Recuento de células Viables (células que aún presentan capacidad para reproducirse)

El conteo de
microorganismos y/o
células en un
laboratorio de
microbiología sin duda
es un factor
indispensable, para ello
se han
desarrollado varios
métodos para facilitar
su recuento, pues al
tener
miles de ellos en un solo
cultivo, resulta difícil
determinar la cantidad
que se tiene. No
siempre los métodos
directos nos
proporcionan la
información adecuada,
o la que buscamos
obtener, por ello
algunas
veces recurrimos a los
métodos indirectos
El recuento de células viables, tanto de los alimentos como de las superficies en contacto
con los mismos y del aire de las industrias alimentarias, es uno de los parámetros más
importantes a la hora de determinar la calidad y seguridad de los alimentos.
Una célula viable es definida como aquélla que es capaz de dividirse y formar una colonia
en el medio de cultivo. Entonces, el recuento de células viables viene a ser el resultado de
la división y formación de una colonia en el medio del cultivo.
Se basa en que cada colonia surge de una simple célula. Cada colonia contiene una sola
especie bacteriana.
Métodos de conteo de células viables
Los métodos de conteo de células viables se utilizan para conocer la cantidad de células
capaces de desarrollarse en un medio ambiente. El fundamento de estos métodos es como
su nombre lo indica, las células viables, las cuales son aquellas que al ser inoculadas en un
medio de cultivo indudablemente se multiplican.
Estos métodos se basan en poner en evidencia la presencia de los microorganismos vivos.
Requieren al menos 24 horas para el cultivo y la interpretación de resultados.
. Cuenta en placa
Se determina el número de microorganismos en una muestra en relación a las colonias que
forman, las UFC (Unidades Formadoras de Colonias). Se emplean soluciones diluidas o
diluciones de una muestra concentrada para que cada colonia formada provenga de un solo
microorganismo, aunque algunas agrupaciones no pueden ser separadas por las diluciones.
Se utilizan principalmente para la cuantificación de bacterias, levaduras y hongos
filamentosos.
Método de vertido en placa: Este método se usa generalmente en bacterias aerobias
obligatorias.
Método de extendido en placa: Es el método de elección para anaerobios facultativos y
cultivo de microaerófilos.
Miles y Misra: Involucra la preparación de diluciones seriadas de una suspensión
bacteriana. Las placas son divididas en sectores separados. Se inocula cada sector una gota
empleando una Pipeta Pasteur calibrada o bien micropipetas inoculando 0.02mL. Las
placas se incuban de 18 a 24 horas a la temperatura adecuada (37ºC). Se toman en cuenta
los sectores donde hay menos de 20 UFC. El número de bacterias viables se obtiene
calculando la media de cada dilución en las repeticiones realizadas.
Miles y Misra Micropipetas

Asa Calibrada: La utilización de agujas o asas calibradas permite tomar volúmenes

pequeños, que son inoculados en la superficie del agar mediante la técnica de siembra
masiva. Las colonias son contadas y se multiplican por el factor de dilución del asa
empleada. El uso más frecuente de éste método es en el urocultivo. Se determinan las
UFC/g o mL de muestra.
 Asas Calibradas Muestra de Urocultivo

Filtración: La concentración de los microorganismos de las muestras se hace,

generalmente, mediante filtración.  Para ello, se hace pasar un volumen conocido de líquido
o de aire a través de un filtro de membrana, haciendo vacio. Los poros del filtro son lo
suficientemente pequeños como para que no puedan pasar las células microbianas.
Posteriormente se coloca el filtro en un medio sólido adecuado y se incuba. El número de
colonias que se desarrollan es el número de células microbianas viables en el volumen de
fluido que se filtró. Generalmente, los resultados se expresan como organismos presentes
por litro.
La membrana de celulosa retiene a los microorganismos en su malla con poros de 0.25-
0.45mm. Esta membrana se transfiere a un medio de cultivo para el desarrollo de colonias.
Filtración

Número más probable

El método del número más probable (NMP), al igual que el método de recuento en placa,
nos proporciona un recuento de viables. Se basa en el principio de que una única célula
viva puede desarrollarse y producir un cultivo turbio. El NMP requiere la realización una
serie de diluciones seriadas al décimo de la muestra de cultivo, en un medio líquido
adecuado para el crecimiento de dicho organismo.
El método del número más probable (NMP) proporciona un recuento de viables. Al
aumentar el factor de dilución, se alcanza un punto en el que algunos tubos contienen
sólo un organismo y los otros, ninguno. A partir del número, determinado por los
tubos que presentan turbidez en tres diluciones sucesivas (en este caso 5, 3, 1), puede
determinarse el número más probable de células estadísticamente (11,0) en la primera
de las tres diluciones, mediante una tabla de números más probables (Tabla 8.6). Este
valor, multiplicado por el factor de dilución nos proporciona el número de células
viables de la muestra.

Posteriormente, se incuban las muestras de dichos tubos problema. Una vez que ha pasado
suficiente tiempo como para que crezca el microorganismo, se examinan los tubos.
Aquellos tubos que fueron inoculados con una o más células microbianas a partir de la
muestra, se pondrán turbios, mientras que los tubos que no recibieron ninguna célula
permanecerán transparentes. A medida que se aumenta el factor de dilución, se alcanzará
un punto en el cual algunos tubos contendrán tan sólo un organismo y otros, ninguno. Al
determinar la probabilidad de que los tubos no recibieran ninguna célula, se puede
determinar el número más probable de microorganismos presentes en la muestra original,
utilizando para ello una tabla estadística.
La precisión del número más probable aumenta con el número de tubos que se usan, aunque
cinco tubos por dilución se considera como una relación apropiada entre la precisión y la
economía. El método del NMP se utiliza para contar microorganismos que son difíciles de
cultivar en medio sólido. También se usa para determinar el número de células de un
cultivo mixto que pueden crecer en un medio líquido detcrminado. Por ejemplo, puede
emplearse para determinar la contaminación del agua potable, determinando el número de
bacterias que pueden crecer en un medio que contiene lactosa. Estas bacterias
probablemente sean Escherichia coli provenientes de aguas residuales contaminadas, y la
presencia de E. coli en el agua potable es una prueba presuntiva de contaminación.
Unidades Formadoras de Colonias(UFC)
El número de bacterias viables por muestra se expresa en UFC. Representa cada colonia
contada y su número total representa el número total de bacterias viables en la muestra.
Es útil para el método de vertido o extensión en placa. Se siembran volúmenes conocidos
de cada dilución, luego se incuba a 35-37 °C durante 24-48 horas.
Finalizado el tiempo de incubación, se realiza el recuento. Se toman en cuenta únicamente
aquellas cajas Petri que tengan entre 30 y 300 colonias. Este número de colonias es
estadísticamente representativo.
NOTA: Aquellas placas que tengan más de 300 colonias se reportan como “incontables”.
Recuento de células viables aplicadas a grupos funcionales
Un Grupo funcional son microorganismos que tienen procesos metabólicos semejantes,
independientemente de su taxonomía.
Procedimiento para determinar abundancia de grupos funcionales que intervienen en
la fertilidad del suelo
1) Suspensión y dilución de suelo.
2) Siembra en medios selectivos líquidos y sólidos
3) Determinación del crecimiento (lectura).
4) Cálculo de abundancia.
1. Suspensión y dilución del suelo
Para realizar el recuento, el suelo debe ser suspendido/diluido (generalmente 10 g de suelo
se colocan en 90 mL de solución salina estéril). Cuando en el suelo la cantidad de
microorganismos es muy alta se deben realizar diluciones de las suspensiones para obtener
un número factible de microorganismos que pueda ser contado. Por eje. Cuando se realizan
métodos de recuento en medio sólido, el número factible de microorganismos que puede ser
contado en una caja de Petri debe estar en el rango de 30 a 300 colonias por caja. Así
mismo, en el caso de recuento en un medio líquido (número más probable), para poder
ingresar a la tabla de Mc. Grady se requiere que exista un tubo negativo. Para poder
cumplir con estos requisitos, comúnmente se realizan diluciones al décimo (1 mL de la
muestra en 9 mL de solución salina estéril).
2. Siembra en medios selectivos líquidos y sólidos
Para realizar la siembra de los microorganismos se procede a colocar 1 mL de cada dilución
de suelo utilizada en medios selectivos para los distintos grupos funcionales. Para optimizar
el procedimiento se recomienda comenzar la siembra con las diluciones más altas, de esa
manera se puede utilizar solo una pipeta estéril por muestra. Grupos funcionales para
evaluar:
-Amonificadores: debido a que es el grupo más abundante en el suelo, se siembran las tres
diluciones más altas. La siembra se realiza por triplicado, colocando 1 mL de las diluciones
-9, -8 y -7 en tubos conteniendo el medio líquido selectivo (con asparagina). Se incuba a
28-30 °C durante 7 días.
-Celulíticos: se siembra por triplicado 1 mL de las diluciones -6, -5 y -4 en tubos
contenidos el medio líquido selectivo (con papel filtro selectivo). Se incuba a 28-30 °C
durante 15 días.
-Fijadores de nitrógeno de vida libre: se siembra 1 mL de la dilución -4 en una caja de
Petri y se agrega el medio sólido respectivo (sin N). Se incuba a 28-30 °C durante 5 días.
-Nitrificadores: debido a que es el grupo menos abundante en el suelo se siembran en las
tres diluciones más bajas. Se siembra por triplicado 1 mL de las diluciones -4, -3, y -2 en
los tubos conteniendo el medio líquido selectivo (con sulfato de amonio). Se incuba a 28-30
°C durante 21 días.

3. Determinación del crecimiento(Lectura)

Una vez que cada uno de los grupos funcionales han sido incubados se procede a la lectura.
En el caso de realizar el recuento en un medio líquido, para poder obtener el NMP se
procede de la siguiente manera:
1) se ordena los tubos desde la dilución más concentrada a la más diluida que se utilizó para
sembrar cada grupo funcional.
2) se cuentan los tubos positivos de cada dilución (número característico) y 3) se ingresa a
la tabla de Mc. Grady con el número característico para obtener el NMP.

-Amonificadores: se agregan 2-3 gotas del reactivo de Nessler en cada tubo y se cuentan
los tubos positivos (color ocre por presencia de amonio). Se ordena la cifra para obtener el
número característico y se ingresa a la tabla de Mc. Grady para obtener el número más
probable.
-Celulíticos: se cuentan los tubos positivos (colonias sobre el papel o alteración del
mismo). Se ordena la cifra para obtener el número característico y se ingresa a la tabla de
Mc. Grady.
-Fijadores de nitrógeno libre: se cuentan las colonias (UFC) que se formen en la caja de
Petri.
-Nitrificadores: se agrega 0.1 mL de ácido sulfúrico concentrado y unas gotas de difenil
amina sulfúrica en cada tubo y se cuentan los tubos positivos (color azul por presencia de
nitratos). Se ordena la cifra para obtener el número característico y se ingresa a la tabla de
Mc. Grady.
Bibliografía
1.- Ingraham, J. L.; Maaloe, O. y Niedhardt, F. C. 1983. Growth of the bacterial
cell. Sunderland, Mass: Sinauer.
2.- Kolter, R. 1992. Life and death in stationary phase. ASM News 58:75-79.
3.- Marr, A. G. 1991. Growth rate of Escherichia coli. .Microbiological Reviews 55:3l6-33.
4.- Mynell, G. G., y Mynell, E. 1970. Theory and practice in experimental
bacteriology. New York: Cambridge University Press.