Avances recientes en pruebas de diagnóstico para infecciones virales

Abstract
Las enfermedades infecciosas virales representan una parte importante de las preocupaciones mundiales de
salud pública con miles de muertes al año. Desde pandemias graves e infecciones altamente contagiosas hasta
episodios comunes de influenza, el pronóstico clínico a menudo se basa en la detección temprana del agente
infeccioso. Por lo tanto, se necesita una identificación efectiva de los patógenos virales para ayudar a prevenir la
transmisión, establecer una terapia apropiada, monitorear la respuesta al tratamiento y conducir a un control y
manejo eficiente de la enfermedad. El objetivo de esta revisión es describir algunos de los avances tecnológicos
recientes en la identificación viral, incluida la reacción en cadena de la polimerasa, la espectrometría de masas y
la secuenciación de próxima generación, y cómo se aplican en el diagnóstico y el tratamiento de las infecciones
virales. Estas poderosas herramientas combinan rapidez y eficiencia en la detección de patógenos virales y han
revolucionado el campo del diagnóstico clínico. Sin embargo, una serie de inconvenientes, como el alto costo,
han limitado su uso en muchos laboratorios, particularmente en entornos con recursos limitados. Por el
contrario, el advenimiento de la tecnología microfluídica ha atraído un creciente interés de los grupos de
investigación biomédica, y podría representar una alternativa desafiante para diagnosticar infecciones virales a
un costo menor.

Introducción
Las pandemias mundiales son serias amenazas para la vida humana. Si bien los virus bien establecidos y
caracterizados como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y la hepatitis todavía están matando a
millones de personas, los virus emergentes también son problemáticos y han causado varios brotes graves en los
últimos años. Por ejemplo, el Síndrome Respiratorio Agudo Severo-Coronavirus (SARS-CoV) en 2002–2003,
Influenza porcina A (H1N1) en 2009 y el brote de fiebre hemorrágica del Ébola en 2014 que ha causado miles
de muertes en África occidental.

Las tasas de morbilidad y mortalidad son significativamente altas. Treinta y cinco millones de personas se
infectaron con el VIH en 2013, y entre 350 y 400 millones de portadores crónicos del virus de la hepatitis
B. Según el informe de 2014 de la Organización Mundial de la Salud (OMS) ( OMS, 2014 ); Más de 780 000
personas mueren cada año de hepatitis B y hasta 500 000 mueren de enfermedades hepáticas relacionadas con la
hepatitis C. La alta prevalencia de estas enfermedades ha aumentado los esfuerzos para mejorar el diagnóstico
clínico.

La prevención efectiva y el manejo clínico de las enfermedades infecciosas están íntimamente relacionados con
la detección temprana y precisa de patógenos, no solo al detectar las partículas infecciosas en el organismo, sino
también al dilucidar los aspectos que confieren resistencia a la terapia y los perfiles de escape inmunitario,
incluidas las mutaciones y la disparidad de genotipos. .

Por lo tanto, el diagnóstico rápido beneficia a los pacientes al permitir una terapia oportuna para prevenir
complicaciones; y beneficia la salud pública al recopilar datos para estudios epidemiológicos, para prevenir
brotes y propagación de enfermedades. En ese contexto, la OMS ha establecido muchos programas de
vigilancia para el control de enfermedades, como la estrategia global para el control y la evaluación de la
resistencia a los medicamentos contra el VIH, el Sistema Global de Vigilancia y Respuesta a la Influenza para
el control y monitoreo de la Influenza y la Política Global sobre Hepatitis Viral.

A menor escala, los laboratorios clínicos son un punto crucial para el diagnóstico de enfermedades virales
mediante el uso de una gama de herramientas y mecanismos que varían en costo y eficacia.
En un mundo de tecnología en rápido crecimiento, la industria está entregando continuamente instrumentos
actualizados, pero muchos factores limitan su implementación en entornos de atención médica con bajos
ingresos, lo que desafortunadamente retrasa el beneficio global. Esta revisión describirá algunos de estos
métodos de prueba avanzados, cómo sus características específicas han revolucionado el campo del diagnóstico
de laboratorio y qué se puede hacer para superar sus limitaciones.

Principios generales de buenas pruebas de laboratorio.

La interpretación rigurosa y precisa de los resultados de laboratorio garantiza el manejo clínico efectivo de una
enfermedad y el control de su propagación ( Lemon et al ., 2007 ). Sin embargo, un diagnóstico erróneo podría
conducir a pérdidas financieras y humanas.

En las pruebas clínicas de enfermedades infecciosas, es crucial determinar con precisión la presencia o ausencia
del agente infeccioso o sus anticuerpos correspondientes, para probar la exposición actual o pasada. Por lo
tanto, la capacidad de decir con precisión si la persona está infectada o no, y determinar el curso de la infección
tiene un impacto positivo en la estrategia terapéutica.

La utilidad y la fiabilidad de los resultados de laboratorio dependen del rendimiento y

los parámetros operativos de la prueba prevista. Los parámetros de rendimiento se relacionan directamente con
los resultados al estimar su precisión, precisión, sensibilidad y especificidad ( Lalkhen y McCluskey, 2008 ). Si
bien estos son valores estadísticos (porcentajes), tienen explicaciones diferentes e implican una comparación
con el método de referencia o 'estándar de oro' para la prueba deseada ( Guzman et al ., 2010 ).
La precisión describe qué tan cerca están los resultados obtenidos de los obtenidos con el método de referencia
y se expresa como un porcentaje de los resultados correctos. La precisión se refiere a la reproducción confiable
de una prueba en la misma muestra y a la obtención de resultados similares.

Estos dos parámetros deben ser monitoreados regularmente usando el control de calidad local (QC) y los
procedimientos de aseguramiento de la calidad (QA) para mantener la confiabilidad de la prueba. En
condiciones perfectas, una prueba ideal tendría 100% de precisión y 100% de precisión; sin embargo, los
factores externos y las diferencias metodológicas pueden causar pequeñas variaciones.

La sensibilidad (también llamada tasa positiva verdadera) es el porcentaje de pacientes con infección

confirmada (por el método del "estándar de oro") que tendrán resultados positivos. Generalmente se mide por el
límite inferior de detección del analito que produce un resultado positivo.
La especificidad (también llamada tasa negativa verdadera) es una evaluación cualitativa, que muestra la
capacidad de la prueba para distinguir el analito objetivo del analito no objetivo. Esta medida se expresa como
el porcentaje de pacientes libres de infección que tendrán un resultado negativo. Cuanto más cerca estén los
valores de la referencia, mayor será la sensibilidad y especificidad de la prueba.

Por el contrario, los parámetros operativos se refieren a la simplicidad y facilidad en la realización de la prueba,
como el tiempo de respuesta (TAT). TAT es un indicador clave de rendimiento definido como el intervalo de
tiempo entre el registro de la muestra y el informe de resultados. La preparación de la muestra y cualquier otro
paso preanalítico se encuentran dentro de este intervalo. La finalización del ensayo en menos de 60 minutos es
ideal, por lo que los fabricantes apuntan a construir instrumentos de diagnóstico que permitan una TAT más
corta, lo que es particularmente beneficioso para los entornos de punto de atención ( Hawkins, 2007 ).

Los criterios ASEGURADA OMS ha establecido ( A ffordable, S SENSIBLES, S ESPECÍFICOS, T Ser-

amigable, R APID y robusto, E -quipment libre y D eliverable a usuarios finales) ( Wu y Zaman, 2012 ) para el
diagnóstico de recursos limitados entornos de punto de atención ( Blacksell, 2012 ). El objetivo es proporcionar
un mejor manejo de la enfermedad, como la entrega inmediata de los resultados y el registro rápido del estado
de la enfermedad, para mejorar la toma de decisiones clínicas.
Métodos de laboratorio tradicionales para el diagnóstico de
infecciones virales.
Durante mucho tiempo, los laboratorios clínicos se han basado en una amplia gama de técnicas para
diagnosticar infecciones virales.

En los países desarrollados, el microscopio electrónico ( EM ) se ha considerado durante mucho tiempo una
herramienta eficiente para la detección directa de virus mediante la visualización y el recuento de partículas
virales en fluidos corporales, heces o muestras histopatológicas. La identificación se basa en las características
morfológicas específicas de cada familia de virus y requiere una cierta cantidad de partículas virales (hasta 106
partículas / ml). Sin embargo, la preparación de muestras que debe realizarse de antemano ( Goldsmith y Miller,
2009) puede reducir la concentración del virus, lo que dificulta el análisis. Además, la microscopía electrónica
requiere importantes habilidades técnicas y experiencia; La presencia de estructuras inusuales o similares, como
los desechos celulares y los orgánulos, puede confundir al microscopista electrónico con sus formas similares a
virus ( Fauquet et al ., 2005 ).

La combinación de EM con métodos basados en cultivos ha demostrado una gran contribución en el diagnóstico
de infecciones virales, junto con pruebas serológicas para la detección de anticuerpos dirigidos contra el
virus. Estos métodos convencionales siguen siendo prácticas fundamentales en muchos laboratorios
hospitalarios.

El cultivo celular es uno de los métodos más populares para aislar virus usando líneas celulares. Estos últimos
varían según los virus objetivo (por ejemplo, las células renales de mono rhesus se usan para aislar el virus de la
Influenza A).
La evidencia del crecimiento del virus se ve a través del efecto citopático (ECP) que exhibe características
específicas y alteraciones de las células ( Robbins, Enders y Weller, 1950 ). La identificación definitiva del
virus se realiza utilizando tinción de inmunofluorescencia (IF). Sin embargo, el aislamiento del virus usando
cultivo celular no es ideal en el caso de virus que no son susceptibles de crecimiento en líneas celulares
(norovirus, virus de la hepatitis) o que producen CPE ( Papafragkou et al ., 2013 ).
Además, pequeños volúmenes de la muestra pueden no permitir la inoculación de muchos tipos de células y,
por lo tanto, comprometer los resultados. Por ejemplo, la inoculación estándar de un medio de cultivo celular
con una muestra de líquido cefalorraquídeo (LCR) requiere un mínimo de 0.2 ml; sin embargo, se necesita
mucho más para inocular una combinación de diferentes tipos de células, lo que podría ser invasivo para el
paciente ( McIntyre, 2007 , Hematiana et al ., 2016 ).

El tiempo requerido para aislar virus mediante cultivo celular es muy largo (semanas), lo que limita la utilidad
de esta técnica cuando se necesita un diagnóstico rápido. El cultivo celular necesita personal altamente
calificado y experimentado para una interpretación precisa del CPE y las instalaciones adecuadas para el
manejo de líneas celulares de mamíferos o virus altamente patógenos.

En la técnica del vial de concha, uno de los métodos de cultivo rápido , las células inoculadas se someten a
centrifugación, incubación y luego a tinción IF con anticuerpos monoclonales, específicos del rango de virus
sospechosos de causar la infección, como virus respiratorios, virus del herpes simple o Virus de la varicela
zoster. Los antígenos inducidos por el virus se detectan de 2 a 4 días después.

El cultivo rápido tiene beneficios limitados, ya que no se dirige a una amplia gama de virus y tiene baja
sensibilidad.

La prueba de fijación del complemento ( CFT ) es uno de los métodos más antiguos en la historia de la virología
clínica ( Casals y Palacios, 1941 ). El complemento reacciona solo con el complejo antígeno-anticuerpo de una
manera no específica. Por lo tanto, en presencia del complejo, el complemento no es libre de interactuar con los
glóbulos rojos de las ovejas (RBC) sensibilizados que se utilizan como indicador y que permanecen sin
analizar. Se dice que la prueba es 'positiva'.

CFT es supuestamente fácil de realizar, conveniente y requiere material económico. Sin embargo, es laborioso y
carece de sensibilidad. La estandarización interna a través de la titulación de los reactivos y la preparación de
controles es crucial para obtener pruebas efectivas.

La prueba de inhibición de la hemaglutinación se usa generalmente para detectar subtipos de virus de la

influenza y parainfluenza de arbovirus y proporciona una cuantificación relativa de las partículas del virus. El
principio se basa en la capacidad de la hemaglutinina (HA); una proteína viral presente en la envoltura, para
unirse a los eritrocitos (RBC) y formar un patrón reticular denominado 'aglutinación'. En el ensayo, se agregan
diluciones en serie de la muestra de suero a una cantidad fija de HA viral y glóbulos rojos aglutinables. Si los
anticuerpos contra la influenza están presentes en el suero, se evita el proceso de aglutinación. La tasa de
dilución correspondiente a la que se observa y considera la hemaglutinación completa.
Las variantes del ensayo de aglutinación se utilizan para el diagnóstico de una gama más amplia de
enfermedades virales distintas de la gripe ( Grandien et al ., 1987 ; Sandeep et al ., 2002 ). Sin embargo, la
prueba lleva mucho tiempo y es exigente, particularmente en términos de control de calidad.

Esta lista de técnicas convencionales no es exhaustiva, y solo se citaron las más utilizadas. Las siguientes
secciones discutirán los desarrollos más recientes en el campo, que reemplazaron las prácticas convencionales y
permitieron la detección (prueba cualitativa), la vigilancia (prueba cuantitativa) y la confirmación del
diagnóstico.

Métodos recientes en el diagnóstico de infecciones virales.

Como se indicó anteriormente, esta revisión discutirá solo algunos de los principales desarrollos en tecnologías
de diagnóstico que han dado paso a la nueva era de la virología clínica, y expondrá sus principales ventajas y
limitaciones que se resumirán en la Tabla 1 .

Tabla 1.
Resumen de los principales métodos de diagnóstico viral.
CLIA, inmunoensayo quimioluminiscente; dNTP, desoxirribonucleótido trifosfato; EIA, inmunoensayo
enzimático; ESI, ionización por electropulverización; FPIA, inmunoensayo de polarización de
fluorescencia; MALDI-TOF, tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistido por matriz; MEIA,
inmunoensayo enzimático de micropartículas; MS, espectrometría de masas; NGS, secuenciación de próxima
generación; NAAT, prueba de amplificación de ácido nucleico; NASBA, amplificación basada en secuencia de
ácido nucleico; qPCR, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa; RIA, radioinmunoensayo; RT-PCR,
reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real; TMA, amplificación mediada por transcripción.

Pruebas basadas en inmunoensayo

Los anticuerpos producidos inmediatamente después de la invasión de una sustancia extraña pueden informar
sobre infección primaria, reinfección o un estado de reactivación. Por lo tanto, medir el nivel de
inmunoglobulinas (Ig) es un enfoque ampliamente considerado para el diagnóstico de infecciones virales.

Los métodos automáticos basados en inmunoensayos se encuentran entre los más utilizados para las pruebas y
son efectivos debido a la alta especificidad y afinidad de unión entre el antígeno y el anticuerpo. Por lo tanto, el
principio de la prueba se basa en la formación de un inmunocomplejo entre el anticuerpo presente en la muestra
del paciente y el antígeno sintético presente en el reactivo o viceversa, para generar una señal medible.

Los inmunoensayos usan etiquetas conjugadas con anticuerpos sintéticos o antígenos que están unidos a una
fase sólida, y se usan para capturar los antígenos o anticuerpos correspondientes presentes en las muestras de
suero. Estas etiquetas pueden ser isótopos radiactivos, enzimas que causan cambios en el color o sustancias
generadoras de luz. En consecuencia, este principio ha generado varias metodologías para las pruebas.

El radioinmunoensayo ( RIA ) es probablemente el método de iniciación (1960); utiliza radioisótopos (como el

yodo 125) para marcar el antígeno o el anticuerpo. La cantidad de sustancia a analizar está determinada por la
 cantidad de radiactividad generada. RIA es un método altamente sensible, pero el principal inconveniente es la
manipulación y eliminación de sustancias radiactivas peligrosas.
Sin embargo, la alternativa de marcado enzimático que utiliza fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante
como marcadores es la más utilizada y se consideró durante mucho tiempo un método de referencia ( Engvall y
Perlmann, 1972 ; Voller, Bidwell y Bartlett, 1976 ). Estas enzimas inducen la emisión de señales o cambios en
el color, respectivamente, y permiten medir la cantidad de analito de interés. Este inmunoensayo ligado a
enzimas ( EIA ) tiene numerosas variantes, incluido ELISA, y difieren en la enzima utilizada y el principio de
detección de señal.

Las principales variantes de EIA son las siguientes:

 Inmunoensayo de polarización de fluorescencia ( FPIA ): utiliza etiqueta fluorescente y luz

polarizada.
 Micro-partícula de enzima inmunoensayo ( MEIA ) ( Tassopoulos et al ., 1997 ):
ampliamente utilizado y se basa en la enzima fosfatasa alcalina y un sustrato fluorescente
correspondiente.
 Inmunoensayo quimioluminiscente ( CLIA ), que utiliza etiquetas quimioluminiscentes o
emisoras de luz. Empresas como ROCHE o Abbott están explotando este método, y los laboratorios
de alto volumen están reemplazando gradualmente la tecnología MEIA con CLIA por su
rendimiento de alta velocidad y facilidad de medición.
En la práctica clínica, los estudios serológicos de la hepatitis B se basan en el inmunoensayo como herramienta
clave para la detección de marcadores del virus de la hepatitis B (VHB). Las versiones actualizadas de los
métodos de inmunoensayo pueden detectar los niveles más bajos del marcador principal HBsAg, indetectables
por los métodos convencionales, particularmente en muestras de suero de pacientes asintomáticos. El último
estándar de detección detecta tan poco como 0.05 UI / ml, el equivalente de 0.2 ng / ml de antígeno viral
( Deguchi et al ., 2004 ) y una alta sensibilidad (> 99%) se observó en diferentes etapas de la enfermedad o
incluso en pacientes mostrando seroclearance.
Un CLIA recientemente desarrollado permitió la desnaturalización de la partícula de VHB y utilizó anticuerpos
monoclonales contra epítopos estructurales internos y externos para obtener una mayor sensibilidad de ensayo
( Shinkai et al ., 2013 ) e información suficiente sobre los genotipos de VHB.

Las técnicas de inmunoensayo automatizado para la detección de virus superan algunas de las limitaciones
encontradas con las pruebas convencionales, particularmente el retraso en la respuesta.

Limitaciones

A pesar de la popularidad del inmunoensayo en las pruebas clínicas, pueden producirse resultados erróneos por
muchas razones, que confieren inconsistencias a las pruebas.

 Los inmunoensayos son más propensos a las interferencias que cualquier otro ensayo, lo que conduce a
resultados falsos positivos o falsos negativos. En la mayoría de los casos, las interferencias se deben a la
presencia de agentes con similitudes estructurales con los reactivos ( Miller, 2004 ), y fluctúan de acuerdo con
la concentración de la sustancia interferente y el analito. Los anticuerpos endógenos (autoanticuerpos,
heteroanticuerpos o anticuerpos humanos anti-animales) son comúnmente los principales culpables de estas
interferencias ( Emerson y Lai, 2013 ). Su unión para capturar anticuerpos y anticuerpos de detección en
ausencia de antígeno (analito) conduce principalmente a resultados falsos positivos ( Berth y Willaert, 2016 ).
 El control de calidad preciso garantiza resultados confiables y supone que el ensayo se realiza bien. Por
lo tanto, las malas medidas de CC conducen a una baja precisión y precisión. En inmunoensayos, el control de
calidad se garantiza mediante la calibración y el control regulares de los reactivos, utilizando soluciones
estandarizadas entregadas por los fabricantes.
 El alto costo de los reactivos y el equipo es otro inconveniente en los inmunoensayos, particularmente
para entornos de recursos limitados, considerando que los métodos más precisos y sensibles están
automatizados.

Ensayos basados en amplificación

Desarrollado por Mullis y Faloona (1987) , la amplificación de ácido nucleico por reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) ha revolucionado el campo del diagnóstico molecular. El ensayo de PCR básico se basa en la
extracción y purificación del ácido nucleico, luego en la amplificación exponencial de la secuencia objetivo,
utilizando una enzima polimerasa termoestable y cebadores específicos. Los amplicones resultantes se
identifican luego usando un sistema de detección basado en fluorescencia, y el resultado se informa en unidades
internacionales UI / ml.

Poco después de su invención, las modificaciones en PCR se probaron y patentaron, con el objetivo de mejorar
las capacidades de ensayo. El término pruebas de amplificación de ácido nucleico (NAAT) se aplicó a este
rango de nuevas variantes.

Los NAAT son muy populares en el diagnóstico y manejo de infecciones virales (VHB, VHC, VIH, virus de la
influenza, ...) porque permiten la determinación de la carga viral. En otros términos, la cuantificación del ácido
nucleico viral amplificando la secuencia objetivo miles de veces. En la mayoría de los casos, ahora se
consideran un método de referencia o "estándar de oro" para prácticas de diagnóstico, como la detección de
sangre donada para detectar virus transmitidos por transfusión (CMV, VIH, VHC, ...) ( Jackson, 1990 ).

Las variantes más utilizadas de amplificación convencional son la PCR en tiempo real (PCR cuantitativa) y la
transcripción inversa-PCR (RT-PCR). Ambos se están convirtiendo en puntos de referencia en la evaluación de
la carga viral, y aunque el primer método cuantifica el ADN a lo largo de las reacciones en tiempo real
( Ntziora et al ., 2013 ); el segundo realiza RT del ARNm (ARN mensajero) y amplifica el ADNc resultante
(ADN complementario). También cuantifica el ARN. La combinación de ambas técnicas aumenta la
sensibilidad en la detección de virus, particularmente virus de influenza. La OMS aprobó recientemente un
ensayo de PCR de transcriptasa inversa recientemente desarrollado después de la primera muerte por infección
por MERS-CoV (Síndrome Respiratorio del Medio Oriente-Coronavirus) reportada en 2012 ( Abd El Wahed et
al.., 2013 ).
Otras pruebas basadas en la amplificación, como la amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico
(NASBA) y la amplificación mediada por transcripción (TMA), son adecuadas para la detección de virus de
ARN mediante la amplificación del ARNm en lugar de la conversión a ADNc ( Mercier-Delarue et al .,
2014 , Wu et al ., 2014 ).
Entre las últimas mejoras en los sistemas de PCR, los pasos de extracción, amplificación y detección se han
combinado dentro de una unidad. Como ejemplo, la tecnología BioFire Film Array aplica dos amplificaciones
secuenciales y puede detectar un panel de virus respiratorios con alta sensibilidad en 1 hy dentro de un solo
instrumento ( Pierce et al ., 2012 ).
Por el contrario, la tecnología microfluídica también ha beneficiado a los sistemas basados en PCR; y permitió
una mayor disminución en el tiempo de detección (15 min), con alta sensibilidad y rentabilidad. En la epidemia
de 2009, la detección del virus de la Influenza A H1N1 se basó en gran medida en una PCR en tiempo real de
tipo chip en lugar del principio basado en tubos. El formato portátil de tales sistemas es muy conveniente
durante epidemias y brotes ( Song et al ., 2012 ).
Los NAAT multiplexados se diseñaron para detectar múltiples virus o subtipos en una sola ejecución. Sus
plataformas de detección pueden comprender hasta 20 virus utilizando paneles diversificados ( Mahony et al .,
2007 ), por ejemplo, detección simultánea de infecciones por VHA, VHB y VHC, así como coinfecciones
( Park et al ., 2012 ).
En la hepatitis B, la PCR se considera el método estándar de oro para evaluar el nivel de ADN del VHB con alta
precisión, y los ensayos están estandarizados de acuerdo con el Estándar Internacional de la OMS para el virus
de la hepatitis B (NIBSC), como la prueba de referencia Roche Cobas TaqMan HBV. La prueba fue el primer
ensayo aprobado por la FDA, con un límite de detección de 10,2 UI / ml. El sistema combinado con Cobas
AmpliPrep tiene un proceso automatizado de extracción de muestras y detección altamente sensible para todos
los genotipos de VHB ( Pyne et al ., 2012 ).
En pacientes con VIH que toman tratamiento antirretroviral (TAR), los ensayos ultrasensibles permiten la
cuantificación de un número bajo de copias de subtipos de VIH (<50 copias / ml) y repeticiones terminales
largas en depósitos latentes y de lisados celulares que omiten el paso de extracción de ácido nucleico
( Vandergeeten et al . , 2014 ). Tales ensayos podrían ser herramientas valiosas en grandes estudios de cohortes
o situaciones de pandemia.
Limitaciones

Las limitaciones de la PCR son un parámetro importante a tener en cuenta, a pesar de la rentabilidad y la
fiabilidad en el diagnóstico de infecciones virales. El riesgo de contaminación es muy alto durante la
manipulación, especialmente durante el paso de preparación de la muestra, además, la PCR en tiempo real tiene
un tiempo de ejecución más largo (2-5 h) en comparación con otras técnicas.

En el caso de la influenza, muchos ensayos basados en PCR se diseñaron para detectar solo un subtipo
particular del virus responsable de pandemias importantes ( Hall et al ., 2009 ), y la necesidad de diseñar
cebadores específicos para el objetivo requiere el manejo por parte de operadores experimentados. , capaz de
detectar errores, particularmente que la PCR es propensa a resultados falsos positivos.

La alta tasa de mutación de algunos virus podría desencadenar la mutación dentro de las regiones de cebador de
PCR del genoma viral, lo que llevaría al virus a escapar de la detección mediante este ensayo.

Secuenciación de próxima generación

La secuenciación de próxima generación (NGS) es uno de los mayores logros de la era moderna. Más allá de la
secuenciación del genoma de organismos conocidos, permitió el descubrimiento de nuevos virus responsables
de enfermedades humanas desconocidas ( Palacios et al ., 2008 ) y el seguimiento de brotes y pandemias como
la gripe ( Baillie et al ., 2012 ) para comprender su aparición y transmisión perfiles ( Leung et al .,
2014 ; Isakov et al ., 2015 ).

El viaje comenzó en la década de 1970 con los trabajos de Sanger y Barrel, seguidos por Maxam y Gilbert,
quienes iniciaron por primera vez el principio de secuenciación de oligonucleótidos mediante polimerización
enzimática, utilizando cebadores radiomarcados. En sus protocolos experimentales, se basaron en el uso de
didesoxinucleótidos para terminar la extensión del polímero, de ahí el nombre: método de terminación de
cadena o didesoxinucleótido ( Sanger, Nicklen y Coulson, 1977 ).

Desde entonces, el principio se ha mantenido prácticamente igual, pero las mejoras y la automatización han
aumentado drásticamente la velocidad y la precisión en la entrega del volumen máximo de datos en
comparación con la secuenciación de didesoxinucleótidos ( Shedure y Ji, 2008 ). Técnicamente, NGS incluye
tres pasos principales: preparación de muestras, secuenciación y análisis de datos. Los sistemas disponibles en
el mercado difieren principalmente en sus técnicas de secuenciación o lectura. El diagnóstico clínico eficiente y
preciso de las infecciones virales con NGS apunta cada vez más a proporcionar una lectura más larga y precisa
en el menor tiempo y a un costo menor. Las plataformas bioinformáticas son componentes clave del proceso de
secuenciación. Permiten la interpretación de la secuencia de salida a través del análisis computacional
( Naccache et al.., 2014 ), y luego convertirlo en información útil sobre especies, genotipos y la aparición de
mutaciones que confieren virulencia o resistencia a los antivirales.
La pirosecuenciación es actualmente la variante de elección dentro de los sistemas NGS. Basado en la detección
de pirofosfato (PPi) después de la incorporación de un nucleótido en un proceso de polimerización de ADN,
utiliza luciferasa para catalizar los procesos de generación de luz, y luego se registra la luz recogida. Aunque
Illumina se considera la plataforma de pirosecuenciación más utilizada, 454 FLX; una compañía subsidiaria de
Roche, fue el primer analizador de alto rendimiento en el mercado y se utilizó para determinar los tipos de virus
del papiloma humano (VPH) ( Barzon et al ., 2011 ), subtipos y variantes, presentes en muestras
cervicales. Otras variantes detectan iones de hidrógeno que se liberan a lo largo de la reacción de incorporación
de nucleótidos ( Rothberg et al . 2011 ).

La generación de grandes volúmenes de datos de secuencia ha permitido la compilación de bases de datos de

nucleótidos virales y la adquisición de secuencias de novo para comprender la variabilidad genética de los virus
( Szpara, Parsons y Enquist, 2010 ). El VIH es, con mucho, el más secuenciado debido a la prioridad mundial
del SIDA como endémico grave y a la alta tasa de mutación del virus.

Hasta ahora, solo los métodos de secuenciación de genes han tenido éxito en la determinación del genotipo del
VHB complicado, a diferencia de la PCR convencional o los ensayos serológicos. Por lo tanto, la secuenciación
ha permitido un mejor manejo clínico de la infección por VHB y complicaciones relacionadas ( Margeridon-
Thermet et al ., 2009 ).
En el análisis de datos, los enfoques técnicos recientes han incluido el ajuste de las plataformas de lectura de
software para la detección simultánea de genotipos y mutantes de importancia clínica ( Germer et al ., 2013 ), y
la secuenciación parcial del gen HBV S con alta sensibilidad (98.64%), considerando esa porción como el sitio
de la mayoría de las mutaciones de resistencia a los medicamentos ( Wang et al ., 2013 ). Sin embargo, la
implementación de NGS en entornos clínicos está aumentando, particularmente para detectar patrones de
resistencia a medicamentos de baja abundancia, como en el VIH y el VHC ( Palmer et al ., 2005 ; Verbinnen et
al ., 2010) La secuenciación de nucleótidos de las regiones subgenómicas del VHC es ahora el método de
elección para el genotipado.
Limitaciones
Los requisitos principales para NGS son inicialmente el acceso a un secuenciador y habilidades considerables
en bioinformática y experiencia en análisis de datos, además de sistemas de manejo adecuados para el
almacenamiento de datos generados. Además de eso, a pesar de los resultados sobresalientes entregados por los
prototipos en los ensayos, muchos todavía están en el nivel de investigación y aún no están aprobados para su
uso en la práctica clínica habitual ( Jiangqin et al ., 2015 ).

Sin lugar a dudas, NGS es una tecnología clave en laboratorios clínicos especializados, pero su implementación
sigue siendo un desafío en muchos países, donde no solo sus entornos con recursos limitados no pueden
permitirse un analizador de secuencias, preparación de muestras y bibliotecas, sino que la gran mayoría de la
población no puede permitirse El costo de la prueba.

Espectrometría de masas
La espectrometría de masas (EM) es hoy en día un punto de referencia de la investigación cualitativa y
cuantitativa de laboratorio, particularmente en bacteriología ( Sauer y Kliem, 2010 ).

El principio de la EM se basa en convertir la muestra en partículas cargadas (iones) mediante un proceso de

ionización. Estos iones se separan de acuerdo con su relación masa-carga ( m / z ) y se analizan mediante un
detector. El resultado obtenido se compara con una base de datos de referencia (biblioteca), existente dentro del
sistema y entregada como un espectro interpretativo.
En los laboratorios clínicos, la ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI) y la
electropulverización (ES) son los métodos de ionización más utilizados porque permiten el procesamiento de
cantidades considerables de analito ( Emonet et al ., 2010 ). Estos enfoques han sido ampliamente evaluados
experimentalmente y proporcionaron excelentes resultados, ya sea utilizados solos o combinados con otros
métodos moleculares, como la PCR, para mejorar la sensibilidad. La combinación (RT-PCR / ESI-MS) fue
capaz de detectar patógenos virales generalmente no detectados mediante métodos de prueba regulares, y
proporcionó datos rápidos y detallados (tipos y subtipos) en poco tiempo ( Lévêque et al ., 2014 ).
 La detección de variaciones genómicas o mutaciones en la Influenza A usando MALDI-TOF ha sido una
herramienta clave en el manejo de brotes ( Chen et al ., 2011 ). La aplicación de MS a la investigación
estructural de biomoléculas mostró la eficiencia de MALDI-TOF-MS acoplada a nanopartículas magnéticas de
anticuerpos en la detección de virus de influenza ( Chou et al ., 2011 ; Yea et al ., 2011 ), a través de resultados
concordantes con el estándar de PCR de oro. basado en el método Esta combinación de dos potentes
mecanismos (PCR-MS) puede detectar la resistencia a los medicamentos a la terapia antiviral, así como la
presencia de múltiples virus dentro de la misma muestra y diagnosticar coinfecciones, cuando los ensayos se
multiplexan.
El creciente interés en MALDI-TOF MS en virología clínica ha llevado a avances en la investigación en el
diagnóstico de hepatitis B. El método no solo fue capaz de detectar el VHB a niveles de carga viral
relativamente bajos (100 copias de ADN de VHB / ml) ( Hong et al ., 2004 ), pero también permitió la
detección de hasta 60 variantes y genotipos de VHB a un costo inferior a $ 10 / muestra para todas las variantes
con alto rendimiento ( Luan et al ., 2009 ). El mismo método se aplicó para el genotipado y detectó con éxito
los ocho genotipos del VHB con precisión ( Ganova-Raeva et al ., 2010 ), y también los genotipos menores del
VHC que se producen a niveles muy bajos ( Kim et al ., 2005 ).

Los métodos basados en espectrometría de masas son versátiles, sensibles, rápidos y rentables, y no requieren
software de interpretación para el análisis de datos. La maquinaria automatizada requiere una preparación fácil
de la muestra y menos operadores. La capacidad de análisis puede alcanzar hasta 960 muestras / día, lo que lo
hace adecuado para el diagnóstico de rutina en laboratorios de gran volumen y estudios a gran escala. Las
pruebas también se pueden realizar de manera eficiente en muestras archivadas.

Limitaciones

La principal limitación de la EM es el alto costo, particularmente en áreas de alta pandemia, que generalmente
son las más pobres; No todos los laboratorios pueden permitirse un analizador de masas para sus actividades. El
segundo inconveniente principal está dentro de la biblioteca de referencia. La identificación está limitada solo
por datos conocidos de organismos bien identificados; por lo tanto, no se pueden detectar mutaciones raras si no
existen dentro de la plataforma de lectura, pero existe la esperanza de que las bibliotecas de bases de datos de
MS se expandan rápidamente.

Ventajas de los métodos recientes.

 Ensayos de alta sensibilidad y especificidad que se acercan al 100%.
 La posibilidad de combinar diferentes métodos en un ensayo mejora la capacidad de detección y la
precisión (PCR-MS, PCR basada en tecnología de chip microfluídico, ...).
 La automatización de los ensayos reduce el número de operadores y la carga de trabajo manual.
 Se necesitan pequeños volúmenes de muestra, por lo que los ensayos aún se pueden realizar en casos
particulares (LCR, recién nacidos, etc.)
 Algunos ensayos, como la EM, siguen siendo eficientes después de varias congelaciones y
descongelaciones de las muestras (muestras archivadas).
 TAT rápido: el tiempo mínimo requerido desde la recolección de muestras hasta el informe de
resultados es de 30 minutos, y las herramientas de microarrays pueden entregar resultados en segundos.
 Límite bajo de detección: 10–100 copias / ml por PCR.
 Reacciones multiplex: la detección de una amplia gama de patógenos en una sola ejecución ahorra
tiempo.
 Detección de patrones raros de resistencia a los medicamentos.
 NGS genera muchos datos de secuencia por ejecución y secuencias de lecturas largas.
 Bajo costo de reacción cuando se usan chips microfluídicos y se usan en configuraciones de POC.
 Menor riesgo de contaminación al procesar un solo tubo dentro de una unidad.
Las últimas tecnologías y configuraciones de recursos limitados
Los métodos descritos anteriormente han demostrado un desempeño sobresaliente en salvar miles de vidas en
países desarrollados. Sin embargo, el diagnóstico preciso sigue siendo un desafío en entornos con recursos
limitados debido a la dificultad de adquirir estos equipos y experiencia técnica. Si bien las herramientas
costosas, como los sistemas basados en PCR o los analizadores de masas, solo están disponibles en laboratorios
de referencia o en instalaciones militares, las clínicas de punto de atención o cerca de pacientes que atienden a
más del 80% de la población pobre luchan con los dispositivos de prueba disponibles. Como ejemplo, la OMS
ha establecido pautas para monitorear la eficacia de ART en pacientes infectados con VIH-1 en países en
desarrollo, al sugerir solo el recuento de células CD4 + y los ensayos basados en ELISA como alternativas a las
costosas pruebas ( OMS, 2006a ). Ultrasensible p24 (Patton et al ., 2008 ) y el ensayo ExaVir ( Kokkayil et al .,
2014 ) miden el nivel de antígeno p24 y la actividad de la transcriptasa inversa, respectivamente, para
reemplazar el monitoreo de la carga viral. Desafortunadamente, su falta de sensibilidad ha inducido el fracaso
del tratamiento y la aparición de cepas resistentes ( Vekemans, John y Colebunders, 2007 ).

La hepatitis es otra carga costosa de manejar en los países pobres, donde es difícil establecer una evaluación
precisa del perfil epidemiológico. En el caso del VHB, la mayoría de las instalaciones de POC dependen de la
detección de HBsAg únicamente mediante pruebas de diagnóstico rápido. Estos dispositivos de bajo costo no
permiten determinar el curso de la enfermedad para informar si iniciar un tratamiento antiviral o no.

Automatización, microfluídica y perspectivas de futuro.

Sin lugar a dudas, proporcionar un monitoreo epidemiológico de alto nivel de las enfermedades virales es una
ambición mundial de salud pública, y a pesar del rápido progreso en el desarrollo de métodos de diagnóstico en
los últimos años, se necesitan mejoras para un mejor costo y tamaño ( Loman et al ., 2012 ; Frey et al. ., 2014 )
y TAT ( Xu et al ., 2013 ).

Después de la fiebre hemorrágica del Ébola en 2014, el Departamento de Energía del gobierno de EE. UU. Ha
desarrollado una innovadora prueba rápida y portátil para detectar específicamente el virus del Ébola en
cuestión de segundos. La prueba tiene como objetivo apuntar a otros ARN y virus exóticos como el dengue y el
Nilo Occidental para el manejo efectivo de los brotes virales. Otros ejemplos incluyen sistemas completamente
NAAT y dispositivos pequeños para secuenciar ADN de molécula única utilizando tecnología de nanoporos
( Eisenstein, 2012 ).

La tecnología de microfluidos se considera con optimismo para el manejo de enfermedades infecciosas al

permitir una terapia oportuna. Proporciona una solución potencial clave para áreas remotas e instalaciones
cercanas a los pacientes al evitar los viajes de respuesta de los pacientes entre la clínica y el laboratorio. Su uso
también es beneficioso cuando el tiempo es crucial o cuando los espacios físicos no permiten la configuración
de métodos convencionales.

Lab-on-a-chip (LOC) es un dispositivo muy pequeño que integra procesos de laboratorio en unos pocos
centímetros cuadrados. Utiliza un volumen muy pequeño de muestras para realizar reacciones inmediatas dentro
del chip o en un dispositivo portátil. Las reacciones varían desde la amplificación y detección de ácido nucleico
hasta el recuento celular y los inmunoensayos; por lo tanto, el diagnóstico microfluídico compite con
instrumentos grandes en la realización de pruebas de laboratorio a un costo menor, para beneficiar entornos de
bajos ingresos y áreas remotas.

La FDA aprobó una amplia gama de dispositivos LOC para el diagnóstico de infecciones virales como
Influenza ( Cao et al ., 2012 ), VIH ( Alyassin et al ., 2009 ) y HBV ( Zhi et al ., 2014 ) y más. El desarrollo está
en progreso. Como ejemplos, Daktari Diagnostics utiliza la cromatografía de afinidad para el recuento de
células T CD4 + como alternativa a la citometría de flujo para controlar el VIH en los países en desarrollo
( Cheng et al ., 2007 ). El analizador de sobremesa GeneXpert fabricado por Cepheid tiene un sistema integrado
de preparación de muestras y PCR para el diagnóstico molecular de la influenza y otras infecciones bacterianas
en un formato ligero y portátil.

La mejora de los programas de control de calidad, el control de calidad y la estandarización de los ensayos, kits
y reactivos son importantes para cumplir con los requisitos de precisión. El Centro para el Control y la
Prevención de Enfermedades (CDC) está implementando continuamente pautas de pruebas de laboratorio,
particularmente para el VIH, antes de que se aprueben más pruebas ( CDC, 2014 ).

La OMS y las organizaciones sin fines de lucro como la Fundación para Nuevos Diagnósticos Innovadores
(FIND) tienen como objetivo maximizar los esfuerzos para implementar programas de vigilancia y control de
enfermedades transmisibles ( Loman et al ., 2012 ), establecer nuevas políticas y mejorar los servicios de
diagnóstico en niveles bajos. configuración de recursos.

Conclusión
Los métodos de diagnóstico viral recientemente desarrollados están remodelando el campo de la microbiología
clínica y podrían contribuir a reducir la prevalencia de enfermedades infecciosas graves. Sin embargo, las
capacidades técnicas por sí solas son insuficientes si no están respaldadas por estrategias de promoción de la
salud para aumentar la conciencia sobre la importancia de la detección temprana y la detección periódica de las
personas en alto riesgo.

Finalmente, el diagnóstico de buena calidad tiene un costo que solo los países desarrollados pueden pagar en la
práctica habitual hasta ahora, y esto está retrasando la implementación de nuevos métodos en el mundo en
desarrollo y las áreas endémicas. Sin embargo, existe la esperanza de que continúen los esfuerzos hacia el
desarrollo de nuevas pruebas de buena calidad asequibles en países de bajos ingresos, que fortalezcan
sustancialmente las estrategias de control de enfermedades para sus poblaciones