con título alto para posteriores estudios de genética y
patogénesis. Para comenzar realiza el siguiente protocolo: el total de la muestra lo pasa a
través de un filtro de 0.22 m y la diluye 1:50, toma una alícuota de 500 L e inocula una
botella T25 de células Vero E6 al 100% de confluencia, deja absorber por 1 h a 37°C
agitando cada 15 min. Posteriormente completa la botella a un volumen final de 5 mL con
medio DMEM al 2% de SFB y se mantienen a 37°C, las células son observadas cada 24 h
hasta la aparición de ECP, a las 72 h post infección realiza la cosecha de la suspensión viral
por centrifugación y forma alícuotas de 0.5 mL que son almacenadas a -80°C hasta su uso.

a) ¿Por qué pasa la muestra a través del filtro de 0.22 m ?

b) ¿Con que objetivo se agita la botella inoculada cada 15 min?

c) Para poder validar que los cambios que se presenten en la botella inoculada son debidos a
la infección por el virus, es necesario un control de no infección ¿En que consiste dicho
control de no infección y que condiciones debe tener?

d) ¿Con qué objetivo centrifuga la suspensión viral antes de realizar las alícuotas de 0.5 mL?

e) ¿Por qué usa línea celular Vero E6 para la propagación del SARS-CoV-2? Mencione que
específicamente que presenta la célula huésped y que el SARS-CoV-2.
2. A partir de las alícuotas generadas en el punto 1, usted toma una de ellas y realiza un
ensayo en placa usando el siguiente protocolo: 24 h antes del ensayo siembra una placa
de 6 pozos con células Vero E6 para obtener monocapas confluentes; para el ensayo,
realiza diluciones seriadas con factor 10 de 10 -1 a 10-7 del stock viral, de las ultimas 3
diluciones toma 0.2 mL e inocula las monocapas correspondientes; deja absorber por 1 h a
37°C con agitación cada 15 min; después de la adsorción adiciona sobre cada pozo una
suspensión de celulosa microcristalina al 0.6% en medio DMEM libre de suero como
overlay; después de 72 h la celulosa es aspirada de cada pozo y enseguida se reemplaza
por formaldehido al 10% durante 1 h a rt, finalmente las monocapas se lavan y se tiñen
con cristal violeta al 0.4%. Se obtiene el siguiente resultado:

a) ¿Por qué se necesita que las monocapas estén al 100% de confluencia para en ensayo
en placa?

b) ¿Qué objetivo tiene adicionar la celulosa microcristalina?

c) De la imagen que se presenta ¿Qué dilución usaría para realizar la cuenta de sus
partículas virales infecciosas? ¿Por qué?

d) Calcule el título viral como PFU/mL del virus SARS-CoV-2 propagado, utilice la imagen
presentada para el cálculo.
3. Del stock viral toma otra alícuota para determinar el titulo viral por TCID50 realizando el
siguiente protocolo: toma una alícuota de 0.250 mL del virus y la lleva a un volumen de 1
mL con medio DMEM al 1% de SFB, de esta nueva suspensión viral hace un serie de
diluciones de 10-1 hasta 10-5 en volumen final de 1 mL y las reserva en hielo; en una
microplaca de 96 pozos coloca 100 L de medio DMEM al 1% de SFB a todos los pozos de
la hilera 2 y hasta la hilera 10, enseguida a todos los pozos de la hilera 1 coloca 200 L de
la dilución de virus 10-5 y a partir de esta hilera comienza a hacer una serie de diluciones
transfiriendo 100 L entre cada hilera de pozos hasta la hilera 10, los últimos 100 L son
desechados. Finalmente adiciona a todos los pozos con diluciones de virus 100 L de una
suspensión de células Vero E6 e incuba la microplaca a 37°C, la hilera de pozos 11 queda
libre y en la hilera 12 la usa para colocar los controles correspondientes. A las 72 h de
iniciado el ensayo la presencia o ausencia de ECP se hace constante y obtiene las
siguientes lecturas:

Hiler Log Infectad Sano Acumulad Acumulad Infectados/tot Porcenta

a dilució os s os os sanos ales je
n infectados
1 8 6 59 6
2 8 6 51 12
3 8 6 43 18
4 8 6 35 24
5 8 6 27 30
6 7 1 19 31
7 7 1 12 32
8 3 5 5 37
9 2 6 2 43
10 0 8 0 51

a) Llene la tabla de acuerdo con todo lo que necesita para calcular el titulo viral en
TCID50/mL usando el método de Reed-Much, ¿Qué título viral obtiene? Coloque todos
los cálculos realizados.

b) Obtenga el título viral en TCID50/mL usando el método de Spearman-Karber. Coloque

todos sus cálculos.

c) ¿Qué controles montaría en esta placa de titulación y que llevaría cada uno de ellos?
4. Con el stock viral ya titulado usted realiza un ensayo de actividad antiviral de “la sustancia
X” que tiene potencial uso terapéutico contra el SARS-CoV-2. Para el ensayo utiliza una
microplaca de 96 pozos y requiere probar 10 diferentes concentraciones de “la sustancia
X” por octaduplicado. De manera general cada concentración de “la sustancia X” en
volumen final de 50 L debe ponerse en contacto con 50 L de una suspensión del stock
de virus ajustada a 2000 TCID50/mL. Las reacciones anteriores se incuban por 1 h a 37°C y
finalmente se le adicionan 100 L de una suspensión de células Vero E6, se revisa el
potencias efecto protector de “la sustancia X” cada 24 h.

a) ¿Cómo obtiene las 2000 TCID50/mL a partir del stock viral?

b) Considere que tiene recurso totalmente limitados por lo que debe preparar la
cantidad justa de suspensiones virales y celulares ¿Qué cantidad de suspensión
viral necesita preparar? Coloque el volumen de medio que necesita para preparar
la suspensión viral y el volumen de alícuota que necesita del stock viral.

c) ¿Cuántas TCID50 está colocando realmente por pozo de prueba?

5. Usted ya tiene estandarizado que cuando una botella T25 de células Vero E6 llega a
confluencia del 100% es porque tiene una concentración de 1.5X10 -6 células por botella.
Para seguir propagando el virus que aisló necesita re infectar botellas con una
multiplicidad de infección de 0.01, ¿¿Qué cantidad de virus necesita para obtener esa
MOI?