Universidad Complutense de Madrid

Depto. Nutrición, Bromatología y Tecnología de Alimentos

Los biofilms como reto

para la industria alimentaria

Carmen S
C San JJosé
éSSerrán
á
serran@vet.ucm.es

Zaragoza, 17 de noviembre de 2010

 ¿Qué es un biofilm?
• En sentido amplio: un conjunto de organismos vivos que crecen agregados,
formando películas, láminas, tapices, alfombras, etc, como p.ej. los moluscos
sobre el casco de los barcos.

• En sentido estricto: una comunidad de MICROORGANISMOS que crecen

agregados en una INTERFASE. Los más estudiados son los presentes en
interfases sólido/líquido y en las sólido/aire en ambiente húmedo.

• En el caso de la adhesión y crecimiento sobre interfases sólido/líquido o

sólido/aire, se entiende que la superficie sólida es INERTE, o al menos no
interacciona específicamente con los microorganismos. Según este criterio,
no se suele considerar como biofilm la flora intestinal, pero sí la placa dental,
o los microorganismos adheridos a frutas y hortalizas mínimamente
procesadas.

• Las células están embebidas en una MATRIZ gelatinosa y cohesiva. Está

constituída por agua, polisacáridos, proteínas, ácidos nucléicos, lípidos e
y p
iones varios: la mayor parte son materiales extracelulares,, pero
p hayy también
celulas muertas y materiales captados del entorno.
 ¿Qué microorganismos se adhieren y sobre qué?

• Arqueas, bacterias, levaduras, algas: todos los organismos unicelulares

ensayados. Diversos protozoos pueden “pastar” sobre biofilms microbianos. La
velocidad de formación de biofilms, sin embargo, depende del microorganismo,
superficie, nutrientes, temperatura, y otras condiciones ambientales.

• Los biofilms naturales son habitualmente consorcios, con más de una especie.
Algunos se comportan como colonizadores primarios de una superficie,
superficie acogiendo
a otros.

• Cualquier superficie puede servir como soporte (mineral, cerámica, metálica,

polimérica, etc) aunque algunas puedan ser más favorables que otras (por su
microtopografía, hidrofobicidad, iones liberados, etc).

• Se cree que en la naturaleza hay más á microorganismos adheridos (o sea en

biofilms) que planctónicos (esto es, en suspensión). Se tiende a un equilibrio
entre la población adherida y la planctónica, con desplazamientos de
células,, en un sentido u otro,, según
g las condiciones ambientales.
Melón

(Annous, 2009)
Perejil

(Annous, 2009)
Brotes de alfalfa

Biofilm natural sobre hipocotilo de brote de alfalfa.

Bacterias no identificadas, incluyendo cocos y bacilos.
Microscopía de epifluorescencia directa. Bacterias retenidas en los arañazos
de una superficie de acero inoxidable que ha sufrido abrasión (Verran 2002)
Células de Staphylococcus aureus
adheridas sobre acero inoxidable, antes y
después de un cepillado con agua y
detergente. Imágenes de microscopía de
fuerza atómica (AFM). (Verran, 2008)
Microorganismos no identificados en un condensador industrial de acero blando, tras 8 semanas de
exposición. El biofilm incluye productos de corrosión, partículas de arcilla, diversos tipos de bacterias
y diatomeas. SEM. Barra de escala = 10 µ
Ventajas para los microorganismos de la vida en biofilms

• Supervivencia en nichos favorables, sin ser arrastrados de allí

por el flujo de líquido

• Condiciones ambientales más estables

• Mayor resistencia a la desecación

• Mayor resistencia a biocidas, anticuerpos y macrófagos

• Comensalismo o cooperación con organismos de aptitudes

fisiológicas diferentes

• La proximidad favorece la transferencia horizontal de genes

Vivir en biofilms. Los atractivos de la vida sedentaria
Etapas en la formación de biofilm:
• Acumulación de p
películas de acondicionamiento
• Deposición o adsorción de células planctónicas
• Producción de material extracelular adhesivo
• Maduración del biofilm (aumento de espesor, establecimiento de
gradientes de oxígeno
oxígeno, nutrientes
nutrientes, pH
pH, etc)
• Atrapamiento y liberación de células
Heterogeneidad
g de situaciones tróficas dentro de un biofilm
 Cambios fenotípicos en las células del biofilm

• Adaptación
p a mayor
y densidad celular
• Pérdida de motilidad
• Producción de polisacáridos adhesivos
• Adaptación a diversos grados de anaerobiosis (multiples vías
metabólicas)
• Mayor resistencia a biocidas (distintos mecanismos)
• Distintas modalidades de relaciones ecológicas

• De la mayor parte de los genes con expresión diferente en

biofilms no se conoce aun la función
Regulación de la formación de biofilms. Sensores de densidad celular. Quorum
Sensing (QS) y sus señales difusibles de comunicación célula-célula, los autoinductores.
En este caso,, acil-homoserin lactonas ((HSL)) en azul,, que
q son producidas
p por
p enzimas LuxI
y (a determinada concentración) captadas por receptores LuxR que, a su vez, activan
determinados genes, regulando la formación de biofilms y otros mecanismos.
a) Baja concentración de autoinductor HSL. b) Alta concentración.

Hay autoinductores específicos (de especie o género) y no específicos.

Regulación de la formación de biofilms en bacterias. El c-diGMP. El ácido
diguanílico cíclico (c-di-GMP) es un segundo mensajero que regula la transición entre el
modo de vida libre y fijo. La actividad de las diguanilato ciclasas (DGC) reside en un
dominio GGDEF y la de las fosfodiesterasas (PDE) en un dominio EAL. (Tomado de
Jenal, 2006)
 Diferencia en susceptibilidad a antibióticos
entre células planctónicas y en biofilms de bacterias Gram+

Concentraciones en µg/mL.

(Tomado de Olson y col. 2002)

Idem para Gram -

(Olson y col. 2002)

Resistencia aumentada de biofilms a biocidas. Compuestos
p de amonio cuaternario.
Bacillus

Peng et al. 2002

Resistencia aumentada de biofilms a biocidas
biocidas. Hipoclorito sódico
sódico. Bacillus

Peng et al., 2002

Resistencia aumentada a biocidas. Hipoclorito sódico. E. coli

Time (min)

Comparación del efecto bactericida. A la izquierda, células planctónicas; a la derecha, biofilms

de 3 cepas de E. coli. En ordenadas, log10 CFU/cupón.
MENOR SUSCEPTIBILIDAD A BIOCIDAS DE
CÉLULAS EN BIOFILMS.
Hipoclorito sódico. Listeria monocytogenes

Reducción logarítmica de células planctónicas (○),

células individuales adheridas (∆) y microcolonias
adheridas (●) de Listeria monocytogenes por
exposición a 100, 400 y 800 ppm de cloruro de
benzalconio.

(tomado de Koffi y Frank 1990

1990, JJ. Food Protection 53
53, 550-554)
550 554)
Relevancia de los biofilms en la industria alimentaria

• Recurso biotecnológico: forma natural de inmovilización de

células microbianas (utilizables para obtención de ingredientes y
aditivos,, tratamiento de aguas
g residuales,, bioremediación,, etc).
)

• Problemas tecnológicos:
Alteración de ppropiedades
p de superficies
p (fricción,
( , transferencia
de calor, etc)
Obturación de conductos, orificios, filtros, válvulas
Ensuciamiento de dispositivos
p instalados para
p medida y muestreo
Facilitación de la corrosión

• Problemas sanitarios y pérdidas en calidad y vida útil del

producto: microorganismos procedentes de materias primas, agua,
aire, operarios, etc se instalan como biofilms en planta, desde
donde actúan como reservorios que, por deficiente manipulación o
limpieza, pueden recontaminar el alimento procesado.
 Porqué existen y persisten los biofilms
en las plantas de procesado de alimentos

• Se forman preferentemente en lugares donde se limpia poco, nada, mal o

muy de tarde en tarde: allí tienen tiempo para crecer e incluso madurar.

• L matriz
La t i del
d l biofilm
bi fil es un gell cohesivo,
h i a veces firme,
fi difícil
difí il de
d desprender.
d d

• Las células están protegidas por la matriz frente a los agentes antimicrobianos
y además, al multiplicarse
p más lentamente queq las células planctónicas,
p son
menos vulnerables a ellos.

• Los fragmentos de biofilm con células viables, al desprenderse pueden

dispersarse en líquidos y aerosoles.

• Las gotículas de los aerosoles pueden mantenerse en suspensión incluso

horas; pueden depositarse sobre superficies en contacto con alimentos, o
sobre alimentos ya procesados
procesados.

• Aunque las células sean destruídas por los desinfectantes, la matriz puede
permanecer intacta o dejar residuos.

• Los restos de matriz facilitan la fijación de nuevas células y el desarrollo de

nuevos biofilms.
 Recursos básicos contra biofilms en la industria alimentaria

1. Diseño de equipos e instalación global fácilmente accesibles para la limpieza.

2. p
Mantener las superficies p
pulidas;; evitar abrasión,, corrosión,, empalmes
p con holgura,
g ,
huecos o resquicios, perforaciones o soldaduras poco alisadas.

3. Reponer frecuentemente piezas de materiales agrietables o fácilmente dañados.

4. Minimizar durante la producción las salpicaduras, manchas, charcos, superficies

humedecidas con condensados y restos de líquidos en codos de conducciones.

5. Identificar en la p
planta los sitios mas favorables p
para el desarrollo de biofims.

6. Desmontar para limpiar lo que tenga resquicios no accesibles.

7. Evitar películas de acondicionamiento por limpieza insuficiente.

8. Eliminar mecánica- o químicamente la matriz de los biofilms.

9. Controlar durante la limpieza los aerosoles, que transportan restos de biofilm.

10 Adoptar frecuencias de limpieza que eviten llegar a tener biofilms maduros

10. maduros.
 Tendencias en la lucha contra biofilms en la industria alimentaria

Fisiología microbiana:
Identificar las condiciones ambientales que estimulan la formación y el desprendimiento de biofilms.
Caracterizar el funcionamiento de sus sistemas de regulación, en particular los de QS
Identificar los autoinductores operativos en cada caso, junto con precursores y antagonistas, así como
enzimas
i que los
l producen
d y degradan
d d y las
l fuentes
f t ded todos
t d ellos,
ll en alimentos
li t o ell entorno.
t
Estudiar el fundamento de los “persistores”.

Ecología microbiana:
Identificar los microorganismos dominantes en cada entorno alimentario y la base de su asociación.
Identificar posibles microorganismos antagonistas para diseñar sistemas de exclusión mutua.
Probar fagos.

Microbiología alimentaria:
Nuevos métodos físicos de inhibición o destrucción microbiana
Nuevos principios antimicrobianos o antibiofilms (p.ej. contra autoinductores)
Comprobar el posible desarrollo de resistencias (simples o cruzadas)
Probar sinergias de productos y/o procesos

Sostenibilidad:
Cerrar los procesos (por ejemplo
“Cerrar” ejemplo, procurar no producir y sobre todo
todo, diseminar,
diseminar resistencias)
Usar agentes biodegradables o naturales.
Ahorrar agua y energía.
 Gracias por su atención

Carmen San José Serrán

Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología de Alimentos

Facultad de Veterinaria
Universidad Complutense de Madrid

serran@vet.ucm.es