FACULTAD DE INGENIERÍA Y CIENCIAS BÁSICAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

ELECTROFORESIS DE PROTEINAS, CONCEPTOS Y APLICACIONES EN

DIVERSAS ÁREAS DE ESTUDIO

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Camargo Gomez Sergio , Jimenez Vacca Juanita , Cardenas Ubillus Michael ,
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Bermudez​ ​Fernandez Valentina , Agudelo Aguilar Laura Horlandy Perez Esteban

RESUMEN las proteínas, ADN, vitaminas, entre otras que

La electroforesis de proteínas, se reconoce
como un método de separación de diversas
proteínas por medio de campos eléctricos. Este
proceso cuenta con un gradiente de producción
de transporte de partículas cargadas
eléctricamente en una solución. La
electroforesis proteica puede implementarse en
diversos campos biológicos, alimenticios, y
médicos. Por ello el objetivo de este informe
es evidenciar diversos procesos de
electroforesis en las proteínas y cómo estos
influyen en los diferentes ámbitos de la ciencia
y la vida humana, reconociendo a su vez la
importancia en la aplicación en la vida
cotidiana.
PALABRAS CLAVE: ​Electroforesis,
Proteínas, Campo eléctrico.
INTRODUCCIÓN
ELECTROFORESIS
La electroforesis es reconocida como una
técnica empleada en diversos laboratorios,
para gestionar la separación de ARN y ADN
de diversas moléculas o proteínas. Esta se da
en función del tamaño o carga eléctrica de la
proteína analizada, implementando corrientes
eléctricas que mueven sus moléculas y logran
una separación adecuada para el estudio
(Ware, Lunte, & Gardiner. 2019).
Esta es una de las técnicas analíticas más
importantes en la bioquímica, ya que se basa
en la migración de iones en un campo
eléctrico. Existen moléculas biológicas como
poseen diversas cargas eléctricas que permiten
la movilidad en un campo eléctrico.
Esta movilidad depende de la carga que
presentan a un pH determinado, la molécula
que tiene carga negativa migra hacia el ánodo
y la positiva hacia el cátodo. La fuerza iónica
que tiene la solución al encontrar en escalas
bajas permite la migración de los solutos de
forma rápida y con un menor desprendimiento
de calor. (Milca B. Vilhena, 2015)
El movimiento de moléculas tiene dos fuerzas
conocidas como la fricción que se genera con
el solvente; la cual da como resultado una
fuerza que se opone, y la difusión en la cual
las moléculas realizan movimientos de forma
aleatoria, por medio de energía cinética propia.
La electroforesis en gel es el método más
conveniente para realizar la correcta
separación de macromoléculas, el soporte de
este tipo de separación es un conjunto
entramado tridimensional que impide o reduce
la difusión.(Aken, 1999)
Es muy importante que el medio tenga una
solución ionizada buffer con el fin de
transmitir la corriente a través de la proteína.
Estas soluciones buffer presentan una baja
resistencia iónica, y producen bajo nivel de
calor, la migración de las proteínas es rápida
pero las que tienen una concentración iónica
muy alta darán como resultado una separación
con más exactitud (Hames, 1998).
La carga que adquiere el mol proteico depende
del número de aminos y grupos carboxilo que
se presentan cargados, el grupo amino con una
carga positiva y el grupo carboxilo con una
carga negativa, en el punto isoeléctrico la
carga es cero lo que quiere decir que el
número de grupos amino y carboxilo son
iguales. Los grupos que se ionizan al disminuir
el pH son los aminos, mientras la proteína
obtiene una carga positiva a diferencia de los
grupos carboxilo, los cuales al aumentar el pH
se ionizan y la proteína adquiere una carga
más negativa. A un pH determinado la carga
neta depende del número de grupos aminos y
carboxilos que son correspondientemente
ionizados. Entre mayor sea la carga en la
proteína más rápido realizará su
desplazamiento hacia su polo opuesto. (Aken,
1999)
CUERPO DEL ARTÍCULO
¿Cuándo se usa la electroforesis?
La electroforesis en gel se puede utilizar para
separar fragmentos de ADN cómo obtener una
huella digital de ADN; un caso en particular es
media la técnica de EM, donde la huella
dactilar de masa de péptidos (PMF) sigue
siendo la técnica más sencilla y eficaz para
lograr la identificación de proteínas de alto
rendimiento, por medio de las las huellas de
masa de péptidos se obtienen mediante
espectrometría de masas de tiempo de vuelo de
ionización por desorción láser asistida por una
matriz (Mathesius U, 2002), también se utiliza
la electroforesis de ADN para comprobar una
reacción PCR y para encontrar genes
asociados con una enfermedad; como anemia
falciforme, mielomas, fibrosis quística y
leucemias, estableciendo reacciones
inmunológicas entre los compuestos (S. Rudge
y C. A. Monnig, 2000). La electroforesis en
gel se utiliza para separar las proteínas que
tienen diferentes tamaños, se usan diferentes
tipos de geles para proporcionar diferente
información; los geles de poliacrilamida se
utilizan para separar proteínas en función de su
tamaño donde se usa calor y sustancia SDS el
cual proporciona carga negativa general a
todas las proteínas logrando así que las
proteínas pequeñas se mueven rápidamente a
través del gel que las proteínas grandes,
generando bandas y cada contiene una proteína
de tamaño particular. (Science learning. 2007)
Electroforesis capilar
Otro tipo de electroforesis es el método de
separación basado en el flujo a través de un
tubo capilar que se puede adaptar a la
resolución de diferentes moléculas en función
del tamaño, la hidrofobicidad o la
estereoespecificidad. Es aplicable a moléculas
grandes como ADN o proteínas, así como a
pequeñas como hormonas o fármacos
terapéuticos. Físicamente, el método es similar
a la cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC), en la que el disolvente se bombea a
través de una columna que retiene o hace pasar
los solutos según las interacciones químicas.
La electroforesis capilar para proteínas séricas
emplea una columna con propiedades
similares a la agarosa, por lo que la separación
de proteínas es comparable a la de la
electroforesis ( ​McPherson, R., & Pincus, M.
2017).
Estimación de las constantes de equilibrio
termodinámico de partículas de óxido de
metálico a través de electroforesis general.
En este artículo se plantea un protocolo,
establecido como el “más eficiente” para
calcular las constantes de asociación y
disociación de los grupos funcionales en la
partícula de óxido metálico, identificando
además la densidad de los grupos funcionales
sin necesidad de saberla de manera previa,
todo esto evitando el tedioso trabajo descrito
en la literatura. (Wu & Hsu. 2020)
En la investigación se llevó a cabo un
modelado, en el cual se halló la densidad de
las partículas. Posteriormente, se realizó la
estimación del pK a y del pK b , para ello
realizaron primero una dispersión de óxido
metálico colicoidal preparado con una
concentración de sal conocida, seguido de una
electroforesis y usando la migración obtenida
como potencial de movilidad ​zeta, l​ a cual fue
sometida a una fórmula de electroforesis
clásica y finalmente analizada por una
medición de electroforesis o de imágenes (Wu
& Hsu. 2020).
Inmunoensayo por electroforesis capilar
indirecta de proteína de membrana en
vesículas extracelulares
Las vesículas extracelulares (VE) se presentan
en fluidos biológicos como la sangre, la orina
y líquido cefalorraquídeo. Estas han mostrado
a lo largo de diversos estudios resultados
alentadores para su uso como biomarcadores
de cánceres. Por ello es importante aclarar sus
funciones, roles y utilidades en los campos de
la bioquímica y la ciencia médica (Yumeki &
Kaneta. 2020).
En este artículo se propuso un nuevo método
CEIA-LIF para la determinación de la proteína
de membrana CD63 (Antígeno-Proteína) en
vehículos eléctricos. En este método se
pretende aislar las VE de un medio de cultivo
y suspenderlas en una solución tampón de
fosfato. Para así desarrollar un inmunoensayo
de electroforesis capilar sensible para una
proteína de membrana como lo son las CD63,
en vesículas extracelulares.
Principalmente se implementaron métodos
químicos con reactivos de grados analiticos,
realizando un tampón de solución salina con
fosfato para obtener soluciones de
precipitación de exosomas(Yumeki & Kaneta.
2020).
Posterior a esto se realizaron cultivos de
células a 37° C en el medio tamponado con
fosfato, suplementado con suero bovino al
10% y antibiotico antimicotico con sal sódica
de penicilina, sulfato de estreptomicina y
anfotericina.
Luego de esto se realizó un aislamiento y
etiquetado de vehículos eléctricos, mediante
cultivos de células de HeLa, llevadas a la
centrifugación en 10 ml del medio de cultivo a
2.580 xg durante 15 minutos para eliminar las
células y restos celulares (Yumeki & Kaneta.
2020).
Figura 1. Ilustración esquemática del protocolo para el
inmunoensayo de electroforesis capilar de CD63. Tomado de
“Indirect capillary electrophoresis immunoassay of
membrane protein in extracellular vesicles”. Modificado por
Jimenez, J. 2020.
Para finalizar con la metodología se realizó un
procedimiento de semicuantificación de CD63,
mediante electrolitos de fondo que se
prepararon añadiendo una cantidad medida de
hidróxido de sodio para permitir una
monitorización del pH mediante un medidor y
se examinaron los electrolitos del fondo del
tampón para optimizar las condiciones de
separación (Yumeki & Kaneta. 2020).
Mediante esto se obtuvo que; los
inmunoensayos indirectos de CD63 en las
muestras que contenían diferentes cantidades
de EV se diluyeron sucesivamente y
reaccionaron con una cantidad constante del
anticuerpo fluorescente. En los
electroferogramas se muestra que la solución
produjo tres picos, de los cuales solo el más
alto corresponde a la reducción de área con el
aumento de la cantidad de VE, mientras que
los otros picos fueron constantes. Estos picos
podrían darse por la dispersión de la luz en
partículas pequeñas que no se pueden eliminar
por completo con la centrifugación (Yumeki &
Kaneta. 2020).
Figura 2. Los electroferogramas de la mezcla contiene el
anticuerpo fluorescente y la fluoresceína después de eliminar
los EVs unidos al anticuerpo fluorescente. Tomado de
“Indirect capillary electrophoresis immunoassay of
membrane protein in extracellular vesicles”. Modificado por
Jimenez, J. 2020​.
Para finalizar en este estudio se realizaron
cálculos de semicuantificación de CD63,
determinando una relación de unión entre esta
proteína y el anticuerpo de 1:1 cuando es
calculada la concentración de CD63
inmovilizadas en los vehículos eléctricos.
Dando a concluir de igual forma, que el
método propuesto al comienzo de la
investigación ( CEIA-LIF ) es prometedor para
la determinación rápida y fácil de las proteínas
de la membrana en la superficie de los
vehículos eléctricos (Yumeki & Kaneta.
2020).
Electroforesis de proteínas en gel de
agarosa nativa.
La electroforesis en gel nativo es una técnica
analítica, y, aunque la metodología empleada
al realizar la electroforesis en presencia de
SDS es una técnica de rutina para seguir la
purificación y el replegamiento de las
proteínas, la técnica en gel nativo permite
seguir la interacción Proteína-Ligando, así
como la heterogeneidad de la proteína (Li,
Akuta, Nakagawa, Sato, Shibata, Maruyama,
Okumura, Kurosawa &. Arawaka. 2020 ).
Además, al realizar la electroforesis con un gel
nativo de agarosa se facilita realizar el análisis
a diferentes proteínas, debido a su versatilidad
ante la acidez o basicidad de las muestras de
proteínas globulares. Se obtuvo que este
funciona de manera adecuada para al menos
cuatro proteínas y un virus (BSA, lisozima,
quimotripsina y BGG). Asimismo, se destaca
que algunos anticuerpos monoclonales
migraron hacia el cátodo, mientras que los
contaminantes del sobrenadante migraron
hacia el ánodo. (Li, Akuta, Nakagawa, Sato,
Shibata, Maruyama, Okumura, Kurosawa &.
Arawaka. 2020 ).
Para el estudio se utilizó un montaje estándar
de electroforesis de lecho plano u horizontal, y
uno vertical. Para el primero, la agarosa se
disolvió en los buffers de histidina a una
determinada concentración, además, para
asegurar una disolución completa se usó un
horno de microondas para calentar las
muestras. La electroforesis se llevó a cabo a
temperatura ambiente y con tiempos de entre
60 a 120 minutos a 100 V. Se tomaron varios
datos a 30 mM de concentración de agarosa en
los geles, con esto observaron que la albúmina
y la lisozima se cargaron al centro del gel (Li,
Akuta, Nakagawa, Sato, Shibata, Maruyama,
Okumura, Kurosawa &. Arawaka. 2020 ).
Por otro lado, para la electroforesis vertical se
usó un aparato de mini gel estándar de
invitrogen, el procedimiento que se siguió en
la electroforesis fue el mismo que en la de
lecho plano. En proteínas ácidas, estas
tendieron a moverse hacia el cátodo, y las
básicas hacia el ánodo. Los geles fueron
teñidos con Azul de Coomassie (Li, Akuta,
Nakagawa, Sato, Shibata, Maruyama,
Okumura, Kurosawa &. Arawaka. 2020 )..
Caracterización de anticuerpos por medio
de electroforesis en gel de agarosa nativa.
Este estudio se realizó con la finalidad de
probar la efectividad de la electroforesis con
gel nativo de agarosa para separar y
caracterizar anticuerpos mono y policlonales,
realizando variaciones en lo que respecta a
concentración de agarosa, tiempo de ejecución
y concentración del tampón del electrodo ( Li
& Arakawa. 2019).
Partiendo de la curiosidad por si el protocolo
establecido podía evaluar diferentes
anticuerpos así como su expresión y
purificación. Obtuvieron como resultado una
efectiva separación de los anticuerpos, (los
cuales se movilizaron hacia el cátodo,) de los
contaminantes, los cuales permanecieron
ácidos o neutros, con una buena separación de
la franja del anticuerpo (Li & Arakawa. 2019).
Para esta investigación se generaron
anticuerpos monoclonales contra cadenas
peptídicas las cuales contenían fosfotirosina.
Los anticuerpos fueron expresados en células
HEK293, las cuales fueron cultivadas bajo una
serie de condiciones específicas (Li &
Arakawa. 2019).
Finalmente, todas las muestras fueron
analizadas mediante una electroforesis en un
gel nativo a base de agarosa, a temperatura
ambiente y a 100 V usando Buffer de Histidina
(Li & Arakawa. 2019).
Cuantificacion de proteinas a niveles de
microgramos integrando electroforesis en
gel y tecnología de teléfonos inteligentes
En este artículo se aplica una combinación
entre la electroforesis en gel y la tecnología de
teléfonos inteligentes, para la cuantificación de
proteínas en una muestra de suero (Romario,
Ivanilce & Zezzi. 2019).
La electroforesis no solo permite capturar una
imagen de gel, si no que también busca el
acceso a los datos extraídos de los
tratamientos, a través de cada banda de
proteínas por medio de un programa de acceso
libre como lo es PHOTOMETRIX.
Para lograr esto se realizó un procedimiento
analitico en el cual se solubilizo un tampón de
SDS al 1% para reparar así curvas de
calibración y reducir la complejidad de la
muestra, evidenciando los resultado de forma
mas concreta para el lector (Romario, Ivanilce
& Zezzi. 2019)
La cuantificación de proteínas con
PHOTOMETRIX, surge directamente del gel
de SDS PAGE, mediante el cual se adquieren
imágenes de cada banda cuantificada a través
del valor de las imágenes capturadas por el
programa. Esto proporciona curvas de
calibración y comparación de comprobación
por medio del gel y el software utilizado.
Por último, para comprobar el desempeño de
la estrategia, se aplicó una mezcla de tres
estándares de proteínas (Alb, Tryp y CA).
Incluyéndolos a su vez en los análisis
univariados que permiten la calibración, el
muestreo, la predicción y análisis de los datos
previamente guardados (Romario, Ivanilce &
Zezzi. 2019)
Figura 3. ​Curvas de calibración ​de una mezcla de patrones
de proteínas obtenidas después de la separación a través de
SDS-PAGE​. Tomado de “Quantifying proteins at
microgram levels integrating gel electrophoresis and
smartphone technology”. Modificado por Jimenez, J. 2020.
Mediante dichos análisis se concluyó que el
método puede ser empleado con éxito para
diversas investigaciones de electroforesis por
medio de nuevas tecnologías al alcance de
todos, ya que presenta una buena precisión y
exactitud en los datos arrojados (Romario,
Ivanilce & Zezzi. 2019)
Aparte de esto se reconoce como una gran
innovación de la tecnología de teléfonos
inteligentes y como un campo significativo en
la proteómica, ya que abre nuevas
posibilidades de visión en la cuantificación de
proteínas.
La quercetina promueve la proliferación de
células madre epidérmicas humanas a
través de la vía de señalización del receptor
de estrógeno
Las células madre epidérmicas tienen un papel
muy importante en la cicatrización de las
heridas; la quercetina se conoce como un
fitoestrógeno capaz de acelerar la cicatrización
de las heridas cutáneas.
En este estudio se investigó el efecto de la
quercetina sobre la proliferación de EpSC
(enfermedad supurativa crónica) y su aumento
de células en la fase S.
Esta investigación se llevó a cabo mediante un
aislamiento y cultivo de EpSC de piel humana
que habían sido expuestos a cirugías plásticas.
Estos se cultivaron de forma ​in vitro para
posteriormente ser cortados y expuestos a una
placa de cultivo de células en presencia o no a
la quercetina.
Luego de esto se analizó una citometría de
flujo; en la cual se detectaron los
biomarcadores de EpSC incubadas con
anticuerpos a una temperatura ambiente. La
distribución de la fase del ciclo celular se
analizó mediante dicha citometría al igual que
su ADN.
Se observó la reacción en cadena de la
polimerasa con transcripción inversa, por
medio del ARN total de las EpSc aisladas.
Los productos de PCR se separaron por medio
de la electroforesis en gel de agarosa 1% y se
visualizaron posteriormente en una tinción con
bromuro de etidio. Su imagen de expresión de
genes se cuantificó por medio del software
ImageJ.
Por último se realizó una tinción con
inmunofluorescencia en las EpSC cultivadas
en cubreobjetos recubiertos por colágeno y
fijados con paraformaldehído a temperatura
ambiente, con el fin de ser llevados a
histología e inmunohistoquímica.
Mediante esto se obtuvo que la quercetina
promueve la proliferación de EpSc en cultivos
y explantes de piel humana. Dicho tratamiento
aumentó significativamente las células madre
dando resultados positivos con el objetivo
inicial de la investigación.
En conclusión se reconoce que llevada a
procedimientos adecuados y análisis
específicos, la quercetina se puede utilizar para
expandir las EpSc en investigaciones básicas,
tratamiento de heridas cutáneas e ingeniería de
tejidos; dando un avance alentador a los
pacientes que sufren estas complicaciones, y
brindando nuevas alternativas a su forma de
vida.
Separación electroforética
inmunotransferencia de southern y
northern
EM Southern inventó una técnica de
separación electroforética conocida como
transferencia Southern. Las enzimas de
restricción se utilizan para digerir una muestra
de ADN en fragmentos y el producto se
somete a electroforesis. Las bandas de ADN
separadas se transfieren luego a un soporte
sólido y se hibridan. La transferencia Northern
es una técnica similar en la que se usa ARN
como material de partida. La transferencia de
Western se refiere a la electroforesis y la
transferencia de proteínas. Actualmente, se
encuentra disponible una amplia gama de
métodos para la separación electroforética y la
transferencia de ADN, ARN y proteínas, que
se incorporan en métodos clínicamente
relevantes. Todos son métodos desarrollados
en laboratorio relativamente complejos. (S.
Melmed, R. Auchus, A. Goldfine, R. Koenig
& C. Rosen. 2020)
CONCLUSIONES
Mediante este informe de revisión, fue posible
familiarizarse con las diversas técnicas de
separación de ADN y ARN, así mismo
identificar la influencia de la electroforesis en
las proteínas y alternos campos de la biología
y la vida.
Se reconoce que las constantes de equilibrio
acercan a entendimientos mas concretos sobre
la reacción que se pretende estudiar, ya que
muestras las concentraciones altas que cada
producto puede experimentar; mediante
herramientas prácticas y comprensibles.
Por otra parte, la gel de agarosa constituye un
papel muy importante en los estudios de
electroforesis, ya que mediante esta se logran
separar moléculas de ADN y la filiación de
moléculas a anticuerpos, antígenos y enzimas.
Para finalizar los inmunoensayos y la
cuantificación de proteínas presentan
alternativas de gran importancia para la
ciencia, la biología y la medicina, ya que
mediante estas se pueden realizar diversos
estudios que favorezcan la vida, brindando
alternativas a diversas enfermedades que
atacan la sociedad en la actualidad de forma
práctica y alentadora.
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