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Reducción selectiva de las neuronas GABA de la corteza cerebral en un modelo de gestación

tardía del trastorno del espectro alcohólico fetal

John F. Smiley una , si , * * , Mariko Saito una , si , Cynthia Bleiwas una , Kurt Masiello una , Babak Ardekani una ,
David N. Guilfoyle una , Scott Gerum una , Donald A. Wilson una , C , Csaba Vadasz una , si
una Instituto Nathan Kline de Investigación Psiquiátrica, Orangeburg, NY, EE. UU.
si Departamento de Psiquiatría, Centro Médico de la Universidad de Nueva York, Nueva York, NY, EE. UU.

C Departamento de Psiquiatría Infantil y Adolescente, Centro Médico de la Universidad de Nueva York, Nueva York, NY, EE. UU.

información del artículo resumen

Historia del articulo: Los trastornos del espectro alcohólico fetal (TEAF) están asociados con deficiencias cognitivas y conductuales. fi cits y disminución del volumen de todo el
Recibido el 7 de marzo de 2015 Recibido cerebro y la corteza cerebral. Los modelos de roedores han demostrado que los tratamientos posnatales tempranos, que imitan la toxicidad del etanol en el
en forma revisada el 20 de abril de 2015
tercer trimestre del embarazo humano, inducen agudamente una degeneración neuronal apoptótica generalizada y un comportamiento conductual
permanente. fi cits. Sin embargo, los efectos celulares y anatómicos duraderos de los primeros tratamientos con etanol todavía se entienden de manera
Aceptado el 20 de abril de 2015
incompleta. Este estudio examinó los cambios en el volumen, el grosor y la organización celular de la neocorteza que persisten en ratones adultos después del
tratamiento con etanol después del día 7 (P7). Volúmenes cerebrales post mortem, medidos por resonancia magnética dentro del cráneo y por fl El
desplazamiento del líquido de los cerebros aislados se redujo 10 mi 13% por tratamiento con etanol. La corteza cerebral mostró una reducción similar (12%)
Palabras claves:
causada principalmente por un área superficial más baja (9%). A pesar de estos grandes cambios, varias características de la organización cortical mostraron
Alcohol fetal
Interneuron poca evidencia de cambio, incluido el grosor cortical, el tamaño general de la neurona y la organización laminar. Las estimaciones del número total de

Neocortex neuronas mostraron una reducción en el nivel de tendencia de aproximadamente el 8%, debido principalmente al volumen cortical reducido pero a la densidad
Diferencia de género neuronal inalterada. Sin embargo, los recuentos de subtipos de calretinina (CR) y parvalbúmina (PV) de las neuronas GABAérgicas mostraron una
Grosor de la corteza sorprendente reducción del número de neuronas> 30%. Se encontraron efectos similares de etanol en ratones machos y hembras, y en cepas de ratones
Estereología C57BL / 6By y BALB / cJ. Nuestra fi Los hallazgos indican que la corteza tiene una capacidad sustancial para desarrollar una organización citoarquitectónica
normal después de la toxicidad postnatal temprana del etanol, pero hay una reducción selectiva y persistente de las células GABA que pueden contribuir al
desarrollo cognitivo y conductual duradero. fi cita en FASD.

2015 Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.

Introducción
Los trastornos del espectro alcohólico fetal (TEAF) son una de las causas más comunes de
discapacidad mental y afectan hasta el 1% de los niños nacidos en los Estados Unidos ( May et al.,
2009 ) Junto con el cognitivo de fi Según la memoria, la atención y la percepción sensorial, el FASD
está asociado con un volumen cerebral reducido que persiste hasta la edad adulta ( Bakoyiannis et
al., 2014; Norman, Crocker, Mattson y Riley, 2009 )
Los modelos animales han sido fundamentales para proporcionar información sobre las áreas
del cerebro y los procesos celulares que se ven afectados por el FASD. Han demostrado que los
efectos del etanol varían según el momento gestacional de exposición. Tratamiento durante el roedor
El período postnatal temprano, que se aproxima al tercer trimestre humano, causa una muerte celular
apoptótica generalizada en el cerebro y un comportamiento conductual duradero. fi cits ( Ikonomidou et
al., 2000; Sadrian, Wilson y Saito, 2013; Wilson, Peterson, Basavaraj y Saito, 2011; Wozniak et al.,
2004 ) Este es un período en el que la neurogénesis se ha completado en gran medida y el cerebro
está creciendo rápidamente ( Miller, 1988 ) Los tratamientos a principios de este período, alrededor del
momento del nacimiento en ratas, causan una neurodegeneración pronunciada en las regiones
talámicas hipotalámicas y ventrales, en comparación con los tratamientos alrededor de P3 que
afectan especialmente las regiones del tálamo dorsal y el hipocampo, o los tratamientos alrededor de
P7 que afectan especialmente la corteza cerebral ( Ikonomidou et al., 2000 ) Tratamientos anteriores
que modelan el fi El primer y segundo trimestres del desarrollo humano también producen cambios
anatómicos y de comportamiento, aunque son algo distintos de los efectos gestacionales tardíos ( Guerri,
1998; Sadrian et al., 2013 ) Si bien estos tratamientos de etanol anteriores no causan una apoptosis
tan extendida, se ha demostrado que interrumpen la neurogénesis y la migración celular ( Cuzon,
Yeh, Yanagawa, Obata y Yeh, 2008 )

** Autor correspondiente. Instituto Nathan Kline de Investigación Psiquiátrica, 140 Old Orangeburg Rd.,
Orangeburg, NY 10962, EE. UU. Tel .: þ 1 845 398 6601; fax: þ 1 845
398 5531.
Dirección de correo electrónico: smiley@nki.rfmh.org (JF Smiley).

http://dx.doi.org/10.1016/j.alcohol.2015.04.008
0741-8329 / 2015 Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.
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Comprender los efectos duraderos del FASD en el cerebro es un área de investigación en curso.
En adolescentes y adultos humanos, el FASD causa volúmenes reducidos de materia gris y materia
blanca en todo el cerebro anterior. Se han descrito reducciones de volumen de materia gris de hasta
el 10% en todas las regiones de la corteza cerebral, con cambios aún mayores en las estructuras
subcorticales, incluidos el hipocampo y el cuerpo estriado ( Coles et al., 2011; Lebel et al., 2012;
Nardelli, Lebel, Rasmussen, Andrew y Beaulieu, 2011; Norman et al., 2009 ) Los animales adultos que
fueron expuestos al alcohol fetal generalmente tienen un pro similar fi archivo de reducciones de
volumen ( Coleman, Oguz, Lee, Styner y Crews, 2012; Leigland, Ford, Lerch y Kroenke, 2013 ) En
algunos modelos, los estudios histológicos mostraron que estas reducciones de volumen
correspondían a un número reducido de neuronas ( Berman y Hannigan, 2000; Ieraci y Herrera, 2007;
Miller, 2006; Olney, 2004 ) Exámenes más detallados encontraron evidencia de longitud dendrítica
alterada y densidad de la columna vertebral ( Berman y Hannigan, 2000; Cui et al., 2010; Lawrence,
Otero y Kelly, 2012; Susick, Lowing, Provenzano, Hildebrandt y Conti, 2014 ), y encontró evidencia de
una organización alterada de las áreas sensoriales corticales ( Margret et al., 2006; Medina, Krahe y
Ramoa, 2005; Miller y Potempa, 1990 ) Además, en varias regiones cerebrales corticales y
subcorticales hay fi hallazgos de densidad celular GABAérgica reducida, lo que sugiere que los
circuitos inhibitorios en la corteza cerebral pueden ser especialmente vulnerables a la toxicidad del
etanol ( Coleman et al., 2012; Sadrian, Lopez-Guzman, Wilson y Saito, 2014; Sadrian et al., 2013 ) En
la actualidad, no está claro en qué medida estos cambios son el resultado directo de la pérdida
celular inducida por la toxicidad del etanol, o son efectos secundarios causados ​por la plasticidad
cerebral compensatoria que ocurre en respuesta al daño inducido por el etanol. En particular, se sabe
que la inhibición de la función GABA en el desarrollo postnatal temprano interrumpe el desarrollo
normal de los circuitos corticales ( Le Magueresse y Monyer, 2013 )
Recientemente demostramos que la corteza piriforme de ratón ha reducido las células GABA
inmunomarcadas con PV, junto con un aumento de la excitabilidad neuronal, una inhibición reducida
del pulso pareado y una mayor coherencia oscilatoria, causada por el tratamiento con etanol en las
etapas gestacionales temprana y tardía ( Sadrian et al., 2013, 2014 ) los fi los hallazgos sugieren que de fi
los cits de inhibición de GABAérgico pueden causar una característica pro fi archivo de electrofisiología
de fi cits. En el estudio actual, utilizamos un modelo de tratamiento de etanol gestacional tardío (P7 de
ratón) para determinar si una reducción similar en las células GABA está presente en toda la
neocorteza, y medimos el número total de neuronas para determinar en qué medida la reducción de
neuronas fue selectiva para GABAérgico neuronas También evaluamos el grosor cortical, el área de
superficie y la organización laminar, para evaluar las características generales de la disrupción
cortical del adulto causada por el etanol perinatal. Además, incluimos comparaciones de cepas de
ratones C57BL / 6By y BALB / cJ, ya que estas cepas tienen diferencias bien establecidas en la
preferencia del alcohol y se usan comúnmente como modelos animales genéticos en investigaciones
relacionadas con el alcohol ( Fish et al., 2010; Rodgers y McClearn, 1962; Vadasz, Baker, Joh, Lajtha
y Reis, 1982; Vadasz, Saito, et al., 2007 )
materiales y métodos
Sujetos y exposición al etanol
Se usaron 24 ratones, comparando 12 animales tratados con etanol con 12 animales tratados
con solución salina. Los dos grupos de tratamiento se combinaron para incluir números iguales de
ratones C57BL / 6By y BALB / cJ, con el mismo número de machos y hembras de cada cepa. Los
ratones fueron obtenidos originalmente del Laboratorio Jackson (Bar Harbor, Maine) en 1978, y
mantenidos por su hermano
hermanamiento en el
Instituto Nathan Kline. Las presas y sus camadas se alojaron individualmente en jaulas de ratones
estándar y se mantuvieron ad libitum
comida y agua. Las crías P7 se inyectaron por vía subcutánea con solución salina o etanol (2.5 g /
kg) dos veces a las 0 hy 2 h como se describió anteriormente ( Saito, Mao, Wang, Vadasz y Saito,
2007 ) de acuerdo con los métodos descritos originalmente para ratones C57BL / 6 ( Olney et al., 2002 )
Este tratamiento induce un nivel máximo de alcohol en sangre de w 0.5 g / dL cuando se recolecta la
sangre del tronco a las 0.5, 1, 3 y 6 h después de la segunda inyección de etanol, como se analizó
usando el Conjunto de reactivos de alcohol (Pointe Scienti fi c, Canton, MI, EE. UU.) ( Saito et al., 2007 )
Este nivel de alcohol es similar a los reportados por otros ( Wozniak et al., 2004; Young y Olney, 2006 )
Después de las inyecciones, los cachorros regresaron a la camada y se produjo el destete en P25 mi 30.
Todos los procedimientos fueron aprobados por el Instituto Nathan Kline IACUC y estaban de
acuerdo con las pautas de los NIH para el tratamiento adecuado de los animales.
Adquisición de datos de resonancia magnética
Después de la supervivencia a 72 mi A los 89 días de edad, los animales se anestesiaron
mediante inyección intraperitoneal con 200 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg de xilazina, y se
perfundieron transcardialmente con paraformaldehído al 4% heparinizado en tampón fosfato, pH 7,2.
Las cabezas de los ratones quedaron en fi Xative durante la noche. Se retiraron la piel, la mandíbula
inferior, las orejas y la punta de la nariz cartilaginosa y se colocó la cabeza en tubos de 50 ml en
azida de sodio al 0,01% en PBS durante 3 mi 7 días a las 4 C. La cabeza se transfirió luego a una
solución al 0.3% de MultiHance (gadobenate dimeglumine 529 mg / mL, Bracco Diagnostics Inc.,
Monroe Township, NJ, EE. UU.) Y azida de sodio al 0.01% en PBS y se balanceó durante 7 días a 4 C.
Un día antes de la resonancia magnética, la cabeza se colocó en un tubo de 15 ml con el reactivo de
contraste fl ombin (Sigma, catálogo # 317926). Un día después de la exploración, se extrajo todo el
cerebro y se almacenó en solución salina tamponada con fosfato con azida sódica al 0,03%.
Las imágenes fueron adquiridas en un sistema de perforación de 40 cm Agilent 7.0 T (Santa
Clara, CA). El inserto de la bobina de gradiente tenía un diámetro interno de 12 cm con una
resistencia de gradiente máxima de 600 mT / my un tiempo de elevación mínimo de 200 metro s con
bobinas de cuña personalizadas de segundo y tercer orden. Se utilizó una bobina de transmisión de
solenoide de 1,5 cm de diámetro interno de Morris Instruments (Ontario, Canadá) para la transmisión
y recepción de radiofrecuencia. Las imágenes utilizadas en este estudio fueron adquiridas con 150 metro
metro 3 resolución isotrópica y se tomaron de un conjunto de datos de mediciones de difusión de
resonancia magnética. Para el análisis de imágenes de 24 cerebros de mouse, se creó
automáticamente una máscara utilizando el software Automatic Registration Toolbox ( www.nitrc.org/
projects / art ) Las extracciones cerebrales individuales se corrigieron manualmente utilizando el
complemento ITK ( www.itk-snap.org ) software y consultando un atlas de cerebro de ratón ( Paxinos y
Franklin, 2004 )
Procesamiento histológico e inmunomarcaje.
Los volúmenes cerebrales completos, incluidos el cerebelo y el tallo cerebral, se midieron
mediante un fl método de desplazamiento de uid ( Dorph-Petersen et al., 2005; Scherle, 1970 )
Después de la crioprotección por inmersión de 2 días en glicerol tamponado al 20%, los cerebros se
dividieron en dos grupos que contenían 12 machos o 12 hembras, y cada grupo se incrustó en una
matriz de proteínas para el corte simultáneo y el procesamiento de tejidos ( Smiley y Bleiwas, 2012 )
Cerebros orientados coronalmente se seccionaron a 50 metro m de espesor. Se montó y se secó
una serie que incluía cada sexta sección consecutiva sobre portaobjetos de vidrio recubiertos con
alumbre de cromo y se procesó para la tinción de Nissl con tionina antes de la deshidratación y el
recubrimiento con Permount . Para el inmunomarcaje, las neuronas se visualizaron con antiPV de
ratón diluido a 1: 2500 (Sigma, catálogo # P3088) anti-CR de conejo diluido a 1: 5000 (Swant,
catálogo # 7699/4) o especificación de anti-neurona de ratón fi proteína c (NeuN) diluida a 1: 2000
(Millipore, catálogo # MAB377). Para el marcado de inmunoperoxidasa con anticuerpos CR y PV, se
expusieron series de cada sexta sección consecutiva a anticuerpos primarios durante 3 días en suero
normal al 1%, Triton X-100 al 0,03% y fosfato
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tampón, pH 7,4, antes de procesar con el método de estreptavidina-biotina-peroxidasa y visualizar la
etiqueta con diaminobencidina. Para inmuno fl uorescencia de las neuronas PV y NeuN, series de
cada 12a sección fueron expuestas a anticuerpos primarios como anteriormente,
seguido de la exposición durante la noche a los anticuerpos secundarios conjugados
con Alexa Flour 488 cabra anti-ratón o cabra anti-conejo (Invitrogen, catálogo # A11001 y # A11008).
Secciones procesadas para inmuno fl la fluorescencia se marcó adicionalmente con 600 nM de la
tinción nuclear 4 0 0 6 6 0 0 diamino-2-fenilindol (DAPI; SIGMA, catálogo # D9564). Inmuno fl Las
secciones marcadas con fluorescencia se cubrieron con cubreobjetos usando medio de montaje
acuoso Fluoro-Gel (Electron Microscopy Sciences, catálogo # 17985-s10).
sección manchada, y se hicieron trazados de la superficie del pial, el borde de la capa IV / V y el
borde de la sustancia blanca. Las áreas de superficie de neocorteza se derivaron de la longitud
sumada de los trazados de la capa I multiplicada por el espaciado de sección de 0.3 mm, y los
volúmenes de neocorteza fueron las áreas resumidas sumadas multiplicadas por el espaciado de
sección. El espesor de las capas superior e inferior se midió mediante un software que muestrea
periódicamente la distancia entre cada borde adyacente. El grosor total de la corteza fue la suma
local de las mediciones de la corteza superior e inferior. Los valores de grosor se muestran como
color fl en los mapas, y se obtuvieron estimaciones de grosor sumando los números de rectángulos de
cada color en las regiones de interés delineadas ( Figura 1 ) por

fi Se omitieron las estimaciones finales del grosor cortical, se omitieron las secciones rostrales de más
de una sección frente a la comisura anterior, para evitar medir la corteza rostral cortada
tangencialmente. Además, se omitió la corteza cingulada de la línea media para evitar distorsiones de
Espesor de neocórtex, volumen y área de superficie
grosor cerca del cuerpo calloso. Las mediciones alternativas del grosor cortical que incluían
secciones rostrales o corteza cingulada mostraron comparaciones de grupos casi idénticos (datos no
Todas las imágenes microscópicas se realizaron con el software ImageJ para controlar un
mostrados).
microscopio Nikon E-600 motorizado equipado con Ludl X,
Motores Y y Z, un microcator del eje z Heidenhain y una cámara digital Foculus FO 442 (Net GMBH,
Todas las medidas de forma cortical anteriores se realizaron por separado para los hemisferios
Alemania).
izquierdo y derecho. Sin embargo, como no hubo evidencia de diferencias hemisféricas, o
Para simplificar la identidad del límite fi cationes, incluimos neocorteza que se extendía
interacciones entre el tratamiento con etanol y el hemisferio, combinamos datos de los dos
lateralmente al borde de las áreas límbicas disgranulares (es decir, corteza piriforme, insular o
hemisferios para simplificar la presentación de los resultados.
ectorhinal; Figura 1 ) Medialmente, utilizamos el borde de la corteza retrosplenial en secciones
caudales donde el hipocampo era visible. En las secciones que eran más rostrales, utilizamos el
borde medio sagital con el cuerpo calloso. Rostrales al cuerpo calloso incluimos la corteza prefrontal
medial a la corteza dorsopeduncular, y también incluimos áreas orbitofrontales ( Paxinos y Franklin, Densidades y números de neuronas
2004 )
Ambos bidimensionales y tridimensional célula contando
Se utilizaron métodos. Para las mediciones bidimensionales de las neuronas PV y CR marcadas con
El grosor cortical, el área de superficie y el volumen se muestrearon como se describió inmunoperoxidasa, desarrollamos un método de umbral semiautomático utilizando el software
anteriormente ( Smiley et al., 2009 ) Usando el software ImageJ, se hicieron fotomontajes (310 píxeles ImageJ. En escala de grises, las imágenes digitales en mosaico se hicieron de corteza cerebral,
por mm) de cada Nissl- utilizando un

Figura 1. El volumen, el área superficial y el grosor se midieron en la región de neocorteza. (A) Se muestra que las secciones teñidas con Nissl ilustran la región de la neocorteza que fue muestreada para mediciones anatómicas. Las líneas
gruesas muestran los trazados de la superficie del pial, el borde de la capa IV / V y el borde de la sustancia blanca que se usaron para las mediciones de volumen y área de superficie. Para estas mediciones, se incluyeron las áreas infralímbica y
cingulada de la línea media, pero la corteza retrosplenial de la línea media se excluyó caudal a la sección más rostral a través del hipocampo. Lateralmente, se incluyó la corteza al borde de las áreas agranulares. Las medidas de grosor de la
corteza (líneas finas) excluyeron secciones rostrales a la sección frente a la comisura anterior; También se excluyó la corteza cingulada de la línea media. fl en los mapas En estos ejemplos, todas las secciones del polo frontal se muestran con
fines ilustrativos. Sin embargo, las secciones de más de una sección rostral a la comisura anterior (flechas) se omitieron del análisis principal. La diferencia entre estas dos parcelas de ejemplo es aproximadamente representativa de los grupos
más grandes: este animal tratado con etanol tenía aproximadamente un 4% de corteza más delgada y aproximadamente un 12% menos de superficie en comparación con este animal tratado con solución salina. Las líneas discontinuas a la
izquierda de la gráfica superior muestran la ubicación de las tres secciones en A. Las barras de escala muestran los límites del grosor cortical (513 y 1213 micras) que se incluyeron en el análisis de estos dos cerebros. Abreviaturas: AI, corteza
insular agranular; Cg, corteza cingulada; DP, corteza dorsopeduncular; Ect, corteza ectorhinal; IL, corteza infralímbica; Pir, corteza piriforme; Rs,
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10 objetivo (1.54 píxeles / micron fi nal magni fi catión). Para facilitar la separación de las células del
fondo local, las regiones del contorno de la corteza se dividieron en cuadrados de 65 micras de
ancho. Cada cuadrado se limitó a un valor establecido por encima del modo de su densidad de
escala de grises, y los objetos mayores de aproximadamente 6 metro m de diámetro se contaron
como células. Las ubicaciones de las celdas detectadas se mostraban en la imagen original, de modo
que las identificaciones de celdas no válidas fi los cationes pueden editarse manualmente. Se tomaron
medidas de la neocorteza del hemisferio izquierdo, entre las áreas cingulada y retrosplenial
medialmente, y la corteza ectorhinal e insular lateralmente, en 8 mi 10 secciones entre bregma y 4 mm
caudal a bregma ( Figura 2 C).
Las mediciones estereológicas tridimensionales para evaluar las densidades y el número de
células PV, CR y NeuN se realizaron utilizando solo los ratones C57BL / 6By. Para este propósito, el
método del disector óptico ( Gundersen et al., 1988 ) se utilizó en cada 12 50 metro m section through
the rostral-caudal extent of the left neocortex. A grid of optical disectors with 0.38 mm spacing was
placed on each section, so that 264 31 (media SD) se tomaron muestras de cada etiqueta de cada
animal. Para cada disector óptico, se registró la distancia a la pia y la sustancia blanca, de modo que
las mediciones de las células podrían clasificarse posteriormente por la profundidad de la corteza.
Inmuno fl Se utilizaron secciones marcadas con fluorescencia para contar células enteras PV o
núcleos NeuN. En cada sitio del disector, se obtuvo una pila az que contenía 6 imágenes con un
espacio z de 2 micras cerca de la superficie superior del tejido, utilizando un 40 objetivo de inmersión
en aceite con apertura numérica de 1.3. La configuración del obturador de la cámara se ajustó
automáticamente para mantener un rango de escala de grises promedio estrecho para todas las pilas
z capturadas. Se dibujaron cuadros de recuento en cada pila z, con una zona de protección superior
que consta de dos sectores de imagen, el cuadro de conteo de tres sectores y la zona de protección
inferior de un sector. Las dimensiones de la caja de conteo X e Y fueron 200 metro my 144 metro metro, medidas de tamaño de celda ( Dorph-Petersen, Pierri, Sun, Sampson y Lewis, 2004 ) fueron <0,03.
respectivamente, para PV y 34 metro m 34 metro m para NeuN. A de fi Identificamos los bordes de
los núcleos en las células NeuN, además recolectamos una pila enfocada idénticamente de la tinción
DAPI en cada sitio del disector, y simultáneamente vimos ambas etiquetas mientras contamos. Para
minimizar la contracción del tejido, todos fl secciones fluorescentes se almacenaron a las 4 C e
imágenes dentro de 1 semana de cubreobjetos. Las mediciones del grosor de la sección, tomadas
por triplicado en cada sección, no mostraron signos significativos. fi no se puede contraer el eje z del
original 50 metro metro. Estereológico
muestreo de Se hicieron células CR en
tejido marcado con inmunoperoxidasa, donde la contracción del eje z facilitó ef fi Muestreo de un mayor
número de células por disector. Los métodos de muestreo fueron los utilizados para las células PV, excepto
el uso de un 50 objetivo de inmersión en aceite (apertura numérica 1.3) y corrección de las densidades
celulares para la contracción del eje z en cada cerebro. El grosor de la sección final tendió a ser más
delgado en los animales tratados con etanol en comparación con los animales tratados con solución salina
(13.6 0.6 y 14.1 0,3 metro m, respectivamente, media DAKOTA DEL SUR, pags ¼ 0,09).
Estimaciones de precisión de medición para densidades celulares y números ( Dorph-Petersen et
al., 2009 ) mostró coeficiente medio fi clientes de error (CE) <0.1. Estimaciones de precisión para
volúmenes de neocorteza unilateral, utilizando ecuaciones para el método Cavalieri ( Gundersen,
Jensen, Kiêu y Nielsen, 1999 ), mostró CE media ' s <0,02.
Tamaño de la neurona y densidad de inmunomarcaje
El tamaño celular se midió utilizando el método nucleador ( Gundersen, 1988 ) Las longitudes
promedio de tres líneas isotrópicas, dibujadas desde el centro aproximado de cada celda hasta su
borde, se midieron en cada celda muestreada por conteo celular estereológico. El CE ' s para todas las

Figura 2. Se muestran ejemplos de los métodos utilizados para medir la densidad celular, el tamaño y la densidad de etiquetado celular. (A y B) Para el recuento celular bidimensional, se contaron las células PV inmuno-marcadas con peroxidasa (A) o las células CR (B) a
través de la profundidad de la corteza. (C) La ubicación de la corteza utilizada para las mediciones bidimensionales de la densidad celular se muestra en una reconstrucción de un cerebro, hecha de imágenes de la cara del bloque tomadas durante el corte. Se tomaron
muestras de 8 a 10 secciones (líneas blancas) entre bregma y 4 mm caudal a bregma. (D) Para recuentos de neuronas tridimensionales, cada 12 50 metro m muestra de sección gruesa a través de neocorteza. (E) Se tomaron muestras de las neuronas en la neocorteza
utilizando el método del disector óptico, con una cuadrícula de sitios de muestreo (cuadrados negros) espaciados uniformemente. (F) Se muestra un ejemplo de la caja de conteo del disector óptico utilizada para muestrear neuronas PV. El tamaño de la caja es 200 metro m
de ancho. La flecha muestra la ubicación de la neurona PV contada que se muestra en G a continuación. (G) Se evaluó la densidad y el tamaño del marcaje celular para las neuronas contadas en los disectores ópticos. La densidad de etiquetado para cada celda fue la
diferencia entre la densidad media de la escala de grises en el centro de la celda (círculo negro) y la densidad modal-gris en una banda ubicada 20 mi 28 micras del centro celular. El tamaño celular se evaluó midiendo tres líneas isotrópicas (líneas negras) desde el centro
celular hasta su periferia. Abreviatura: wm, materia blanca.
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La densidad de inmunomarcaje también se tomó de cada célula. La densidad de etiquetado se Resultados

evaluó como la diferencia absoluta en los valores de escala de grises entre la densidad media en un
círculo de 5 micras de diámetro en el centro de la celda etiquetada y el valor de escala de grises Volumen total del cerebro y peso corporal
modal muestreado en una banda circular ubicada en un radio de 20 mi 28 micras desde el centro
celular ( Figura 2 SOL). Volúmenes cerebrales completos medidos por fl desplazamiento de líquido de paraformaldehído aislado fi los

cerebros xed eran aproximadamente un 13% más pequeños en ratones tratados con etanol en comparación con

los ratones tratados con solución salina ( p < 0,0001, tabla 1 ) Una reducción similar (10%, p < 0.001) se obtuvo al

obtener imágenes de los cerebros con IRM antes de extraerlos del cráneo. Los ratones tratados con etanol

análisis estadístico también tuvieron aproximadamente un 8% de reducción de peso corporal ( pags ¼ 0.015), lo que sugiere que un

volumen cerebral más bajo puede ser causado, al menos en parte, por la disminución del tamaño corporal. Sin

Los datos se sometieron a un análisis univariado de covarianza (ANCOVA) utilizando el Modelo embargo, el análisis de correlación parcial no mostró una relación estrecha entre el peso corporal y el volumen

lineal general tal como se implementó en el ver IBM SPSS ver. 22 programa. Además del análisis cerebral ( r ¼ 0,155,

principal de los efectos del etanol, incluimos números iguales de ratones BALB / cJ y C57BL / 6By,
divididos por igual entre machos y hembras, para explorar los efectos de la tensión y el sexo en pags ¼ 0,48, utilizando el sexo y el tratamiento con etanol como covariables). Las diferencias entre las

nuestras mediciones anatómicas. Por estas razones, los efectos del etanol se probaron utilizando cepas de ratón y los sexos en el peso corporal y otras medidas se analizan en una sección separada

ANCOVA univariante, incluido el sexo y la tensión como covariables. La comparación adicional entre a continuación.

sexos o entre cepas utilizó el tratamiento con etanol, y cepa o sexo, como covariables.
Volumen de neocórtex, área de superficie y grosor

El volumen de la neocorteza, medido en secciones teñidas con Nissl, fue aproximadamente un

En las mediciones de densidad celular bidimensional, la densidad celular PV en un animal BALB 12% más pequeño en los animales tratados con etanol ( p < 0.001). Las mediciones del área

/ cJ fue un valor estadístico atípico, de fi ned como mayor de 2 desviaciones estándar de la media del superficial y el grosor mostraron que el volumen neocortical reducido se debió principalmente al área

grupo. Si bien este punto de datos se omitió del análisis principal, un análisis alternativo que incluyó superficial reducida (9%,

este dato también se describe en el Resultados sección. Un segundo animal BALB / cJ fue excluido p < 0,001; Figura 1 ) La pequeña reducción del grosor cortical (3%) no fue estadísticamente significativa fi

de los análisis de inmunohistoquímica PV y CR porque estas etiquetas fallaron, aparentemente no puedo pags ¼ 0.13, tabla 1 )

debido a un pobre fi Xation. En el análisis de volumen de IRM de todo el cerebro, se excluyó del
análisis un ratón hembra C57BL / 6By tratado con etanol debido a la baja calidad de imagen. Densidades y números de neuronas

Los recuentos celulares se usaron para determinar si los volúmenes corticales reducidos
correspondían a un número reducido de neuronas ( Figura 2 ) Inicial

tabla 1
Resumen de medidas anatómicas.

una Comparar cepas una Compara sexos

Comparar grupos

si % CV
SAL N EtOH % CV Relación N pags Relación SAL Relación EtOH Ratio SAL Ratio de EtOH

ETOH / SAL valor

C57BL / C57BL / hombre / mujer hombre / mujer
BALB / c BALB / c

Peso corporal (g) 21,3 (13) 12 19,6 (14) 12 0,92 ** 1.10 1.12 þþ 1.20 1,21 þþ
Volumen cerebral (cm 3)
Resonancia magnética 0,47 (4) 11 0,42 (8) 12 0,90 ** * * 1.01 1.08 1.02 0,98
Desplazamiento de fluido 0,41 (4) 12 0,36 (7) 12 0,87 ** * * 0,98 1.02 0,98 0,97
Corteza (ambos hemisferios)
Volumen (mm 3) 60 60 (8) 12 53 (9) 12 0,88 ** * 1.01 1.12 1.00 1.03
Área de superficie (mm 2) 83 (5) 12 75 (6) 12 0,91 ** * * 1.02 1.08 1.01 1.01
Grosor ( metro metro) 900 (6) 12 870 (6) 12 0,97 0,99 1.07 1.03 1.02
Densidad de neuronas 2D (células / mm 2)

PV 248 (12) 10 202 (25) 12 0,81 ** * * 0,81 0,73 þþ 0,79 0,80 þþ

CR 116 (dieciséis) 11 95 (14) 12 0.82 *** 1.22 1.16 þþ 1.24 1.07 þ
3-D neuron density.(cells/mm 3 10 3)
PV 10.4 (30) 6 7.3 (28) 6 0.71 ** e e 0.58 0.64 þþ
CR 3.2 (7) 6 2.4 (10) 6 0.74 *** e e 1.09 0.92
NeuN 185 (5) 6 181 (9) 6 0.98 e e 1.00 1.07
Neuron number ( 10 3, left hemisphere only)
PV 310 (25) 6 206 (27) 6 0.67 *** e e 0.64 0.68 þþ
CR 98 (11) 6 68 (12) 6 0.69 *** e e 1.21 0.97
Neun 5582 (8) 6 5119 (11) 6 0.92 # e e 1.11 1.13 þ
Neuron label density
PV 34.9 (8) 6 33.1 (19) 6 0.95 – e 0.92 0.87
CR 44.2 (5) 6 43.8 (9) 6 0.99 e e 1.03 1.14
NeuN 30.5 (8) 6 29.4 (13) 6 0.96 e e 0.92 1.10
Neuron size (radius in microns)
PV 5.9 (2) 6 6.0 (3) 6 1.03 e e 1.01 0.99
CR 5.1 (3) 6 5.1 (3) 6 1.00 e e 1.05 1.06 þþ
NeuN 5.5 (2) 6 5.4 (5) 6 0.98 e e 1.03 0.98

# p < 0.1,* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, for ANCOVA comparisons between treatment groups, þ p < 0.05, þþ p < 0.01, for ANCOVA comparisons of strain or gender, using both SAL and EtOH animals.

a Values show ratios between strains or sexes within each treatment group.
b Percent coef fi cient of variation (% C.V.) ¼ 100 S.D./mean.
576 J.F. Smiley et al. / Alcohol 49 (2015) 571 e 580

2-dimensional counts of PV- and CR-immunoreactive GABA cells showed reduced densities of both
cell types (PV, 19%, p < 0.001; CR 18%, p < 0.001). This analysis excluded one PV cell-density
measurement that was a statistical outlier ( Fig. 3 A). However, an alternative analysis that included this
measurement showed a similar effect of ethanol (16% lower PV, p < 0.02). While there were also
strain and sex differences in cell densities, similar ethanol effects were seen in both BALB/cJ and
C57BL/6By mice, and in male and female animals ( Fig. 3 A e B and Table 1 ).
Comparisons of mouse strains and sexes
Table 1 provides an overview of strain and sex comparisons for our anatomical measurements.
While several measurements revealed strain and sex differences, these differences (expressed as
ratios in Table 1 ) were generally comparable in the saline-treated and ethanol-treated groups,
indicating that the two strains and two sexes were similarly affected by P7 ethanol treatment. One
possible exception was cortex volume, which showed some evidence of greater ethanol-induced
reduction in BALB/cJ compared to C57BL/6By mice. However, the ethanol

Three-dimensional cell counts using the optical disector method in the C57BL/6By animals con fi rmed
the reductions of PV (29%,
p < 0.01) and CR (26%, p < 0.001) neuron densities seen with 2-dimensional measurements ( Fig. 3 C).
Estimates of total numbers that incorporate reduced cortex volume as well as neuron density
indicated striking reductions of PV (34%, p < 0.001) and CR neurons (32%, p < 0.001; Table 1 ).
strain interaction effect
was not statistically signi fi cant ( p ¼ 0.16, ANCOVA). Several strain and sex differences were found. In
both treated and untreated animals, bodyweight was about 20% greater inmales than females ( p < 0.00001,
ANCOVA), and about 10% greater in C57BL/6By mice than BALB/cJ mice ( p < 0.01). Similar strain
and sex differences were not seen in whole-brain or neocortex volumes ( p values > 0.10).

In contrast to the GABA cell types, 3-dimensional counts of total neurons, identi fi ed by NeuN
immunolabeling, showed essentially unchanged neuron densities in ethanol-treated compared to
salinetreated animals (2% lower in ethanol-treated animals, p ¼ 0.66). Calculation of total neuron
number showed a trend-level reduction of 8% ( p ¼ 0.06) in the ethanol-treated animals ( Table 1 ). In
order to explore the cortical distribution of these changes, the 3-dimensional neuron density
measurements were separated by their rostral-caudal position across the cortex, or by their position
in the depth of the cortex. These separations indicated that ethanol ’ s effects on neuron densities were
similar across regions and layers of the neocortex ( Fig. 4 ).
Three-dimensional estimates of PV neuron number in C57BL/ 6By mice showed that females had
as much as 36% greater PV neuron number than males ( p < 0.01; Table 1 ), and 2-dimensional density
measurements in C57BL/6By and BALB/cJ mice showed a similar gender effect ( p < 0.01; Fig. 3 , Table
1 ). This is consistent with a previous report of female > male difference in PV neuron number in rat
prefrontal cortex ( Wischhof, Irrsack, Osorio, & Koch, 2015 ). Additional gender comparisons from
3-dimensional measurements in C57BL/6By mice showed slightly larger CR neurons ( p < 0.01), and
greater total neuron numbers in males ( p < 0.05). Strain comparisons, from 2-dimensional
measurements, showed higher density of PV neurons ( p < 0.0001, ANCOVA), and lower density of CR
neurons ( p < 0.01), in BALB/CJ compared to C57BL/6By mice ( Fig. 3 , Table 1 ).

Neuron immunolabeling density and size

A possible explanation of the fi nding of reduced neuron number is that neurons have reduced
immunolabeling, for example, due to lower protein expression. However, measurement of labeling
density in PV, CR, or NeuN cells counted with 3-dimensional methods did not reveal signi fi cant
effects of ethanol treatment ( Table 1 ). Neuron size was additionally measured for all counted
neurons. Group differences were not signi fi cant for any cell type ( Table 1 ). However, separation of
PV-positive cells by depth of cortex showed evidence of larger cells in approximately the upper 60%
of the cortex, across rostral-caudal sections ( Fig. 5 ). This size difference was statistically signi fi cant if
only cells in the upper 60% of cortex were evaluated ( p < 0.05).
Discussion
The ethanol treatment used in this study was previously shown to cause widespread cell death
across the cerebral cortex within the
fi rst few days after treatment ( Olney, 2004; Saito et al., 2007; Wilson et al., 2011 ). The goal of the
present study was to determine to what extent the cell loss and cytoarchitectonic disruption caused by
this treatment persist in the adult (>P70) neocortex. The

fi ndings showed several gross features of cortical organization to be largely unaltered, including
cortical thickness and total neuronal density, size, and laminar organization. However, additional

Fig. 3. Counts of parvalbumin (PV) and calretinin (CR) neurons in neocortex were done by 2-dimensional (2D) and 3-dimensional (3D) methods. Filled symbols show counts from female animals. (A) In the initial 2-dimensional cell counts in
BALB/cJ sample, one saline-treated animal was excluded due to poor labeling. A second saline-treated animal had PV neuron density that was a statistical outlier (arrow). (B) 2-Dmeasurements in C57BL/6By animals showed ethanol effects
similar to that of BALB/cJ animals. ANCOVA analysis of all 2dimensional measurements showed a highly signi fi cant effect of ethanol in both CR and PV neurons, and a female >male gender difference in PV neuron density. Additionally, there was
evidence of strain differences, with higher PV neuron density and lower CR neuron density in BALB/cJ mice. (C) 3-D measurements of PV and CR neuron density in the C57BL/ 6By animals con fi rmed the ethanol and gender differences seen with
2-D measurements. * p < 0.05, ** p < 0.01, [*] p < 0.05 if outlier is omitted.
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Fig. 4. Three-dimensional cell density measurements in C57BL/6By mice were further separated by percent depth of cortex, or by rostral-caudal section. It should be noted that these histograms give a qualitative overview of local differences: each
data point includes only about 30 counted cells, and individual points lack statistical power to show de fi nitive changes. (A e C) The lower density of PV and CR cells in ethanol-treated animals was similar in all cortical layers. Total neurons, identi fi ed
by NeuN-cell immunolabeling, showed similar laminar distributions in the two groups. (D e F) The lower density of PV and CR cells in ethanol-treated animals was similar across rostral-caudal sections. NeuN-cell densities showed very similar
rostral-caudal distribution in the two groups. In graphs of rostral-caudal sections, a few brains had more than 11 sections, and the fi nal sections with small cell numbers were omitted. Closed circles ¼ saline-treated, and open triangles ¼ ethanol-treated
animals. Arrows ¼ the approximate location of the rostral edge of the anterior commissure, which was used to align the rostral-caudal sections from different animals.

measurements demonstrated an overall reduction of about 12% in cortex volume, accompanied by
about an 8% decrease of total neurons, and a comparatively severe reduction of approximately 30%
of the GABA neuron subtypes that were sampled. At least within the resolution of our sampling
paradigm, these changes were similar across the rostral-caudal extent of neocortex, and across all
cortical layers.
Several mechanisms might explain the selective de fi cit of GABA neurons. One possibility is that
GABA cells are selectively sensitive to ethanol toxicity at P7. At this time, both GABA and non-GABA
cortical neurons are quite immature. The major wave of cortical neurogenesis is completed by several
days before birth ( Fairén, Cobas, & Fonseca, 1986; Rymar & Sadikot, 2007 ), and by about P3 e 7,
most neurons have ended their migration to their fi nal cortical positions ( Miyoshi et al., 2010 ). The
postnatal development of GABA cells to their mature form is an ongoing process that continues to
adulthood ( del Rio, de Lecea, Ferrer, & Soriano, 1994; Jiang, Huang, Morales, & Kirkwood, 2005 ).
During the fi rst postnatal week, there is an onset of rapid growth, including rapid increases of
presynaptic terminals and inhibitory and excitatory postsynaptic currents ( Le Magueresse & Monyer,
2013 ). It has been proposed that ethanol toxicity in P7 cortex is mediated in large part by inhibition of
NMDA receptors and stimulation of GABA-A receptors ( Ikonomidou et al., 2000 ). However, it has not
been directly investigated whether P7 ethanol treatment selectively eliminates
GABA cells, in part because most GABA-related cell markers are poorly expressed at this age ( del
Rio et al., 1994; Lema Tomé et al., 2008 ).
There is also evidence that neurogenesis after P7 ethanol treatment can shape the fi nal adult
composition of cortical neurons. For example, Coleman and colleagues ( Coleman et al., 2012 )
demonstrated increased neurogenesis in the mouse dentate gyrus in response to P7 ethanol
treatment. In the cerebral cortex, application of hypoxia tomice at P3 e P10 caused increased
neurogenesis, with new neurons at least partially originating from glial fi brillary acid protein
(GFAP)-expressing cells in the cortical plate ( Bi et al., 2011; Fagel et al., 2006 ). The authors
suggested that this might account for the observation that the nearly 30% neuron loss seen at P11
was no longer detectable at day P18. Notably, they also found that this normalization of total neuron
number was not accompanied by a corresponding recovery of PV- and CR-GABAergic cells, which
continued to show a 30% reduction in adult animals ( Fagel et al., 2009 ). If similar mechanisms occur
in our ethanol-treated mice, these fi ndings suggest that the de fi cit in GABA number may re fl ect
compensatory neurogenesis that occurs mainly in nonGABAergic neurons of the cortex.

Yet another possible explanation for selectively reduced GABA cells is that they are still present
in the cortex, but have suppressed expression of GABA-related proteins such as PV and CR. This
scenario was supported in the P3 e P10 hypoxia-treated mouse model,
578 J.F. Smiley et al. / Alcohol 49 (2015) 571 e 580
Fig. 5. Parvalbumin neuron size was slightly larger in the ethanol-treated animals. (A) Separation of size measurements by depth of cortex showed that increased size was present mainly in the upper 60% of cortical depth. (B) Separation of
parvalbumin cell-size measurements by rostral-caudal sections indicated that this size difference was similar throughout neocortex.
where a 30% reductionwas found in immunolabeled GABAneurons, but was not seen using GABA
cells identi fi ed by GAD67-enhanced green fl uorescence protein (EGF) in transgenic mice ( Komitova
et al., 2013 ). The authors additionally showed that the density of GABA cell immunolabeling could be
upregulated in these mice by exposure to an enriched environment. However, it remains to be
demonstrated whether a similar explanation is relevant to our ethanol reduction of GABA cells.
Notably, Komitova et al. (2013)
showed that the hypoxia-induced reduction of GABA cell number was accompanied by reduced
immunolabeling density in PV and somatostatin cells, and by reduced cell diameter in PV cells. In
contrast, we did not fi nd reduced PV- or CR-immunolabeling density, and found some evidence for
increased diameter of PV cells.
Additionally, there is some neurogenesis of cortical GABAergic interneurons that continues
postnatally, originating from stem cells in the subventricular zone and white matter beneath the
cingulate cortex ( Inta et al., 2008; Le Magueresse et al., 2011; Riccio et al., 2012 ). These stem cells
produce GABA cells mainly in the fi rst postnatal week, and less in subsequent weeks. It is possible
that ethanol toxicity at P7 inhibits this source of cortical GABA cells. However, descriptions of these
cells indicated that they are a comparativelyminor fraction of the total GABA cell population, that they
include CR but not PV cells, and that they migrate mainly into cortical layers V and VI. Therefore, if
ethanol inhibits this late wave of GABA cell neurogenesis, it probably would account for only a fraction
of the GABA cell reduction we observed in CR and PV cells throughout the depth of cortex.
It remains to be demonstrated whether other types of cortical GABA cells are similarly reduced by
P7 ethanol treatment. The CR and PV cells that we counted comprise about 1/3 of the total GABA
population, and represent non-overlapping and distinct subtypes of GABA cells ( Miyoshi et al., 2010 ).
Whereas PV cells are often fastspiking feed-forward cells, CR cells are typically non-fast spiking
bipolar or double-bouquet type cells ( Kawaguchi & Kondo, 2002 ). Whereas rodent PV cells originate
from neurogenesis in the medial ganglionic eminence, CR cells originate in the caudal ganglionic
eminence ( Miyoshi et al., 2010; Rymar & Sadikot, 2007 ). Our results extend previous fi ndings that
immunolabeled PV cells are reduced in animal models of late gestational ethanol toxicity, in frontal
cortex ( Coleman et al., 2012 ), cingulate cortex ( Moore, Ruygrok, Walker, & Heaton, 1997 ), piriform
cortex and hippocampus ( Sadrian et al., 2014 ), the medial septal area ( Mitchell, Paiva, &
Heaton, 2000 ), and striatum ( De Giorgio, Comparini, Intra, & Granato, 2012 ). Our fi ndings seem to
contradict a fi nding of increased CR and unchanged PV cell density in rat cortex, after ethanol
treatment at days P2 e P6 ( Granato, 2006 ). In early gestation models of alcohol toxicity, reduced
GABA cell density has also been observed, but its features are somewhat different. For example,
treatment of monkeys in early gestation or throughout pregnancy caused decreased GABA cell
density, but it was not proportionally greater than the decrease of total neuron density ( Miller, 2006 ).
In mouse piriform cortex, ethanol causes reduced PV cell density at both late and early gestational
periods, but in the hippocampus it reduces PV cell density with late treatment, but increases it with
early treatment ( Sadrian et al., 2014 ). It might be expected that widespread death in the early
postnatal cerebral cortex would cause the adult cortex to be thinner, or alternatively to have
decreased total neuron density. However, our
fi ndings showed that the reductions in cortical volume (12%) and total neuron number (8%) were
accompanied mainly by about 9% lower surface area, with very minor net reductions in neuron density
(2%) and cortical thickness (3%) that were not signi fi cant in our sample. These fi ndings suggest that
the immature cortex has signi fi cant capacity to recover from the cell death caused by P7 ethanol,
either by upregulating neurogenesis as discussed above, or perhaps additionally by reorganizing the
remaining neurons into approximately normal cortical organization in the adult animal. Previous
mapping of cortical thickness also revealed evidence of dynamic response to ethanol treatment. In
rats, ethanol applied throughout gestation caused slightly thinner cortex at P11, but cortical thickness
was nearly normal by P60, even though reduced volume and surface area persisted ( Leigland et al.,
2013 ). In adolescent and adult FASD subjects, cerebral cortex was found to be thicker than controls,
perhaps re fl ecting compensatory development after ethanol-induced damage ( Fernández-Jaén et al.,
2011; Sowell et al., 2008; Yang et al., 2012 ). However, there is also a
fi nding of thinner cortex in FASD subjects ( Zhou et al., 2011 ). Besides decreased GABA cell labeling
and total neuron number, our measurements of total neuron density, laminar organization, and
cortical thickness did not show obvious changes in ethanoltreated animals. Additional analyses of
speci fi c areas and cell types might reveal anatomical changes beneath the resolution of our
measurements. For example, disrupted columnar organization was found in somatosensory and
visual cortex after prolonged
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gestational ethanol exposure ( Margret et al., 2006; Medina & Ramoa, 2005; Miller & Potempa, 1990 ).
Another study showed changes in pyramidal cell dendritic length after early postnatal ethanol ( Granato
& De Giorgio, 2014 ).
We additionally tested whether C57BL/6By and BALB/cJ mouse strains have different long-term
responses to early ethanol treatment. There is strong evidence that alcohol consumption phenotypes
are heritable, and these strains are commonly used as genetic animal models of alcohol consumption
and alcoholism ( Rodgers & McClearn, 1962; Vadász, Fleischer, LaFrancois, & Mao, 1996 ). We and
others have shown that C57BL/6J mice have alcohol-preferring behavior, in contrast to
alcohol-avoiding behavior in BALB/cJ mice ( Rodgers & McClearn, 1962; Vadasz, Saito, et al., 2007 ).
In the present experiments, we did not observe differences between these strains in the long-term
cellular de fi cits caused by P7 alcohol toxicity. However, our cell density measurements showed strain
differences in the normal complement of cortical GABA cells in these strains, with proportionally fewer
PV neurons and more CR neurons in C57BL/6By mice. These differences may be relevant to the
alcohol-related behaviors that distinguish these strains, similar, for example, to previously described
differences in dopamine cell number ( Vadasz, Smiley, et al., 2007 ). In summary, our fi ndings in adult
animals showed a modest trend-level reduction of total cortical neuron number, accompanied by a
proportionally much greater reduction in the number of immunolabeled PV and CR neurons. It
remains to be determined whether the reduction of GABA cells represents actual cell loss, or
alternatively represents reduction of GABA-related proteins in these cells. In either case, our fi ndings
suggest that GABAergic neurotransmission is altered throughout the cerebral cortex. GABA is known
to be a critical modulator of brain development, and its reduction during critical periods alters normal
development of cortical circuits ( Le Magueresse & Monyer, 2013 ). In the adult, reduced GABA
neurotransmission is thought to contribute to hyperexcitability and disrupted cortical oscillations that
have been noted in various developmental disorders ( Sadrian et al., 2013 ). Our
fi ndings that several gross features of cortex, such as thickness and laminar organization, are largely
normal in the adult animal, is consistent with previous observations that the cortex has substantial
capacity to overcome perinatal disruption.
Acknowledgments
This research was supported by NIAAA grant AA023181 and NIMH grant MH086385.
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