UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

ESCUELA PROFESIONAL DE GENÉTICA Y BIOTECNOLOGÍA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA GENERAL

Cinética de crecimiento de un cultivo por lotes

Profesor encargado (a): Susana Gutiérrez

Alumnos: Códigos:

Lima-Perú
I. Introducción
 II. Crecimiento de Escherichia coli en melaza

II.1. Melaza
La melaza o miel de caña es un producto líquido espeso derivado de la caña de azúcar. Se
elabora mediante la cocción del jugo de la caña de azúcar hasta la evaporación parcial del
agua que este contiene, formándose un producto meloso semi – cristalizado. La composición
de las melazas varía según la clase de caña, las condiciones del suelo, el clima y los métodos
de fabricación. Las melazas son ligeramente ácidas, con un pH de 5,5 a 6,5 y tienen alrededor
de 14 a 25% de hidratos de carbono.

Tabla 1 – Composición aproximada de melaza (%) peso de la miel

II.2. Método de biomasa
Se construyeron las curvas de crecimiento de E. coli en distintas condiciones mediante
turbidimetría para evaluar el efecto de cada una y calcular la velocidad de crecimiento, son
brevemente descritas a continuación y reportadas como densidad óptica vs tiempo.

II.2.1.Resultados
Figura 1 – Crecimiento de E.coli en un medio con melaza

CURVA DE CRECIMIENTO DE E.coli K12

1.2
1
0.8
D.O REAL

f(x) = 0.02 x + 0.68

0.6 R² = 0.05
Linear ()
0.4
0.2
0
0 1 2 3 4 5 6 7
TIEMPO

EDAD BIOMASA
DEL FACTOR ABSORBANCIA BIOMASA EN EN
LN(BIOMASA)
CULTIV DE PROMEDIO DILUCIÓN CULTIVO
  O (h) DILUCIÓN (D.O.) (g/L) (g/L)
T
-3.834
0 0 4 0.139 0.00541 0.0216
T
-3.548
1 2 10 0.062 0.00288 0.0288
T
-3.212
2 4 10 0.097 0.00403 0.0403
T
-3.107
3 6 20 0.042 0.00224 0.0447
T
-3.122
4 8 20 0.041 0.00220 0.0441
T
-3.394
5 10 20 0.025 0.00168 0.0336
T
-3.320
6 12 10 0.084 0.00362 0.0362
Tabla 2 - Método de biomasa
 Biomasa en dilución (BMD)
ABS = 30,446 * BMD - 0,0261

 Biomasa en cultivo (BMD)

BMC = BMD * Factor de Dilución

Figura 2 - Curva de crecimiento en lotes de E.coli en medio de melaza

0.0500

0.0400
Biomasa en el cultivo (g/L)

0.0300

0.0200

0.0100

0.0000
0 2 4 6 8 10 12

Edad del cultivo (h)

 Fase de latencia
No se observa

 Fase exponencial
T: 0 – 6 horas

 Fase estacionaria
T: 6 – 8 horas

 Fase de muerte
 T: 8 – 10 horas

 Fase de crecimiento críptico

T: 10 – 12 horas

Figura 3 - Curva semilogarítmica en fase exponencial de E.coli en

medio de melaza

-2.000

-2.400
Ln de la biomasa

-2.800

-3.200
f(x) = 0.13 x − 3.8

-3.600

-4.000
0 1 2 3 4 5 6
Edad del cultivo (h)

Parámetros cinéticos (en fase exponencial)

 Velocidad de crecimiento
 = 0.1258 h-1
 Tiempo de duplicación
Td = 5.510 h
  = pendiente de la gráfica ln vs T

 Td = Ln(2) / 

II.2.2.Discusión de resultados
Análisis de figuras 1 y 2

Según se pudo observar, las E. coli tuvieron un rápido reacomodo de la composición

macromolecular al nuevo ambiente y, por este motivo, no se consideró ningún intervalo como
fase de latencia. La ausencia de la fase de latencia probablemente se deba a que las bacterias
transferidas se encontraban en la fase exponencial en un medio similar y en condiciones
similares de crecimiento (temperatura, ventilación, etcétera).

Entre las 0 y 6 horas se percibe un crecimiento exponencial, el cual constituye la fase del
mismo nombre, siendo esta en la cual las bacterias crecieron y se dividieron hasta el nivel
máximo posible. En esta fase se evaluó posteriormente la velocidad de crecimiento.

Entre las 6 y 8 horas se puede percibir una detención en el aumento de biomasa por lo tanto la
bacteria se encuentra en fase estacionaria. El crecimiento nulo en este intervalo se debe al
agotamiento de algún nutrimento en el medio. En esta fase disminuye el volumen celular y la
forma se redondea, engrosa la pared, disminuye el número de flagelos y se incrementa la
resistencia celular a condiciones adversas. La expresión de los genes necesarios para el
crecimiento disminuye y aumenta la de aquellos relacionados con la viabilidad celular
durante el ayuno. La regulación de los genes de la fase estacionaria depende, principalmente,
del factor transcripcional σs (RpoS). Las células en fase estacionaria muestran además una
gran heterogeneidad en propiedades como viabilidad, genotipo y mutabilidad.

Entre las 8 y 10 horas se deduce que la población entró en fase de muerte. Para explicar la
muerte celular de dichas bacterias en los cultivos se han propuesto los modelos de muerte
celular aleatoria y de muerte celular programada. El modelo de muerte celular programada
propone que la causa es la activación de los sistemas antitoxina-toxina (la degradación de la
antitoxina permite la acción de la toxina y la muerte celular) presentes en el cromosoma de
E.coli.

Finalmente, entre las 10 y 12 horas se aprecia un nuevo aumento en la biomasa (más lento
que el del crecimiento exponencial) que se trataría de la fase de crecimiento críptico. Es
probable que este crecimiento se deba a la presencia de una subpoblación hipermutable. La
mayoría de estas mutaciones favorecen un incremento moderado en la expresión de los genes
dependientes de σ70 y este incremento confiere a las células en ayuno una mayor capacidad
para transportar y catabolizar los aminoácidos liberados por las células muertas. Es decir, las
bacterias mutantes sobrevivieron debido a los nutrientes proporcionados por las bacterias
muertas.

Conclusión

II.3. Método de UFC

Resultados

Discusión de resultados

Conclusión

III. Crecimiento de Escherichia coli en sacarosa

III.1 Medio mínimo de Davies + Sacarosa

El medio de cultivo utilizado para esta experiencia estuvo conformado por sacarosa en
adición al medio mínimo de Davies. Este medio mínimo está compuesto por las siguientes
sales inorgánicas:  Fosfato dipotásico (K2HPO4), fosfato monopotásico (KHPO4), citrato de
sodio (Na3C6H5O7), sulfato de magnesio (MgSO4) (Sigma-Aldrich, 2013). Por otra parte, la
sacarosa de fórmula química C12H22O11 es un disacárido no reductor formado por la unión a
través de los carbonos anoméricos de dos monosacáridos: Una molécula de glucosa y una
molécula de fructosa. Su función, además de muchas otras, es la de ser un metabolito de
diversos organismos incluyendo Escherichia coli (PubChem, s.f.).

III.2 Método de biomasa

Para determinar la curva de crecimiento de E. coli K12, se realizó la siembra de la cepa en el
medio mínimo de Davies con sacarosa, se extrajeron 2 muestras del cultivo en 6 tiempos con
intervalos 2 horas entre cada toma de muestra. Ambas muestras se analizaron en el
espectrofotómetro y las lecturas de absorbancia se reportaron como densidad óptica (D.O). A
continuación, se presentan los datos obtenidos y las gráficas de densidad óptica en función
del tiempo.

III.2.1.Resultados
 Tabla * - Valores obtenidos de la lectura en el espectrofotómetro a 620nm.
TIEMPO DILUCIÓN D.O1 D.O2 PROMEDIO D.O REAL
0 4 0.156 0.209 0.1825 0.73
1 4 0.042 0.048 0.045 0.18
2 4 0.104 0.09 0.097 0.388
3 4 0.114 0.131 0.1225 0.49
4 10 0.038 0.03 0.034 0.34
5 10 0.049 0.047 0.048 0.48

CURVA DE CRECIMIENTO DE E.coli K12

0.8
0.7
0.6
0.5
D.O REAL

0.4 f(x) = − 0.02 x + 0.48

R² = 0.04 Linear ()
0.3
0.2
0.1
0
0 1 2 3 4 5 6
TIEMPO
Figura * –
Crecimiento estándar de E.coli en medio mínimo de Davies más sacarosa.

o Fase de latencia = No se observa

o Fase exponencial = T1 (2h) - T3(6h)
o Fase estacionaria = No se observa
o Fase de muerte = T3- T4
o Fase de crecimiento críptico = T4-T5

Tabla * - Valores de la biomasa.

TIEMPO DILUCIÓN D.O 1 D.O 2 PROMEDIO Biomasa BR Ln (BR)

0 4 0.156 0.209 0.1825 0.00685147 0.027405899 -3.596996998
1 4 0.042 0.048 0.045 0.00233528 0.009341129 -4.673328204
2 4 0.104 0.09 0.097 0.00404322 0.016172896 -4.124418507
3 4 0.114 0.131 0.1225 0.00488077 0.01952309 -3.936157408
4 10 0.038 0.03 0.034 0.00197399 0.019739867 -3.925114967
5 10 0.049 0.047 0.048 0.00243382 0.024338173 -3.715709276
6
 Biomasa real vs Tiempo
0.03

0.03
BIOMASA REAL g/L

0.02

0.02

0.01

0.01

0
0 1 2 3 4 5 6
Tiempo

Figura * - Curva de crecimiento de E.coli en medio mínimo de Davies

y sacarosa según biomasa real en función del tiempo.

Ln (biomasa real) vs Tiempo

0
0 1 2 3 4 5 6
-0.
-1
-1.
-2
-2.
-3
-3.
-4
-4.
-5

Figura * - Curva de crecimiento de E.coli en medio mínimo de

 Davies y sacarosa según Ln(biomasa real) en función del tiempo.

o Fase de latencia = No se observa

o Fase exponencial = T1 (2h) - T3(6h)
o Fase estacionaria = T3
o Fase de muerte = T3- T4
o Fase de crecimiento críptico = T4-T5

-3.4
0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
-3.6

-3.8
Ln(biomasa)

-4

-4.2

-4.4

-4.6

-4.8
Tiempo

Figura * - Curva de crecimiento en fase exponencial de E.coli en

medio mínimo de Davies según Ln(biomasa real) en función al tiempo.

 Velocidad de crecimiento específico

 = 0.03686 h-1
 Tiempo de duplicación
Td =18.8049 h

III.2.2.Discusión
Al analizar el T0 se observa que tanto en el estándar de la curva del crecimiento
como en la curva obtenida por medio del cálculo de la biomasa no existe una fase de
latencia o adaptación del microorganismo al medio de cultivo al que fue incorporado,
en su lugar se percibe un alto índice de densidad óptica que no corresponde a los
esperados en el crecimiento de Escherichia coli K12, tal comportamiento pudo haber
acontecido por una mala homogenización previa a la toma de la muestra a analizar por
 espectrofotometría, de modo que se obtuvo una carga bacteriana superior y en
consecuencia una mayor absorbancia (densidad óptica).

En el periodo T2-T3 se observa una aumento exponencial en la biomasa

correspondiente a la fase logarítmica de la curva de crecimiento, sin embargo, en base
a estos datos se obtiene una tasa de crecimiento específico de 0.036 h -1 la cual es
considerablemente menor a las obtenidas en medio TCB (µ=0.174 h -1) y el medio
mínimo complementado con melaza (µ= 0.126), ya que las condiciones generales
fueron las mismas para todos los medios (temperatura, presión, etc.) se puede afirmar
que la tasa deriva directamente del medio y de la disponibilidad de nutrientes de este.
A pesar de que la presencia de sacarosa implicaría una fuente rica de carbono, la cepa
Escherichia coli K-12, al igual que muchas cepas de esta especie bacteriana, es
incapaz de hidrolizar el disacárido en fructosa y glucosa, por lo tanto, no puede
metabolizarla (Lee, et al., 2010). El crecimiento evidenciado en la práctica se deriva
únicamente del medio mínimo de Davis: El sulfato monopotásico y dipotásico actúan
como agente tamponante, el sulfato de magnesio y sulfato de amonio proveen al
microorganismo de los iones necesarios para el correcto desarrollo metabólico además
de ser la fuente de sulfuro y nitrógeno para la formación de aminoácidos, el magnesio
es un cofactor importante para múltiples reacciones metabólicas y, por último, el
citrato actúa como principal fuente de carbono ante la imposibilidad de la asimilación
de sacarosa (Sigma- Aldrich, 2013).

Al analizar la gráfica relacionada al ln(biomasa real) en función al tiempo se podría

catalogar al periodo T3- T4 como fase estacionaria, sin embargo, al compararla con la
curva ligada a la biomasa real se observa una ligera caída, en consecuencia durante
este periodo involucraría una corta fase estacionaria y además la fase de muerte.
Escherichia coli K12 ingresa a la fase estacionaria cuando agota los nutrientes del
medio en el que se encuentra de modo que el número de bacterias muertas es
equivalente al de bacterias en duplicación, durante este periodo la bacteria acumula
metabolitos tóxicos que conducen a la muerte celular o fase de muerte (Pletnev, et.al,
2015).

Por último, se puede considerar al periodo T4-T5 como la fase críptica en la que los
contenidos de las bacterias lisiadas liberados en el medio son aprovechados por otros
microorganismos, sin embargo, la alta tasa de crecimiento de esta fase plantea la
posibilidad de una contaminación.

III.2.3. Conclusión
Mediante la práctica se evidenció una tasa de crecimiento baja para la bacteria
Escherichia coli K12 en un medio de cultivo mínimo con sacarosa, debido a que esta
cepa es incapaz de usar el disacárido como fuente de carbono dependiendo
únicamente de la concentración de citrato en el caldo de Davies.
III.3 Método de recuento de placas

Del medio inoculado con la cepa anteriormente descrito se extrajo 1ml de muestra y
se realizaron diluciones sucesivas en intervalos de tiempo de 2h. Posteriormente se
sembraron por diseminación estas diluciones y se llevaron a incubar, a continuación,
se presentan los datos obtenidos del recuento de colonias observadas.

III.3.1.Resultados
Tabla * - Valores obtenidos del recuento de placas.

T UFC/mL Ln
0 65000000 17.9898978
2 8080000000 22.8126577
3 60000000 17.9098551
4 2.3E+11 26.1613451
5 1E+12 27.6310211

ln(UFC/ml) vs tiempo de cultivo

30

25

20

15

10

0
0 1 2 3 4 5 6

Figura * - Curva de crecimiento de E.coli en medio mínimo de

Davies y sacarosa según Ln(UFC/ml) en función del tiempo.

o Fase de latencia = No se observa

o Fase exponencial = T0 (0h) – T2(8h)
o Fase estacionaria = No se observa
 o Fase de muerte = T2- T3
o Fase de crecimiento críptico = No se observa

III.3.2. Discusión
A partir de los resultados de recuento de placas y en base a las características
anteriormente descritas de Escherichia coli K12 se infiere que en el T0 anteriormente
aducido a un error experimental en la homogenización se trata del punto de inicio de
la fase logarítmica, esta se extiende hasta la T2 para luego producirse la fase de
muerte desde la T2 hasta T3, el crecimiento póstumo observado podría ser clasificado
como la fase críptica, sin embargo, la tase de crecimiento en este periodo aumenta de
manera exponencial hasta T4 e inmediatamente después, hasta T5, se observa una
curva similar a una fase estacionaria, por lo que sería plausible el plantear el
crecimiento de otra bacteria por causa de una posible contaminación. Ante la
incongruencia entre los datos obtenidos en la determinación de la biomasa y el
recuento de UFC en las placas se debe plantear la posibilidad del error experimental
durante las diluciones sucesivas, la alta temperatura del agar adicionado durante el
proceso de diseminación o una contaminación durante el sembrado. De haber
sucedido alguno de estos factores la interpretación de los datos variaría
considerablemente.

III.3.3. Conclusión
Se concluye que el método de recuento de placas a pesar de ser una representación
directa del crecimiento bacteriano, a diferencia del método de biomasa que
únicamente mide la absorbancia, y además permitir la distinción de una posible
contaminación por otra bacteria, es más propensa a error experimental por lo que su
confiabilidad se reduce como en la experiencia desarrollada cuya gráfica es de dudosa
interpretación.

BIBLIOGRAFÍA
National Center for Biotechnology Information. PubChem Database. Sucrose, CID=5988,
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Sucrose (accessed on Nov. 4, 2019)

Sigma-Aldrich (2013). Davis Minimal Broth (Minimal Broth, Davis)(93753). Recuperado de

https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma-
Aldrich/Datasheet/1/93753dat.pdf

Lee, J., Choi, S. Park, J., Vickers, C., Nielsen L. & Lee, S.(2010, Octubre). Development of
sucrose-utilizing Escherichia coli K-12 strain by cloning β-fructofuranosidases and its
application for l-threonine production. Recuperado de
https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs00253-010-2825-7
Pletnev, P., Osterman, I., Sergiev, P., Bogdanov, A., & Dontsova, O. (2015). Survival guide:
Escherichia coli in the stationary phase. Acta naturae, 7(4), 22–33.