Resumen Durante los últimos años los azoles anti fúngicos se han presentado como una

herramienta potencialmente efectiva contra infecciones de Candida albicans, sin embargo la

resistencia a azoles puede ocurrir mediante mutaciones en la secuencia del gen ERG11, lo cual
presenta un problema de gran importancia a la hora de encontrar tratamiento efectivo contra las
infecciones de C. albicans, en este estudio se buscaron mutaciones en las secuencias del gen
ERG11 en muestras provistas, luego de la amplificación y secuenciación del gen ERG11 de la cepa
presente, se realizó un análisis bioinformatico con intención de comparar la muestra secuenciada
con información almacenada en bases de datos la finalidad de esta búsqueda consistió en encontrar
variaciones en las secuencias que indicaran la presencia de unas potencial resistencia a azoles de la
muestra.

Palabras clave: Candida albicans, gen ERG11, mutación, Antifúngicos, PCR

Introducción En estas últimas dos décadas el varias familias de antifúngicos disponibles en

hongo Candida albicans ha adquirido una
gran importancia[ CITATION Mar07 \l 9226 ],
al ser responsable de una cantidad importante
de condiciones clínicas, pasando por
infecciones de la mucosa tales como vaginitis
y candidiasis orofaringea, hasta llegar a
algunas con un alto índice de mortalidad
como candidemia [ CITATION Mor10 \l
9226 \m Loc12] debido a su carácter de
patógeno oportunista suele actuar en
situaciones de pacientes inmunodeprimidos
que suelen ser resultado de tratamiento contra
el cáncer, trasplante de médula ósea y/o
SIDA [ CITATION Van12 \l 9226 ] sin
embargo la gran fama adquirida por este
hongo en tiempos recientes no se relaciona
tanto en la patogénesis sino en su resistencia
al tratamiento. Usualmente la forma más
común de tratar las infecciones de Candida es
mediante el uso de azoles antifungicos
[ CITATION Mar07 \l 9226 ]
La ruta de síntesis del ergosterol, ha sido el
blanco más ampliamente utilizado para el
desarrollo de antifúngicos en agricultura y
medicina, dado los efectos en viabilidad y
crecimiento celular que su inhibición produce
en los hongos, así como del carácter
específico que tiene la acción de las
sustancias.[CITATION Van78 \l 1033 ]. Los
antifúngicos son compuestos, naturales o
sintéticos, que pueden producir
modificaciones en estructuras básicas de la
célula fúngica inhibiendo su desarrollo y
alterando su viabilidad. Actualmente, existen
el mercado siendo una de los más comunes
los azoles, que inhiben la enzima 14α-
lanosterol-desmetilasa, afectando la
biosíntesis de ergosterol, un importante
componente de la membrana plasmática
fúngica [CITATION Mar \l 1033 ].
Sin embargo, el uso indiscriminado de estas
sustancias ha favorecido la formación de
cepas resistentes de casi todas las especies
que se conocen como patógenas de plantas de
importancia económica y humanos[ CITATION
Van97 \l 1033 ], por lo que entonces se ha
continuado con el estudio de los blancos de
acción y se ha determinado que el desarrollo
de resistencia al fluconazol es un proceso
complejo en el cual intervienen diversos
factores, tanto del huésped como del
microorganismo. Entre los factores
dependientes del microorganismo figuran
mecanismos moleculares y celulares.
[CITATION SPe00 \l 1033 ] A nivel molecular,
diversos mecansimos de resistencia ha sido
descritos en Candida. albicans como
alteraciones genéticas puntuales en la región
405-488 del gen que codifica para la enzima
“blanco” del fármaco o ERG11, como por
ejemplo G464S, R467K y I471T, y/o sobre-
expresión de este gen. [CITATION Mar \l 1033
].
En este estudio se presenta la secuencia del
gen ERG11 de Candida albicans que
codifica para la enzima lanosterol-14-alfa-
demetilasa, junto con la secuencia del gen
ERG11 y la predicción de mutaciones que
originan sustituciones en aminoácidos que
causen resistencia a azoles, ya que estas
alteraciones generan pérdida de afinidad del
azol por su blanco de acción, la intención con
esto es hacer un estudio comparativo a partir
de datos obtenidos experimentalmente contra
información obtenida de bases de datos, esto
con la finalidad de encontrar posibles
mutaciones
Materiales y Métodos Se realizó la
extracción de ADN de candida albicans, de
una siembra en agar YEPD (1% Extracto de
levadura, 2%Peptona, 2% Dextrosa (Glucosa)
y 1.5% Agar), previamente incubado a 37°C
por durante 24 - 48 horas previas de la
extracción. Se procede a realizar la lisis con
solución salina, y posterior mente realizar la
extracción según el protocolo de levaduras
de Wizard genomic DNA promega.
Clean-Up System [Promega, Madison
(Wisconsin), USA]. La electroforesis de los
productos de PCR se realiza en un gel de
agarosa al 1,5%, se deja correr y se analiza
con ayuda de un transluminador.
Al final se realizó la secuenciación que se
hizo con un secuenciador ABI PRISM® 310
Genetic Analyzer [Applied Biosyste ms,
Foster City (California), USA] y las
reacciones de secuenciación se realizaron con
el Kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle
Sequencing (Applied Biosystems, Foster
City, CA, USA).
Resultados Se obtiene la secuencia consenso
y se visualizan los resultados mediante el
programa CLC main Workbench 7.5.1.

Para la selección de primers se obtuvo la

secuencia en NCBI (National Center for
Biothecnology informatic) y se hizo un
diseño de primers para la secuencia ERG11
en prime3plus. Posteriormente se realizó un
PCR, donde amplificamos 407pb del gen Ilustración 1 Secuencia forward sepa
ERG11 de la región donde están los hotspots Cándida Albicans: se elimina los primeros
en el marcador. Primero se realiza el “Master 100 nucleótidos debidos al sonido que tienen
Mix”, y se divide en 3 eppendorf y en uno se esta técnica por defecto. Los picos detallados
realiza una muestra problema con agua ultra que se pueden ver en la imagen muestran
pura, y en los 2 restantes se punen las una secuenciación de muy alta calidad.
muestras de ADN previamente obtenidas,
después se llevan las muestras al
termociclador y se programa el perfil térmico
(tabla A).

Tabla A

Numero de Temperatura Tiempo(min)

ciclos
1 94°C 5
94°C 1 Ilustración 2 Secuencia Reverse sepa
35 58°C 1 Cándida Albicans: se elimina los primeros
72°C 1 100 nucleótidos debido al sonido que tienen
1 72°C 1 esta técnica por defecto. Los picos detallados
1 10°C ∞ muestran una cromatografía correcta con
nivel de ruido moderado.
Se hace la purificación del producto de la
PCR usando el Kit Wizard SV Gel and PCR
Secuencia consenso (Anexo2):
TTACGTTTTAGTTTCTCCAGGTTATGCT
CATACTAGTGAAAGATATTTTGATAAC
CCTGAAGATTTTGATCCAACTAGATGG
GACACTGCTGCTGCCAAAGCTAATTCT
GTTTCATTTAACTCTTCTGATGAAGTT
GATTATGGGTTTGGGAAAGTTTCTAAA
GGGGTTTCTTCACCTTATTTACCATTTG
GTGGTGGTAGACATAGATGTATTGGG
GAACAATTTGCTTATGTTCAATTGGGA
ACCATTTTAACTACTTTTGTTTATAACT
TAAGATGGACTATTGATGGTTATAAAG
TGCCTGACCCTGATTATAGTTCAAT
Ilustración 3 blast2 secuencia nativa vs
secuencia consenso: en la imagen se ilustra
el resultado del alineamiento entre la
secuencias, se observa una mutación en el
primer nucleótido del tercer codón, el
polimorfismo anterior cambia una metionina
por una valina en la estructura de la
proteína.
Como se puede ver en el (anexo 2) la
secuencia forward y reverse son
complementaria en más de un 90% de sus
bases, porcentaje que no tiene en cuenta los
datos basura debido al error de la lectura de
las primeras bases. En consecuencia, la
secuencia consenso da una secuencia más
certera para la comparación genética del
organismo nativo y la sepa a estudio, este
tema se discutirá más adelante.
Por otro lado, la ilustración 2 muestra que la
secuencia reverse posee un ruido de fondo a
comparación de secuencia forward
(ilustración 1), este ruido es causado por
diferentes razones, una de las más comunes
es la purificación incorrecta del ADN y otros
reactivos que pueden afectar los resultados
esperados. Para solucionar esto se repite el
proceso de purificación. [CITATION Ano141 \l
9226 ]
Otras causas pueden afectar la secuenciación
después de la purificación, estas son: la baja
concentración de ADN, concentración del
cebador deficiente o cebador disfuncional,
provocando una ausencia de reacción en la
PCR. En otras circunstancias, el cebador
puede tener dos o más puntos de hibridación
lo que reduce la veracidad de los resultados
causando ruido. Para solucionar estos
problemas se asegura un diseño de cebador
que cumpla los requisitos de la reacción, y
suministrar la concentración adecuado de
cada reactivo. [CITATION Ano141 \l 9226 ]
Finalmente la comparación entre la secuencia
nativa y la secuencia consenso indica que hay
variaciones genéticas en el gen erg11, que
pueden contribuir a la resistencia a asoles en
esta sepa, por tanto, la resistencia de esta sepa
se debe a un cambio de la estructura
proteínica de su membrana causado por el
cambio en un solo nucleótido del gen erg11,
resultados similares se puede ver también en
la mutaciones A395T en el gen ERG11 de la
Cándida Tropicalis, mutación resultante de
una sustitución en el Y132F en el
ERG11p,dándole a la sepa resistencia al
Fluconazole. Por tanto la hipótesis planteada
es corecta.
Discusión La bioinformática ligada a las
técnicas moleculares significan un valioso
desarrollo para estudios en genética,
bioquímica y molecular, los cuales han sido
de gran utilidad al momento de enfrentarse a
una nueva incógnita. En este estudio a partir
de la amplificación de gen mediante PCR, la
secuenciación del ADN del gen ERG11 de
Candida albicans y el posterior análisis de la
secuencia con las herramientas
bioinformáticas se logró realizar un
alineamiento (BI2seq) el cual permite
identificar específicamente las regiones
donde se dan las posibles mutaciones de las
proteínas involucradas en la vía metabólica y
síntesis del ergosterol en C. albicans.
La secuenciación del gen ERG11 solamente
mostró una sustitución en el primer
nucleótido del tercer codón que es ATG a
ACG , este polimorfismo cambia entonces
una metionina por una valina en la estructura
de la proteína, sin embargo no se debe
descartar la presencia de otras mutaciones en
la región de los primeros aminoácidos ya que
esta región no se secuencio correctamente,
para lo cual, se requiere la secuenciación del
gen ERG11 de nuevo para así ser analizada
de nuevo y determinar si esa región puede
estar involucrada con mutaciones que generan
resistencia a los antifúngicos.
La mutación que se identificó en la secuencia,
no debe ser considerada como un cambio
relevante a la hora de determinar la
resistencia a los azoles, pues las mutaciones
que han sido mayormente reportadas por
causar resistencia en el gen ERG11 de
Candida albicans son (F308S, P230L y
Y118A) , y una sustitución particular de un
aminoácido puede ser determinada como
“patológica” si el clasificador usado lo
predice como deletéreo o causante de
enfermedad[ CITATION Sur14 \l 1033 ]. Estas
mutaciones están dispersas en hot spots en los
límites de aminoácidos 105 a 165, 266 a 287
y 405 a 488.[ CITATION Mar99 \l 1033 ]. De
igual manera, si una mutación se encuentra
lejos del sitio activo o del grupo Heme
probablemente no cause una resistencia a
azoles[ CITATION Sur14 \l 1033 ].
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Además la resistencia a azoles en C.
albicans es un proceso
multifactorial[CITATION Bal02 \l 1033 ] que
puede ser mediado por distintos mecanismos
independientes al gen ERG11.[ CITATION
Sur14 \l 1033 ]. Es decir, la resistencia no
solo se debe a mutaciones en el gen ERG11,
también puede deberse por la sobre-expresión
de los genes de bombas de eflujo CDR1 y
CDR2. En este proceso una presión selectiva
como la presencia del antifúngico, permite
que las células adquieran un fenotipo
resistente en el cual varios mecanismos
puedan contribuir[ CITATION Mar \l 1033 ].
Entre otros mecanismos moleculares de
resistencia a los azoles figura también la
alteración en otras enzimas de la ruta
biosintética del ergoesterol[ CITATION
SPe00 \l 1033 ].
El carácter multifactorial que presenta la
resistencia de C. albicans a los antifúngicos,
hace necesario que se adopten nuevas
estrategias que permitan el control de estas
afecciones, dado que tiene una gran
importancia en cuanto a enfermedades en
humanos y en patologías en plantas;
estrategias en la que se desarrollen moléculas
más potentes, la investigación de nuevos
antifúngicos con nuevas dianas y mecanismos
de acción, así como combinaciones con
inhibidores de los transportadores activos de
membrana. [ CITATION SPe00 \l 1033 ].
Esto constituye además, un aporte y una
herramienta útil para diagnosticar si hay
resistencia a azoles en Candida albicans.
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