Photodynamic therapy and antitumor immunity

Autores: Ana P. Castano*, Pawel Mroz* and Michael R. Hamblin*‡

Summary

La terapia fotodinámica (PDT) utiliza fotosensibilizadores no tóxicos y luz visible inofensiva en

combinación con oxígeno para producir especies de oxígeno reactivas citotóxicas que matan las
células malignas por apoptosis y / o necrosis, apagan la microvasculatura tumoral y estimulan el
sistema inmunitario del huésped. A diferencia de la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia que
son principalmente inmunosupresoras, la PDT causa inflamación aguda, expresión de proteínas de
choque térmico, invasión e infiltración del tumor por leucocitos, y podría aumentar la
presentación de antígenos derivados de tumores a las células T.

El principio de la terapia fotodinámica (TFD) se propuso por primera vez hace más de 100 años.
Una revisión reciente en Nature Reviews Cancer por Rakesh Jain y sus colegas describieron
algunos de los hitos históricos en el desarrollo de la TFD como un tratamiento contra el cáncer.
Muchos de los fotosensibilizadores (PS) que se han estudiado desde que se propuso PDT por
primera vez se basan en un núcleo similar a la porfirina3. Los PS funcionan como catalizadores
cuando absorben la luz visible y luego convierten el oxígeno molecular en un rango de especies de
oxígeno altamente reactivas (ROS). Se ha demostrado que las ROS que se producen durante la TFD
destruyen tumores mediante mecanismos multifactoriales (figura 1). PDT tiene un efecto directo
en las células cancerosas, produciendo muerte celular por necrosis y / o apoptosis6. La PDT
también tiene un efecto en la vasculatura tumoral, por lo que la iluminación y la producción de
ROS provocan el cierre de los vasos y, posteriormente, priva al tumor de oxígeno y nutrientes7,8.
Finalmente, la PDT también tiene un efecto significativo sobre el sistema inmune9–11, que puede
ser inmunoestimulante o inmunosupresor. La mayoría de las terapias contra el cáncer
comúnmente utilizadas son inmunosupresoras.

Se sabe que la quimioterapia y la radiación ionizante administrada en dosis suficientes para

destruir tumores son tóxicos para la médula ósea, que es la fuente de todas las células del sistema
inmunitario, y la neutropenia y otras formas de mielosupresión son a menudo la toxicidad
doselimitadora de estas terapias. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que las dosis bajas de
radiación ionizante12,13 o quimioterapia14 pueden tener efectos inmunoestimuladores, incluida
la inducción de proteínas de choque térmico15. Menos conocido es el hecho de que la cirugía
mayor también puede tener un efecto inmunosupresor que conduce a una disminución
significativa de la función de los linfocitos y las células asesinas naturales (NK) 16. La terapia ideal
contra el cáncer no solo destruiría el tumor primario, sino que al mismo tiempo provocaría que el
sistema inmunitario reconozca, rastree y destruya las células tumorales restantes, ya sea en el sitio
del tumor primario o en las micrometástasis distantes. La TFD, en común con algunas otras
terapias locales contra el cáncer como la crioterapia17 y la hipertermia18, podría tener estas
propiedades deseables. La importancia del sistema inmune en la respuesta del huésped contra el
cáncer se ha estudiado durante muchos años, pero la inmunoterapia solo se acepta como una
opción de tratamiento en algunos casos. Se han reportado más de 700 casos de regresión
espontánea en tumores avanzados en pacientes19, incluyendo melanoma maligno, carcinoma
hepatocelular, metástasis pulmonares después de la destrucción del carcinoma primario de células
renales y la enfermedad de Hodgkin. Además, tales regresiones espontáneas normalmente
ocurren después de una infección. La inmunoterapia contra el cáncer (incluso si no se reconoce
como tal) tiene una larga historia. Los egipcios notaron que la apertura quirúrgica del sitio del
tumor podría producir una regresión tumoral, se podría suponer a través de la generación de
infección y la activación del sistema inmune20. Hace más de 100 años, un cirujano de Nueva York,
William Coley21, descubrió que algunas infecciones podían producir regresión tumoral, y creó una
"vacuna" basada inicialmente en bacterias causantes de erisipela22. La vacuna contra el bacilo
Calmette-Guerin (BCG) derivada de Mycobacterium bovis se ha utilizado para prevenir la
tuberculosis desde 1921, y se ha aplicado para la inmunoestimulación en la neoplasia desde la
década de 1960. El uso más efectivo de este tratamiento es para el cáncer de vejiga superficial23.
Desde estos primeros estudios, descubrimientos innovadores en inmunología han identificado los
roles de las clases y subclases de linfocitos24, las células dendríticas y la presentación de
antígenos25, las interleucinas (IL) y otras citocinas26, y los antígenos asociados a tumores y las
principales moléculas del complejo de histocompatibilidad (MHC) 27 en la mediación de la
respuesta inmune antitumoral

Sin embargo, la mayoría de los cánceres evitan o escapan al control inmunitario28,29, y la muerte
por cáncer metastásico sigue siendo el resultado más probable. En esta revisión, discutimos el
efecto de la PDT sobre la respuesta inmune antitumoral, y el papel de la PDT en la estimulación y
supresión de la respuesta inmune innata y la respuesta inmune adaptativa. También resumimos
los datos disponibles sobre combinaciones de PDT con otras terapias inmunoestimuladoras.
Efectos de la PDT en las células tumorales Se han informado muchos efectos de la PDT en las
células cancerosas que crecen en cultivo de tejidos que, si se replican in vivo, harían probable la
activación del sistema inmune después del tratamiento con PDT en pacientes. La combinación de
PS con su luz activadora provoca una mezcla inusual de muerte celular apoptótica y necrótica6,
que es diferente de la mayoría de los agentes citotóxicos convencionales que generalmente solo
desencadenan la muerte celular apoptótica. El equilibrio entre la apoptosis y la necrosis después
de la PDT in vitro depende de varios parámetros, incluida la dosis total de PDT (la dosis de PDT es
el producto de la concentración de PS y la fluencia de luz), la localización intracelular de la PS, la
tasa de fluencia, la concentración de oxígeno y el tipo de celda 4. Existe una extensa bibliografía
que examina las vías de apoptosis que se inducen después de la TFD tanto en células normales
como tumorales en cultivos de tejidos, tales como vías de señalización30,31, eventos
mitocondriales4 y mediadores de la apoptosis32. La aparición de apoptosis después de PDT en
tumores in vivo también se ha demostrado33–35, pero no se han realizado estudios que analicen
los mecanismos de depuración in vivo de células apoptóticas en tumores después de PDT. Muchos
estudios han examinado la relación entre el modo de muerte de las células tumorales (por
métodos distintos a PDT) y la eficiencia de la inducción de la respuesta inmune, tanto in vitro
como in vivo.

Aunque algunos informes muestran que las células tumorales apoptóticas son más efectivas que
las células tumorales necróticas para inducir una respuesta inmune38,39, hay otros informes que
muestran que los modos de terapia contra el cáncer que inducen predominantemente la necrosis
son en realidad mejores para activar el sistema inmunitario que los métodos que
predominantemente inducir apoptosis40,41. En el caso de la necrosis, los componentes citosólicos
se derraman en el espacio extracelular a través de la membrana plasmática dañada y provocan
una respuesta inflamatoria robusta. Estos productos están aislados de manera segura por las
membranas intactas que inicialmente persisten en las células apoptóticas, que son fagocitadas por
los macrófagos. La inflamación aguda causada por la necrosis inducida por PDT podría potenciar la
inmunidad al atraer los leucocitos del huésped hacia el tumor y aumentar la presentación del
antígeno (Figura 2). Uno de los factores celulares más importantes inducidos por PDT y liberados
por las células necróticas tumorales es la proteína extracelular de choque térmico 70 (HSP70)
(Figura 3). HSP70 se induce efectivamente después del estrés y, cuando permanece intracelular,
acompaña a las proteínas desplegadas y previene la muerte celular al inhibir la agregación de
proteínas celulares42. Estas propiedades no solo permiten que HSP70 intracelular inhiba la muerte
de células tumorales por apoptosis, sino que también promueven la formación de complejos
estables con antígenos tumorales citoplasmáticos. Estos antígenos pueden expresarse en la
superficie celular o escapar intactos de las células necróticas moribundas para interactuar con las
células presentadoras de antígenos (APC) y estimular una respuesta inmune antitumoral43. HSP70
extracelular se une a receptores de alta afinidad en la superficie de las APC, lo que conduce a la
activación y maduración de las células dendríticas (DC), un proceso que permite la presentación
cruzada de la carga de antígeno peptídico de HSP70 por las APC a CD8 + citotóxico Células T44. Los
niveles de ARNm de HSP70 aumentaron con la PDT mediada por tres PS (mono-1-aspartilclorina
e6, etiopurpurina de estaño y fotofrina), pero solo la mono-laspartilclorina e6 y etiopurpurina de
estaño aumentaron los niveles de proteína HSP70 en células tumorales de ratón in vitro e in
vivo45 . Foster y colaboradores46 usaron imágenes de fluorescencia para mostrar que la PS m-
tetrahidroxifenilclorina (mTHPC) medió la inducción de HSP70 en células EMT6 que habían sufrido
PDT.

Estas células se transfectaron de manera estable con un plásmido que contenía el gen que codifica
la proteína fluorescente verde (GFP) bajo el control de un promotor HSP70, y pudieron ver una
mayor expresión de GFP después de PDT en un modelo de tumor in vitro e in vivo. Verwanger y
col. utilizó un microarray de ADNc para encontrar el nivel de expresión más alto de varios genes
después de PDT in vitro. HSP70 mostró el mayor aumento en la expresión (12 veces), seguido por
los genes tempranos inmediatos FOS y JUN47. Además, un artículo reciente43 informó que entre
el 15 y el 25% del HSP70 celular total quedó expuesto en la superficie celular casi
instantáneamente después del tratamiento de las células con PDT basada en Photofrin, y una gran
proporción de esto se liberó dentro de 1 hora de PDT a dosis citotóxica Además de HSP70, ha
habido informes de que PDT induce la expresión de otros miembros de la familia de proteínas de
choque térmico como HSP47 (REF. 48) y HSP60 (REF. 49), así como otras proteínas inducibles por
estrés como la glucosa. proteína regulada 78 (GRP78) (REF. 50), GRP94 (REF. 43) y hemo
oxigenasa51. La liberación de antígenos tumorales unidos a HSP que APC puede absorber
fácilmente a partir de células tumorales necróticas inducidas por PDT podría explicar la eficacia de
PDT para estimular una respuesta inmune contra tumores. Efectos de la PDT en las células
inmunes Hay informes basados en datos de estudios in vitro que la PDT puede tener un efecto en
los linajes de células de monocitos / macrófagos y linfocitos. Los linfocitos son generalmente
destruidos fácilmente por PDT52, y los linfocitos activados son especialmente susceptibles53. Este
hallazgo ha llevado a que se proponga PDT como tratamiento para la enfermedad de injerto
contra huésped54, algunas formas de enfermedad autoinmune55 y linfoma cutáneo de células
T56. Por otro lado, los macrófagos pueden activarse con dosis subletales bajas de PDT57. Los
informes muestran que los macrófagos tratados con PDT secretan factor de necrosis tumoral α
(TNFα) 58. Cuando una mezcla de macrófagos y linfocitos se somete a PDT, los linfocitos liberan
lisofosfatidilcolina y esta molécula induce la expresión de β-galactosidasa en linfocitos B y, junto
con la sialidasa NEU1 de los linfocitos T, estas enzimas modifican la proteína de unión a la vitamina
D3 en el suero bovino para producir un potente factor activador de macrófagos (MAF)

La producción de este MAF también ocurre en ratones, donde se deriva de la proteína de unión a
la vitamina D3 análoga en suero de ratón60. La evidencia también indica que los macrófagos
pueden mostrar citotoxicidad preferencial para las células tumorales que han sido tratadas con
una dosis subletal de PDT61. Otro informe62 mostró que aunque la función tumoricida de los
macrófagos peritoneales que se eliminaron de los ratones después de que la PDT no se modificó,
hubo una reducción en la función de las células NK. Liberación de citocinas e inflamación después
de la TFD La TFD produce una respuesta inflamatoria aguda tanto si se administra al tejido normal
como a los tumores (figura 3). Se han detectado citocinas y quimiocinas inflamatorias en el suero
de ratones que han recibido PDT dirigida a un tumor subcutáneo o a un área de piel normal. Estos
incluyen IL6 en particular y la proteína inflamatoria de macrófagos 1 (MIP1) y MIP2 (REF. 63). Se
detectaron niveles aumentados de IL1β, IL6, IL8 e IL10 en pacientes después de la cirugía y PDT
para mesotelioma64. Las fuentes de estos mediadores inflamatorios pueden ser muchos de los
diversos tipos de células que están presentes en los tumores.

Por ejemplo, se ha demostrado que las propias células malignas, las células endoteliales
tumorales y los leucocitos infiltrantes de tumores, pero no los fibroblastos, producen miembros de
la clase de mediadores inflamatorios conocidos como prostaglandinas65,66. La liberación de
tromboxano de las células endoteliales después de la TFD es en parte responsable del cierre
vascular67. Esta inducción de inflamación aguda es importante para desencadenar la respuesta
inmune, ya que comparte algunas similitudes con el tipo de señal de peligro proporcionada por la
respuesta inflamatoria del huésped a la invasión microbiana de tejido sano. El ambiente del tumor
se describe más adecuadamente como un estado de inflamación crónica, en lugar de un estado de
inflamación aguda68. Factores de transcripción y producción de citocinas. Es probable que la
inflamación aguda que se observa después de la TFD sea causada por la expresión de dos factores
de transcripción, el factor nuclear κB (NFκB) y la proteína activadora 1 (AP1). Ambos factores
participan en la activación transcripcional de genes que codifican proteínas inmunorreguladoras y
proinflamatorias69, y se sabe que se activan por el estrés oxidativo celular70,71. La PDT mediada
por fotofrina produjo la translocación de NFκB en células de leucemia L1210 murinas en
condiciones de PDT que dieron como resultado aproximadamente un 20% de supervivencia
celular72. Sin embargo, Kick et al. descubrieron que las células HeLa que fueron tratadas con PDT
mediada por Photofrin mostraron un aumento en la expresión de IL6 causada por la activación de
AP1, no de NFκB73. Las células de carcinoma de colon HCT116 que se trataron con pirofoforbida,
éster amílico y luz roja, condujeron al procesamiento de IκB y dos ondas distintas de activación de
NFκB; primero promoviendo la internalización de los receptores de IL1 de superficie, y luego
mediante la generación de ceramida74,75. Las células HL60 que se transfectaron con una
construcción que contenía 5 sitios NFκB de la repetición terminal de VIH tipo 1, clonada aguas
arriba del gen de luciferasa, mostraron una mayor actividad de luciferasa después de PDT76
mediada por derivado de benzoporfirina (BPD). La activación de NFκB es el mediador más
importante de la inflamación aguda, y su inducción después de PDT in vitro confirma la
observación de que PDT induce inflamación aguda in vivo. COX2 y síntesis de prostaglandinas. La
expresión de la enzima ciclooxigenasa 2 (COX2, también conocida como prostaglandina
endoperóxido sintasa 2 (PTGS2)) está regulada por NFκB y produce los mediadores inflamatorios
conocidos como los eicosanoides (incluida la prostaglandina E2 (PGE2) y los leucotrienos).

Se descubrió que PDT causaba una expresión prolongada de COX2 en células de cáncer de ratón
tratadas con PDT y tumores in vivo, junto con un aumento de la síntesis de PGE277. Aunque PGE2
es proinflamatorio, generalmente se cree que tiene efectos inmunosupresores78. Los niveles de
PGE2 se atenuaron en células que se coincubaban con el inhibidor de COX2 NS-398. Además, la
administración sistémica de NS-398 disminuyó la expresión inducida por PDT tanto de PGE2 como
del factor de crecimiento endotelial vascular en tumores mamarios de ratón BA, y aumentó el
número de curas. Los inhibidores de COX2 no sensibilizan las células cancerosas a la muerte
mediada por PDT per se, el objetivo puede usarse para potenciar la efectividad antitumoral de PDT
cuando se administran después de la iluminación. Este efecto antitumoral es probablemente
causado por la inhibición de la angiogénesis, que es necesaria para el crecimiento tumoral79.
Flying y col. descubrieron que la expresión de COX2 era principalmente el resultado de la
activación de NFκB, pero el mecanismo de activación difería en dos líneas celulares80. En las
células de carcinoma de vejiga T24, la activación de NFκB ocurre a través de una proteína quinasa
C-α (PKCα) y la activación dependiente de fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K) del complejo de
quinasa IκB, mientras que en las células HeLa, la activación de NFκB está mediada por PKC- y vías
independientes de PI3K. Curiosamente, la PDT81 mediada por hipericina condujo a una mayor
expresión de COX2 y PGE2, excepto que esta vez la activación de la ruta de la proteína quinasa
activada por mitógeno p38 (MAPK) estaba implicada (como lo muestra el inhibidor de MAPK
PD169316), en oposición a la activación de NFκB encontrado en otros sistemas. La sobreexpresión
de p38 MAPK también aumentó la resistencia celular a la apoptosis inducida por PDT, pero este
efecto fue independiente de COX2. Se necesita más trabajo para comprender el papel preciso de
COX2 y los eicosanoides en la respuesta inmune inducida por PDT contra tumores. Reclutamiento
de neutrófilos y producción de IL6. Kick et al.73 compararon la producción de ARNm de IL6
después del tratamiento con PDT o UVB. Los niveles de proteína IL6 inducida por PDT fueron más
altos y fueron detectables antes que después del tratamiento con UVB. La expresión de IL6
inducida por PDT estaba mediada por AP1, y era independiente de la actividad de PKC, NFκB o el
elemento sensible a múltiples citocinas y segundo mensajero en el promotor de IL6.

Usando un modelo de ratón BALB / c, Gollnick et al.82 demostraron que la PDT administrada a
tejido normal y tumoral causaba cambios marcados en la expresión de IL6 e IL10, pero no de
TNFα. Este grupo63 también descubrió que la PDT mediada por 2- [1-hexiloxietil] -2-devinil
pirofeofórbido-a (HPPH) causó la migración de neutrófilos al área del tumor tratado debido a un
aumento transitorio y local en la expresión de la quimiocina MIP2 (la proteína murina equivalente
de IL8), y el aumento de la expresión de la molécula de adhesión E-selectina. Aunque se encontró
una mayor expresión local y sistémica de IL6, esto no fue necesario para el reclutamiento de
neutrófilos. Un informe posterior83 comparó el efecto de una fluencia baja y alta (energía de luz
total), cada una entregada a una tasa de fluencia baja y alta, contra los tumores murinos Colo 26
tratados con HPPH. Anteriormente, se había propuesto que la PDT es menos eficiente cuando la
luz se entrega a una alta tasa de fluencia porque el oxígeno del tejido se consume por completo y
la microvasculatura no puede suministrarlo lo suficientemente rápido como para mantener el
consumo fotoquímico84. La PDT de baja tasa de fluencia que conserva el oxígeno con una alta
fluencia dio como resultado un 70-80% de curas tumorales, mientras que la misma fluencia con
una alta tasa de fluencia que redujo el oxígeno resultó en un 10-15% de curas tumorales. La alta
fluencia a una baja tasa de fluencia condujo a la ablación de los vasos sanguíneos. Los niveles más
altos de citoquinas inflamatorias e infiltrados neutrofílicos se observaron cuando se administraba
baja fluencia a una tasa de fluencia baja (10-20% de curas). El régimen PDT óptimamente curativo
(alta fluencia a una baja tasa de fluencia) produjo una inflamación mínima. El agotamiento de los
neutrófilos no cambió significativamente las altas tasas de curación de ese régimen, pero abolió la
curabilidad en el régimen inflamatorio máximo. Estos datos indican que la cura del tumor puede
estar mediada al maximizar la acción fotoquímica de la PDT, pero la importancia de causar
inflamación e infiltración de neutrófilos es menos clara. Sluiter et al.85 observaron por primera vez
que los neutrófilos se adhieren a la pared microvascular después de la PDT in vivo, pero la PDT no
estimulaba la expresión de P-selectina (una de las principales moléculas de adhesión que se unen
a los leucocitos) por las células endoteliales (CE).

Las CE se retrajeron después de PDT, lo que permitió a los neutrófilos adherirse a la matriz
subendotelial por sus receptores de adhesión de β2-integrina, y esto podría ser bloqueado por
anticuerpos anti-β2-integrina86. Este hallazgo fue respaldado por un informe que mostró que los
niveles de expresión de las moléculas de adhesión molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM1) y
la molécula de adhesión celular vascular 1 (VCAM1) se regulaban negativamente en las CE después
de PDT87. La administración de suero de neutrófilos antirrata con TFD en ratas portadoras de
rabdomiosarcoma anuló por completo el retraso normal del crecimiento tumoral inducido por la
TFD88, lo que demuestra que se requiere una afluencia de neutrófilos para una respuesta
antitumoral eficaz en este modelo. Se encontró un aumento en el número de neutrófilos de
sangre periférica 4 horas después del tratamiento con PDT, y duró 24 horas. El aumento de
neutrófilos fue precedido por un aumento en los niveles séricos de IL1 β. Los anticuerpos antiGCSF
(factor estimulante de colonias de granulocitos) disminuyeron el número de neutrófilos y
disminuyeron la eficacia de la PDT. Las razones por las cuales los neutrófilos son tan importantes
para producir una respuesta efectiva a la TFD en algunos (pero no en todos) los modelos
tumorales aún son inciertos. Krosl y colaboradores89 midieron las poblaciones celulares en el
modelo de carcinoma de células escamosas murinas VII (SCCVII) tratado con PDT mediada por
fotofrina. Encontraron un aumento de 200 veces en el número de neutrófilos dentro de los 5
minutos de PDT, seguido inmediatamente por un aumento en los niveles de mastocitos. Otro tipo
de célula mieloide, los monocitos más probables, invadieron el tumor 2 horas después de la TFD.
Cecic y col. 90 encontraron que la neutrofilia pronunciada se desarrolló rápidamente después de
Photofrin o PDT mediada por mTHPC de ratones con carcinomas mamarios SCCVII o EMT6.
También se observó neutrofilia después del tratamiento con PDT de la piel dorsal normal, pero no
en la almohadilla del pie de los ratones libres de tumor. La inhibición del complemento evitó
completamente el desarrollo de neutrofilia inducida por PDT. Los fragmentos de complemento de
las proteínas C3 y C5a pueden inducir neutrofilia, ya sea movilizando piscinas de médula ósea o
como respuesta a la neutropenia transitoria causada por la adhesión de neutrófilos al endotelio91.
Korbelik y col. continuó demostrando que la activación del complemento se produjo después de
que los carcinomas de pulmón de Lewis (LLC) fueron tratados con PDT mediada por fotofrina y
observaron niveles aumentados de C3 en el tumor y el suero92. El aumento de la actividad de la
vía alternativa del complemento en el suero fue evidente 1-3 días después de la TFD.

El bloqueo de los receptores C3a o C5a en los ratones huéspedes disminuyó la eficacia de PDT en
la producción de curas tumorales LLC. Korbelik y sus colegas también demostraron que el bloqueo
de ICAM1 con anticuerpos monoclonales reducía el número de curas tumorales93. Una marcada
regulación al alza de los ligandos ICAM1 CD11b y CD11c, que se encuentran en los neutrófilos,
también se asoció con tumores tratados con PDT. Los anticuerpos neutralizantes de IL1
disminuyeron el número de curas de los tumores tratados con PDT. Los neutrófilos expresan
moléculas de MHC de clase II, lo que sugiere que están involucradas como células presentadoras
de antígeno y están involucradas en el desarrollo de la respuesta inmune antitumoral. Korbelik y
col. También se encontró que IL1 y TNFα funcionan como potentes promotores de la fase
temprana de la neutrofilia inducida por PDT, pero no parecen tener un papel significativo en la
fase avanzada94. Los datos obtenidos al bloquear otras dos citocinas, GCSF e IL10, mostraron que
son contribuyentes importantes a la neutrofilia en fase avanzada, sin influencia aparente en la fase
temprana. Los informes descritos anteriormente muestran que la inflamación aguda, que es
producida por PDT, y un aumento sistémico y localizado de tumor en neutrófilos es importante
para obtener curas tumorales. Es muy probable (aunque difícil de demostrar) que estos
fenómenos también sean importantes en el desarrollo de una respuesta inmune antitumoral de
células T de memoria después de la TFD. PDT e inmunidad antitumoral La introducción de tumores
trasplantables crecidos en cepas endogámicas de ratón o rata que comparten el mismo haplotipo
MHC (animales singénicos) y tienen sistemas inmunes intactos, ha permitido a los investigadores
estudiar la inmunidad antitumoral después de la TFD. Songs y colegas95 examinaron los efectos de
la PDT con la ftalocianina disulfonada de aluminio PS sobre la respuesta inmune antitumoral en
ratones inmunosuprimidos y normales que tienen fibrosarcomas MS-2.

Todos los ratones fueron curados y sobrevivieron indefinidamente, pero la resistencia a la

reexposición de MS-2 fue evidente solo en los animales supervivientes normales curados por PDT,
mientras que los animales supervivientes inmunosuprimidos y los animales curados por cirugía
murieron después de la reexposición tumoral. No se rechazaron diferentes leucemias murinas
singénicas. Korbelik y col. 96 informaron que la PDT basada en fotofrina curó el 100% de los
sarcomas mamarios EMT6 en ratones BALB / c singénicos, pero no se observaron curas a largo
plazo en diabéticos no obesos (NOD), inmunodeficientes combinados graves (SCID) o ratones
desnudos. La transferencia adoptiva de linfocitos T esplénicos de ratones BALB / c ingenuos a
ratones SCID antes de PDT pospuso la recurrencia de tumores tratados, mientras que la
transferencia adoptiva realizada inmediatamente o 7 días después de PDT no tuvo ningún
beneficio. La transferencia adoptiva de esplenocitos no adherentes (una mezcla de células T CD4 +
y CD8 + con algunas células B, células NK y monocitos) de ratones normales curados de tumores
EMT6 por PDT 5 semanas antes, restableció completamente el efecto curativo de PDT en tumores
EMT6 que estaban creciendo en ratones SCID. Los esplenocitos obtenidos de donantes que fueron
curados por rayos X fueron mucho menos efectivos. El agotamiento de las poblaciones específicas
de células T de los esplenocitos de los donantes indicó que los linfocitos T citotóxicos CD8 + tenían
el efecto más curativo, mientras que las células T auxiliares CD4 + desempeñaron un papel de
apoyo97. Estudios análogos fueron realizados por un grupo diferente98 usando PDT con el cloruro
de PS 2-yodo-5- etilamino-9-dietilaminobenzo [a] -fenotiazinio.

Un informe reciente99 mostró que la TFD mediada por BPD de tumores RIF1 (un sarcoma murino
poco inmunogénico) en ratones C3H / HeN de tipo salvaje conduce a la desaparición inicial del
tumor pero no a curas permanentes debido a la recurrencia local. Por el contrario, cuando los
tumores fueron modificados genéticamente para expresar GFP a partir de medusas, se obtuvo un
100% de curación y resistencia a largo plazo al nuevo desafío después de la TFD. La PDT (pero no la
extirpación quirúrgica) indujo el reconocimiento inmunitario de la GFP extraña como antígeno
tumoral modelo. A medida que se identifican antígenos de rechazo tumoral adicionales en las
líneas celulares tumorales de ratón100, se puede adoptar un enfoque más racional para estudiar
los factores que gobiernan la fuerza relativa de las respuestas inmunes antitumorales estimuladas
por la PDT para diferentes tumores y regímenes de PDT. Vacunas contra el cáncer producidas por
PDT Un enfoque relacionado que aprovecha los efectos inmunoestimuladores de la PDT es la
preparación de vacunas contra el cáncer utilizando PDT in vitro de cultivos celulares. Gollnick et
al.101 compararon el potencial de la vacuna contra el cáncer de los lisados celulares generados
por PDT (células tumorales EMT6 y P815) con los lisados generados por radiación UV o ionizante.
Las vacunas generadas por PDT fueron específicas de tumor, indujeron una respuesta de células T
citotóxicas y, a diferencia de los otros métodos, no requirieron que la administración conjunta de
un adyuvante fuera efectiva. Los lisados generados por PDT fueron capaces de inducir la
maduración fenotípica de DC y la expresión de IL12. Korbelik y Sun102 produjeron una vacuna al
tratar las células SCCVII con PDT mediada por BPD y luego con una dosis letal de rayos X, y
mostraron que estas células, cuando se inyectan peritumoralmente en ratones con tumores SCCVII
establecidos, producen un efecto terapéutico significativo, incluido el retraso del crecimiento ,
regresión tumoral y curas. Es importante destacar que las células de la vacuna que se recuperaron
del sitio de tratamiento 1 hora después de la inyección se mezclaron con las células dendríticas
(DC), se expresó HSP70 en su superficie y se opsonizó con el complemento C3. Esta observación
verifica algunos de los hallazgos anteriores en modelos de ratones e in vitro. PDT combinada con
otras terapias Los informes de PDT combinados con otros agentes o estrategias
inmunoestimulantes se pueden dividir en tres clases amplias (Figura 4). PDT y adyuvantes
microbianos. Primero, los agentes que se derivan de los estimuladores microbianos de la
inmunidad innata pueden inyectarse en el tumor o en el área circundante antes, durante o
después de la PDT (Figura 4). Su función es activar los receptores Toll-like (TLR) o moléculas de
reconocimiento de patrones similares que están presentes en los macrófagos y las células
dendríticas103. Hasta ahora, se han identificado 13 miembros de la familia TLR en monocitos y
macrófagos, células dendríticas, mastocitos y algunas células epiteliales.

Se cree que su función principal es ser detectores de señales de peligro; Sistemas de alerta
temprana de infección inminente. La activación de las vías TLR puede inducir NFκB y, en
consecuencia, la expresión de varios genes implicados en la activación del sistema inmune que
también son importantes para la respuesta inmune antitumoral107. Estos hallazgos dieron lugar a
la hipótesis de que la terapia combinada que involucra la administración de inmunoadyuvantes (a
menudo ligandos TLR potenciales) y diferentes regímenes de PDT podría resultar efectiva. Myers
et al.108 combinaron PDT mediada por derivado de hematoporfirina (HPD) con una preparación
eliminada de Corynebacterium parvum (CP, ahora Propionibacterium acnes) en un modelo de
ratón de cáncer de vejiga subcutáneo. Se demostró que administrar una dosis alta de PC después
de la TFD tiene un efecto significativamente mayor que el tratamiento con PC antes de la TFD. Los
tumores EMT6 de ratón subcutáneo se trataron con una dosis única de BCG en combinación con
PDT usando seis PS109. Independientemente de la PS utilizada, BCG aumentó significativamente la
cantidad de tumores curados y la cantidad de células T de memoria en los ganglios linfáticos que
drenan el tumor en comparación con la TFD sola. La PDT se combinó con una dosis única de
extracto de pared celular de Mycobacterium inmediatamente después de la exposición a la luz110,
y produjo significativamente más curaciones a largo plazo de tumores EMT6 en ratones BALB / c y
más leucocitos infiltrantes de tumores a las 22 horas después de la PDT. OK432 es una preparación
derivada de bacterias estreptocócicas muertas, y aumentó el tiempo libre de tumor en ratones con
carcinomas de células escamosas NRS1 cuando se inyectó por vía intratumoral 3 horas antes de la
TFD mediada por HPD. OK432 inyectado inmediatamente después de PDT, o OK432 solo tuvo poco
efecto111. La inyección intratumoral de OK432 también potencia la inmunidad antitumoral
inducida por PDT contra los tumores EMT6 (A.P.C., P.M. y M.R.H., observaciones no publicadas).
Schizophyllan (SPG) es un ejemplo de un polisacárido fúngico β-D-glucano, que se cree que son
potentes inductores de la inmunidad humoral y celular por el receptor de dectina-1 de
macrófagos112, así como TLRs113. La tasa de curación del tumor se triplicó cuando se administró
SPG por vía intramuscular antes de la PDT mediada por fotofrina de ratones con SCCVII, mientras
que la SPG administrada después de PDT tuvo poco efecto.

Un informe de Chen y colegas115 mostró que una preparación de quitosano glicosilado derivado
de cáscaras de camarones inyectadas por vía intratumoral aumentó los efectos curativos de la PDT
mediada por fotofrina en tumores EMT6 y tumores de pulmón Line1. Se desconocen los
receptores que son responsables de mediar los efectos del quitosano glicosilado. El grupo de
Korbelik ha observado la activación del sistema del complemento durante PDT92, y ha propuesto
esto como un mecanismo adicional de respuesta antitumoral. El tratamiento localizado con el
tumor con zymosan, un activador alternativo de la vía del complemento, y los ligandos TLR2 y
TLR6, redujeron el número de tumores recurrentes después de PDT116. Sin embargo, un
tratamiento similar con γ-globulina agregada por calor (un clásico activador de la vía del
complemento) no tuvo un efecto significativo como adyuvante PDT. La activación sistémica del
complemento con el tratamiento con estreptoquinasa no tuvo un efecto detectable sobre la
deposición del complemento en el sitio del tumor sin PDT, pero aumentó la actividad del
complemento en los tumores tratados con PDT. La PDT fotofrinmediada se probó contra tumores
SSCVII en combinación con el factor activador de macrófagos derivado de proteínas de unión a la
vitamina D3 (DBPMAF) 117. DBPMAF mejoró notablemente el resultado de la TFD, pero como
agente único no tuvo un efecto significativo sobre el crecimiento de los tumores SCCVII.
PDT y terapia con citocinas. Otra clase de terapias combinadas se refiere a la administración de
citocinas como TNFα, que Bellnier118 demostró que potencia la PDT mediada por fotofrina de
adenocarcinoma SMT-F murino después de una dosis única de material humano recombinante
administrado por vía intravenosa. El tratamiento localizado del tumor con GCSF en combinación
con PDT mediada por fotofrina dio como resultado una reducción significativa del crecimiento
tumoral y un aumento en la duración de la supervivencia de ratones BALB / c con dos tipos de
tumor: tumores colo 26 y carcinomas de pulmón de Lewis119 (FIG. 4 ) Además, el 33% de los
ratones colo 26 con tumor se curaron completamente después de la terapia combinada y
desarrollaron una inmunidad específica y duradera. Krosl et al.120 inyectaron repetidamente
células SCCVII irradiadas letalmente que fueron diseñadas genéticamente para producir GMCSF y
mostraron una eficacia antitumoral aumentada de la PDT basada en Photofrin y BPD en ratones
con SCCVII. El tratamiento con GMCSF resultó en una mayor actividad citotóxica de los macrófagos
asociados a tumores contra las células SCCVII. Células T reguladoras y terapias celulares adoptivas.
Un tercer grupo de terapias combinadas de PDT incluye intervenciones que están diseñadas para
alterar o aumentar el brazo celular de la respuesta inmune antitumoral. Hay una creciente
conciencia de que las células reguladoras T CD4 + CD25 + tienen una función importante en la
supresión de la respuesta inmune contra múltiples objetivos, y estas células se agotan con una
dosis baja de ciclofosfamida (CY), lo que potencia la inmunidad121, mientras que una dosis alta de
CY es inmunosupresor122.

La dosis baja de CY combinada con la TFD mediada por BPD, usando un intervalo corto de fármaco
a luz que se dirigió predominantemente a los vasos sanguíneos tumorales, condujo a un número
significativo de curas de sarcoma de células reticulares J774 a largo plazo y resistencia al nuevo
reto tumoral, mientras que cada tratamiento solo condujo al 100% de muerte por tumores
progresivos o metástasis123. El examen de los esplenocitos recuperados de ratones con tumor
después de una dosis baja de CY mostró que las células T CD4 + CD25 + se redujeron en número, y
los esplenocitos secretaron significativamente menos factor de crecimiento transformante β
(TGFβ). El TGFβ es una citocina inmunosupresora importante que es secretada por las células T
reguladoras, y también estimula las células T reguladoras124.125. Golab y sus colegas126
demostraron que la inyección de células dendríticas inmaduras en tumores que fueron tratados
con PDT mediada por Photofrin resultó en un retorno efectivo a los ganglios linfáticos regionales y
periféricos y la estimulación de células CTL y NK. El tratamiento combinado produjo la mejor
respuesta tumoral y cierta resistencia a un nuevo reto tumoral.

Un artículo reciente estudió la combinación de células dendríticas intratumorales y PDT mediadas

por el PS ATXS10 Na (II) de tipo clorina contra tumores CT26 en ratones BALB / c. La terapia
combinada produjo curas tumorales que no se observaron con ninguno de los dos tratamientos.
Además, cuando los ratones con dos tumores tenían solo uno tratado con la combinación de PDT y
células dendríticas, el tumor contralateral no tratado experimentó regresión. La presencia de
linfocitos específicos de tumor se demostró mediante el ensayo CTL de liberación de cromo y
mediante la producción de IFNγ. Korbelik y Sun128 utilizaron la transferencia adoptiva de una
línea celular NK humana que fue alterada genéticamente para producir IL2 combinada con PDT
mediada por mTHPC de carcinoma subcutáneo de células escamosas humanas que crecen en
ratones SCID. La inyección peritumoral o intravenosa de células inmediatamente después de la
PDT produjo una mejora en el resultado de la PDT, que no se observó con una línea celular que no
producía IL2. Efectos inmunosupresores de la PDT Paradójicamente, considerando las discusiones
anteriores, también hay varios informes de que la PDT puede inducir diversas formas de
inmunosupresión129. Casi todos estos han estado relacionados con la supresión de la reacción de
hipersensibilidad de contacto (CHS) en ratones130. Esto implica la aplicación de un hapteno como
el dinitrofluorobenceno a la piel, seguido de un nuevo desafío en un sitio distante, y puede
suprimirse hasta 28 días después de la TFD (figura 5). Parece que esta supresión implica la
liberación sistémica de IL10 en los casos en que la iluminación PDT penetra en la piel (luz roja) 131,
pero es independiente de IL10 cuando la PDT se limita a las capas de la piel (luz azul) 132. A
diferencia de la irradiación UVB que suprime las respuestas de CHS y de hipersensibilidad de tipo
retardado (DTH), PDT no suprime DTH133. Una diferencia entre CHS y DTH es que se cree que CHS
es un proceso mediado por MHCclass-I, mientras que DTH está mediado por MHC clase II (REF.
134). Como las células dendríticas presentan antígenos derivados de células tumorales destruidas
por MHC clase II, se podría argumentar que esta diferencia explica por qué la inmunosupresión
inducida por PDT no anula la inmunidad antitumoral. Las moléculas MHC de clase I generalmente
presentan moléculas endógenas a las células T CD8 +, mientras que las moléculas MHC de clase II
presentan moléculas exógenas a las células T CD4 +.

Es probable que la inducción eficiente de la respuesta inmune contra los tumores requiera el
cebado de las células T CD4 + por parte de las moléculas MHC de clase II y las células T CD8 + por
parte de las moléculas MHC de clase I en el momento del tratamiento, seguido del reconocimiento
de los antígenos presentados en MHC clase I moléculas en la etapa efectora. Estudios clínicos y
perspectivas futuras Teniendo en cuenta la cantidad de pacientes (varios miles) que han sido
tratados con PDT por varios tipos de cáncer durante las tres décadas anteriores, ha habido muy
pocos estudios que incluso hayan intentado determinar los efectos de la PDT en el sistema
inmunitario humano. , o para detectar la inmunidad antitumoral después de que los pacientes
fueron tratados. Existen informes dispersos sobre la medición de la expresión de citocinas
inducida por PDT en pacientes64, y hay informes anecdóticos sobre la supervivencia
inesperadamente larga de pacientes que fueron tratados con PDT por cáncer recurrente135. Ha
habido dos informes sobre los efectos sobre el sistema inmunitario en la TFD de las lesiones del
virus del papiloma humano en pacientes136,137. Hace mucho tiempo que falta un estudio
sistemático diseñado para detectar el posible reconocimiento inmunitario de las células tumorales
después de la TFD para pacientes con cáncer. Un resumen reciente de la reunión (SO Gollnick,
comunicación personal) informó que los pacientes que fueron tratados con PDT para el carcinoma
basocelular (CCB) demostraron un aumento significativo (50-130%) en el número de células T de
sangre periférica que produjeron IFNγ cuando reconoció el ligando sonic hedgehog, la proteína
que interactúa hedgehog (HIP1). HIP1 no está mutado en BCC, y se ha demostrado que funciona
como un antígeno asociado a tumor. Para otros tipos de cáncer, la medición de la respuesta
inmune inducida por PDT podría involucrar anticuerpos séricos reactivos al tumor o células T CD8 +
o CD4 + específicas del tumor después de la PDT, pero implicaría tomar muestras de biopsia
tumoral antes de la PDT. A medida que aprendamos más, debería ser posible comprender cómo la
PDT puede influir en los aspectos celulares precisos de la inmunidad antitumoral. Por ejemplo, las
células reguladoras de T podrían ser inactivadas específicamente por IL6 (REF. 138), una citocina
que se produce abundantemente después de PDT82. El informe de Henderson et al.83 sugiere un
punto a tener en cuenta en el diseño de futuras pistas clínicas, al que se hace referencia
anteriormente. Es completamente posible que el régimen óptimo de PDT para producir curas
locales del tumor sea diferente del régimen óptimo de PDT para producir inflamación y estimular
la respuesta inmune. El tiempo determinará si la inmunidad antitumoral inducida por PDT es un
fenómeno clínicamente útil que podría beneficiar a los pacientes y potencialmente salvar vidas, o
si es una curiosidad solo aplicable a ratones y ratas en el laboratorio