Biodisponibilidad de hidrocarburos meteorizados en suelos contaminados con aceite de motor:

impacto de la bioaumentación mediada por Pseudomonas spp. sobre biorremediación

RESUMEN

Los hidrocarburos de fracción más pesada (C15-C36) formados en el suelo después de la

meteorización biótica y abiótica del aceite de motor son las limitaciones continuas en la estrategia
de biorremediación, y su biodisponibilidad sigue siendo un factor regulador mal cuantificado. En
un estudio de microcosmos, utilizamos dos cepas de Pseudomonas, P. putida TPHK-1 y P.
aeruginosa TPHK-4, en estrategias de biorremediación, es decir, atenuación natural,
bioestimulación y bioaumentación, para la eliminación de hidrocarburos de petróleo totales (TPH)
meteorizados en suelos contaminados a largo plazo con altas concentraciones de aceite de motor
(39.000 a 41.000 mg TPH kg − 1 suelo). Ambas cepas bacterianas exhibieron un gran potencial para
remediar los hidrocarburos degradados del aceite de motor. La adición de fertilizantes inorgánicos
(NPK), en los niveles recomendados para la biorremediación, resultó en una inhibición significativa
en la bioestimulación/atenuación natural, así como bioaumentación. Los datos sobre la actividad
deshidrogenasa confirmaron claramente las estrategias de biorremediación utilizadas, lo que
indica que este ensayo enzimático podría servir como indicador del potencial de biorremediación
de suelos contaminados con aceite. Extracción de TPH de suelo contaminado con aceite de motor
con hidroxipropil-β-ciclodextrina (HPCD), pero no 1-butanol, resultó confiable para predecir la
biodisponibilidad de los hidrocarburos meteorizados. Además, 454 datos de pirosecuenciación
estaban de acuerdo con los de las estrategias de biorremediación utilizadas en el presente estudio
de microcosmos, lo que sugiere el posible uso de la pirosecuenciación en el diseño de enfoques
para la biorremediación.

INTRODUCCIÓN

La producción, el transporte, el uso y la eliminación de lubricantes o aceite de motor tienen varios

impactos ambientales. Un gran porcentaje del aceite usado se vierte a los ecosistemas sin ningún
tratamiento incluso en los países desarrollados. El aceite de motor persiste durante más de seis
años en algunos ecosistemas, lo que genera problemas crónicos para la biota. Incluso en
condiciones controladas, el aceite no puede ser metabolizado rápida y completamente por
microorganismos, y se necesitan semanas a meses para que los aceites de motor se degraden. Por
lo tanto, la descarga de lubricante en la naturaleza es una preocupación continua y grande debido
a la no cuantificación del impacto y daño crónico potencial al ecosistema. La meteorización es una
acción en la que los procesos físicos, químicos y biológicos afectan el tipo de hidrocarburos que
quedan en el suelo. El envejecimiento es, por tanto, un proceso natural importante de
contaminantes en el medio ambiente del suelo que afecta su biodisponibilidad, toxicidad biológica
y biodegradabilidad. El suelo contaminado con aceite a largo plazo consiste principalmente de
compuestos recalcitrantes de hidrocarburos de alto peso molecular (Compuestos NC25) que son
más difíciles de degradar por microorganismos autóctonos. Los hidrocarburos de petróleo
meteorizados que son menos o no biodisponibles complican el desempeño de las tecnologías de
remediación. Además, los hidrocarburos meteorizados tienen importantes efectos cualitativos y
diferencias cuantitativas en comparación con los productos frescos del petróleo, y estos aún no se
consideran en la mayoría de las evaluaciones de riesgos. Por tanto, es necesario evaluar la
eficiencia de los microorganismos que degradan los hidrocarburos en el contexto de los
hidrocarburos degradados en suelos contaminados con petróleo.

La contaminación del suelo y los sedimentos con hidrocarburos de petróleo es un grave problema
ecológico que justifica la remediación de sitios contaminados con petróleo. La biorremediación,
entre las técnicas de remediación, es factible porque los compuestos del petróleo que incluyen
tanto compuestos alifáticos y aromáticos de cadena ramificada y no ramificada son susceptibles al
proceso de biodegradación. Sin embargo, la biorremediación de un suelo contaminado con aceite
puede estar muy influenciados por la naturaleza de los hidrocarburos y la duración de la
contaminación. Además, es poco probable que los microrganismos del suelo respondan de la
misma manera a los aceites de motor frescos y a los degradados. Por lo tanto, el objetivo principal
de este estudio fue evaluar la eficiencia de diferentes estrategias de biorremediación de suelos
recolectados de un sitio que ha sido contaminado durante mucho tiempo con aceites de motor y
otros productos derivados del petróleo de automóviles o por cualquier disposición no intencional.
En nuestro estudio más reciente, dos cepas de Pseudomonas sp., P. putida TPHK1 y P. aeruginosa
TPHK-4, capaces de crecer en hidrocarburos de petróleo, fueron aisladas de sitios contaminados
con petróleo y su gran potencial para degradar diésel y n-alcanos ha sido bien establecido. La
bioaumentación utilizando cepas bacterianas eficientes es un enfoque eficaz para la
biorremediación de suelos contaminados con sustancias orgánicas. Por lo tanto, estas cepas se
utilizaron además en el presente estudio de microcosmos por su eficiencia en la biorremediación
de suelos contaminados con aceite de motor después de la bioaumentación.

La eficiencia de los microorganismos en la biodegradación de hidrocarburos puede ser mejor

evaluado cuando se conoce claramente la biodisponibilidad / bioaccesibilidad de estos
compuestos. Dado que la biodisponibilidad es la tendencia de los componentes individuales del
aceite a ser absorbidos por microorganismos, debe ser considerado como un objetivo de
investigación prioritario en el campo de la biorremediación. Sin embargo, es un factor regulador
mal cuantificado para la biodegradación de aceite y otros compuestos orgánicos en contaminación
de suelos. La mayoría de los estudios de biodisponibilidad publicados hasta la fecha se han
centrado en compuestos individuales o representantes de un grupo de compuestos como
hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) y bifenilos policlorados (PCB). Ahora solo se dispone
de información muy escasa sobre biodisponibilidad de mezclas químicas complejas en suelos y
sedimentos. Por lo tanto, otro objetivo del presente estudio fue evaluar la biodisponibilidad de
una mezcla compleja de hidrocarburos meteorizados en suelos contaminados con petróleo. Para
predecir la biodisponibilidad de mezclas complejas de hidrocarburos de petróleo de suelos
contaminados con aceite de motor, se siguieron con mayor frecuencia los métodos analíticos
químicos que involucran ciclodextrina o butanol, extracción se utilizaron en la presente
investigación. Además, la validez de los datos de los diferentes enfoques de biorremediación
seguidos en la presente investigación fue verificados utilizando el ensayo desarrollado
recientemente de pirosecuenciación basada en ARNr 16S para evaluar la diversidad microbiana en
suelos contaminados con contaminantes ambientales.

MATERIALES Y MÉTODOS

1. Muestra de suelo y aislados bacterianos

Obtención de la Muestra: Suelo contaminado con aceite de motor de un depósito de servicio y
eliminación de automóviles en Australia del Sur.

La muestra de suelo se homogeneizó y se pasó por un tamiz de 2 mm.

Determinación de las características fisicoquímicas: (siguiendo métodos estándar)

 El pH y la conductividad eléctrica se midieron en 1: 5 (suelo: agua; p / v) en suspensión

usando Smart CHEM-Lab (TPS Pty Ltd., Brisbane, Australia).

pH: 7,6

Conductividad eléctrica: 890 μS cm− 1

 La distribución del tamaño de las partículas del suelo se determinó mediante el método de
micropipeta.

% de arena: 24%

% de limo: 60%

% de arcilla: 16%

 La concentración de nitrato y amoníaco en el extracto de agua del suelo se determinó

mediante cromatografía iónica (IC).

N03- nitrógeno: 90 mg L-1

NH3+ nitrógeno: 3,3 mg L-1

 El contenido de carbono orgánico del suelo (OC) por el método de oxidación húmeda.

 El análisis de metales pesados se realizó utilizando ICP-MS Agilent 7500c (espectrómetro

de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS Agilent Technologies, Tokio,
Japón)) después de la extracción en un sistema de reacción acelerada por microondas
(CEM-MARS X®, CEM Corporation, Matthews, NC, EE. UU.)

Cu: 798 mg kg-1

Pb: 355 mg kg-1

Zn: 604 mg kg-1

Cr: 56 mg kg− 1

Ni: 86 mg kg− 1

Capacidad de intercambio catiónico: 2,1 meq 100 g− 1

Hidrocarburos de petróleo totales (TPH): 39.000–41.000 mg kg – 1

Discos compactos: 0,7 mg kg-1

Cepas bacterianas: Las cepas seleccionadas fueron P. putida TPHK-1 y P. aeruginosa TPHK-4, las
cuales fueron aisladas anteriormente de suelo contaminado con petróleo pues exhibieron un gran
potencial para degradar altas concentraciones de hidrocarburos (Ramadass et al., 2016).

Las cepas bacterianas se cultivaron hasta una fase logarítmica tardía utilizando 500 ml de medio
de sales mínimas (MSM). Las células se recolectaron, se lavaron en medio Bushnell-Hass (BHM)
estéril y se resuspendieron los sedimentos en BHM estéril para obtener una densidad óptica a 600
nm de 1.0 (5 × 10 10 células mL - 1). La suspensión celular se diluyó más en agua MQ para la
inoculación para proporcionar un nivel final de humedad del suelo en 60% de capacidad de
retención de agua (WHC).

2. Estudio del microcosmos del suelo

El microcosmos se llevo a cabo en porciones de 400 g de suelo contaminado con aceite de motor
colocados en frasco de vidrio de 1 L mantenidos al 60% de humedad de WHC e incubados durante
30 semanas a temperatura ambiente (25 ± 2 ° C).

Tratamientos

T1: Control abiótico, se realizó mezclando la muestra de suelo con HgCl2 al 2% (Porq se le agrego)

T2-T7: Atenuación natural, bioaumentación usando dos cepas bacterianas y bioestimulación con
la aplicación de fertilizantes inorgánicos (NPK).

NPK inorgánico se utilizó como fuentes de nutrientes en una proporción molar 100: 10: 1: 2,5 de
carbono (C), nitrógeno (N), fósforo (P) y potasio (K), respectivamente, según lo recomendado para
estudios de biorremediación (Alexander, 1999).

Cada tratamiento fue replicado en tres microcosmos. Dos veces por semana, cada microcosmos
fue aireado y nivel de humedad mantenido con agua desionizada.

3. Análisis de muestras de suelo para calcular hidrocarburos totales

Para determinar las concentraciones de TPH, se tomaron muestras de suelo de microcosmos

retirado a los 0, 7, 15, 30, 60, 90, 150 y 210 días para la extracción con una mezcla de
diclorometano (DCM) y acetona (1: 1). Los extractos de solvente se analizaron para determinar los
hidrocarburos totales usando un cromatógrafo de gases equipado con un detector de ionización
de llama (GC-FID Agilent modelo 6890). La cromatografía se realizó en una columna capilar de
sílice fundida. BPX-5 de SGE (15 m × 0,32 mm de diámetro interno) recubierto con HP-5 (espesor
de película de 0,10 μm). El helio se utilizó como gas portador en 2,5 mL min-1, y la temperatura del
detector FID se mantuvo a 300 ° C. Se aplicó una inyección sin división con un volumen de muestra
de 1 μl. La temperatura del horno se incrementó de 50 a 300 ° C en un gradiente de 25° C min − 1,
y se mantuvo a esta temperatura durante 5 min. El tiempo de ejecución total fue 19,6 min.

4. Análisis de concentraciones biodisponibles de hidrocarburos

Una técnica de extracción suave para estimar las fracciones biodisponibles de hidrocarburos en
muestras de suelo de microcosmos usando hidroxipropil-β-ciclodextrina acuosa (HPCD) se adoptó
como se describió anteriormente. Triplicados de muestras de suelo secas y tamizadas (1,25 g) de
cada microcosmos se tomaron en tubos de centrífuga de teflón de 40 ml y se añadieron a cada
tubo 25 ml de una solución acuosa de HPCD de 50 ml. El extracto de HPCD de un tubo vacío sirvió
como blanco analítico. Los tubos se sellaron y se colocaron en un agitador orbital (Fisher Scientific,
Australia), fijado a 100 rpm, durante 20 h antes de la centrifugación a 27.000 × g durante 30 min
(centrífuga Beckman JA21 / 2, EE. UU.). El sobrenadante se extrajo líquido-líquido con 10 mL de
DCM. Las fases orgánicas se deshidrataron pasándolas a través de Na2SO4 anhidro, se combinaron
y se concentraron a 1,0 m L bajo una suave corriente de nitrógeno. El método de Liste y Alexander
(2002) también se adoptó para la extracción infantil de hidrocarburos utilizando n-butanol.
Brevemente, se agregaron 15 ml de n-butanol a porciones de 5 g de suelo húmedo y luego se
suspendieron en un mezclador de vórtice durante 2 minutos. La suspensión se centrifugó y el
sobrenadante se separó de la porción del suelo.

5. Ensayo de deshidrogenasa del suelo

Para determinar la influencia de la contaminación por hidrocarburos en la actividad microbiana en

suelos contaminados con aceite de motor, se midió la actividad deshidrogenasa a intervalos
periódicos en muestras de suelo de microcosmos, y se expresó en términos de trifenilformazán
(TPF) formado a partir de cloruro de trifenil tetrazolio (μg TPF g − 1 suelo h − 1) como se describió
anteriormente.

6. Amplificación del gen ARNr 16S y pirosecuenciación

El ADN de la comunidad microbiana total se aisló de 1,0 g de muestra de suelo de cada

tratamiento utilizando el kit de extracción de ADN de suelo MoBio.

La amplificación de los genes de ARNr 16S y la pirosecuenciación de todo el ADN del suelo extraído
se realizó en el Centro Australiano de Investigación Genómica (AGRF), Brisbane, Australia. Los
amplicones de PCR se generaron utilizando cebadores, mezcla maestra AmpliTaq Gold 360 (Life
Technologies, Australia) y las condiciones descritas anteriormente. Los amplicones resultantes se
midieron mediante fluorometría, normalizada y medida por qPCR, normalizada de nuevo por
segunda vez y luego agrupada en proporciones equimolares. Este conjunto de amplicones se
ejecutó luego en la plataforma GS-FLX usando la química XLR70. Dado que la pirosecuenciación de
Roche 454 GS FLX puede proporcionar un millón de lecturas de secuencia de 500 millones de pares
de bases de información de secuencia en una sola ejecución a un costo relativamente bajo.
También seguimos 454 pirosecuenciación aquí para la elaboración de perfiles de diversidad
microbiana antes y después de la biorremediación de suelo contaminado a largo plazo con
hidrocarburos.

7. Análisis estadístico
Todas las pruebas estadísticas se realizaron con SPSS versión 17.0. Se aplicó la prueba de rango
múltiple (DMR) para determinar la significancia estadística de valores medios (n = 4) a P ≤ 0.05

RESULTADOS

1. Biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos degradados en aceite de

motor

El suelo contaminado con aceite de motor era de tipo franco limoso con pH neutro. El contenido
de carbono orgánico total fue del 4,7%, mientras que el NO3 N, el fósforo disponible (Olsen-P) y
Kwere 90, 70 y 375 mgkg − 1, respectivamente. Dado que se recomendó una proporción de 100: 10:
1: 2,5 de C, N, P y K, respectivamente para la biorremediación de contaminantes orgánicos, el
estado de nutrientes del suelo utilizado se ajustó a esta relación aplicando compuestos
fertilizantes inorgánicos, nitrato de amonio y potasio fosfato de dihidrógeno. Además, estas
relaciones de C: N y C: P fueron utilizados como se conocen para proporcionar la cantidad
requerida de N y P para convertir el 100% del C del petróleo en biomasa celular.

Entre los metales pesados, la concentración de Cu (798 mg kg − 1) en aceite contaminado se

encontró que el suelo era más alto, seguido de Zn, Pb, Ni y Cr. El rango en la recuperación de
diferentes fracciones de hidrocarburos de los tratamientos T1-T7 de suelo contaminado con aceite
de motor a los días 0 después de la extracción de DCM + acetona fue 860-1102,24,500-27,174 y
12,904-14,832 mg kg − 1 de suelo para C8-C14, C15-C28 y C29-C36, respectivamente. La presencia
muy limitada de hidrocarburos alifáticos de cadena corta (bC14) en las muestras de suelo indica
que ya se ha producido un mayor grado de meteorización en suelos contaminados con aceite de
motor. Además, los extractos de solventes obtenidos el día 0 revelaron que las concentraciones de
TPH en todos los tratamientos (T1-T7) fueron casi iguales. En todos los tratamientos del estudio de
microcosmos, hubo un rápido aumento en la biodegradación de los TPH hasta solo 90 días de
incubación, y luego siguió una lenta tasa de degradación en muestras de suelo contaminadas con
aceite de motor.
El alcance de la biorremediación en cualquiera de los tratamientos utilizados no fue mayor al 74%,
aunque las muestras de suelo se incubaron durante un periodo total de 210 días. El motivo de la
biorremediación incompleta podría deberse a la presencia de concentraciones apreciablemente
más altas (39.000 a 41.000 mg kg − 1) de TPH en la muestra de suelo contaminada con aceite
seleccionada, ya que se estableció que la biorremediación de suelos contaminados con TPH a
50.000 mg kg− 1 es muy difícil que ocurra. Las muestras de control abiótico (T1) mostraron solo
una disminución del 4% en hidrocarburos, posiblemente explicando la degradación química
durante este período. La atenuación natural (T2), mediada por microorganismos del suelo que
degradan los hidrocarburos autóctonos, provocó una degradación del 41% de TPH. opinó que los
suelos contaminados con petróleo exhiben una mayor capacidad microbiana de degradación de
hidrocarburos (atenuación natural) debido a la exposición previa a los hidrocarburos.
Sorprendentemente, las enmiendas del suelo con NPK (T3 y T4) empleadas para mejorar la
atenuación natural dieron como resultado una disminución pronunciada (17%) en la degradación
de los hidrocarburos en comparación con la atenuación natural. Aunque los fertilizantes NPK se
utilizaron para el crecimiento microbiano mejorado selectivo seguido de la biodegradación de los
TPH en suelos contaminados con aceite, no hubo bioestimulación en la biorremediación.

El impacto negativo de las enmiendas de nutrientes en la biodegradación de los TPH no es

infrecuente. Por ejemplo, Akbari y Ghoshal (2014) informaron sobre la inhibición de la
degradación del aceite con la aplicación de contenido de nitrógeno. Braddock et al. (1997)
correlacionó el impacto negativo de la aplicación de N para la remediación de hidrocarburos con el
aumento de la salinidad debido a la distribución de las sales de fertilizantes en el agua de los
poros. Del mismo modo, Wang et al. (2012) notaron un impacto negativo de la adición de
nutrientes en las poblaciones de degradadores de TPH en el suelo. Aunque el propósito de las
enmiendas de nutrientes para la eliminación de contaminantes es estimular las actividades
metabólicas en microorganismos, Sarkar et al. (2005) no notaron ningún beneficio en la tasa de
degradación de TPH con la adición de nutrientes debido a la toxicidad del amoníaco en niveles
altos. Además, se observaron muy pocos cambios en la población de degradadores de TPH en
suelos modificados con nutrientes por Coulon et al. (2010). Nuestra observación actual de una
clara inhibición en la biodegradación de TPH en muestras de suelo contaminadas con aceite que
recibieron fertilizantes NPK sugiere claramente que el nivel óptimo de contenido de N del suelo
necesario para una biorremediación eficiente después de la atenuación natural es de alrededor de
90 mg kg-1 de suelo, que es el nivel de N presente en el suelo recolectado originalmente, y
cualquier N adicional inhibiría la biodegradación de los TPH.

Como era de esperar, en muestras de suelo (T4 y T5) bioaumentado con cepas bacterianas de
Pseudomonas sp. la biodegradación de los hidrocarburos fue más significativa en comparación con
la atenuación natural. En particular, bioaumentación de muestras de suelo contaminadas con
aceite de motor con

P. aeruginosa El TPHK-4 resultó en un 22% más de degradación de los hidrocarburos que la que se
produjo en las muestras atenuadas naturalmente en 90 días. Por otra parte, P. putida TPHK-1
también se desempeñó mejor al efectuar un 18% más de degradación de los hidrocarburos en
comparación con la atenuación natural. Nuevamente, una combinación de tratamientos con el
propósito tanto de bioaumentación como de bioestimulación inhibieron la degradación de
hidrocarburos en muestras de suelo contaminadas con aceite (T6 y T7), posiblemente al ejercer
una toxicidad significativa hacia las bacterias introducidas para la bioaumentación. Así, la
degradación de los hidrocarburos en muestras de suelo que recibieron P. aeruginosa TPHK-4 o P.
putida TPHK-1 junto con fertilizantes NPK fue solo del 31% frente al 41% de biodegradación en
muestras naturalmente atenuadas durante el período correspondiente de 90 días. Sin embargo,
Bento et al. (2005) informaron muy poco efecto de la bioestimulación y bioaumentación en los
recuentos de población de degradadores de TPH, así como la degradación de TPH en suelos
contaminados con aceite.

De las bacterias que degradan los hidrocarburos, las especies de Pseudomonas como P.
aeruginosa, P. putida y P. chlororaphis son las más conocidas por la utilización de hidrocarburos
como fuentes de carbono y energía y por la producción de biosurfactantes (tipo glicolípido). La
sorprendente capacidad de las cepas seleccionadas de Pseudomonas sp. en biorremediación de
suelo contaminado con aceite de motor observado en el presente estudio podría deberse a su
capacidad para producir biosurfactantes implicados en la biodegradación de hidrocarburos de
petróleo hidrófobos. En general, Los aislados bacterianos se consideran productores de
biosurfactantes o emulsionantes si son hidrófobos y capaces de reducir la tensión superficial.
Nuestros estudios preliminares indicaron que las cepas presentes, TPHK-1 y TPHK-4, mostraron
una alta actividad de emulsificación (80-82%), y también exhibieron valores de tensión superficial
b 35 mN · m − 1 además de una alta hidrofobicidad de la superficie celular (79-82 % de adherencia
de las células a los hidrocarburos) para desperdiciar aceite de motor. Por lo tanto, los
biosurfactantes que pueden haber sido producidos por estos Las cepas bacterianas podrían
facilitar la solubilización y absorción de hidrocarburos insolubles de cadena larga de muestras de
suelo contaminadas con aceite degradado.

2. Biodisponibilidad de hidrocarburos erosionados en suelos contaminados con aceite de

motor
Recientemente, ha habido un cambio en ciertas regulaciones de tierras contaminadas y políticas
de evaluación, ya que los procedimientos regulatorios actuales tienden a sobreestimar la fracción
verdaderamente biodegradable de un contaminante en el ecosistema. Por lo tanto, la
concentración total de hidrocarburos medida en un suelo después de una extracción exhaustiva
con solventes no proporcionará una idea en su fracción potencialmente biodegradable. Por lo
tanto, predecir la "fracción biodisponible o bioaccesible" de los contaminantes sería útil para
suponer límites de exposición "reales" en la evaluación de riesgos. Se ha propuesto la extracción
no exhaustiva de suelo contaminado utilizando extractantes orgánicos suaves para predecir la
bioaccesibilidad de los HAP y los plaguicidas para la biodegradación. La mayoría de los estudios de
biodisponibilidad se ocuparon de hidrocarburos aromáticos individuales o compuestos de PAH,
pero se ha comprendido muy poco sobre la biodisponibilidad de los hidrocarburos alifáticos
meteorizados en suelos contaminados. Por lo tanto, este estudio se centró en evaluar la viabilidad
de utilizar extractantes orgánicos suaves como HPCD y 1-butanol para evaluar la fracción
biodisponible y potencialmente degradable de los hidrocarburos meteorizados de suelos
contaminados con aceite de motor.
Se realizó una comparación del porcentaje de degradación medido de las fracciones de
hidrocarburos meteorizados en diferentes tratamientos después de 210 días después de una
extracción exhaustiva con una mezcla de DCM y acetona con porcentaje previsto de degradación
obtenido después de la extracción con HPCD o butanol en el día 0 para determinar la extensión de
las porciones biodisponibles de TPH para la biorremediación de suelos contaminados con aceite de
motor. En general, la extracción con butanol predijo una mayor degradación de los TPH en
comparación con la extracción con HPCD en todos los tratamientos. Por lo tanto, los valores de
degradación porcentuales previstos para las extracciones de butanol y HPCD estaban en el rango
de 53 a 61 y 36 a 41, respectivamente. Excepto en los tratamientos del suelo utilizados para
bioaumentación (T4 y T5), la degradación prevista de los TPH después de la extracción de butanol
fue mayor que la degradación medida en todos los demás enfoques de biorremediación. Por
ejemplo, los valores de degradación previstos para la extracción con HPCD y la extracción con
butanol en relación con la atenuación natural (T2) fueron 40 y 59%, mientras que el porcentaje de

degradación medido correspondiente fue 52. Esto podría deberse al hecho de que la extracción
con butanol, al ser algo exhaustiva que la extracción con HPCD, sobrestimó las porciones
biodisponibles de TPH en los tratamientos utilizados. Nuestro presente estudio de microcosmos
sugiere que la extracción suave con HPCD puede ser más apropiada mientras predice las
concentraciones biodisponibles de hidrocarburos presentes incluso en el rango superior de 39.000
- 41.000 mg kg - 1 en suelos erosionados y contaminados con petróleo.

3. Actividad deshidrogenasa del suelo - un indicador de la biorremediación de TPH

Los contaminantes causan graves tensiones en la estructura de la comunidad microbiana, la

diversidad y las actividades enzimáticas. Durante la remediación, los contaminantes y varias otras
sustancias alteran continuamente las comunidades microbianas. Las actividades microbianas del
suelo y la diversidad de las comunidades son indicadores críticos de la salud ecológica de los
suelos y, por lo tanto, es importante evaluar la dinámica de toda la comunidad microbiana en
lugar de solo microbios que degradan contaminantes durante la biorremediación. De acuerdo con
la eficiencia de la remediación, la salud del ecosistema del suelo también debe tenerse en cuenta
en la biorremediación de suelos contaminados con contaminantes como el aceite de motor. Por lo
tanto, el monitoreo continuo de la actividad microbiana es imperativo para mantener un
ecosistema de suelo sano y para lograr una biorremediación exitosa. La deshidrogenasa es una
enzima intracelular exclusiva en la mayoría de los microorganismos del suelo, y su actividad en el
suelo es una estimación del potencial oxidativo total de los microorganismos que se ha utilizado
como índice para monitorear la actividad microbiana. Asimismo, se utilizó el ensayo de
deshidrogenasa en suelos contaminados con gasoil como método sencillo para examinar los
posibles efectos inhibidores de los contaminantes sobre la población microbiana. Por lo tanto,
queríamos verificar si la respuesta de la actividad deshidrogenasa estaba en línea con el potencial
de biorremediación de diferentes tratamientos de suelos contaminados con aceite de motor.

Hubo un aumento gradual en la actividad de la deshidrogenasa en la muestra de suelo atenuada

naturalmente (T2) hasta los 30 días de incubación, y se inhibió a partir de entonces ( Figura 2 ). La
adición de fertilizantes inorgánicos al suelo contaminado con aceite (T3) inhibió en gran medida la
actividad enzimática. Claramente, la actividad deshidrogenasa se correlacionó bien con los
tratamientos bioaumentados (T4 y T5) que contenían las cepas bacterianas introducidas hasta por
90 días y la enzima se inhibió significativamente posteriormente. Al igual que con la
biodegradación de hidrocarburos, P. aeruginosa TPHK-4 funcionó mejor que P. putida TPHK-1 en la
expresión de deshidrogenasa durante la biorremediación de suelos contaminados con aceite de
motor. Por tanto, la bioaumentación mediada por esta cepa fue 2,6 veces mayor en comparación
con la atenuación natural al final de los 90 días. Nuevamente, la adición de una cepa bacteriana
junto con NPK a las muestras de suelo (T6 y T7) que contienen hidrocarburos meteorizados resultó
en una inhibición significativa de la biorremediación. En total, los resultados sobre la actividad
deshidrogenasa apoyan claramente los datos sobre la biodegradación de los TPH en diferentes
tratamientos del suelo hasta los 90 días. Por tanto, la respuesta observada de la enzima durante la
biodegradación de los hidrocarburos meteorizados presentes en el aceite de motor sugiere que el
ensayo de deshidrogenasa podría considerarse como un indicador para evaluar el potencial de
biorremediación de un suelo contaminado con aceites.
 4. Pirosecuenciación - Implicación para la biorremediación de TPH

Un cambio en la dinámica de las comunidades microbianas en los suelos se debe a las fuerzas
selectivas ejercidas por los contaminantes ambientales. Por lo tanto, vincular la biodegradación de
los contaminantes con la identidad filogenética de los microbios activos se ha convertido en un
desafío importante en los estudios de biorremediación. La distribución, diversidad y composición
de las comunidades bacterianas en diferentes tratamientos de suelos contaminados con aceite de
motor se exploraron a los 0 y 210 días después de la pirosecuenciación 454 de alto rendimiento,
ya que esto proporcionaría información detallada sobre la taxonomía y el potencial metabólico de
las bacterias en la biorremediación. Muy recientemente, Kuppusamy y col. (2016a, 2016b) implicó
por primera vez el ensayo de pirosecuenciación 454 en la biorremediación de suelos
contaminados con HAP a largo plazo y metales pesados. En particular, nuestro principal objetivo
en utilizando la pirosecuenciación para determinar el grado de supervivencia y crecimiento, en
términos de abundancia de población, de cepas bacterianas introducidas con el fin de validar los
datos obtenidos sobre su potencial en la biorremediación de suelo contaminado con aceite de
motor.

En total, nuestros resultados sobre la pirosecuenciación basada en ARN agruparon las secuencias
obtenido de todos los seis tratamientos del suelo (T2-T7) en 13 filos bacterianos diferentes. Los
resultados de 0 días sobre la abundancia relativa de comunidades bacterianas en diferentes
tratamientos de suelos contaminados a largo plazo con aceite de motor revelaron la presencia
predominante de Proteobacteria seguida de otros filotipos bacterianos que consisten en
Gemmatimonadetes, Actinobacteria, Bacteriodetes y Chloroflexi, mientras que las comunidades
menores incluyeron Acidobacteria, Chlorobi, Verrucomicrobia, Firmicutes y WPS-2. Los miembros
de Cyanobacteria y Nitrospirae estaban totalmente ausentes.

De manera similar, miembros de Proteobacteria, Actinobacteria y Acidobacteria se encontraban

entre los grupos filogenéticos bacterianos observados anteriormente en suelos contaminados con
hidrocarburos. También, Zhang y col. (2012) reportaron la dominancia de Proteobacteria seguida
de Actinobacteria en suelos contaminados por una fuga de hidrocarburos de petróleo pesado. Por
lo tanto, las Proteobacterias que son degradadores de TPH conocidos representaron casi 35 - 37%
del total de filos bacterianos en muestras de suelo de T2a y T3a. Se observó un aumento del 15-
18% en la población del filo bacteriano Proteobacteria en muestras de suelo (T4a, T5a, T6a y T7a)
que recibieron el inóculo de un degradador de TPH, P. putida TPHK-1 o P. aeruginosa TPHK-4 . Se
espera este resultado porque las bacterias introducidas pertenecen a Gammaproteobacteria, que
es una de las tres clases principales de Proteobacteria. La incubación de muestras de suelo con
diferentes tratamientos durante 210 días resultó en un cambio importante en las comunidades
bacterianas durante la biorremediación. Un aumento de 2 veces en las poblaciones bacterianas
pertenecientes a Proteobacteria en la muestra de suelo T2b está en clara conformidad con la
atenuación natural significativa resultante ( Figura 1 ) y sugiere que este grupo puede utilizar TPH
para el crecimiento y la proliferación. Además, un aumento ( norte 3 veces) en bacterias del filo
Acidobacteria sugirió su posible papel en la biorremediación de TPH en aceite de motor. En
particular, los miembros de Gemmatimonadetes disminuyeron significativamente de 28 a 0,8%, lo
que indica el enriquecimiento selectivo de degradadores de TPH (Proteobacteria y Acidobacteria)
para mediar la atenuación natural. El crecimiento de Actinobacterias, que suelen ser bacterias del
suelo Gram-positivas que pueden sobrevivir incluso en un ambiente seco, tampoco se vio
favorecido durante la biorremediación. La sorprendente disminución del 19% en las
Proteobacterias en la muestra de suelo tratada con fertilizantes inorgánicos (T3b) es un fiel reflejo
de la inhibición observada de la biorremediación de TPH. Ciertamente, Actinobacteria, cuya
población aumentó significativamente (50%) posiblemente bajo la influencia de fertilizantes
inorgánicos, no participó en la degradación de los TPH. El aumento significativo de miembros del
filo Proteobacteria en las muestras de suelo contaminadas con aceite de motor (23% en T4b y 31%
en T5b) que recibieron P. putida TPHK-1 o P. aeruginosa TPHK-4 corroboran claramente la
bioaumentación mediada por estas cepas introducidas. Además, hubo una disminución
significativa en las poblaciones de Actinobacteria en ambas muestras, lo que confirma que este filo
no está implicado en la biorremediación de TPH. Una vez más, es de particular interés la clara
confirmación de los resultados sobre la inhibición significativa en la biodegradación de los TPH en
muestras de suelo contaminadas con aceite que recibieron simultáneamente cepas bacterianas y
fertilizantes inorgánicos. Por lo tanto, los datos de pirosecuenciación mostraron una disminución
pronunciada (48% en T6b y 35% en T7b) en las comunidades bacterianas relacionadas con
Proteobacteria, seguido de un aumento significativo (62% en T6b y 58% en T7b) en la abundancia
poblacional de Actinobacteria. Claramente, nuestro estudio demuestra que las cepas bacterianas
introducidas que pertenecen al filo Proteobacteria pueden crecer en fracciones más altas de TPH
presentes en suelos contaminados con aceite de motor. Además, el tratamiento del suelo utilizado
para la bioestimulación signi inhibió significativamente la biodegradación de los TPH. Los hallazgos
del presente estudio de microcosmos sugieren que los datos de pirosecuenciación podrían usarse
para diseñar métodos para la biorremediación de suelos contaminados con contaminantes como
los hidrocarburos meteorizados.

CONCLUSIONES

En un estudio de microcosmos, evaluamos el potencial de biorremediación del suelo contaminado

a largo plazo con aceite de motor siguiendo diferentes enfoques, como atenuación natural,
bioestimulación y bioaumentación. Aunque el suelo contenía altas concentraciones de
hidrocarburos erosionados, la atenuación natural se produjo de manera apreciable; sin embargo,
el tratamiento del suelo con fertilizantes NPK a los niveles recomendados para la bioestimulación
resultó en una inhibición significativa de la atenuación natural. La introducción de cepas
bacterianas degradantes de hidrocarburos, P. putida TPHK-1 o P. aeruginosa TPHK-4 en muestras
de suelo contaminadas con aceite dio como resultado un pronunciado bioaumentación. Sin
embargo, un enfoque de combinación de bioaumentación y bioestimulación inhibió
significativamente la biorremediación de los TPH degradados. Estos resultados de biorremediación
estuvieron de acuerdo con la respuesta de la actividad deshidrogenasa en suelos contaminados
con aceite, lo que sugiere que el ensayo de esta enzima podría servir como indicador para evaluar
el potencial de biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos. Extracción de aceite
contaminado el suelo para los hidrocarburos meteorizados con HPCD, pero no con butanol,
predeciría mejor su disponibilidad para la biorremediación. Los datos sobre la pirosecuenciación
de ARNr 16S de muestras de suelo con diferentes tratamientos también coincidieron claramente
con su potencial de biorremediación. Sin embargo, en esta dirección se requieren más
investigaciones que involucren un mayor número de suelos contaminados con una mezcla
compleja de hidrocarburos meteorizados.