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7/23/2019 POST-PRACTICA MÉTODOS Y TÉCNICAS DE AISLAMIENTO DE AGENTES FITOPATÓGENOS (CULTIVO TRAMPA (MANZAN…
UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

FACULTAD DE AGRONOMÍA
POST-PRACTICA MÉTODOS Y
TÉCNICAS DE AISLAMIENTO DE
AGENTES FITOPATÓGENOS
(HONGOS Y CHROMISTAS)
LABORATORIO INTRODUCCIÓN A LA FITOPATOLOGÍA
Ing. Agro. GUSTAVO ADOLFO ÁLVAREZ VALENZUELA
Pec Hernández Marvin Mateo

Carne: 200915859
Lunes Vespertina.
GUATEMALA 16 DE SEPTIEMBRE 2011
http://slidepdf.com/reader/full/post-practica-metodos-y-tecnicas-de-aislamiento-de-agentes-ﬁtopatogenos 1/27
ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................... 3
2. OBJETIVOS ............................................................................................................................................. 3
3. MARCO TEÓRICO ................................................................................................................................. 4
3.1. Métodos y técnicas para el aislamiento de agentes fitopatógenos a partir de
tejido vegetal ............................................................................................................................................ 4
3.1.1. Preparativos para el aislamiento (Según Agrios) ................................................................. 4
3.1.2. Aislamiento de hojas ....................................................................................................................... 5
4. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................................ 6
4.1. Materiales. ...................................................................................................................................... 6
4.2. Metodología. .................................................................................................................................. 6

4.2.1. Procedimiento para efectuar la siembra .................................................................................. 6
4.2.2. Cultivo trampa .................................................................................................................................... 3
4.2.3. Técnica de solución de extracto de suelo ................................................................................. 6
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................................................. 8
5.1. Aislamiento de agentes fitopatógenos ................................................................................. 8
5.2. Cultivo Trampa. ......................................................................................................................... 10
5.3. Técnica de solución de extracto de suelo ......................................................................... 12
5.3.1.1. Observaciones al Microscopio. ......................................................................................... 13
6. CONCLUSIONES ................................................................................................................................. 15
7. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................................... 16
8. anexos .................................................................................................................................................. 17
8.1. ¿Qué otras técnicas de aislamiento se conocen para microorganismos que
afectan plantas, ..................................................................................................................................... 17
8.1.1. Aislamiento de hojas .................................................................................................................... 17
8.1.1.1. Inducción al desarrollo micelar ....................................................................................... 17
8.1.1. Aislamiento de tallos, frutos y otros órganos aéreos de la planta.............................. 17
8.1.1. Cultivo líquido ................................................................................................................................. 17
8.1.1. Placas de suelo de Warcup ......................................................................................................... 17
8.1.1. Fraccionamiento de la comunidad de hongos del suelo ................................................. 17
8.1.1. Filtración de partículas ................................................................................................................ 18
LABORATORIO INTRODUCCIÓN A LA FITOPATOLOGÍA 1

8.2. Investigue que tipo de medios selectivos son utilizados para desarrollar
algunos microorganismos (Hongos y bacterias),...................................................................... 18
8.3. Cómo puede saber que medio utilizar cuando desea aislar un organismo
patógeno a plantas (hongos o bacteria)? ..................................................................................... 20
8.3.1. Medios Básicos ................................................................................................................................ 20

8.3.2. Medios Enriquecidos..................................................................................................................... 20
8.3.3. Medios Selectivos ........................................................................................................................... 20
8.3.4. Medios Diferenciales ..................................................................................................................... 21
8.3.5. Medios para hongos ...................................................................................................................... 21
8.3.6. Medio para bacterias .................................................................................................................... 21
8.3.7. Agar V 8 .............................................................................................................................................. 21

8.3.8. Medio YDC (Levadura, Dextrosa, Calcio)............................................................................... 21
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura No 1 Preparativos para el aislamiento .................................................................................................. 4
Figura No 2 Metodologia de aislamiento de hongos en hojas. ................................................................... 5
Figura No 3 Lesiones provocadas por generos del phyllum Oomycota ................................................. 5
Figura No 4 Colonizacion por hongos Oomycota ............................................................................................ 5
Figura No 5 Mancha negra en Rosa ...................................................................................................................... 8
Figura No 6 Organismo aislado de hoja de rosa ............................................................................................. 8
Figura No 7 Espora asexual. bicelular esporas de hongos del anamorfo Marssonina rosae .......... 9
Figura No 8 Espora sexual Apotecio, Ascospora y ascas .............................................................................. 9
Figura No 9 Manzana Inocualda con suelo (Magnolia)............................................................................. 11
Figura No 10 Manzana Inoculada con raiz de Magnolia. ........................................................................... 11
Figura No 11 Manzana inocualda con raiz de Magnolia ........................................................................... 11
Figura No 12 Siembra en Medio selectivo PARPBH y siembra se semilla en solucion de suelo de
las manzanas que dieron positivo la prueba del cultivo trampa. .......................................................... 12
Figura No 13 Semilla en solucion de suelo. .................................................................................................... 12
Figura No 14 Semilla en solucion de suelo. .................................................................................................... 13
Figura No 15 Montaje del micelio del Oomycota a las 24 horas de la siembra en solucion de
suelo............................................................................................................................................................................... 13
Figura No 16 Micelio de Phytophthora ............................................................................................................ 14
Figura No 17 Micelio de Phytophthora a las 48 horas despues de la simbra .................................. 14

1. INTRODUCCIÓN
En la estructura de los hongos patógenos, las diversas formas que desarrollan: Estructuras
vegetativas. Estructuras propagativas. Estructuras reproductivas. Estructuras de
conservación. Todo estos datos entran en juego cuando se quiere clasificar a los diferentes
agentes fitopatógenos.
Para que se logre observar las diferentes estructuras que se mencionaron anteriormente es
necesario en algunas ocasiones y en algunos tipos de hongos fitopatógenos en especial que se
necesita de poder aislarlos para determinar el agente causal.
El aislamiento consiste en el proceso de separación de microorganismos a partir de su sustrato
natural (plantas, hojas, tubérculos, tallo raíces o suelo) para hacerlas crecer en un medio de
cultivo artificial (Por ejemplo medio PDA). El aislamiento y cultivo persigue diversos fines, el
más común en un laboratorio de fitopatología es para diagnosticar la causa de una enfermedad
desconocida.
El cultivo de microorganismos tiene enormes ventajas que contribuyen al conocimiento de la
biología de estos. Sin embargo, hay que considerar que al cultivar un organismo:
Los hongos pueden o no formar cuerpos fructíferos en medios artificiales; estos
cuerpos pueden presentar variación,
Existen hongos que no se pueden cultivar (parásitos obligados) y otros que requieren
medios complejos para su desarrollo.
Las técnicas para aislar hongos son diversas y dependen del hongo a estudiar a continuación
se presenta una recopilación de información sobre los tipos de técnicas de aislamiento de los
diversos hongos fitopatógenos que afectan a los cultivos de importancia agrícola.
2. OBJETIVOS
 Conocer cuando se utiliza el método de aislamiento como siembra directa.
 Conocer la técnica de aislamiento de siembra en solución de suelo.
 Conocer las dimensiones utilizadas en la perforación de la manzana en el la técnica de

aislamiento conocida como cultivo trampa.
 Determinar el tiempo que tarda en reaccionar la manzana verde inoculada con raíz de
planta para determinar la presencia de oomycotas.
 Determinar el organismo oomycota

3. MARCO TEÓRICO
3.1. Métodos y técnicas para el aislamiento de agentes fitopatógenos a partir de

tejido vegetal
La mayoría de las enfermedades de las plantas se diagnostican al observarlas a simple vista o

mediante al microscopio, lo cual hace innecesario el aislamiento del patógeno. Sin embargo,
hay muchas enfermedades bacterianas y fungosas en las que es imposible identificar al
patógeno que ya se encuentra mezclado con uno o más contaminantes, porque aún no ha
producido sus cuerpos fructíferos característicos y esporas, debido a que una misma
enfermedad puede deberse ya sea a uno o a varios patógenos morfológicamente semejantes o
tal vez a algún factor del ambiente, o bien a que la enfermedad es causada por un nuevo
patógeno hasta ese momento desconocido, el cual debe aislarse y estudiarse.
Como es habitual, los patógenos de enfermedades desconocidas deben aislarse de los tejidos
enfermos de una planta a fin de que se pueda llevar a cabo un estudio de sus características,
hábitos, etc
3.1.1. Preparativos para el aislamiento (Según Agrios)

Siempre que se desee aislar una bacteria o un hongo patógeno de los tejidos de una planta
enferma, deben llevarse a cabo los siguientes procedimientos preliminares.
Figura No 1 Preparativos para el aislamiento

3.1.2. Aislamiento de hojas

En caso de que la infección de las hojas de una planta avance en forma de tizón o mancha foliar
fungosa y en caso de que las esporas del hongo aparezcan sobre su superficie, algunas de esas
esporas deben depositarse sobre una caja de Petri que contenga medio de cultivo.
En ocasiones, el aislamiento del patógeno a partir de tizones y manchas foliares bacterianas o

fungosas se logra mediante la esterilización superficial de la zona infectada con soluciones de
Cloro o de Rada, separando una pequeña porción del tejido infectado con un escalpelo estéril u
otro objeto y colocándola en una caja de Petri que contenga un medio nutritivo.
Sin embargo, el método más común para aislar a los patógenos de las hojas infectadas y de
otros órganos de la planta es aquel en el que se seleccionan varios cortes pequeños de 5 a 10
mm2 a partir del borde de la lesión infectada, a fin de que contenga tejidos enfermos y tejidos
al parecer sanos (figura 2).
Los cortes esterilizados en su superficie durante menos tiempo generalmente contienen al

patógeno y a varios contaminantes, mientras que los que se han esterilizado durante más
tiempo no permiten el desarrollo de cualquier tipo de microorganismos debido a que han sido
destruidos por el esterilizante de superficie.
Figura No 2 Metodologia de aislamiento de hongos en hojas.

4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. Materiales.
Material vegetal enfermo, Agua destilada y estéril,

Una manzana o tomate verde, Papel absorbente estéril,
Caja con instrumental de Asa,
laboratorio, Pinzas,
Cristalería estéril (vidrios de reloj y Atomizador,
cajas Petri), Papel absorbente,
Medios de cultivo, Film,
Mechero, Marcador indeleble,
Alcohol, Microondas,
Hipoclorito de sodio, Campana de flujo laminar.
4.2. Metodología.
4.2.1. Procedimiento para efectuar la siembra
Las porciones de tejido vegetal se depositaron en el primer vidrio de reloj

(agua estéril).
Seguidamente se traslado al vidrio de reloj que contiene alcohol,

permanecio durante 30 seg.
Posteriormente se traslado al siguiente vidrio de reloj que contiene agua

estéril, para eliminar el exceso de alcohol.
Seguidamente se procedio
hipoclorito de sodio, a pasarlos
permanecio al siguiente
durante vidrio de reloj con
a 30 segundos.
Posteriormente se paso sucesivamente en los dos vidrios de reloj que

contienen agua estéril.

Se colocar las porciones de tejido sobre una hoja de papel filtro estéril,
para quitarles el exceso de agua.
Pasar las porciones de tejido a papel estéril con el fin de eliminar el

exceso de agua en los tejidos.
Depositar las porciones de tejido en la caja petri o tubo de ensayo donde

se hará crecer el microorganismo.
Cuidar que el recipiente se encuentre cerca de la llama del mechero,

evitar exhalar sobre el medio de cultivo.
Previo a introducir el tejido enfermo, debe flamear la boca del recipiente

donde se cultivará el microorganismo.
Las cajas petri deberán identificarse con el nombre de la persona y día de

laboratorio e incubarse a 28 ºC durante 8 días.

4.2.2. Cultivo trampa
Desinfección del área de

Desinfección de Manzana
trabajo
Desinfección del material raíz de magnolia
Con un sacabocados a cada fruta se le hacen de 3

a 4 perforaciones, (1x1 cm.) y con una
profundidad de 1.5 cm

Llenar agujeros con material raíz de Llenar agujeros con material

magnolia raíz de magnolia Sellarlo y
colocarle fecha
Incubarlo a temperatura
ambiente
Posteriormente incuban en un recipiente cerrado a temperatura ambiente por espacio de 36 a

48 horas, luego de las cuales pueden verse las lesiones ocasionadas por Pythium o
Phytophthora alrededor de los puntos de inoculación. En la figura 3 se muestra un proceso de
incubación a medio ambiente.
Cuando la inoculación resulta positiva y el agente coloniza dentro de la manzana, pueden

observarse lesiones firmes color marrón rodeando los puntos de inoculación. En la figura 4 se
muestran los síntomas desarrollados y considerados como positivos a la presencia de
Oomycetos en frutas de manzana inoculadas con un sustrato considerado como sospechoso de
contener a alguno de estos patógenos

Figura No 3 Lesiones provocadas por generos del phyllum Oomycota
Figura No 4 Colonizacion por hongos Oomycota
Se procedio al aislamiento “in vitro” en medio de cultivo selectivo (PARPBH ), para ello se
cortan las manzanas que presentan síntomas positivos y se procedio a extraer tejido infectado
de pulpa en la región más externa de la lesión o zona de avance. Se muestra la forma en que es
separada cada una de las lesiones y se procede a observar su consistencia y velocidad de
avance.
Simultáneamente se procede a cultivar las semillas de la fruta en solución de suelo para que
genere estructuras reproductivas.

4.2.3. Técnica de solución de extracto de suelo
• Se peso 50 g de suelo y se mezclo con 500 cc de agua.

1
• Se dejo por 24 horas reposando la solución.

2
• Se tomaron 100 cc de la solución y se aforo a 1000 cc con agua destilada

3
• Se esterilizo en autoclave por 20 minutos a 15 psi

4
• La solución se dejo enfriar y está lista para utilizar.

5
• Para provocar desarrollo de esporangios, se colocaron en una caja de Petri, 10

cc de la solución y se depositaron en ella las semillas con micelio de Pythium y
Phytophthora, provenientes de las manzanas inoculadas con suelo o raíces y que
6 habian dado positivo.
• Se identifican las cajas y se dejaron temperatura ambiente . El micelio crece en

el término de 24-48 horas
7

Desinfección área de trabajo

Positivo
Solución de suelo
Corte de la manzana
Preparación área de trabajo área de trabajo
Siembra de Semillas en solución de suelo
Siembra del Oomycota en medio de cultivo

selectivo (PARPBH)
Sellado he identificacion

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1. Aislamiento de agentes fitopatógenos

En las hojas se observaron diferentes manchas
grandes de color pardo a negro, tenía la forma de
estrella. Las hojas se tornan de un color amarillo y
posteriormente se caen.
Esta enfermedad debilita a la planta debido a que
su fuente de producción de nutrientes es afectado
n este caso es la hoja
Se tomaron pedazo tanto de la parte sana como
enferma de la hoja afectada como se menciona en
Figura No 5 Mancha negra en Rosa la metodología.
El hongo inverna en forma de micelio o como ascósporas y conidios en las hojas y tallos de los
rosales infectados ambos tipos de esporas producen infecciones primarias de hojas en la
primavera mediante penetración directa. El micelio se desarrolla en el mesófilo, pero al cabo
de dos semanas forma acérvulos y conidios en el haz de la hoja (fase sexual).
De los aislamientos realizados no se logró la
siembra correcta solo uno de los cuatro reacciono
al medio empezando a crecer los micelios del
hongo, pueden haber varios motivos por los
cuales no se logró que los demás pedazos de tejido
no hayan crecido en el medio puede que el tejido
tomado simplemente no contenía al hongo, otra de
las causas puede ser que los tejidos se hallan
colocado demasiado tiempo en los compuestos
tanto de alcohol o hipoclorito, esto debido a que
Figura No 6 Organismo aislado de hoja de rosa como se observa en la figura 6 las porciones de
medio de cultivo. tejidos parecer estar muertas o secas dentro del
Según varias investigaciones en literatura el agente causal de la enfermedad el cual se aisló

probablemente es Diplocarpon rosae que es conocida comúnmente como la mancha negra de
la rosa.

Diplocarpon rosae es un hongo que causa la rosa Punto Negro enfermedad. Debido a que fue
observado por personas de varios países al mismo tiempo (alrededor de 1830), la
nomenclatura de los hongos variados con cerca de 25 nombres diferentes. La etapa asexual se
sabe ahora que Marssonina rosae , mientras que el estado sexual y más común se conoce como
Diplocarpon rosae .
Diplocarpon rosae en temporadas como micelio, ascosporas y conidias en las hojas y tallos. En
la primavera durante condiciones húmedas y húmedas, ascosporas y conidios son llevados por
el viento y la lluvia salpica al tejido de la hoja de reciente aparición. Tras la infección, la
enfermedad progresa a partir de las hojas más bajas hacia arriba provocando la defoliación y
manchas de negro en las hojas. Pertenece al phyllum ascomycota
Este hongo ascomycota en su fase asexual se

le conoce como Marssonina rosae y como se
observa en la figura 7, lo que se esperaría es
observar las esporas bicelular. Es muy
característico en este hongo.
Figura No 7 Espora asexual. bicelular esporas de hongos del

anamorfo Marssonina rosae
Fuente: http://www.ipmimages.org/browse/detail.cfm?imgnum=5368965
En la fase sexual lo que se observaría sería

una estructura de resistencia del tipo apotecio
que dentro tendría ascosporas y dentro de
estas se encontrarían ascas, debido a esto es
que a este hongo se le clasifica en el phyllum
ascomycota.
Figura No 8 Espora sexual Apotecio, Ascospora y ascas
Fuente: http://www.ipmimages.org/browse/detail.cfm?imgnum=5390063

5.2. Cultivo Trampa.
FOTOGRAFÍA (SIEMBRA DE RAÍZ DE

FECHA CARACTERÍSTICAS
MAGNOLIA)
En esta fotografía lo que se

observa es el hongo recién
30/08/2011 inoculado por lo que todavía
no muestra indicios de
presencia del Oomycota.
A las 48 horas todavía la

manzana no mostraba
características de presencia
01/09/2011 del hongo, sin embargo cabe
destacar que la consistencia
de la manzana ya no era la
misma como se mostraba
inicialmente.
La manzana que contenía las

raíces de magnolia que se
sospechaba que estaba
02/09/2011 infectada
la queconmás
phytoptora
indicios era
mostraba de la presencia del
Oomycota
Tanto la manzana que

contenía suelo como las que
05/09/2011 contenían raíces, era un
diagnostico positivo de la
presencia del Oomycota.

La manzana que contenía suelo fue la que tardo más en

reaccionar a la presencia del Oomycota esto puede ser
porque las condiciones ambientales del suelo no eran las
óptimas en el momento de la tomas de la muestra por lo que
la cantidad de Oomycotas presentes no era tan alta.
Figura No 9 Manzana Inocualda con

suelo (Magnolia).
Unas de las manzanas que fue inoculada con raíces de

Magnolia (Magnolia guatemalensis ) esta fue reacciono en
menor tiempo en comparación con la que fue inoculada
con suelo, esto no da la pauta de que la planta estaba
infestada con el Oomycota.
Figura No 10 Manzana Inoculada con

raiz de Magnolia.
La tercera manzana al igual que la segunda que también fue

inoculada con raíces de la planta infestada con el Oomycota,
presentaba una diagnostico positivo de la presencia del hongo.
Esto corrobora lo que se intuía de debido a que la planta
donde fueron tomadas las muestras presentaba síntomas
característicos de la presencia del Oomycota.
Figura No 11 Manzana inocualda

con raiz de Magnolia

5.3. Técnica de solución de extracto de suelo
Las tres manzanas a las cuales se les practicó la

prueba del cultivo trampa y dieron positivo también
pasaron a la siguiente prueba el cual era la
determinación del genero de Oomycota el cual era la
que estaba afectando a las plantas.
El Oomycota trata de moverse hacia el centro de la
manzana porque tiende a llegar a las semillas esto
debido a que las semillas son ricas en energía, porque
están llenas de reservas para la nueva planta que
germinara por eso el Oomycota busca siempre llegar
a ella.
Por lo que la para la siembra en el medio selectivo
PARPBH se toma porciones de la manzana en la
zona conocida como zona de avance del hongo que
Figura No 12 Siembra en Medio selectivo está cercano donde están las semillas.
PARPBH y siembra se semilla en solucion de
suelo de las manzanas que dieron positivo la
prueba del cultivo trampa.
A las 24 horas de la siembra de las semillas en

solución de suelo la primea en reaccionar fueron
las semillas extraídas de la manzana inoculada
con raíces de la planta infectada, confirmando
con ello que, esta es la que mayor infestación del
Oomycota tenía.
El micelio del hongo tiene una coloración blanca

y crece rápidamente porque las semillas tienen
muchos nutrientes que el Oomycota necesita.
La solución del suelo su función es la de
simularle al Oomycota que está en el suelo y por
lo tanto ataca a la semilla.
Figura No 13 Semilla en solucion de suelo.

A las 24 después de la siembra de semillas

de manzana en solución de suelo la que
menos reacciono fueron las semillas
prevenientes de la manzana la cual fue
inoculada con suelo.
Esto porque como se mencionó

anteriormente, como posible causa que en el
suelo no haya un alta cantidad del Oomycota.
Figura No 14 Semilla en solucion de suelo.
5.3.1.1. Observaciones al Microscopio.
Figura No 15 Montaje del micelio del Oomycota a las 24 horas de la siembra en solucion de suelo
A las 24 horas después de la siembra el Oomycota solo había producido hifas y esto hacia que
no se pudiera determinar si era phytopthora o no porque no tenía características
específicas por lo que había que esperar mas tiempo.

A las 48 horas después de la siembra en solución de suelo se

realizó nuevamente un montaje sobre el oomycota, pero lo que
se encontró es una contaminación del micelio de este hongo con
otros hongos. Pero después de una cuidadosa selección de la
parte que se necesitaba se encontró con el micelio de
Phytophthora
Figura No 16 Micelio de
Phytophthora
Figura No 17 Micelio de Phytophthora a las 48 horas despues de la simbra
En el montaje que se ve en el lado izquierdo de la figura 17 se muestra el micelio de

Phytophthora, pero al lado derecho se hace una aceración de ello y se observa el oogonio
característico de este oomycota, además de ello se muestra de una oósporo que se esperaría
que a lo largo del tiempo mostrase este microorganismo.
Por lo que después de una largo proceso se llegó a determinar que la planta de magnolia si
estaba infestada con Phytophthora.

6. CONCLUSIONES
En caso de que la infección de las hojas de una planta avance en forma de tizón o
mancha foliar fungosa y en caso de que las esporas del hongo aparezcan sobre su
superficie, algunas de esas esporas deben depositarse sobre una caja de Petri que
contenga medio de cultivo (raspado).
Técnica de siembra directa de suelo, este método se lleva a cabo introduciendo

fragmentos del suelo fresco en la superficie de placas con diferentes medios de cultivo,
para posteriormente observar el crecimiento micelial de los hongos presentes en las

muestras.
El cultivo trampa no es más que los trozos de tejido se introdujeron en orificios de 5

mm de diámetro y 30 mm de profundidad, hechos en frutos maduros de manzana verde
luego se cubrieron con cinta de enmascarar y se dejaron a temperatura ambiente.
El tiempo que tardó en reaccionar la manzana a la cual se le inoculo raíces de planta

infectada con Phytophthora fue de 3 dias.
En el cultivo trampa el organismo que se llegó a determinar es Phytophthora sp.

7. BIBLIOGRAFÍA
1. AGRIOS, G. 1998. Fitopatología.5ª.Edición.EditorialMcGraw-Hill.México.928p.
2. Loredo Vega J. Universidad Autónoma De Sinaloa Unidad Regional Norte Escuela
Superior De Agricultura Del Valle Del Fuerte Manual De Prácticas Del Laboratorio De
Fitopatología. Consultado el 17 de Septiembre 2011. Disponible en:
http://www.slideshare.net/jloveuas/manual-de-prcticas-fitopatologa-3025383.
3. Arias E. Aislamiento e identificación de hongos filamentosos del suelo. Trabajo de

grado. Universidad Javeriana, Bogotá Colombia. Consultado el 16 de Septiembre 2011.
Disponible en: http://ciagrope.tripod.com/fitote20.html.
4. Principios de fitopatología, Universidad Central de Venezuela, Facultad de Agronomía.
Consultado el 10 de Septiembre 2011 Disponible

en:http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_agronomia/Clase_1_PRINCIPIO
S_DE_FITOPATOLOG%C3%8DA.pdf
5. Universidad de la República, Facultad de Agronomía, Departamento de Protección

Vegetal, Monte Video Uruguay. Practica de hongos. Consultado el 18 de Septiembre
2011. Disponible en:
http://www.pv.fagro.edu.uy/fitopato/cursos/fitopato/practicas/hongos.html y
http://www.pv.fagro.edu.uy/fitopato/cursos/fitopato/practicas/clave_bacterias.html
6. Fitopatología General, Universidad Agraria de Molina, Departamento de fitopatología.

Lima, Perú. Consultado el 18 de Septiembre 2011. Disponible
en:http://tarwi.lamolina.edu.pe/~fonz/fitogen/PDF/APUNTES%20DE%20CLASES1.pdf

8. ANEXOS
8.1. ¿Qué otras técnicas de aislamiento se conocen para microorganismos que
afectan plantas,
8.1.1. Aislamiento de hojas
En caso de que la infección de las hojas de una planta avance en forma de tizón o mancha foliar
fungosa y en caso de que las esporas del hongo aparezcan sobre su superficie, algunas de esas
esporas deben depositarse sobre una caja de Petri que contenga medio de cultivo.
8.1.1.1. Inducción al desarrollo micelar
Se recomienda que el hongo crezca y esporule sobre medios de cultivo, recomendable para
hongos que crecen en el interior del hospedante y/o que esporulen poco en el tejido, tales
como hongos de la raíz. Este método es el más usado cuando se requiere tener a un hongo en
cultivo puro.
8.1.1. Aislamiento de tallos, frutos y otros órganos aéreos de la planta
La mayoría de los métodos que se han descrito para aislar bacterias y hongos patógenos de las
hojas, pueden también utilizarse para aislar esos mismos patógenos de las infecciones
superficiales de los tejidos mencionados.
8.1.1. Cultivo líquido

En esta técnica se toman 10 g (equivalente peso seco) de suelo fresco y se adiciona a
erlenmeyers de 1000 mL con una solución de agua destilada estéril, peptona al 0,1%, Tween
80 al 0,5% y Cloramfenícol (400ppm) 0,005mg/mL. Se coloca la mezcla en shaker giratorio
durante 48 horas para luego dejarlo en incubación estática hasta observar el desarrollo de
micelios en el líquido (aproximadamente 1 semana).
8.1.1. Placas de suelo de Warcup
Fue desarrollado por Warcup en 1950, las placas se preparan dispersando pequeñas
cantidades (0.2-5 mg) de suelo pulverizado en una caja de petri estéril, se adiciona agar a las
placas y se agita lentamente para dispersar las partículas.
8.1.1. Fraccionamiento de la comunidad de hongos del suelo
Esta técnica involucra la preseparación de propágulos del suelo utilizando centrifugación por
gradiente de densidad antes de la aplicación en los medios de aislamiento. Se aíslan
específicamente, las esporas de diferentes tamaños.

8.1.1. Filtración de partículas

Se denomina también "lavado de suelo" y permite el aislamiento de hongos de fragmentos de
micelio sumergidos en el sustrato, reduciendo la recuperación de colonias de hongos
originarios de esporas; de igual forma el aislamiento de especies con clamidosporas también
es favorecido ya que sus propágulos no son removidos del todo por el lavado.
8.2. Investigue que tipo de medios selectivos son utilizados para desarrollar
algunos microorganismos (Hongos y bacterias),


8.3. Cómo puede saber que medio utilizar cuando desea aislar un organismo
patógeno a plantas (hongos o bacteria)?
Inicialmente con los síntomas y signos que presente el microorganismo o alguno de los cortes
realizados nos dan indicios si es un hongo o una bacteria partiendo de eso después se puede
seleccionar varios medios para su utilización se puede empezar con medios básicos, y
dependiendo la reacción del microorganismo podemos llegar hasta un medo diferencial para
estar seguros de que el organismo aislado es el requerido
Para estudiar los microorganismos (p. ej.: hongos, bacterias) se necesita como requisito previo
cultivarlos en condiciones de laboratorio, para lograr esto, es preciso conocer cuáles son los
nutrientes y las condiciones físicas que requieren. Por medio de estudios se ha logrado
determinar las necesidades nutricionales de hongos y bacterias en forma general. Aunque
algunas especies de estos microorganismos necesitan condiciones más específicas para poder
desarrollarse.
La preparación de medios de cultivo es importante para desarrollar microorganismos fuera de
su ambiente natural y demostrar sus propiedades en el diagnóstico. En fitopatología se utilizan
muchos medios. Estos medios varían ampliamente, de acuerdo a las necesidades particulares
de los microorganismos bajo estudio.
8.3.1. Medios Básicos
Estos son los medios más simples, que sólo contienen lo necesario para proporcionar a los
microorganismos los aminoácidos, vitaminas, sales, y pequeñas cantidades de carbono,
nitrógeno, hidrógeno
cultivo sólidos. y otros de
Los medios elementos. Existen
cultivo que no medios de agar
contienen cultivos líquidos yotro
o cualquier medios de
agente
solidificante son medios líquidos. Para el estudio de las características de las colonias es
indispensable el uso de medios sólidos. La solidificación se consigue agregando agar, gelatina,
albúmina de suero o de huevo.
8.3.2. Medios Enriquecidos
La adición de componentes como sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas al
los medios básicos, les proporcionan sustancias nutritivas complementarias para que el medio
pueda soportar el crecimiento de los organismos exigentes
8.3.3. Medios Selectivos
Son usualmente medios de agar básico o enriquecidos, a los cuales se les han agregado ciertos
reactivos que impiden el crecimiento de la mayoría de las bacterias, permitiendo por lo tanto,
el crecimiento de unas cuantas seleccionadas, en los especímenes que contengan grandes
número de microorganismos indeseables.

8.3.4. Medios Diferenciales

Son medios básicos o enriquecidos, a los cuales se les han agregado ciertos reactivos que
reaccionarán con algunos tipos específicos de bacterias en cierta forma observables. Por
ejemplo: cuando se agrega lactosa y rojo neutro al agar nutritivo (medio básico de cultivo), las
bacterias fermentadoras de lactosa de diferenciarán de las no fermentadoras de lactosa por la
formación de productos finales ácidos, demostrables por un cambio de color (rojo en un pH
ácido) del rojo neutro. Como es natural, al añadir algunas substancias inhibidoras a los medios
diferenciales, puede hacérseles selectivos así como diferenciales. La mayoría de los llamados
medios diferenciales son de este último tipo.
La bacteria del género Xanthomonas y Erwinia presenta una coloración amarillenta en el
medio diferencial llamado YDC (levadura, dextrosa, calcio).
8.3.5. Medios para hongos
A excepción de algunas especies de hongos, la mayoría de los mismos se desarrollan bien
sobre un medio que contenga Papa, Dextrosa y Agar (PDA).
8.3.6. Medio para bacterias
El medio para bacterias a utilizar es el conocido como Agar Nutritivo (AN). Se utiliza para el
aislamiento de la mayoría de las bacterias, como medio en la identificación.
8.3.7. Agar V 8
Este medio es muy útil para promover la esporulación de ciertos hongos y para el desarrollo
de otros muy exigentes en nutrientes.
El jugo V 8 es un producto que contiene extractos de tomate, zanahoria, apio de vitaminas y
minerales.
8.3.8. Medio YDC (Levadura, Dextrosa, Calcio)
Se utiliza para la identificación de las bacterias del género Xanthomonas y Erwinia, las cuales
dan una coloración amarillenta en este medio.

Dokumen - Tips - Post Practica Metodos y Tecnicas de Aislamiento de Agentes Fitopatogenos

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7/23/2019 POST-PRACTICA MÉTODOS Y TÉCNICAS DE AISLAMIENTO DE AGENTES FITOPATÓGENOS (CULTIVO TRAMPA (MANZAN…

UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

Pec Hernández Marvin Mateo

GUATEMALA 16 DE SEPTIEMBRE 2011

LABORATORIO INTRODUCCIÓN A LA FITOPATOLOGÍA 1

8.3.1. Medios Básicos ................................................................................................................................ 20

LABORATORIO INTRODUCCIÓN A LA FITOPATOLOGÍA 2

 Conocer cuando se utiliza el método de aislamiento como siembra directa.

 Conocer la técnica de aislamiento de siembra en solución de suelo.

 Conocer las dimensiones utilizadas en la perforación de la manzana en el la técnica de

 Determinar el organismo oomycota

LABORATORIO INTRODUCCIÓN A LA FITOPATOLOGÍA 3

3. MARCO TEÓRICO

3.1. Métodos y técnicas para el aislamiento de agentes fitopatógenos a partir de

La mayoría de las enfermedades de las plantas se diagnostican al observarlas a simple vista o

3.1.1. Preparativos para el aislamiento (Según Agrios)

Figura No 1 Preparativos para el aislamiento

LABORATORIO INTRODUCCIÓN A LA FITOPATOLOGÍA 4

3.1.2. Aislamiento de hojas

En ocasiones, el aislamiento del patógeno a partir de tizones y manchas foliares bacterianas o

Los cortes esterilizados en su superficie durante menos tiempo generalmente contienen al

Figura No 2 Metodologia de aislamiento de hongos en hojas.

LABORATORIO INTRODUCCIÓN A LA FITOPATOLOGÍA 5

4. MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal enfermo, Agua destilada y estéril,

Las porciones de tejido vegetal se depositaron en el primer vidrio de reloj

Seguidamente se traslado al vidrio de reloj que contiene alcohol,

Posteriormente se traslado al siguiente vidrio de reloj que contiene agua

Posteriormente se paso sucesivamente en los dos vidrios de reloj que

LABORATORIO INTRODUCCIÓN A LA FITOPATOLOGÍA 6

Pasar las porciones de tejido a papel estéril con el fin de eliminar el

Depositar las porciones de tejido en la caja petri o tubo de ensayo donde

Cuidar que el recipiente se encuentre cerca de la llama del mechero,

Previo a introducir el tejido enfermo, debe flamear la boca del recipiente

Las cajas petri deberán identificarse con el nombre de la persona y día de

LABORATORIO INTRODUCCIÓN A LA FITOPATOLOGÍA 2

4.2.2. Cultivo trampa

Desinfección del área de

Desinfección del material raíz de magnolia

Con un sacabocados a cada fruta se le hacen de 3

LABORATORIO INTRODUCCIÓN A LA FITOPATOLOGÍA 3

Llenar agujeros con material raíz de Llenar agujeros con material

Posteriormente incuban en un recipiente cerrado a temperatura ambiente por espacio de 36 a

Cuando la inoculación resulta positiva y el agente coloniza dentro de la manzana, pueden

LABORATORIO INTRODUCCIÓN A LA FITOPATOLOGÍA 4

Figura No 3 Lesiones provocadas por generos del phyllum Oomycota

Figura No 4 Colonizacion por hongos Oomycota

LABORATORIO INTRODUCCIÓN A LA FITOPATOLOGÍA 5

4.2.3. Técnica de solución de extracto de suelo

• Se peso 50 g de suelo y se mezclo con 500 cc de agua.

• Se dejo por 24 horas reposando la solución.

• Se tomaron 100 cc de la solución y se aforo a 1000 cc con agua destilada

• Se esterilizo en autoclave por 20 minutos a 15 psi

• La solución se dejo enfriar y está lista para utilizar.

• Para provocar desarrollo de esporangios, se colocaron en una caja de Petri, 10

• Se identifican las cajas y se dejaron temperatura ambiente . El micelio crece en

LABORATORIO INTRODUCCIÓN A LA FITOPATOLOGÍA 6

Desinfección área de trabajo

Preparación área de trabajo área de trabajo

Siembra de Semillas en solución de suelo

Siembra del Oomycota en medio de cultivo

LABORATORIO INTRODUCCIÓN A LA FITOPATOLOGÍA 7

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN