Método Químico

Con el objetivo de poder aislar anaeróbicamente bacterias del género Clostridium, se preparó 4
tubos con agar nutricio de los cuales 2 fueron preparados en plano inclinado, y los otros 2 tubos
fueron preparados con el medio en columna.

Para evaluar la eficacia del método de aislamiento por este método, en dos tubos con agar nutricio
(uno de plano inclinado y otro en columna) se sembró una especie de bacterias del género Bacillus
(bacteria aeróbica) con las mismas condiciones de anaerobiosis que en los tubos con bacterias del
género Clostridium.

 Resultados
Los resultados que se muestran a continuación fueron observados el día lunes 30/09/19,
habiendo los tubos sido sembrados el día viernes 27/09/19.

Fig. 1. Clostridium sp sembrado en un tubo con agar nutricio en plano inclinado

Se observan pequeñas colonias circulares de color marrón - crema crecidas sobre el medio y
que se confunden que ellas por el color desde esta vista.
 Fig2. Bacillus sp sembrado en tubo en agar nutricio en plano inclinado
A lo largo del plano inclinado se observan colonias blanquecinas sobre el agar.

Fig. 3 y 4. Clostridium sp sembrado en un tubo con agar nutricio en columna

Se observa una marcada elevación del medio sobre la base del tubo donde se preparó este.
Así mismo, se pueden observar pequeñas fisuras a lo largo del medio, como la marca que
dejó el asa en siembra en punta al momento de inocular la cepa.
 Fig. 5. Bacillus sp sembrado en un tubo con agar nutricio en columna

Fig.6. Resultado de la tinción Gram de una muestra del tubo con Clostridium sp en
plano inclinado (Fig.1) Aumento: x1000
Se obervan bacterias teñidas de rozado en donde algunas llevan el extremo teñido de violeta
 Fig 7. Zoom digital a la imagen del resultado de la tinción Gram en la figura 6.
Se observan bacterias alargadas en forma de bolos con extremos ligeramente redondeados
que son características típicas del género Clostridium

 Discusión
El aislamiento de microrganismos anaeróbicos por el método del ácido pirogálico se
fundamenta en que este ácido, al estar en un medio alcalino (brindado por el NaOH
añadido) es fácilmente oxidable por lo que absorbe el oxígeno del medio. Esta reacción de
óxido-reducción produce el color marrón observado en el algodón de todos los tubos (Fig. 1
a Fig. 5). Esta propiedad de oxidación del pirogalol o ácido pirogálico lo convierte en un
potente agente reductor. (Clayton, G. D. and F. E. Clayton, 1981). Esta absorción de oxígeno
producto de la oxidación del ácido pirogálico, de igual forma se vio manifestada en el tubo
de las figuras 3 y 4 donde el agar en columna sufrió una elevación producto de la fuerza
generada por la diferencia de presiones generadas al consumirse el aire con oxígeno que
quedaba dentro del tubo.
Por otro lado, que en el tubo de plano inclinado con agar nutricio y bajo condiciones de
anaerobiosis (Fig.2) haya crecido el inóculo de Bacillus podría explicarse si es que la cepa
de Bacillus sembrada se trató de una especie facultativa que pudo reproducirse en
condiciones anaeróbicas o asumiendo que las bacterias del género Bacillus utilizaron el
poco oxígeno existente para crecer en la superficie.
 Luego del proceso de tinción Gram, los resultados observados al microscopio compuesto
(1000X) indican bacterias teñidas de rosado que tienen la forma típica de una bacteria del
género Clostridium como indica la figura 7. Las bacterias de este género son Gram
positivas; sin embargo, el color que presentan en esta coloración Gram puede deberse a que
las bacterias inoculadas en el agar nutricio presentaban cierta antigüedad en el medio donde
se encontraban antes de ser sembradas.
Así mismo, T.V. Riley (2012) afirma que, aunque las especies del género Clostridium son
Gram +, estas pueden parecer Gram – muchas veces.

 Conclusiones

- El aislamiento de bacterias anaeróbicas del género Clostridium fue posible con la

aplicación del método del ácido pirogálico en medio alcalino, observándose los
resultados en las figuras 6 y 7.
- El consumo de oxigeno por el ácido pirogálico en medio alcalino fue verificado en
todos los tubos al observar el cambio de color (transparente a marrón) en los
algodones de los todos los tubos (figuras del 1 al 5).
- Al igual que con el cambio de color en los algodones de los 4 tubos, el poder
reductor del ácido pirogálico en medio alcalino fue demostrado con la elevación del
medio (figuras 3 y 4) producido por el vacío y diferencia de presiones generado
dentro del tubo producto de la absorción del oxígeno en la superficie (algodón con
pirogalol)

Referencias

- Geetha, H.Cultivation of Anaerobic Organisms | Microbial Biotechnology.

Recupeado de:
http://www.biotechnologynotes.com/microbial-biotechnology/cultivation-of-
anaerobic-organisms-microbial-biotechnology/1223
- Clayton, G. D. and F. E. Clayton (eds.). Patty's Industrial Hygiene and Toxicology: 
Volume 2A, 2B, 2C: Toxicology. 3rd ed. New York: John Wiley Sons, 1981-1982., 
p. 2594
- T.V. Riley (2012). Clostridium: Gas gangrene; tetanus; food poisoning;
pseudomembranous colitis. Medical Microbiology (Eighteenth Edition) Pages 245-
255. https://doi.org/10.1016/B978-0-7020-4089-4.00037-8