Bioquímic Tema 6. Enzimas.

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Tema 6. Enzimas.
Existen dos condiciones fundamentales para la vida. Una, la entidad viva ha de
poder autorreplicarse, y dos ha de poder catalizar reacciones químicas eficiente y
selectivamente.

La conversión de la sacarosa en CO 2 y H2O es un proceso que libera energía

libre que podemos utilizar, el problema es que es un proceso espontáneo y lento. Por
ello producen reacciones químicas como la catálisis, que acelera la escala de tiempo de
oxidación de la sacarosa y permite mantener la vida.

-Los enzimas.

Los enzimas son los catalizadores de las reacciones biológicas, son proteínas con
una gran especialización, superior a los catalizadores sintéticos o inorgánicos. También
existen moléculas de RNA con actividad catalítica (riboenzimas).

Tienen un alto grado de especificidad (aceleran las reacciones químicas

específicas) y actúan en soluciones acuosas a 37ºC y pH neutro (Tª y pH suaves).

Las enzimas están en el centro de los procesos bioquímicos, degradan nutrientes,

conservan y transforman la energía química, además pueden regularse sistemas
enzimáticos. El 25% de los genes humanos codifican enzimas.

-Importancia de los enzimas.

La importancia de los enzimas es enorme en algunas enfermedades,

especialmente en las genéticamente heredables, donde se puede producir la ausencia de
uno o más enzimas o su excesiva producción.

La medición de la actividad enzimática en la sangre es importante en el

diagnostico de enfermedades. Muchos fármacos ejercen sus efectos biológicos a través
de la interacción con enzimas, inhibidores de la actividad enzimática. También son
importantes en el tratamiento de animales y en la agricultura.

Cada paso de una vía metabólica está catalizado por un enzima.

-Los enzimas son proteínas.

Todos los enzimas son proteínas a excepción de un grupo de moléculas de RNA

catalítico. Si se desnaturaliza pierde su conformación proteica y por tanto la actividad
catalítica. Las estructuras 1ª, 2ª, 3ª y 4ª son esenciales para la actividad catalítica del
enzima.

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Según los elementos que forman una enzima podemos distinguir:

-Enzimas: aquellas constituidas solo por proteínas.

-Holoenzimas: aquellas que están constituidas por una parte

proteica (apoenzima) y otra no proteica (cofactor).

-Cofactor: puede ser un ión metálico (Fe, mg, Zn) o una molécula
orgánica (denominada coenzima). El cofactor es necesario para la
actividad enzimática. Si el cofactor está unido fuertemente al enzima se
denomina grupo prostético.

-Apoenzima: es la parte proteica del enzima (no activa).

HOLOENZIMA = APOENZIMA + COFACTOR

Parte proteica Ión metálico (Fe, Mg, Zn)

Molécula orgánica (coenzima)

Grupo prostético (enlace fuerte)

Procesos como la fosforilación y la glucosidación intervienen en la regulación de

la actividad enzimática. Un tercio de los enzimas requieren algún ión metálico para
catalizar. Muchas vitaminas son cofactores o precursores de cofactores de enzimas.

-Nomenclatura de las enzimas.

SUSTRATO + TIPO DE REACCIÓN + -ASA

Ej.: colesteroloxidasa, alcohol deshidrogenasa.

CH3 – CH2 – C – OH CH3 – CHO

NAD NADH – H+

Alcohol NAD – oxidorreductasa.

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-Funcionamiento de los enzimas.

La característica principal de una reacción catalizada enzimáticamente es que

tiene lugar en una zona del enzima denominado: centro activo o sitio activo. La
molécula que se fija al centro activo y sobre la que actúa el enzima se denomina
sustrato. En ocasiones el centro activo cubre por completo el sustrato y lo secuestra de
la solución.

Se puede escribir una reacción enzimática sencilla como:

E + S = ES = E + P

donde E, S y P representan a enzima, sustrato y producto respectivamente.

La función de un catalizador es aumentar la velocidad de una reacción. Los

catalizadores no modifican los equilibrios de reacción. Las enzimas no alteran el
producto de la reacción. Cualquier reacción se puede describir mediante un diagrama de
coordenadas de reacción. La energía en los sistemas biológicos se describe en función
de la energía libre, G. En el diagrama de la coordenada se representa la energía libre del
sistema frente al progreso de la reacción. El punto de partida de la reacción (tanto hacia
la derecha como hacia la izquierda) se denomina estado basal.

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Para describir las variaciones de energía libre de las reacciones, se define un

conjunto estándar de condiciones (temperatura 298K, presión parcial 1 atm y
concentración de todos los solutos igual a 1M) y expresan la variación de la energía
libre de este sistema reaccionante como AGo, la variación de la energía libre estándar.

Dado que en los sistemas bioquímicos participa normalmente el H + en

concentraciones muy lejanas de 1M, definiremos la variación de la energía libre
estándar bioquímica (AG10) como la variación de la energía libre estándar a pH 7’0.

La energía libre del estado basal de P es inferior a la del estado basal de S, por lo
que la AG10 de la reacción es negativa y el equilibrio favorece a P. Esta reacción no se
ve afectada por un catalizador.

En la cumbre de la colina energética existe un punto donde la caída hacia el

estado S o P es igual de probable. Es o que se denomina el estado de transición. Es un
momento molecular fugaz en el que acontecimientos como rotura y formación de
enlaces y desarrollo de cargas han llegado al momento preciso en el que el colapso a
sustrato o producto es igual de probable. En la unión SE el sustrato está unido al enzima
por enlaces débiles (puentes de H, fuerzas de Van der Waals, etc.), para alcanzar el
posterior estado de transición se necesita un aporte de energía, es la energía de
activación (AG++) (la diferencia entre los niveles de energía del estado basal), que es la
energía necesaria para que se produzca una reacción química (para alcanzar el estado de
transición).

Las enzimas disminuyen la energía de activación necesaria y así las reacciones

químicas se llevan a cabo con mayor velocidad, además se ahorra energía en el
consumo que supone la energía de activación de las miles de reacciones que tienen lugar
en un ser vivo.

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-Poder catalítico y especificidad de los enzimas.

Los enzimas son catalizadores extraordinarios y muy específicos, pudiendo

discriminar fácilmente entre sustratos con estructuras muy similares. Muchos tipos de
reacciones químicas tienen lugar entre sustratos y grupos funcionales de enzimas. Los
grupos funcionales catalíticos de los enzimas pueden formar enlaces covalentes
transitorios con el sustrato activándolo para la reacción, o puede transferirse un grupo
funcional del sustrato al enzima. Normalmente estas reacciones solo tienen lugar en el
centro activo del enzima y las interacciones covalentes las que reducen la energía de
activación.

Gran parte de la energía requerida para disminuir la Ea proviene de interacciones

débiles entre el sustrato y el enzima. El factor que diferencia a otros catalizadores de los
enzimas es la formación de un complejo ES específico. La interacción entre E y s en
este complejo esta canalizada por las mismas fuerzas que estabilizan la estructura
proteica (p. de H, interacciones iónicas e hidrófobas). La formación de cada interacción
débil en el complejo ES está acompañada de una pequeña liberación de energía, se
denomina energía de fijación, la energía de fijación es la energía usada por los enzimas
para disminuir la energía de activación.

Las interacciones débiles totales entre S y E solo se forman cuando S alcanza el

estado de transición. Si el centro activo de un enzima tiene grupos funcional ordenados
para interaccionar con un sustrato no lo hará con ninguna otra molécula. La energía
libre liberada por la formación de estas interacciones equilibra parcialmente la energía
requerida. Los enzimas son estereoespecíficas porque forman varias interacciones entre
aminoácidos del centro activo y los distintos grupos del sustrato. El centro activo de los
enzimas es complementario al estado de transición de la reacción catalizada.

El enzima experimenta un cabio de conformación cuando se une al sustrato, esta

situación se conoce como encaje inducido. El encaje inducido puede servir para
disponer grupos específicos funcionales del enzima en la orientación adecuada para
catalizar la reacción. La necesidad de múltiples interacciones débiles para impulsar la
catálisis es una de las razones por las que las enzimas son tan grandes.

ENCAJE
INDUCIDO

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-Cinética enzimática.

El enfoque central para estudiar el mecanismo de una reacción catalizada por un

enzima consiste en medir la velocidad de la reacción y la forma en que se modifica
como respuesta a cambios en los parámetros experimentales ([S], [E], tª y pH),
disciplina que se conoce como cinética enzimática.

La concentración del sustrato afecta a la velocidad de las reacciones catalizadas

por enzimas. Pero el estudio de la concentración de sustrato es complicado ya que [S]
cambia en el transcurso de una reacción a medida que S se convierte en P. Una
aproximación es medir la velocidad inicial (Vo) cuando [S] es mucho mayor que [E]. En
este caso si solo se toman datos al inicio de la reacción se puede considerar [S]
constante.

En las siguientes gráficas se muestra el efecto de la variación de [S] sobre V o

cuando [E] se mantiene constante. A concentraciones de sustrato relativamente bajas Vo
aumenta casi linealmente con el incremento de [S]. A mayores concentraciones de
sustrato, Vo aumenta a incrementos aún menores en respuesta a incrementos de [S].
Finalmente se alcanza un punto más allá del cual se dan incrementos pequeñísimos de
Vo con el incremento de [S]. Esta meseta en se denomina velocidad máxima, Vmáx.

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La velocidad máxima se alcanza cuando todos los centros activos están

ocupados con sustratos.

El complejo ES es la clave para entender el comportamiento cinético. El enzima

se combina en primer lugar de forma reversible con el sustrato formando un complejo
enzima-sustrato en un paso reversible y rápido.
s
K1
E+S s ES
K-1

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El complejo ES se descompone seguidamente en un paso más lento dando E y P.

s
K2
ES s E+P
K-2

La segunda reacción es más lenta y limita por tanto la velocidad de la reacción

global. De ahí que la velocidad global de la reacción catalizada enzimáticamente ha de
ser proporcional a la concentración de la especie que reacciona en el segundo paso, ES.
En cualquier momento de una reacción catalizada por enzimas, el enzima existe de dos
formas, la forma libre E y la forma combinada ES. A baja [S] la mayor parte del enzima
estará en la forma E. aquí la velocidad será proporcional a [S] porque el equilibrio se
desplazara hacia la formación de más ES a medida que [S] aumenta. La V máx se
observará cuando todo el enzima esté en forma ES. En estas condiciones el enzima está
“saturado” con un sustrato, de modo que el aumento adicional de [S] no tendrá efecto
sobre la velocidad. Esta situación se produce cuando [S] es suficientemente alto para
convertir todo el enzima libre en ES. Cuando el complejo EP se descompone en E y P,
E queda libre para catalizar otro sustrato. El efecto de saturación es el responsable de la
meseta de Vmáx. Esto se conoce como cinética de saturación.

-Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática.

Loa aumentos de temperatura por lo general aceleran las reacciones químicas.

Solo que al ser proteínas por encima de cierta temperatura +40º se desnaturalizan. Esta
temperatura se denomina temperatura óptima y es aquella en la que la velocidad
enzimática es máxima.

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-Efecto del pH sobre la actividad enzimática.

Los enzimas poseen grupos químicos ionizables en las cadenas laterales de sus
aminoácidos. Según el pH del medio estos pueden tener distinta carga, y como la
conformación de las proteínas depende en parte de sus cargas, habrá un pH en el cual la
conformación será la más adecuada para la actividad catalítica. Este es el llamado pH
óptimo. Los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH, así cada enzima tiene un
pH óptimo. Ligeros cambios de pH pueden provocar la desnaturalización de la proteína,
existen amortiguadores fisiológicos que mantienen estable el pH intracelular.

La pepsina tiene un pH óptimo de 2 y la tripsina lo tiene a 6.

-Relación entre velocidad inicial (Vo) y concentración de enzima ([E]).

La velocidad inicial es función lineal de la concentración de enzima siempre que

la concentración de sustrato sea alta.

-Ecuación de Michaelis – Menten

La relación entre concentración de sustrato y velocidad de reacción enzimática

se puede expresar de manera cuantitativa.

La forma hiperbólica de la curva se puede expresar algebraicamente mediante la

ecuación de Michaelis – Menten, deducida partiendo de la hipótesis básica de que el
paso limitante de velocidad en las reacciones enzimáticas es la descomposición del
complejo ES para formar el producto y el enzima libre. La ecuación es:

Km = constante de Michaelis

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La deducción se inicia con las dos reacciones básicas de formación y

descomposición de ES. Al principio la concentración del producto es despreciable y se
ignora la reacción inversa (P S).
s s
K1 K2
E+S s ES E+P
K-1

La reacción siempre se aplica con un solo sustrato (reacción monosustrato), y

hay que tener en cuenta que la reacción de formación del complejo ES es más rápida
que la de descomposición de este en P y E.

De esta ecuación emerge una relación numérica importante en el caso de que Vo

sea exactamente la mitad de Vmax.

Al dividir por Vmáx obtenemos:

Despejando Km obtenemos: Km + [S] = 2[S], o, Km = [S] cuando Vo = Vmáx

Km es equivalente a la concentración de sustrato a la cual la V o es la mitad de la

Vmáx. La ecuación de Michaelis – Menten puede transformarse algebraicamente en
formas que son útiles en la determinación práctica de K m y Vmáx, y en el análisis de la
acción de los inhibidores.

-Transformaciones de la ecuación de Michaelis – Menten, gráfica de dobles

recíprocos o representación de Lineweaver – Burk

Una transformación común se deduce simplemente tomando los inversos en

ambos miembros de la ecuación de Michaelis – Menten, obteniéndose:

Separando los componentes del numerador en el segundo miembro de la

ecuación da:

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Que se simplifica a:

Esta ecuación se denomina ecuación de Lineweaver – Burk. Para los enzimas

que obedecen la relación de Michaelis – Menten la gráfica 1/V o frente a 1/ [S] (el “doble
reciproco” de Vo frente a [S]) da una línea recta. Además tiene la ventaja de permitir
una determinación mucho más precisa de Vmáx.

-Parámetros cinéticos/enzimáticos

Esta ecuación se denomina ecuación de Lineweaver – Burk. Para los enzimas

que obedecen la relación de Michaelis – Menten la gráfica 1/V o frente a 1/ [S] (el “doble
reciproco” de Vo frente a [S]) da una línea recta. Además tiene la ventaja de permitir
una determinación mucho más precisa de Vmáx.

1. Km (constante para cada enzima) = concentración de S a la que la Vo es ½

Vmax. Es una medida de la afinidad del enzima por S. Cuanto menor es Km, mayor es
la afinidad del enzima por S.

2. Kcat (constante para cada enzima) = número de recambio = número de

moléculas de sustrato convertidas en producto por molécula de enzima y unidad de
tiempo, en condiciones de saturación de sustrato.

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3. Vmax = velocidad máxima teórica = la velocidad cuando todos los centros

activos están ocupados con sustrato (nunca alcanzada en la realidad).

4. Unidad de enzima = cantidad de enzima que transforma 1 μmol de sustrato

por min = una forma común de expresar la velocidad.

5. Actividad específica = unidades por mg de proteína total de la preparación

enzimática. En el caso de enzimas en suero: unidades/L.

-Inhibición Enzimática

Los inhibidores enzimáticos son agentes moleculares que interfieren en la

catálisis haciendo más lenta o deteniendo las reacciones. Hay dos clases de inhibidores
enzimáticos: reversibles e irreversibles.

Inhibición irreversible. Los inhibidores irreversibles son los que se combinan

con o destruyen un grupo del enzima que es esencial para su actividad. Es frecuente la
formación de un enlace covalente entre un inhibidor irreversible y un enzima.
Normalmente el inhibidor se une al centro activo del enzima de forma permanente y por
tanto no tiene lugar la unión entre sustrato y enzima. Existen los llamados inactivadores
suicidas que se unen al enzima a través de los primeros pasos de una reacción
enzimática normal y se combina irreversiblemente con el enzima.

Inhibición reversible. Tiene lugar cuando el inhibidor se une al enzima de

forma no permanente y solo impide el normal funcionamiento del enzima por un cierto
periodo de tiempo. Según sea el mecanismo de unión se diferencian dos tipos:

-Inhibición competitiva. Cuando el inhibidor compite con el enzima por ocupar

el centro activo debido a que tiene una estructura similar a la del sustrato. Mientras el
inhibidor ocupe el centro activo, evita la fijación del sustrato. Se forma el complejo EI
pero no se llega a la catálisis. Para tratar de evitarlo solo hay que aumentar la [S]
minimizando la probabilidad de que se una un inhibidor al enzima. Los parámetros
cinéticos quedan afectados, aumenta Km aunque Vmáx no varía.

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-Inhibición no competitiva. Cuando el inhibidor se une al enzima a través de otro

lugar diferente del centro activo haciendo que se modifique la estructura de dicho centro
activo, por lo que impide la unión a este del sustrato. Cuando el inhibidor se separa del
enzima se recupera la actividad enzimática. El inhibidor no compite con el sustrato, no
cambia Km pero disminuye la Vmáx.

-Inhibición acompetitiva. Cuando el inhibidor se une al complejo ES en un sitio

distinto del centro activo, en este caso aumenta Km y disminuye la Vmáx.

-Inhibidor mixto. Cuando el inhibidor se fija a un sitio distinto del centro activo,
tento en ES como en E.

-Retroinhibición. Si la cantidad de producto final producido por un enzima

excede al necesitado por la célula el enzima es inhibido de forma específica por el
producto. A medida que se agotan los sustratos la velocidad se reduce y la acumulacón
de producto final hace que la ruta funcione más lentamente.

-Mecanismos de regulación enzimática.

En el metabolismo celular hay grupos de enzimas que funcionan cojuntamente

en rutas secuenciales para llevar a cabo un proceso metabolico determinado. En tales
sistemas enzimáticos el producto de la reacción del primer enzima se convierte en el
sustrato del siguiente y asi sucesivamente. La mayor parte de los enzimas de cada ruta
metabólica siguen los comportamientos cineticos ya descritos. Sin embargo en cada ruta
hay uno o más enzimas que fijan la velocidad de la secuencia global ya que cataliza la
reacción mas lentamente. Estos enzimas reguladores muestran ademas una actividad
catalitica mayor o menor en respuesta a ciertas señales. Gracias a la accion de tales

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enzimas reguladores, la velocidad de cada secuencia metabolica se ajusta

constantemente para adaptarse a los cambios en las necesidades de la celula.

La actividad de los enzimas reguladores se modula de diversas maneras. Existen

dos clases principales de enzimas reguladores en las rutas metabólicas. Los enzimas
alostericos funcionana a traves de la unión reversible, no covalente, de compuestos
reguladores denominados moduladores alostericos. Otros enzimas estan regulados por
modificación covalente reversible. En ambos casos el sitio o sitios reguladores pueden
no encontrarse en la misma subunidad que el centro activo.

Existen al menos otros dos mecanismos de regulación enzimática. Algunos

enzimas son inhibidos o estimulados por proteinas a las que se fijan, y otros se activan
cuando se eliminan segmentos peptídicos mediante escisión proteolíica la cual es
irreversible. La unión del modulador implica siempre un cambio conformacional.

Activación/Inhibición alostérica. Los moduladores de los enzimas alostéricos

pueden ser inhibidores o estimuladores que interconvierten formas más o menos activas
del enzima. En ocasiones el propio sustrato es el modulador, en estos casos en los que el
sustrato y el modulador son idénticos, el enzima se denomina homotrópico. Cuando el
modulador es otra molécula distinta del sustrato se dice que el enzima es heterotrópico.

Además de sitios activos, los enzimas alostéricos tienen generalmente uno o más
sitios reguladores para la fijación del modulador. Los sitios de fijación son específicos
para cada modulador y en los enzimas homotrópicos el centro activo y el regulador son
el mismo. Los enzimas alostéricos tienen dos o más cadenas polipetídicas, son enzimas
multiméricas. Si el modulador es un activador la V máx aumenta y K0.5 disminuye, pero si
es un inhibidor la Vmáx disminuye y K0.5 aumenta.

Las propiedades cinéticas de los enzimas alostéricos difieren del

comportamiento de Michaelis – Menten. Los enzimas alostéricos muestran una relación
entre Vo y [S] que difiere del comportamiento de Michaelis –Menten, tienen cinética

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sigmoidea. Aunque se saturan con el sustrato cuando [S] es suficientemente elevada,

algunos enzimas alostéricos dan lugar a una curva de saturación sigmoidea cuando se
representa Vo frente a [S], en lugar de la curva hiperbólica típica de los enzimas no
reguladores. Ya que el enzima no sigue la relación hiperbólica no podemos utilizar K m,
en su lugar tilizamos K0.5 para representar la [S] que da la mitad de la Vmáx de la reacción
catalizada por el enzima alostérico.

En un modulador positivo (activador) homotrópico la unión de un sustrato al

sitio de fijación altera la conformación del enzima facilitando la unión de más sustratos.
Esto explica el incremento sigmoideo en lugar de hiperbólico de Vo al aumentar [S].

En el caso de los enzimas heterotrópicos es dificil generalizar acerca de la forma

de la curva de saturación del sustrato ya que muestran diferentes clases de respuesta en
sus curvas de actividad frente a sustrato debido a que algunos tienen moduladores
inhibidores, otros tienen moduladores activadores y otros tienen ambas clases.

Modificación covalente. Un grupo covalente se une a la cadena lateral de un

aminoácido para hacer activo al enzima, estos grupos se unen y eliminan por acción de
otra proteina. La modificación puede ser debida por:

-Fosforilación cuando se una un grupo fosfato. Constituye la mayoria de las

modificaciones reguladoras conocidas. Las proteinas quinasas catalizan la unión de
grupos fosforilo aresiduos aminoácidos específicos de una proteina, la eliminación de
los grupos fosforilo está catalizada por las proteinas fosfatasa. La unión de un grupo
fosforilo produce efectos sobre la conformación de la proteina, la fijación del sustrato y
la catálisis.

-Metilación cuando se une un grupo metilo.

-ADP – ribosilación cuando se une un grupo ADP – ribosa.

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Activación de proenzimas por proteólisis. En algunas enzimas para formar el

enzima activo se escinde un precursor inactivo denominado proenzima. Esta rotura
específica produce cambios conformacionales que hacen asequible el sitio activo del
enzima. Dado que este tipo de activación es irreversible, se necesitan otros mecanismos
para inactivar estos enzimas, como inhibidores que se fijan muy fuertemente al centro
activo del enzima.

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