10/17/2020 PRÁCTICA 5.

ELISA E INMUNODETECCIÓN (Western blot) · Benchling

PRÁCTICA 5. ELISA E INMUNODETECCIÓN

(Western blot)
Introduction
Los anticuerpos son proteínas producidas por el sistema inmune de vertebrados como defensa contra infecciones. Estas moléculas entre
las proteínas son únicas porque son hechas en millones de formas diferentes, cada una de las cuales con un sitio de unión diferente que
reconoce una molécula blanco específica o antígeno. La especificidad precisa de un anticuerpo por un antígeno los convierte en
herramientas poderosas para los biólogos celulares. Marcados con compuestos fluorescentes, son fundamentales para localizar moléculas
específicas en células, mediante microscopia de fluorescencia; marcados con partículas densas a los electrones (esferas de oro coloidal)
pueden ser usados con propósitos similares en el microscopio electrónico. Como herramientas bioquímicas, pueden ser usados para
detectar y cuantificar moléculas en extractos celulares y para identificar proteínas específicas después de ser fraccionadas mediante
electroforesis en geles de poliacrilamida. Cuando son acoplados a una matriz inerte, esta matriz puede ser usada en una columna ya sea
para purificar una molécula específica de un extracto celular crudo o si la molécula está en la superficie celular, para atrapar tipos
específicos de células de una población heterogénea.

La sensibilidad de los anticuerpos como sondas para detectar y analizar moléculas específicas en células y tejidos, es aumentada por el
método de amplificación de señal. Por ejemplo, aunque un colorante fluorescente puede ser unido a un anticuerpo para un reconocimiento
específico (anticuerpo primario), se puede obtener una señal más fuerte usando un anticuerpo primario no marcado y detectando entonces
este con un grupo de anticuerpos secundarios marcados que se unen a él.

El contenido de anticuerpo de un suero puede evaluarse por la capacidad de unirse al antígeno, el cual puede inmovilizarse por adsorción
física a un tubo de plástico o una placa de microtitulación con múltiples pozos; luego la inmunoglobulina unida puede estimarse mediante
la unión de una anti-Ig marcada producida en otra especie.

En el ELISA (del inglés, enzyme-linked immunosorbent assay: ensayo inmunosorbente ligado a enzimas), las enzimas que dan un
producto de la reacción soluble coloreado son en la actualidad los marcadores utilizados con más frecuencia y las enzimas más
empleadas son la peroxidasa de rábano (HRP: horseradish peroxidase: peroxidasa de rábano) y la fosfatasa alcalina (AP: alkaline
phosphatase). La proteína G estreptocócica o la proteína A estafilocócica marcadas con enzimas se unen a la IgG. En ocasiones se utiliza
la conjugación con la vitamina biotina, dado que este conjugado puede detectarse con facilidad por su reacción con la avidita o
estreptavidina ligada a una enzima, ambas se unen con una gran especificidad y afinidad (K = 1015 M-1).

Este reconocimiento puede llevarse a cabo en antígenos separados a partir de un complejo mixto por electroforesis en geles de
poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE). Las proteínas entonces se transfieren a una membrana de nitrocelulosa o PVDF, 41 donde las proteínas
se unen de manera inespecífica, ayudadas por un campo eléctrico. La detección se realiza utilizando un anticuerpo primario contra alguno
de los antígenos de la mezcla, y posteriormente con un segundo anticuerpo marcado con una enzima como en el caso anterior.

La detección se realiza con sistemas de quimioluminiscencia basados en la reacción del luminol incrementada por la catálisis de la HRP
(horse radish peroxidase: peroxidasa de rábano), donde la luz proveniente del sustrato luminol oxidado se intensifica y la duración de la
señal se incrementa por el uso de un reactivo intensificador, lo cual es detectado en una placa fotográfica. El otro método utilizado es el
uso de la 3,3’-diaminobencidina que en presencia de peróxido de hidrógeno produce manchas de color café en donde se identifica la
peroxidasa, aunque es menos sensible.

Materials
› Placas de 96 pozos para ELISA o tiras de 8 pozos
› Pipetas automáticas y puntas
› Tubos Ependorf
file:///tmp/tmpjLp25v/contents.html 1/4
10/17/2020 PRÁCTICA 5. ELISA E INMUNODETECCIÓN (Western blot) · Benchling

› Gradilla
› Pipetas Pasteur
› Bulbo de hule.
› INMUNODETECCION
› Pipetas automáticas y puntas
› Tubos Ependorf
› Pipetas Pasteur
› Bulbos de hule
› Vaso de precipitados de 50 ml.

Procedure

ELISA

1. Coloque el antígeno (50 μl/pozo) en los pozos a una concentración entre 5 y 25 μg/ml en PBS o amortiguador de
carbonato-bicarbonato 0,2 M pH 9,6. Deje toda la noche a 4 ºC.

2. Sature con gelatina al 0,1% p/v en PBS durante 1 h a temperatura ambiente.

01:00:00


3. Lave con PBS-Tween (0,05% p/v) 5 minutos (5X).

00:05:00


4. Añada los sueros respectivos obtenidos en la práctica 5, a las diluciones indicadas de acuerdo al diagrama,
empleando PBS-Tween (0,05% p/v) para prepararlas. Incube 1 h a temperatura ambiente.

file:///tmp/tmpjLp25v/contents.html 2/4
10/17/2020 PRÁCTICA 5. ELISA E INMUNODETECCIÓN (Western blot) · Benchling

Table1

A B

1 Preinmune Inmune
2 1/100
3 1/300
4 1/900
5 1/2700
6 1/8100
7 1/24300
8 1/72900
9 Sin ag Sin ab

5. Lave con PBS-Tween (0,05% p/v) durante 5 min (5X).

00:05:00


6. Agregue el segundo anticuerpo chivo anti-conejo-peroxidasa (ch-c-PO) a una dilución 1:2000 en PBS-Tween
(0,05% p/v). Incubar con agitación 1 h.

01:00:00


7. Lave con PBS-Tween (0,05% p/v) durante 5 minutos (5X).

00:05:00


8. Revele con la siguiente mezcla: 0.165 g ácido 2,2’-azino-bis(3- etilbenzotiazolin-6-sulfónico (sal diamónica) (ABTS)
en 10 ml de amortiguador citrato-fosfato pH 5,0 y 10 μl de peróxido de hidrógeno al 30%.

9. Incube a 37 ºC, observar cada 5 min (máximo 15 min). Leer D.O. a 450 nm en el lector de ELISA.

INMUNODETECCIÓN

10. El papel con las proteínas transferidas obtenido en la electroforesis de la práctica 1, se coloca en un recipiente
adecuado y se satura con leche descremada Svelty al 5% p/v en tris-HCl 10 mM, EDTA 5 mM pH 7,5 por 1 a 2 h
con agitación.

11. Lave 5 x con PBS-Tween (0,05% p/v) 5 minutos con agitación.

file:///tmp/tmpjLp25v/contents.html 3/4
10/17/2020 PRÁCTICA 5. ELISA E INMUNODETECCIÓN (Western blot) · Benchling

12. Agregue el suero inmune (1er. Anticuerpo) a la dilución determinada mediante el procedimiento de ELISA, en una
mezcla de PBS-Tween (0,05% p/v) y solución de leche en relación 1:1, con agitación.

13. Lave 5 x con PBS-Tween (0,05%) 5 minutos con agitación.

14. Agregue el segundo anticuerpo chivo anti conejo acoplado a peroxidasa (ch α C-PO) 1:2000 en PBS-Tween
(0,05% p/v) con agitación.

15. Lave 5x con PBS-Tween (0.05%) 5 minutos con agitación.

16. Revele con 3,3-diaminobencidina. Prepare una solución de 3 mg de 3,3- DAB + 15 ml de tris-HCl 50 mM pH 7,5.
Agregue aproximadamente la mitad de la solución a la membrana.

17. Incube 10 minutos con agitación y cubierto para evitar la luz

18. Quite la solución y añada la solución restante a la que se le haya agregado peróxido de hidrógeno (25 μl de H2O2
al 1% por cada 5 ml de solución).

file:///tmp/tmpjLp25v/contents.html 4/4
10/17/2020 RESULTADOS (Evidencia experimental). · Benchling

RESULTADOS (Evidencia experimental).

Project: PRÁCTICA 5. ELISA
Authors: Alejandro Villegas Ojeda
Created at: 2020-10-17T06:40:37.162012+00:00

TUESDAY, 13/10/2020

 PREPARACIÓN DE DILUCIONES.

Imágen 1. Se puede observar la preparacion de las diluciones

seriadas, a partir del suero del paciente 1, en toal se realizarón tres
diluciones (1:2, 1:10, 1:100). Se realiza el mismo procedimiento con
los pacientes B y C. Posteriormente se les agrega buffer para preparar
estas diluciones.

 CONTROLES POSITIVOS Y NEGATIVOS.

Imágen 2. Se añade a la placa ELISA 0,1 ml diluciones para cada

título de anticuerpo primario anti-ADN (control positivo) y un
tampón (control negativo)

file:///tmp/tmpuzGqUX/contents.html 1/4
10/17/2020 RESULTADOS (Evidencia experimental). · Benchling

 LAVADOS

Imágen 3. Posterior a la primera incubación se retira el liquido de

cada pocillo y posteriormente se realizan varios lavados con PBS.

 SEGUNDO ANTICUERPO.

Imágen 4. Se añade a cada pocillo el segundo anticuerpo, que es

anticuerpo de conejo. La placa psteriormente será incubada y
lavada. Cabe recordar que este anticuerpo tiene una enzima ligada
que es la que ayudara al posterior revelado de la placa.

file:///tmp/tmpuzGqUX/contents.html 2/4
10/17/2020 RESULTADOS (Evidencia experimental). · Benchling

 RESULTADOS

imágen 5. Posterior a la incubación y los lavados se le añade el

sustrato de la enzima (HRP). El cual volvera el sustrato
transparente en amarillo.

 RESULTADOS.

-El paciente A es muy probable que tenga Lupus Eritematoso Sistémico (LES) ya que hubó deteccion positiva en las tres diluciones.
Por otro lado, el paciente B es muy probable que tambien tenga Lupus, pero se necesitaria realizar de nuevo la prueba para confirmar.
Por ultimo, el paciente C definitivamente no tiene LES ya que no hay anticuerpos que detecten al antigeno en ninguna de las tres
diluciones. Por lo tanto el paciente con LES positivo es: Paciente A

DISCUSIÓN DE RESULTADOS.

file:///tmp/tmpuzGqUX/contents.html 3/4
10/17/2020 RESULTADOS (Evidencia experimental). · Benchling
El tipo de ELISA que se realizó fue del tipo: Elisa Indirecto, ya que utilizamos un primer anticuerpo (humano) que va a reconocer al
antígeno y posteriormente se usa un segundo anticuerpo (de conejo) que está ligado a una enzima, este segundo anticuerpo reconoce
al primero y posteriormente mediante la adición del sustrato para la enzima unida al anticuerpo obtendremos un cambio en la
coloración de este sustrato, lo cual nos permite cuantificar y observar en que pocillos están presentes los anticuerpos que reconocen a
cierto antígeno que está en la placa pretratada de ELISA, posteriormente se pueden realizar las mediciones de densidad óptica para
cuantificar esta cantidad de anticuerpos, que es proporcional a la densidad óptica, a mayor densidad/absorbancia, mayor será la
cantidad de anticuerpos presentes. En base a estos conceptos, se puede decir que la muestra de suero del paciente A tiene presentes
anticuerpos que reconocen al antígeno LES que es indicativo de que el paciente posee la enfermedad de Lupus Eritamosa Sistémica,
por otro lado el paciente B no tiene presencia de estos anticuerpos en todos los pocillos, lo cual nos indica que no es seguro que este
paciente tenga LES, pero es muy probable que si tenga, esto se necesitaría confirmar repitiendo la prueba de este paciente,
preferentemente realizando las pruebas por duplicado, este resultado se puede deber a que las personas pueden ser pobres
productores de anticuerpos o pueden tener alguna sustancia que interfiere en la sangre. La cantidad de anticuerpos, por lo tanto,
puede ser demasiado baja para medir con precisión o puede pasar desapercibida. Este resultado se denomina falso negativo. Por
último, para el paciente C, al no tener una reacción positiva en ninguno de los tres pocillos (especialmente el primero, que es el más
concentrado) nos indica que este paciente no tiene Lupus. Otro aspecto que cabe resaltar es que un resultado positivo es casi
confirmatorio de LES, ya que a diferencia de otras enfermedades que siguen produciendo anticuerpos, aunque el paciente ya no esté
enfermo, para la LES que es una enfermedad autoinmune y que no tiene cura, solo tratamiento, la presencia de anticuerpos ayuda
demasiado para confirmar si un paciente tiene o no LES.

CONCLUSIÓN.

De acuerdo con el tipo de ELISA que se realizó (ELISA indirecto), se obtuvo un diagnostico en el cual se detectó la presencia de
anticuerpos para LES en un paciente, el paciente A, posible portador de estos anticuerpos, el paciente B y no portador de anticuerpos,
paciente C. El tipo de ELISA realizado nos otorga una mayor especificidad que si se realizara un Elisa directo, el cual es mucho más
sencillo y rápido, ya que solo involucra tratar la placa con el antígeno, añadir posteriormente la muestra que se desea detectar, con una
enzima unida a esta muestra para su posterior revelado, esta técnica es menos especifica que un ELISA indirecto, el cual involucra la
adición de dos anticuerpos (el segundo es el que contiene la enzima ligada) para posteriormente añadir su sustrato que nos produce
un camio de coloración. Como podemos ver, la ELISA indirecta involucra un poco más de tiempo para poderse realizar, además de
más reactivos, y muchos más lavados, pues después de cada incubación es necesario retirar el líquido y enjuagar con PBS
aproximadamente 5 veces por cada lavado, lo cual involucra más tiempo de procedimiento, pero con la ventaja de que estamos
realizando un ensayo más específico y sensible que nos arrojara mejores resultados. Cabe mencionar que existen otros dos métodos
principales de ELISA, el tipo sándwich y el tipo competitivo (este último se realiza cuando se tienen muy pocas cantidades de antígeno
o cuando la estructura del antígeno es complicada y epítopos del antígeno difíciles de detectar). Este tipo de ensayos inmunoquímicos
son de mucha importancia para el diagnóstico de muchas enfermedades y al tener distintos tipos de ELISA se puede optar desde una
técnica rápida, hasta alguna de mayor sensibilidad y especificidad, de acuerdo con las necesidades y recursos del laboratorio,
especialmente para la detección de este tipo de enfermedades autoinmunes son de gran utilidad y son ensayos muy confiables.

file:///tmp/tmpuzGqUX/contents.html 4/4
10/17/2020 CUESTIONARIO · Benchling

CUESTIONARIO
Project: PRÁCTICA 5. ELISA
Authors: Alejandro Villegas Ojeda
Created at: 2020-10-17T06:00:38.734155+00:00

TUESDAY, 13/10/2020

Paso 1. Centrifugar muestras de sangre completa de los pacientes A, B y C durante 15 minutos a temperatura ambiente para
obtener el suero. ¿por qué?
Las muestras deben ser centrifugadas para precipitar las células sanguíneas y obtener el líquido transparente conocido como suero.
Cualquier célula que quede interferirá con el ensayo y puede hacer que aparezca un resultado positivo independientemente de si el
anticuerpo LES está presente.
Un ensayo que carece de especificidad y produce un resultado falso positivo no es útil para hacer un diagnóstico.

Paso 2 (Paciente A). Usando el suero del paciente A, prepare tres diluciones de la siguiente manera:
• Tome 1 ml de suero del paciente A y añada 1 ml de solución salina tamponada por fosfato (PBS). Esto es una dilución de 1:2.
• Tomar 1 ml de suero del paciente A y añadir 9 ml de PBS. Esto es una dilución a la 1:10.
• Tomar 0,1 ml de suero del paciente A y añadir 9,9 ml de PBS. Esto es una dilución a la 1:100. ¿por qué?
Las diluciones en serie se realizan para determinar el nivel del anticuerpo en la muestra. Las muestras altamente diluidas no
aparecerán positivas si hay un título bajo de anticuerpos en los sueros.
PBS es una solución de laboratorio común que contiene sal de mesa. La cantidad de sal en el tampón es aproximadamente la misma
que la que normalmente se encuentra en la sangre. El tampón de fosfato evita que la solución se vuelva demasiado ácida o básica.

Paso 3. Preparar una placa ELISA con 0,1 ml de las diferentes diluciones del suero del paciente utilizando un pipeteador ®
Eppendorf.
*Nota: La placa ELISA ha sido pretratada para unir el antígeno SLE a cada pozo. ¿por qué?
Proteínas como antígenos y otros materiales biológicos pueden, en condiciones adecuadas, unirse físicamente al material plástico que
compone los pozos de la placa ELISA.
El procedimiento de recubrimiento debe realizarse cuidadosamente. Si se utiliza muy poco antígeno, las manchas desnudas permitirán
que el anticuerpo u otra proteína se pegue, lo que conduce a una reacción falsa positiva. Si se utiliza demasiado antígeno, el exceso
será capaz de unir el anticuerpo LES de los sueros del paciente, pero luego será lavado, creando una reacción falsa negativa.
La adición de antígeno es el primer paso crucial en la cadena de eventos de reconocimiento entre antígeno y anticuerpo que terminará
con la formación de color a partir de la enzima unida al segundo anticuerpo.

Paso 4. Añadir a la placa ELISA 0,1 ml diluciones para cada título de anticuerpo primario anti-ADN (control positivo) y un
tampón (control negativo). ¿por qué?
Un ELISA puede estar sujeto a muchos errores. Una es que los reactivos biológicos y químicos utilizados en ELISA pueden cambiar
con el tiempo. Otra es que el ELISA no siempre se lleva a cabo en condiciones adecuadas. Para descartar estos problemas, se utilizan
dos controles. Un control siempre debe producir una respuesta positiva si los reactivos y las condiciones son correctos. El segundo
control nunca debe producir una respuesta positiva. Si cualquiera de las muestras de control no reacciona como se esperaba, entonces
los resultados de las muestras de los pacientes no se pueden confiar y el ensayo debe repetirse.
Cualquier suero de un paciente que contenga el anticuerpo para les s reconocerá el antígeno en el pozo y se unirá a él. Cada muestra
sérica contiene muchos tipos diferentes de anticuerpos, pero debido a que son tan específicos en la forma en que reaccionan, por lo
general ningún anticuerpo reconocerá el antígeno LES excepto el anticuerpo LES.

Paso 5. Incubar la placa ELISA a 37°C durante 15 minutos. ¿por qué?

La incubación de muestras de suero en pozos recubiertos con antígeno ayuda a garantizar que el anticuerpo presente en la muestra
interactúe correctamente con el antígeno. Debido a que el LES es una enfermedad de los seres humanos, la reacción generalmente
ocurre a la temperatura del cuerpo humano, que es 37 grados C. El tiempo es importante: la reacción debe proceder el tiempo
suficiente para que se produzca una unión adecuada o la medición será artificialmente baja.

file:///tmp/tmpBQTCSq/contents.html 1/3
10/17/2020 CUESTIONARIO · Benchling
Problema: Si el temporizador se establece en menos de 15 minutos, no se producirá la reacción adecuada y no se verá ningún color al
final del ensayo. El observador registrará los resultados incorrectamente como falsos negativos.
Problema: Si la temperatura es demasiado baja, la reacción no se completará en el tiempo permitido. Si la temperatura es demasiado
alta, la proteína (antígeno y anticuerpo) se verá afectada negativamente a través de un proceso conocido como desnaturalización, que
disminuye su capacidad de interactuar. Los resultados se registrarán de nuevo como falsos negativos.

Paso 6. Retirar el líquido de cada pocillo con la pipeta y lavar con 0,1 ml de PBS. ¿por qué?
A menudo, en un laboratorio real, estos lavados se repiten de 3 a 6 veces antes de agregar la siguiente sustancia. Para acelerar este
ejemplo, hemos dado solo un ejemplo de enjuague/lavado por paso.
El lavado ayuda a eliminar cualquier anticuerpo que no haya reaccionado con el antígeno LES en el pozo. Cuando el líquido se extrae
del pozo, el anticuerpo que ha reaccionado con el antígeno permanece unido a la superficie del pozo. Los anticuerpos no reaccionados
(sin consolidar) también pueden permanecer en el pozo en la pequeña cantidad de líquido que queda atrás. Este anticuerpo sin anzar
debe ser eliminado, porque el anticuerpo anti-humano añadido en el siguiente paso reconocerá y reaccionará con cualquier anticuerpo
restante en el pozo, independientemente de si ese anticuerpo es específico para el antígeno LES. Una reacción con anticuerpos no LE-
SLE producirá un resultado falso positivo.

Paso 7. Añadir 0,1 ml de solución tamponada que contenga un anticuerpo secundario que reconozca los anticuerpos
fabricados en humanos. Tenga en cuenta que este anticuerpo secundario se fabrica en un conejo y tiene una enzima adjunta
(HRP) que interactuará con el sustrato en el siguiente paso. ¿por qué?
El segundo anticuerpo, a diferencia del primero, no reconoce el antígeno LES. En su lugar, el anticuerpo antihumano de conejo
reacciona con anticuerpos humanos. El anticuerpo LES es un anticuerpo humano que puede estar presente en un pozo porque está
siendo mantenido por antígeno. Por lo tanto, el segundo anticuerpo (del conejo) reconocerá este anticuerpo y se unirá a él. Si el pozo
no se ha lavado a fondo, otro anticuerpo humano puede seguir estando allí y también reaccionará con el segundo anticuerpo. La
reacción de un anticuerpo humano no LE-SLE con el segundo anticuerpo producirá un resultado falso positivo.

Paso 8. Incubar la placa ELISA a 37°C durante 15 minutos. ¿por qué?

La incubación de muestras de suero en pozos recubiertos con antígeno ayuda a garantizar que el anticuerpo presente en la muestra
interactúe correctamente con el antígeno. Debido a que el LES es una enfermedad de los seres humanos, la reacción generalmente
ocurre a la temperatura del cuerpo humano, que es 37 grados C. El tiempo es importante: la reacción debe proceder el tiempo
suficiente para que se produzca una unión adecuada o la medición será artificialmente baja.

Problema: Si el temporizador se establece en menos de 15 minutos, no se producirá la reacción adecuada y no se verá ningún color al
final del ensayo. El observador registrará los resultados incorrectamente como falsos negativos.
Problema: Si la temperatura es demasiado baja, la reacción no se completará en el tiempo permitido. Si la temperatura es demasiado
alta, la proteína (antígeno y anticuerpo) se verá afectada negativamente a través de un proceso conocido como desnaturalización, que
disminuye su capacidad de interactuar. Los resultados se registrarán de nuevo como falsos negativos.

Paso 9. Retire el líquido de cada pozo con el pipeteador y lávelo con 0,1 ml de PBS. ¿por qué?
El lavado ayuda a eliminar cualquier anticuerpo que no haya reaccionado con el antígeno LES en el pozo. Cuando el líquido se extrae
del pozo, el anticuerpo que ha reaccionado con el antígeno permanece unido a la superficie del pozo. Los anticuerpos no reaccionados
(sin consolidar) también pueden permanecer en el pozo en la pequeña cantidad de líquido que queda atrás. Este anticuerpo sin anzar
debe ser eliminado, porque el anticuerpo anti-humano añadido en el siguiente paso reconocerá y reaccionará con cualquier anticuerpo
restante en el pozo, independientemente de si ese anticuerpo es específico para el antígeno LES. Una reacción con anticuerpos no LE-
SLE producirá un resultado falso positivo.

Paso 10. Añadir 0,1 ml de solución tamponada que contenga el sustrato químico (sustrato HRP). Si hay anticuerpos humanos
presentes, el sustrato transparente se volverá amarillo. ¿por qué?
Una de las enzimas más utilizadas que se pueden unir a los anticuerpos se llama peroxidasa de rábano picante. La enzima junto con el
peróxido de hidrógeno actúa sobre un producto químico llamado ABTS (2,2'-azinobis-3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico) para
producir una solución amarilla que se puede estimar por ojo o medir cuantitativamente en un espectrómetro a 414 nanómetros.

file:///tmp/tmpBQTCSq/contents.html 2/3
10/17/2020 CUESTIONARIO · Benchling
Paso 11. Ajuste el temporizador durante 15 minutos. ¿por qué?
Si el temporizador se establece en menos de 15 minutos, no se producirá la reacción adecuada y no se verá ningún color al final del
ensayo. El observador registrará los resultados incorrectamente como falsos negativos.

file:///tmp/tmpBQTCSq/contents.html 3/3