INTRODUCCIÓN

El jengibre (Zingiber officinale Roce) es una de las especies más importantes de Malasia. Es un
cultivo de alto valor, con un rendimiento potencial de 9-12 toneladas por hectárea; Al precio
de RM 3-5 por kilogramo, los agricultores pueden obtener un ingreso neto por hectárea de RM
20595-53595 (Departamento de Agricultura, 2011). Las principales estaciones de cultivo que se
saya son conocidas. En Sabah las principales áreas productoras de jengibre son los distritos de
Ranau y Tambunan. El distrito de Tambunan es reconocido como el principal productor de
jengibre en Malasia (Daily Express, 2006), y el gobierno estatal apuntó a hacer Sabah el mayor
productor de jengibre del país (Dayly Express, 2012).

Sin embargo, la enfermedad de marchitez bacteriana restringió la producción de jengibre en

Sabah. Las áreas de plantación y producción de jengibre en Sabah disminuyeron de 458.3
hectáreas (5.848,4 toneladas) en 2006 a sólo 117,7 hectáreas (956,7 toneladas) en 2014
(Departamento de Agricultura, 2006-2014). Este incidente causó el aumento del valor de la
importación de jengibre de 1.185 toneladas (RM 1953000) en 2006 a 3.508 toneladas (RM
5691698) en 2012 (Departamento de Estadística, 2006 - 2012).

La marchitez bacteriana es la enfermedad principal del jengibre en Sabah después de la

putrefacción del rizoma. La enfermedad ha afectado la producción de jengibre en Sabah desde
2005. Los síntomas observados en el campo incluyen el amarillamiento, el marchitamiento y la
putrefacción de los rizomas, que se sospecha son la enfermedad de marchitez bacteriana
causada por Ralstonia solanacearum.

El objetivo de este estudio fue identificar las bacterias que causan la enfermedad del
marchitamiento del jengibre hasta el nivel de las especies. La identificación de las bacterias se
realizó cultivando en Agar nutritivo y utilizando la tecnología MALDI-TOF. La identificación del
agente causal de la enfermedad del marchitamiento del jengibre es importante para el control
adecuado de la enfermedad con el fin de mejorar la producción de jengibre en Sabah.

MATERIAL Y MÉTODOS

Los aislamientos de patógenos se basaron en el procedimiento estándar descrito por Johnston

y Booth (1968). Se recolectaron plantas de jengibre con síntomas foliares (amarillamiento y
marchitamiento) (Figura 1) de seis áreas de crecimiento de jengibre en los distritos de
Tambunan y Ranau que fueron afectadas por la enfermedad de marchitez en enero y febrero
de 2014. Las muestras en cada área se recogieron por muestreo al azar. Se inspeccionaron las
plantas de jengibre para detectar signos de patógeno bacteriano (es decir, pudrición de rizoma
y exudado bacteriano).

Las cepas bacterianas se aislaron a partir de rizoma, ya que la bacteria sospechada (R.
solanacearum) es un rizoma de semilla, y la población bacteriana es generalmente mayor en
las raíces en comparación con los tallos y las hojas (Lamb et al., 1996); Los rizomas de jengibre
se lavaron con agua del grifo para eliminar la tierra del suelo, y luego se secaron al aire. Los
rizomas se seccionaron luego asépticamente con aproximadamente 5 mm.^ {3} secciones de
tejido cortadas del cilindro central. Las secciones de tejido se maceraron en agua destilada
estéril (SDW) en un cubo de vidrio, antes de que un bucle completo de la suspensión se rayó
sobre una placa de agar nutriente y se incubaron a 28ºC a 30ºC durante 2 días. Las colonias
individuales que se formaron después de eso se transfirieron a nuevas placas y se incubaron.
Los cultivos purificados se caracterizaron basándose en sus características morfológicas,
tinción con Gram, ensayo con hidróxido de potasio y examen microscópico (Suslow et al.,
1982, Breakwell et al., 2007). Identificación

De las cepas bacterianas se completó usando tecnología de ionización de desorción por láser
asistida por matriz y tiempo de vuelo (MALDI-TOF) (Bizzini et al., 2010). Se llevaron a cabo
ensayos de patogenicidad basados en el método de Nishijima et al. (2004). Se realizaron
pruebas de inoculación en rodajas de rizoma de jengibre y plantas de jengibre jóvenes
cultivadas en bolsas de polivinilo. Las pruebas de patogenicidad en las rodajas se realizaron
utilizando rizomas de jengibre maduros comprados en el mercado local.

Los rizomas se limpiaron con agua del grifo y se secaron a temperatura ambiente. Después de
eso, se cortaron en trozos de aproximadamente 3 mm con un cuchillo esterilizado.

Las rebanadas se esterilizaron en ambas superficies por llama, luego se sumergieron en SDW
para rehidratación y se colocaron en papel de filtro humedecido en placas petri. Las rodajas de
rizomas en cada placa de petri se inocularon con suspensión bacteriana. Los rizomas
inoculados con SDW sirvieron como control.

Las inoculaciones se realizaron usando dos métodos. En la primera, se pinchó un palillo de

dientes estéril sumergido en cultivo bacteriano o SDW en el centro de cada rebanada de
rizoma. En el segundo método, 100 μl de bacterias

Se inocularon por medio de una pipeta, en las heridas punzantes de las rodajas de rizomas,
una suspensión a aproximadamente 1011, 1010, 109, 108 y 107 unidades formadoras de
colonias (CFU) / ml o SDW. Cada rodaja de rizoma inoculada en la placa petri de ambos
métodos se incubó a 30 ° C hasta que se observaron síntomas visibles para la evaluación. Se
llevaron a cabo ensayos de patogenicidad en las plantas de jengibre utilizando plantas de
jengibre iniciadas en cultivos de tejidos que se hicieron crecer en bolsas de polietileno que
contenían medios de envasado de Sahara esterilizados (90% de materia orgánica). Las plantas
de 3 meses de edad se inocularon vertiendo 18 ml de suspensión bacteriana a
aproximadamente 1011, 1010, 109, 108 y 107 CFU / ml o SDW en los medios en tres
repeticiones. El seguimiento de los síntomas foliares se realizó cada semana.

RESULTADO Y DISCUSIÓN

Se observó que las plantas de jengibre con síntomas foliares (amarillamiento y

marchitamiento) recogidos en seis zonas de crecimiento de jengibre en los distritos de
Tambunan y Ranau tenían signos de patógeno bacteriano (es decir, pudrición de rizoma y
exudado bacteriano). Se aislaron un total de 19 cepas bacterianas, y todos los aislamientos
Figura 1. Plantas de jengibre con síntomas foliares (amarilleamiento y marchitez)

Se caracterizaron como en forma de varilla y Gram-negativas por Gram-tinción y la prueba de

hidróxido de potasio, y el examen microscópico. El análisis MALDI-TOF identificó seis especies
de los aislados: Enterobacter cloacae (57,9%), Ralstonia pickettii (10,5%), Agrobacterium
tumefaciens (10,5%), Bacillus pumilus (10,5%), Stenotrophomonas maltophilia (5,3%) y Serratia
marcescens 5,3%).

Las bacterias con mayor abundancia fueron E. cloacae con aislamiento de 57,9%, mientras que
R. solanacearum, que se pensaba que era la causa de la enfermedad de marchitez del jengibre,
no fue detectada entre los aislamientos. E. cloacae es una bacteria gram-negativa, facultativa
anaeróbica, en forma de varilla, que se ha informado de que causa pudrición de rizoma de
jengibre en Hawai y Brasil (Nishijima et al., 2004; Moreira et al., 2013). También se ha
informado que las especies de Enterobacter causan la putrefacción del rizoma del jengibre en
Australia (Stirling, 2004). Se ha informado que E. cloacae tiene efectos antagonistas y suprime
eficazmente el crecimiento de R. solanacearum (Xue, 2009; Liu et al., 2013).

El estudio anterior mostró que dos especies de Enterobacter, E. asburiae y E. cloacae, se

aislaron frecuentemente de rizomas de jengibre y, de hecho, se cultivó R. solanacearum en
cultivo (Alvarez et al., 2003). Además, se ha reportado que E. cloacae reemplaza a R.
solanacearum como el agente patógeno causante de la marchitez bacteriana de la morera en
China (Wang et al., 2010). Este resultado sugirió que R. solanacearum podría haber sido
suprimida o cubierta por E. cloacae. Las otras cuatro bacterias patógenas de las plantas, R.
pickettii, A. tumefaciens, B. pumilus y S. marcescens, también se aislaron de las muestras. B.
pumilus es un patógeno secundario de los rizomas de jengibre que causa la putrefacción de los
rizomas y los síntomas foliares en etapas de crecimiento posteriores (Peng et al., 2013). No se
sabe que R. pickettii, A. tumefaciens y S. marcescens sean el patógeno del jengibre. R. pickettii
es un patógeno para la enfermedad de la mancha foliar y el tizón del árbol de Aves de Paraíso
(Polizzi et al., 2008). R. pickettii también conocido como biocontrol para R. solanacaerum y se
puede encontrar en el suelo, el agua y las plantas (Stelzmueller et al., 2006; Wei et al., 2013).
A. tumefaciens es un patógeno para la enfermedad de la vesícula coronaria de muchas
especies de plantas (Suma et al., 2008; Gohlka & Deeken, 2014). S. marcescens es un patógeno
para la enfermedad de la vid amarilla de la cucurbitácea y la putrefacción de la verruga del
maíz (Besler & Little, 2015; Wang et al., 2015).

S. marcescens también conocido como agente de control biológico y una rizobacteria que se
puede encontrar en la rizósfera del jengibre (Bini et al., 2011; Yang et al., 2012). Las otras
bacterias S. maltophilia no son bacterias patógenas de las plantas. S. maltophilia es un agente
de control biológico y una rizobacteria que se puede encontrar en la rizósfera del jengibre (Bini
et al., 2011; Yang et al., 2012).

Se realizó una prueba de patogenicidad de E. cloacae en plantas de rizoma y jengibre para

determinarlo como patógeno causal. Los resultados mostraron que se observaron síntomas
evidentes de la enfermedad en la rodaja de rizoma en ambos métodos de inoculación que se
utilizaron. Sin embargo, rodajas de rizomas inoculadas utilizando.

El método 1 mostró los síntomas de la enfermedad antes (es decir, después de 10 días de
inoculación) en comparación con rodajas de rizomas inoculadas usando el Método 2 (es decir,
después de 13 días de inoculación). Las rodajas de rizoma infectadas con E. cloacae mostraron
decoloración y descomposición en la herida perforada, que son síntomas comunes de
pudrición, mientras que las rodajas de control no mostraron síntomas de pudrición (Figura 2).

No se observaron síntomas de enfermedad en ninguna planta de jengibre inoculada con E.

cloacae. Un estudio previo de Nishijima et al. (2004) informaron que E. cloacae no produjo
síntomas de enfermedad en plantas de jengibre cuando la temperatura,

La humedad, la aireación y la humedad del suelo no son óptimas para la infección. Para una
infección óptima (Nishijima et al., 2004) se necesitan condiciones ambientales tales como alta
temperatura (35 a 370C), alta humedad y baja atmósfera de oxígeno (es decir, suelo estancado
y congestionado). El suelo utilizado durante el tiempo de la prueba fue aireado (90% de
materia orgánica), la temperatura promedio del aire fue de 330 ° C y la planta se colocó bajo
sombra. Esta condición del entorno no fue óptima para la infección.

Las bacterias de las rodajas de rizomas infectadas en el ensayo de patogenicidad se re-aislaron

y se cultivaron en agar nutritivo y

Figura 2. Síntomas producidos por Enterobacter cloacae en rodajas de rizomas. R: Rodajas de

rizoma inoculadas con bacterias usando palillo de dientes (A1: Control inoculado con agua
destilada estéril, A2: rizoma infectado mostrando síntomas de descomposición). B: Rebanadas
de rizoma inoculadas con 1011 UFC / ml de bacterias usando una pipeta (B1: Control inoculado
con agua destilada estéril, B2: rizoma infectado con decoloración que es un síntoma de
putrefacción leve)

Figura 3. Características de las colonias de Enterobacter cloacae. A: agar nutriente (A1: forma de colonia en agar
nutriente, A2: vista de la colonia bajo microscopio estéreo). B: agar MacConkey (B1: forma de colonia en agar
MacConkey, B2: la vista microscópica mostró bacterias Gram-negativas y en forma de varilla, 1,4 \ mu m con
aumento de 100x)

Agar de medios selectivos para E. cloacae (es decir, agar MacConkey). Las bacterias aisladas
fueron efectivamente E. cloacae porque fueron capaces de crecer en el agar selectivo y
confirmadas por el análisis MALDI-TOF. Las colonias de E. cloacae eran de color crema en agar
nutritivo y de color rosa en agar MacConkey, de forma irregular con elevaciones elevadas y un
margen entero de 0,45 a 0,66 mm. Las bacterias eran Gram-negativas y en forma de varilla con
un tamaño de 1,0 a 2,0 μm (Figura 3).

CONCLUSIÓN

El patógeno bacteriano aislado de las plantas de jengibre con síntomas de amarillamiento y

marchitamiento se había identificado hasta el nivel de especie como una especie de
Enterobacter cloacae complejo en lugar de Ralstonia solanacearum, como se esperaba. Sin
embargo, otros estudios
Se requiere la interacción de E. cloacae con otras especies aisladas para confirmar las causas
de la enfermedad del marchitamiento del jengibre en Sabah, Malasia