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1. Titulo
Aplicación De La Técnica De Elisa En Diagnóstico De Rubeola Y Sarampión

2. Objetivo
Aplicar la técnica de ELISA como método serológico para diagnóstico viral.

2.1 Objetivos Específicos

 Revisar el diagnóstico de las enfermedades virales exantémicas como la rubéola y el
sarampión.
 Leer, interpretar y aplicar procedimientos comerciales de ELISA para diagnóstico de
rubéola y sarampión.
 Desarrollar habilidades y destrezas en el trabajo de laboratorio.

3. Marco Teórico

3.1 RUBEOLA

Agente Causal
Virus de la Rubéola. Virus de la familia Togaviridae, género Rubivirus. Virus con genoma
tipo RNA de cadena sencilla lineal de sentido positivo de 9757 nucleotides, envuelto, en
cuya envoltura se encuentran los antígenos E1 y E2 (1).

Definición de la Enfermedad:

La rubéola es una enfermedad infecciosa aguda caracterizada por fiebre, exantema y

adenopatías. Cuando la enfermedad ocurre en una mujer embarazada el virus es
teratogénico (2).

La rubéola entonces puede ser de dos clases: post natal y congénita.

Rubéola post natal:

El individuo se contagia por contacto directo o aerosoles provenientes de las secreciones
nasofaríngeas del infectado, siendo el periodo de incubación de 2 a 3 semanas. Ingresa e
infecta el tracto respiratorio superior, desde donde se disemina a los ganglios linfáticos
locales causando una viremia, que provoca la infección a los tejidos y la piel.
Seguidamente sucede una segunda viremia llevando el virus de nuevo a la nasofaringe
por donde se excreta.

La edad determina la gravedad de la enfermedad siendo menos intensa en niños que en

adultos. En niños la enfermedad comienza con una erupción maculopapular, en la cara
que se disemina a tronco y extremidades con una duración de 3 a 5 días, también se
presenta linfadenopatías principalmente retroauricular, cervical y suboccipital. El
exantema, fiebre, conjuntivitis leve y un cuadro catarral de vías respiratorias superiores
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son los síntomas principales en los adultos (2, 3).

El virus puede detectarse en la sangre desde 6 a 8 días antes y 4 a 5 días después de la

aparición de rash, el cual aparece cuando comienza a desarrollarse la inmunidad.

Rubéola congénita:
Se transmite transplacentariamente como consecuencia de una viremia materna debido a
una primoinfección. El virus puede infectar la placenta, atravesarla y alcanzar al feto. El
efecto del virus sobre el feto depende del momento de la infección, cuando más temprano
sea la infección mayor será el daño. La infección puede llevar a muerte fetal, parto
prematuro o a defectos congénitos (2, 3, 4).

En los dos primeros meses podemos encontrar: aborto espontáneo o malformaciones

congénitas múltiples.
En el tercer mes: 30-35% de posibilidad de malformaciones, siendo el oído y el corazón
los más afectados.
En el cuarto mes: sólo el 10% tienen compromiso y generalmente es en su audición.
En embarazos de más de 20 semanas usualmente no se presenta ninguna malformación.

Respuesta inmune en rubéola:

Los Ac IgM (3):

En niños y adultos se detectan a partir del tercer día después de aparecer el exantema y
en el 100% de los pacientes después del día 11; alcanza su pico entre la 3 y 4 semana y
disminuyen rápidamente entre la semana 8 a 12, hasta que ya no son detectables.

Los anticueropos IgM anti rubeola se detectan también en el 60-80% de los vacunados y
en niños infectados in útero luego de 2 semanas de su nacimiento. La presencia de IgM
en suero o sangre de cordón umbilical de neonatos es un fuerte indicio de infección
congénita debido a que la IgM no atraviesa la placenta.

Los Ac IgG (3):

Pueden ser demostrables entre los 15 a 20 días después de la infección, por lo que su
presencia será indicio de contacto previo 2 a 3 semanas antes. Siempre se detectan
cuando hay rash en el paciente.

Los anticuerpos Ig G anti-rubeola son detectables 30 a 50 días después de la vacunación.

Se pueden emplear para indicar infección congénita si se determinan y persisten por más
de 61 a 71 meses con valores mayores o iguales a los del momento del nacimiento. Si
disminuyen después del nacimiento indican que los anticuerpos han sido transferidos
desde la madre.
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Diagnóstico:

Empleo de las pruebas serológicas:

El diagnóstico de rubéola es principalmente serológico

Es importante emplear las pruebas serológicas para determinar el estado inmune de las
mujeres embarazadas o en edad reproductiva y/o en individuos que estén en contacto con
embarazadas; y para el diagnóstico de rubéola en los recién nacidos.

Una determinación y resultado positivo de Ac totales o Ac IgG clasificará al paciente como

inmune.

En pacientes con síntomas compatibles, resultados positivos para IgG más IgM indican
una infección primaria.

La presencia de IgM en sangre fetal indica la infección fetal (3).

Para diagnóstico de gestantes es necesaria la información no sólo de los resultados

serológicos sino también de la fecha del posible contacto y duración del mismo, presencia
de signos clínicos, historia de vacunación y los resultados de determinaciones previas.

Técnicas:

1. RUBEÓLA- ELISA SEMICUANTITATIVO (VEDALAB)

Técnica: Detección Semicuantitativa de IgM para Rubéola.

Esta técnica de detección es un ELISA indirecto que remueve los Ac IgG e IgM del factor
reumatoide por un tratamiento previo de la muestra.

Principio:
Los pozos de las microplacas están recubiertos de Ag de rubéola obtenido por lisado
celular, si la muestra presenta anticuerpos Ig M específicos para rubéola estos
reconocerán el Ag y posteriormente un conjugado (anti-Ac IgM humano marcado con
peróxidasa de rábano-HRP) se unirá a la porción Fc de la Ig M el cual será detectado por
la adición de sustrato (tetrametil bencidina- TMB + urea-H2O2) hidrolizando el sustrato y
formando un compuesto coloreado de azul, el desarrollo de color se detendrá por la
adición de HCl 1N formándose un color amarillo, cuya intensidad será proporcional a la
cantidad de Ig M presente en la muestra y se leerá a 450nm en el lector de ELISA.

2. RUBEÓLA-ELISA SEMICUANTITATIVO (Diagnostic System Laboratories)

Técnica: Detección Cualitativo de Ig M para Rubeóla.

Principio:
Los pozos de las microplacas están recubiertos de Ac monoclonales anti-IgM, si la
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muestra presenta anticuerpos Ig M para rubéola, estos se unirán al Ac; posteriormente un

conjugado (antígeno –virus inactivado de Rubéola- y Ac monoclonal marcado con
peróxidasa de rábano-HRP) es agregado y se unirá a los IgM capturados de la muestra.
El complejo será detectado por la adición de sustrato (tetrametil bencidina- TMB + H2O2)
hidrolizando el sustrato y formando un compuesto coloreado, el desarrollo de color se
detendrá por la adición de H2SO4 0,3M formándose un color amarillo, cuya intensidad
será proporcional a la cantidad de Ig M presente en la muestra y se leerá a 450nm en el
lector de ELISA.

3.2 SARAMPION

Agente causal:
El virus del sarampión corresponde a un virus envuelto con cápside filamentosa y genoma
de RNA de cadena sencilla lineal de polaridad negativa. Se clasifica en el Género:
Morbillivirus, Subfamilia: Paramyxovirinae, Familia: Paramyxoviridae, orden
Mononegavirales (4, 5).

El virus contiene proteínas importantes como: Proteína M (de matriz), H (hemaglutinina) y

F (fusión); el virus se une al receptor: CD46 (4, 5).

Patogenia:
El virus ingresa por las vías aéreas y se replica en el epitelio mucoso de la nasofaringe,
ocurriendo una viremia primaria que permite llevar el virus al sistema reticulo endotelial
(SER), linfocitos T, linfocitos B, monocitos y PMN. En el SER el virus se multiplica
ocurriendo luego una viremia secundaria, 5 a 7 días despues de la infección. Con la
viremia secundaria el virus alcanza piel, conjuntiva, vías respiratorias, bazo, timo, pulmón,
hígado y riñón. La viremia secundaria dura más o menos 1 semana, es decir alcanza su
pico máximo entre el día 11 y 14 post infección para luego disminuir progresiva y
rapidamente. Raras veces ocurre enfermedad del sistema nervioso central como
encefalitis post- infección aguda o panencefalitis esclerosante (6, 7).

Los síntomas clínicos típicos del sarampión hacen referencia a:

Periodo podrómico con fiebre, coriza, conjuntivitis, posteriormente en las mucosas de la
boca aparecen manchas puntiformes de color blanco grisáceo rodeadas por eritema,
denominadas manchas de koplik, seguidamente un exantema que se distribuye desde la
cabeza hacia el tronco y las extremidades. La fiebre y los síntomas sistémicos graves
disminuyen de manera gradual mientras la erupción progresa hacia las extremidades. Es
también frecuente la linfadenopatía con afección en particular notable de los ganglios
cervicales (6).

Diagnostico
El sarampión típico puede diagnosticarse a menudo con base a los datos clínicos. El
laboratorio se emplea como medio de confirmación.

El aislamiento del virus a partir de la bucofaringe y la orina es productivo durante los

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primeros 5 días de la enfermedad, su crecimiento en los cultivos celulares produce células

gigantes multinucleadas con inclusiones acidófilas en el núcleo y en el citoplasma (6).

Puede realizarse un diagnóstico rápido identificando Ags virales en el sedimento urinario o

en células faringeas mediante inmunofluorescencia.

Los anticuerpos de tipo inmunoglobulina de clase M (IgM) e IgG se producen durante la

respuesta inmunitaria primaria y se pueden detectar en el suero pocos días después de la
aparición del exantema. Usando técnicas de ELISA para detección de IgM anti-sarampión,
90 % de casos de sarampión son positivos a los 3 días de iniciado el exantema. Las
concentraciones de anticuerpos IgM alcanzan su punto máximo después de 7 a 10 días y
luego disminuyen rápidamente y rara vez son detectables después de 6 a 8 semanas. Las
concentraciones de anticuerpos IgG alcanzan su punto máximo hacia la 4ta semana y
persisten mucho tiempo después de la infección.

Técnica:

SARAMPIÓN -ELISA CUALITATIVO (Vircell)

Técnica: Detección Cualitativo de Ig M o Ig G para Sarampión.

Principio:
Los pozos de las microplacas están recubiertos de Ag del virus del Sarampión del la cepa
Edmoston, si la muestra presenta anticuerpos (Ig M o Ig G para el sarampión) estos
reconocerán el Ag y posteriormente un conjugado (anti-Ac IgM o Ig G humano marcado
con peróxidasa de rábano) se unirá a la porción Fc de la Ig M o Ig G. Este complejo será
detectado por la adición de sustrato (tetrametil bencidina- TMB) formando un compuesto
coloreado de azul, el desarrollo de color se detendrá por la adición de ácido sulfúrico 0,5M
formándose un color amarillo. Leyéndose posteriormente a 450nm en el lector de ELISA.

3.2 DIAGNOSTICO DIFERENCIAL

Además de Sarampión y Rubeola hay otras enfermedades que presentan síntomas
inespecíficos, fiebre y exantema, por esta razón es importante para el clínico hacer un
diagnóstico diferencial con entidades similares como exantema súbito (roséola), dengue,
varicela en su etapa inicial, escarlatina, eritema infeccioso, infecciones por enterovirus o
adenovirus, síndrome de choque tóxico, reacciones de hipersensibilidad, entre las más
frecuentes.

En la siguiente tabla se comparan las características clínicas y epidemiológicas del

sarampión, la rubéola, el dengue, el eritema infeccioso y la roséola (8):

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Enfermedad Sarampión Rubéola Dengue Eritema Roseóla

Infeccioso (Exantema
súbito)
Agente Sarampión virus Rubéola virus Dengue virus Parvovirus Herpesvirus
Etiológico (serotipos 1 al 4) humano B19 humano 6 (HHV
6)
Periodo de 7-21 12-23 3-14 4-14 5-15
Incubación
(días)
Fiebre Sí Sí Sí Sí Sí
Exantema Sí Sí Sí Sí Sí
Características Maculopapular Maculopapular Maculopapular Maculopapular Maculopapular
Tórax y
Distribución
Cefalocaudal Cefalocaudal Centrífugo Cefalocaudal Abdomen.
Duración 4 a 7 días 4 a 7 días 3 a 5 días 5 a 10 días Algunas horas o
días.
Conjuntivitis Sí No Sí No No
Tos Sí No No No No
Coriza Sí No No Sí No
Adenopatía No Sí Sí No Sí
Retroauricular
Prueba Detección de Detección de Detección de Detección de Detección de
Serológica para Anticuerpos Anticuerpos Anticuerpos Anticuerpos Anticuerpos
detectar específicos tipo específicos específicos tipo Ig específicos específicos tipo
infección Aguda Ig M tipo Ig M M tipo Ig M Ig M
Consecuencias
de la infección
durante el
embarazo:
Aborto Sí. Sí. No. Sí. No.

Defectos
Congénitos No. Sí No. No. No.
Vacunación Sí. Sí. No. No. No.
como medida
preventiva

4. Materiales, Equipos e Insumos

 Espectofotómetro para placas de ELISA.

 Equipo incubador de placas de ELISA.
 Micropipetas automáticas de 5-50 microlitros.
 Micropipetas automáticas de 100-1000 microlitros.
 Agua destilada farmacéutica x 500mL.
 Papel absorbente.
 Tubos para realizar diluciones.
 Centrifuga (para separación de suero del paciente)
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 Material para toma de muestra: guantes, algodón, alcohol, torniquete, jeringa y tubos
sin anticoagulante
 Gradillas.
 Muestras de suero de los pacientes.

5. Reactivos

 Kit de ELISA para Rubeola Ig M.

 Kit de ELISA para Sarampión Ig G e Ig M.
 ELISA Sorbente de Ig G humana.

6. Procedimiento
El establecido en cada inserto.

7. Nivel de Riesgo
Nivel 2.

8. Bibliografía

1. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/00.073.0.02.001.htm. 2008.
2. Restrepo A., Robledo J., Bedoya V., Restrepo M., Botero D., Leiderman e., Betancur
J., Gómez C., Vélez L. Fundamentos de Medicina. Enfermedades Infecciosas. 5ta
edición. CIB. 1996.
3. http://coli.usal.es/web/educativo/biblioteca/bibelectro.alu/documentos/protocolos2/serol
oembar/cap3.pdf. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE LA rubéola. Protocolos de
Diagnóstico Serológico Clínico - Núm. 3. Coordinación Dr. Juan J. Picazo y Dr. Antonio
Fuertes Ortiz de Urbina. 2004.
4. Campoux J., Neidehard T., Drew W. L., Plorde J. Sherris: Microbiología Médica, una
introducción a las enfermedades Infecciosas. Ryan y Ray Editores. Editorial Mc Graw
Hill. 4ta edición. México. 2005.
5. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/01.048.1.02.001.htm. 2008.
6. Fenner Frank, White David; Medical Virology. Academic Press inc., fourth edition,
1990.
7. Manual para el diagnóstico de laboratorio de la infección por los virus del sarampión y
de la rubéola. Segunda Edición. OMS.2006.
8. Eliminación del Sarampión, Guía Practica. Publicación Científica y Técnica 605.
Segunda Edición. OPS. Washington, D.C. 2007.

9. Anexos

9.1 Insertos: Measles ELISA Ig G/ Ig M vircell, ELISA sorbente vircell, certificados de

análisis para measles ELISA Ig G/Ig M, Rubella IgM ELISA Diagnostic Systems
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Laboratories, reporte de control de calidad DSL.

9.2 Cuestionario
 Realice un dibujo del virus del sarampión y del virus de la rubeóla indicando sus partes
estructurales.
 Realice un esquema de la patogenia del sarampión y de otro para rubeóla.
 Realice la gráfica de la respuesta inmune a cada una de las enfermedades. Tenga en
cuenta el tipo de infección además del tipo de anticuerpo.
 Realice un diagrama de flujo para el diagnostico de cada enfermedad.
 Desde el punto de vista técnico enumere y nombre los tipos de ELISA que pueden
encontrase.
 En una ELISA encontramos diferentes pares de complejos enzima-sustrato aplicables
al proceso, enumere tres diferentes combinaciones que pueden encontrarse en una
prueba diagnóstica de ELISA.
 ¿Qué es el valor de corte o cut off o calibrador en una técnica de ELISA? ¿Para qué
sirve?
 En su diaria labor como Bacteriólogo usted procesa muestras por una técnica de
ELISA para IgM e IgG de sarampión. se obtienen los siguientes resultados:
Sarampión Ig G Sarampión Ig M
Blanco 0.043 Blanco 0.065
Control Positivo 2.118 Control Positivo 2.308
Control Negativo 0.104 Control Negativo 0.047
Calibrador 1 IgG 1.345 Calibrador 1 IgM 1.578
Calibrador 1 IgG 1.467 Calibrador 1 IgM 1.407
Muestra 1 1.867 Muestra 1 0.304
Con los datos anteriores realice los cálculos, explique el proceso de validación, informe
los resultados de los pacientes e interprete dichos resultados.

 En su labor diaria como Bacteriólogo usted procesa muestras por una técnica de
ELISA para Ig M de rubeola por el kit DSL obteniendo los siguientes resultados:

Rubeola Ig M
Blanco 0.042
Control Positivo 2.625
Control Negativo 0.103
Calibrador 0.602
Muestra 1 0.127
Con los datos anteriores realice los cálculos, explique el proceso de validación teniendo
en cuenta todos los parámetros del inserto, informe los resultados de los pacientes e
interprete dichos resultados.

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