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ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN
Desarrollo de una nueva proteína de fusión con

Anaplasmamarginale y A. centrale MSP5 mejoró el
rendimiento de Anaplasma
detección de anticuerpos por cELISA en bovinos infectados y
vacunados
Mari á E. Primo CARNÉ DE IDENTIDAD 1,2 *, Carolina S. Thompson 1, Beatriz S. Valentini 1, Macarena Sarli 1,2,
a1111111111
Mari á B. Novoa 1,2, Atilio J. Mangold 1,2, Susana T. de Echaide 1
a1111111111
a1111111111 1 Instituto Nacional de Tecnologia á Agropecuaria, Estacióń Experimental Agropecuaria Rafaela, Rafaela,
a1111111111 Santa Fe, Argentina 2 Consejo Nacional de Investigaciones Cientı ´ficas y Tećnicas (CONICET), Santa Fe,
a1111111111 Argentina
** primo.maria@inta.gob.ar
ACCESO ABIERTO Resumen

Citación: PrimoME, Thompson CS, Valentini BS, Sarli M,
Detección de anticuerpos contra Anaplasma spp. El uso de un ensayo de inmunosorción enzimático competitivo comercial
Novoa MB, Mangold AJ, et al. (2019) Desarrollo de una nueva
proteína de fusión con (ccELISA) se basa en la proteína 5 de superficie principal recombinante fusionada con la proteína de unión a maltosa
Anaplasmamarginale y A. centrale MSP5 mejoró el rendimiento de (MBP-MSP5) o glutatión S-transferasa (GST-MSP5). Para evitar reacciones falsas positivas debido a la presencia de
Anaplasma detección de anticuerpos por cELISA en bovinos
anticuerpos contra E. coli MBP en bovinos, se requiere absorción previa de sueros. Este estudio evaluó el reemplazo de los
infectados y vacunados. PLoS ONE 14 (1): e0211149. https://doi.org/
antígenos MBPMSP5 o GST-MSP5 por el MSP5 truncado (residuos 28–210) de A. marginale
10.1371 / journal.pone.0211149
(tMSP5m), A. centrale ( tMSP5c) y la proteína de fusión MSP5 (tMSP5cm), expresada sin hélice transmembrana
Editor: Ulrike GertrudMunderloh, Universidad de Minnesota,
ESTADOS UNIDOS N-terminal en la prueba ccELISA. La inmunorreactividad se evaluó mediante transferencia Western usando anticuerpos
monoclonales contra el tMSP5 y mediante en la casa cELISA (hcELISA) con tMSP5m, tMSP5c o tMSP5cm purificado
Recibido: 27 agosto 2018
utilizando sueros de ganado infectado con A. marginale ( n = 226) o vacunados con A. centrale ( n = 173) y ganado no
Aceptado: 8 de enero de 2019
infectado (n = 216). Los resultados de hcELISA se compararon con los de ccELISA. La proteína recombinante se expresó
Publicado: 23 de enero de 2019
altamente soluble (> 95%) en E. coli sin una chaperona molecular La especificidad de hcELISA-tMSP5m, -MSP5c o
Derechos de autor: © © 2019 Primo et al. Este es un artículo de -tMSP5cm fue idéntica a (99.5%) y mayor que la de ccELISA (96.3%). La sensibilidad de hcELISA-tMSP5m y ccELISA
acceso abierto distribuido bajo los términos del
fue idéntica (95.5%), pero inferior a la de hcELISA-tMSP5cm (96.2%) y -tMSP5c (97.2%). El análisis de bovinos
Licencia de atribución de Creative Commons , que permite el uso, la
vacunados por hcELISA-tMSP5c mostró una sensibilidad del 99,4%. En resumen, la generación de fusión MSP5 A.
distribución y la reproducción sin restricciones en cualquier medio,
siempre que se acredite al autor original y a la fuente. marginale-A. Centrale La proteína sin hélice transmembrana fue un método muy eficaz para expresar la proteína
recombinante altamente soluble en el citoplasma bacteriano y contribuyó a un mayor rendimiento de la prueba para
Declaración de disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están detectar anticuerpos en bovinos infectados naturalmente con A. marginale o vacunado con A. centrale.
dentro del manuscrito.
Fondos: Este trabajo fue apoyado por ANPCyT (PICT 2013-0369) y TCP
INTA EEA Rafaela Asoc. Cooperativa. 426100. Los financiadores no tuvieron
ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos,
la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen
intereses en competencia.
PLOSONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211149 23 de enero de 2019 1/13

FusionMSP5 de A. marginale y Centrale mejora cELISA
Introducción
La anaplasmosis bovina es una enfermedad infecciosa causada por la bacteria intraeritrocítica obligada. Anaplasma marginale [ 1 ]
y se transmite biológicamente al ganado susceptible mediante garrapatas o mecánicamente al picar moscas y fómites [ 2 - 4 4 ] La
enfermedad es endémica en áreas principalmente tropicales y subtropicales del mundo. En Argentina, A. marginale prevalece al
norte de 33˚S; sin embargo, se han detectado brotes de anaplasmosis al sur de la zona endémica debido al movimiento de
ganado portador a áreas no endémicas [ 5 5 , 6 6 ] La anaplasmosis aguda afecta principalmente a bovinos adultos y se caracteriza
por anemia severa con destrucción de eritrocitos, aborto, pérdida de peso, reducción de la producción de leche y muerte. El
ganado que se recupera de una enfermedad aguda sigue siendo portador y sirve como depósito para la transmisión a otros
animales [ 7 7 ] Vacunación con vivo A. centrale, una especie estrechamente relacionada con A. marginale, se usa para prevenir la
anaplasmosis aguda en varios países del mundo, incluida Argentina. El inmunógeno causa solo signos clínicos leves y no
previene la infección con A. marginale, pero reduce la gravedad de la enfermedad y previene la muerte [ 8 ] La ausencia de brotes
de anaplasmosis en áreas endémicas se logra después de que una alta proporción de terneros se infecten naturalmente con A.
marginale o por inoculación de ganado joven con el A. centrale vacuna viva, junto con evitar la entrada de A. marginale- ganado
infectado en zonas libres de anaplasmosis de Argentina. La implementación de medidas de control apropiadas requiere pruebas
serológicas altamente sensibles y específicas que podrían proporcionar principalmente información sobre: i) identificación precisa
de los portadores, ii) estado epidemiológico de la anaplasmosis en terneros de regiones enzoóticas, y iii) la respuesta inmune a A.
centrale vacuna.
Se han desarrollado y utilizado varios ensayos de diagnóstico en el campo, incluida la fijación del complemento (CF) [ 9 9 ],
aglutinación de tarjetas [ 9 9 , 10 ], prueba indirecta de anticuerpos fluorescentes (IFAT) [ 9 9 ], punto ELISA [ 11 ], ensayo inmunosorbente
indirecto ligado a enzimas (ELISA) [ 12 , 13 ] y ELISA competitivo (cELISA) [ 14 ] Los ELISA son preferibles a las pruebas convencionales
debido a su practicidad, objetividad, confiabilidad, idoneidad para la automatización, tiempo de respuesta rápido y, a menudo, mayor
sensibilidad y especificidad para la detección de portadores de anaplasmosis [ 4 4 ]
El cELISA comercial (ccELISA) recomendado por la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) se basa en el A.
marginale proteína 5 de superficie principal recombinante (MSP5) fusionada con E. coli proteína de unión a maltosa
(MBP-MSP5) y en el anticuerpo monoclonal (mAb) ANAF16C1. Para un área endémica de EE. UU. ( A. centrale- país libre), se
informó el 96% de sensibilidad y el 95% de especificidad utilizando esta prueba [ 15 ] Aunque ccELISA se usa para detectar
anticuerpos contra A. centrale, la prueba no ha sido validada para este propósito específico.
MSP5 es una proteína transmembrana de 210 residuos (23kDa) presente en todos Anaplasma especies, y el epítopo
MSP5 definido por ANAF16C1 está ampliamente conservado, con reactividad cruzada descrita entre A. marginale, A.
centrale, A. ovis, A. phagocytophilum y Ehrlichia
sp. [ dieciséis - 18 años ] Una estrategia para mejorar la expresión de proteínas solubles es el uso de chaperonas moleculares. Sin
embargo, este enfoque podría aumentar las reacciones inespecíficas mediante la interacción de anticuerpos con chaperonas o
disminuir las reacciones específicas al ocultar los epítopos debido a impedimentos estéricos. La chaperona MBP mejora la
expresión de MSP5 soluble, pero también aumenta el número de falsos positivos debido a los anticuerpos contra E. coli MBP, que
se encuentran con frecuencia en bovinos. Por esta razón, se requiere un paso de adsorción de sueros con MBP antes de realizar
el análisis [ 14 , 19 ] Chung y col. (2014) evaluaron el reemplazo de MBP con glutatión S-transferasa (GST) para la expresión del
antígeno recombinante soluble en un cELISA para detectar anticuerpos contra A. marginale. Los autores informaron que se
resolvieron tres tipos de problemas: i) carpetas MBP; ii) ligantes inespecíficos de mecanismo desconocido; y
iii) valores de cELISA cercanos al punto de corte. Sin embargo, no se mencionaron los niveles de expresión, purificación o estabilidad
de GST-MSP5 [ 19 ]

Para desarrollar un cELISA altamente específico y sensible, no solo para la detección de anticuerpos en bovinos
infectados con A. marginale, pero también en bovinos vacunados con A. centrale, La prueba se evaluó con un antígeno
modificado. En este trabajo se probaron dos hipótesis: i) la expresión de una variante truncada de MSP5 (tMSP5) sin la
región hidrófoba amino-terminal en E. coli permitirá la expresión de proteínas recombinantes solubles evitando el uso de
chaperonas moleculares (MBP o GST); y ii) la inclusión de A. centrale MSP5 con el A. marginale El antígeno como objetivo
en el ELISA permitirá la identificación de bovinos vacunados con alta sensibilidad sin afectar la detección de animales
infectados naturalmente con A. marginale.
El objetivo de este estudio fue evaluar el uso de la proteína truncada MSP5 de A. marginale
(tMSP5m), A. centrale ( tMSP5c) y A. centrale-A. fusión del marginale tMSP5cm) como antígeno en un cELISA. La sensibilidad de
las tres versiones de cELISA desarrolladas se analizó de acuerdo con la población bovina (terneros infectados naturalmente o
vacunados previamente).
Materiales y métodos
Muestras de ganado
Se recogieron muestras de sangre asépticamente con y sin citrato al 5% como anticoagulante de tres grupos de ganado. El
primer grupo incluyó 255 vacas nacidas y criadas en dos granjas argentinas, ubicadas en un área altamente endémica de
anaplasmosis. Ambas fincas, "La Margarita" y "Don Goyo" se ubicaron en Avia Terai, (26˚40'S-60˚46'W) y Villa Angela
(27˚35'S-60˚43'W) respectivamente, en la provincia del Chaco . El segundo grupo incluyó 173 terneros vacunados con una dosis
única de 10 7 7 A. centrale eritrocitos parasitados, al menos 4 meses antes del comienzo de este estudio. La utilización de A.
centrale la vacuna ha sido aprobada por el Servicio Nacional de Salud y Calidad Agroalimentaria (N ° 93159). Los terneros
provenían de un rebaño históricamente libre de anaplasmosis, ubicado en una zona templada libre de garrapatas (Rafaela,
31˚11'S — 61˚30'W), propiedad de INTA, en la provincia de Santa Fe. El tercer grupo incluyó 216 vacas, también nacidas y
criadas en el rebaño de INTA sin anaplasmosis mencionado anteriormente.
Muestras de sangre y suero obtenidas de bovinos susceptibles, sanos y esplenectomizados infectados por inoculación
intramuscular de 10 7 7 de A. marginale o A. centrale fueron utilizados como controles positivos. El ganado fue aislado en cajas usadas ad
hoc en la Estación Experimental Agrícola del INTA de Rafaela. Se proporcionó comida y agua. ad libitum y el estado general de salud
de los animales fue monitoreado diariamente. Todos los protocolos fueron aprobados por el Comité de Cuidado Animal de la Facultad
de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional del Litoral (Protocolo número 243/15). Las muestras se distribuyeron en alícuotas
y se mantuvieron a -20 ° C hasta su uso.
Extracción de ADN
El ADN genómico (ADNg) se obtuvo de muestras de sangre mediante el método de fenol / cloroformo. Brevemente, las suspensiones
de eritrocitos se lisaron con tampón de lisis de eritrocitos (0.14 MNH 4 4 Cl, 0,17 M Tris-HCl) a temperatura ambiente durante 30
minutos y luego se granula. La hemoglobina se lavó con agua destilada por centrifugación a 14,000 × g durante 15 min, y los
sedimentos se lisaron en 400 μl de tampón de lisis (0.05 MTris-HCl pH 8.0, 0.1MEDTA, 0.1MNaCl, SDS al 2%) con 160 μg de
proteinasa K (Invitrogen Corp., EE. UU.) A 58 ° C durante 1 h. El ADNg se extrajo con 1 volumen de fenol / cloroformo / alcohol
isoamílico, se precipitó con alcohol isopropílico helado y se lavó una vez con etanol helado al 75%. Los gránulos se suspendieron en
50 μl de agua destilada y se mantuvieron a -20 ° C hasta su uso.
Estado de la infección
El estado de la infección por anaplasmosis del ganado muestreado se confirmó mediante PCR anidada (nPCR) validada
específicamente para cada especie de Anaplasma [ 20 ] Infección de terneros vacunados con A.

Centrale También se confirmó mediante un examen microscópico directo de frotis de sangre teñidos con Giemsa.
En silico análisis de MSP5
Alineación de secuencia, presentación y determinación del porcentaje de identidad entre A. marginale

y A. centrale MSP5 se realizó utilizando CLUSTALW (1.83) ( http://embnet.vital-it.ch/ software / ClustalW.html ) Algoritmo
TMPred ( http://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_ form.html ) se utilizó para predecir los dominios transmembrana [ 21 ] La
solubilidad de MSP5 truncada de longitud completa (residuos 28-210) y la proteína de fusión se calculó utilizando un modelo
de predicción basado en E. coli proteínas sobreexpresadas ( http://www.biotech.ou.edu/ ) [ 22 ]
Clonación de truncado msp5 gen de A. marginale y A. centrale

ADNc que codifica los residuos 28-210 con una etiqueta de seis histidinas en el extremo C de la proteína MSP5 de
A. marginale ( tMSP5m) o MSP5 de A. centrale ( tMSP5c) se amplificaron por PCR usando los cebadores MSP5-F 5'-catatgggtattttc
' y MSP5-R
5'-ggatcctcagtgatggtgatggtgatggcggccttcaattttaaaagaattaagcat gtgacc-3 '. El ADNc para tMSP5m y tMSP5c
se clonó en pGEM-T Easy (Promega, EE. UU.). Posteriormente, se cortó un fragmento con Nde yo y Bam HI
y subclonado en pET9b (Novagen, EE. UU.) Para producir ptMSP5m o ptMSP5c. La identidad de la
construcción de ADN se confirmó por secuenciación (Instituto de Biotecnología)
á, INTA CICVyA, Argentina).
Se usaron tres PCR para generar el ptMSP5cm: PCR1 por amplificación de tMSP5c usando ptMSP5c
como plantilla y cebadores. 5´-tgcatgcaaggagatggcgcccaacagt-3´ ( FpET9) y 5´-gctttcttatacagagaggtagaattaagcatg-3´
( R-1), PCR2 por amplificación de tMSP5m usando pMSP5m y los cebadores 5´-ctctgtataagaaagcaggtggta
ttttcag-3´ ( F-2) y 5´-ttctccttcattacagaaacggct-3´ ( R-pET9) y PCR3 usando productos PCR1 y PCR2 como
plantilla y cebadores F-pET9 y R-pET9. El subrayado de secuencia de los cebadores R-1 y F-2 son
complementarios y permiten la fusión de los productos PCR1 y PCR2.
Expresión y purificación de proteínas.
E. coli BL21 RIL (DE3) PLISO Las células competentes (Novagen, EE. UU.) transformadas con ptMSP5m, ptMSP5c o ptMSP5cm
se cultivaron a 37 ° C en 500 ml de medio Luria-Bertani suplementado con 50 μg / ml de kanamicina y 34 μg / ml de cloranfenicol
a sobredosis 600 nm = 1. La expresión de proteínas se indujo con 1% de lactosa. Después de 3 h de inducción a 37 ° C, las bacterias
se cosecharon por centrifugación, se suspendieron en 10 ml de tampón de lisis (fosfato de sodio 50 mM, 300 mM NaCl, imidazol
10 mM, pH 8) que contiene 1/1000 conjunto de cóctel de inhibidor de proteasa III (Calbiochem , EE. UU.), Y lisada por 2 pases a
través de un disruptor celular a 20000 psi (Avestin Emulsiflex B15, Canadá). Después de la centrifugación (12000 × g, 30 min,
4˚C), la fracción soluble se separó y se añadió a 2 ml de agarosa Ni-NTA (Qiagen, Alemania) previamente equilibrada con
tampón de lisis. Después de la incubación a 4 ° C durante 1 h, la suspensión se vertió en una columna de 1,5 cm x 5,0 cm y se
lavó con 5 volúmenes de tampón de lisis que contenía imidazol 30 mM. Obligado tMSP5m, El tMSP5c o tMSP5cm se eluyó
sucesivamente con 5 volúmenes de 100 mM y luego con 5 volúmenes de tampón de lisis de imidazol 200 mM. Finalmente, el
tampón se cambió por fosfato de sodio 50 mM, NaCl 200 mM, pH 7,2 por diálisis durante la noche a 4 ° C. La concentración
molar en muestras puras se calculó por absorbancia a 280 nm usando un coeficiente de extinción molar ( ε 280 nm)
igual a 8940 M −1 cm –1, 10430 M- 1 cm- 1 o 20860 M −1 cm –1 para tMSP5m, tMSP5c o tMSP5cm, respectivamente.

Western blot para tMSP5m, tMSP5c y tMSP5cm

La electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) se realizó como se describió anteriormente [ 23 ]
Las proteínas se transfirieron luego a membranas de nitrocelulosa. Los sitios de unión a proteínas libres fueron bloqueados por
incubación con TBS / 5% de leche descremada durante 2 h. El conjugado de mAb ANAF16C1-peroxidasa (VMRD Inc., EE. UU.)
Se evaluó a dilución 1/100 en TBS / Tween 0,05% 20/5% de leche descremada. Después de la incubación a 25 ° C durante 1 h,
las membranas se lavaron cinco veces con TBS / Tween 20 al 0,05% y la reacción se reveló añadiendo el sustrato colorimétrico
tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina (DAB) (Sigma-Aldrich, EE. UU.).
Protocolos de ELISA
Todas las muestras de suero de campo y los controles se analizaron por duplicado a temperatura ambiente (25 ° C).
Comercial competitivo ELISA (ccELISA). En este estudio se utilizó una ccELISA (VMRD Inc, EE. UU.) Basada en la proteína
de fusión MBP-MSP5 recomendada por la OIE, siguiendo las recomendaciones del fabricante. Brevemente, se incubaron 70 μl de
controles y muestras de suero en la placa de adsorción de MBP a 25 ° C durante 30 min. Luego, 50 μl de las muestras adsorbidas
se transfirieron a los pocillos correspondientes del Anaplasma Placa recubierta de antígeno e incubada durante 1 h. Después de dos
lavados con solución de lavado, se añadieron 50 μl de mAb ANAF16C1-conjugado de peroxidasa y se incubaron durante 20
minutos. Después de lavar la placa cuatro veces, se añadieron 50 μl de solución de sustrato a cada pocillo y se incubaron en la
oscuridad durante 20 min. Finalmente, se añadieron 50 μl de solución de parada y la detección se realizó a 620 nm.
ELISA competitivo interno (hcELISA). Se evaluaron tres versiones de hcELISA basadas en tMSP5m (hcELISA-tMSP5m),
tMSP5c (hcELISA-tMSP5c) o tMSP5cm (hcELISA-tMSP5cm). Las microplacas de poliestireno (Thermo Fisher Scientific Inc, EE.
UU.) Se recubrieron durante la noche a 4 ° C con 50 μl de tMSP5m, tMSP5c o tMSP5cm purificado (1 μg / pocillo) en PBS.
Después de dos lavados con PBS, se añadieron 300 μl de tampón de bloqueo (PBS / 10% de leche en polvo sin grasa) y las
placas se incubaron durante 1 h. Las placas se lavaron tres veces con PBS / Tween 20 al 0,05% y luego se incubaron con 100 μl
de muestras de suero durante 1 h. Posteriormente, se utilizaron el mismo protocolo y reactivos de ccELISA.
Análisis de los datos
Los resultados se expresaron como porcentaje de inhibición (% I), que se calculó utilizando la siguiente fórmula:
% yo ¼ 100 ½ 1- re Muestra OD = Control Negativo OD Þ
El punto de corte óptimo, la sensibilidad y la especificidad para ccELISA y las tres versiones de hcELISA se establecieron
mediante análisis ROC utilizando el software MedCalc 8.1.0.0. La concordancia entre ccELISA y hcELISA-tMSP5m se estimó
mediante el valor kappa de Cohen utilizando el mismo software [ 24 ] Las diferencias entre los resultados obtenidos con los cuatro
protocolos cELISA se evaluaron mediante una prueba de MannWhitney.
Resultados
Expresión, purificación y control de calidad de proteínas recombinantes.
La comparación de la secuencia de la proteína MSP5 de A. marginale y A. centrale ( MSP5m y MSP5c, respectivamente)

revelaron 91.5% de identidad ( Figura 1 ) El análisis de la estructura primaria de MSP5 realizado con TMPred predijo una hélice
transmembrana en el extremo N de la proteína (residuos 1–25) [ 21 ] La solubilidad prevista para MSP5 de longitud completa,
truncada (residuos 28–210) y proteínas de fusión, sobreexpresadas en E. coli, fue 65%, 100% y 100%, respectivamente

Fig 1. Secuencia de alineación de A. marginale MSP5 (MSP5m) y A. centrale MSP5 (MSP5c). Las regiones transmembrana, excluidas de tMSP5m y
tMSP5c, se resaltan con barras grises horizontales. Asterisco ) indica posiciones que tienen un residuo conservado; dos puntos (:) indica conservación
entre grupos de características muy similares; y el punto (.) indica conservación entre grupos de características débilmente similares.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211149.g001
[ 22 ] Las proteínas recombinantes MSP5 (tMSP5m, tMSP5c y tMSP5cm) se expresaron con alta eficiencia en E. coli, y más del
95% de la proteína recombinante era soluble en el citoplasma bacteriano. La cantidad de proteína expresada fue de
aproximadamente 40 mg, 60 mg y 60 mg por litro de cultivo para tMSP5m, tMSP5c y tMSP5cm, respectivamente. La etiqueta
His de C-terminal añadida a las proteínas nos permitió purificar grandes cantidades de proteína pura (> 95%) en un solo paso ( Figura
2)
La inmunorreactividad de tMSP5m, tMSP5c y tMSP5cm se demostró mediante transferencia Western con el mAb
ANAF16C1, que detectó las tres proteínas recombinantes. ( Fig. 3 )
Anaplasma estado de infección basado en resultados de nPCR
Anaplasma spp. Se seleccionaron muestras positivas y se clasificaron utilizando nPCR como método estándar de oro. Solo 226 muestras
de ADN de 255 vacas nacidas y criadas en un área altamente anémica de anaplasmosis fueron positivas para nPCR A. marginale y
negativo para A. centrale. Todos los bovinos vacunados analizados (n = 173) fueron positivos para A. centrale y negativo para A.
marginale, y todas las vacas nacidas y criadas en una granja históricamente libre de anaplasmosis fueron negativas para nPCR para
ambas cepas (n = 216).
Detección de anticuerpos por ELISA
Según los resultados de nPCR, 226, 173 y 216 muestras de suero de A. marginale infectado,
A. centrale vacunado y A. marginale / A. Centrale El ganado negativo, respectivamente, se utilizó para comparar las pruebas cELISA.
Fig. 2. SDS-PAGE de fracciones de la purificación de tMSP5cm, tMSP5c y tMSP5m en una columna de Ni-NTA.
Lane MW, marcadores de peso molecular; carriles 1 y 2, fracciones insolubles y solubles posteriores a la inducción del lisado celular, respectivamente; los carriles 3
corresponden a la fracción de proteína purificada con imidazol 100 mM. La mancha fue Coomassie Brilliant Blue R-250.

Fig. 3. Western blot de tMSP5cm purificado (carril 1), tMSP5c (carril 2) y tMSP5m (carril 3) revelado con el anticuerpo monoclonal
ANAF16C1.
La distribución de frecuencia de% I para ccELISA y hcELISA-tMSP5m en bovinos infectados o vacunados y no

infectados se muestra en Higo 4 . Los sueros negativos y positivos tuvieron un% I medio de 15 y 68 por hcELISA-tMSP5m y
2 y 66 por ccELISA, respectivamente. El análisis ROC mostró valores de punto de corte de 30% I con 95.5% de sensibilidad
y 99.5% de especificidad para hcELISA-tMSP5m y 28% I con 95.5% de sensibilidad y 96.3% de especificidad para ccELISA.
El acuerdo entre los resultados de ccELISA y hcELISA-tMSP5m fue del 97% con un kappa valor de
0,94. Se detectaron un total de 29 resultados falsos positivos y 8 falsos negativos con hcELISA-MSP5m y / o ccELISA, solo
7 de ellos coincidieron en ambas pruebas ( tabla 1 )
Fig. 4. Distribución de frecuencia de los valores de hcELISA-tMSP5m y ccELISA de no infectados (barras grises); y ganado infectado o vacunado (barras
negras). El punto de corte (línea de puntos) fue 28 y 30% I para ccELISA y hcELISA-tMSP5m, respectivamente. Las muestras de prueba con> 28 y> 30% I fueron
positivas para ccELISA y hcELISA-tMSP5m, respectivamente.

Tabla 1. Resultados falsos negativos y falsos positivos por ccELISA (MBP-MSP5) vs hcELISA (tMSP5m) para Anaplasma spp. detección de anticuerpos
Infectado (FN) No infectado (FP)
Total (n = 399) A. marginale ( n = 226) A. centrale ( n = 173) n = 216
ccELISA y hcELISA-tMSP5m 7 (1,7%) 4 (1,8%) 3 (1.7) 0 (0.0%)
ccELISA 11 (2,8%) 7 (3,1%) 4 (2,3%) 8 (3,7%)
hcELISA-tMSP5m 11 (2,8%) 2 (0.9%) 9 (5,2%) 1 (0,5%)
Número y proporción de reacciones falsas negativas (FN) y falsas positivas (FP) en sueros de bovinos infectados con Anaplasma marginale o vacunado con A. centrale
(n = 399) y ganado no infectado (n = 216).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211149.t001
Comparación entre ccELISA y hcELISA

La hcELISA basada en las variantes truncadas de MSP5 tMSP5m, tMSP5c o tMSP5cm mostró mayor sensibilidad y
especificidad que la ccELISA basada en el antígeno MBP-MSP5. La especificidad fue la misma para las tres versiones
(99.5%) y la sensibilidad fue del 95.5%, 96.2% y 97.2% para hcELISA-tMSP5m, hcELISA-tMSP5cm y hcELISA-tMSP5c,
respectivamente. El mejor rendimiento se observó con hcELISA-tMSP5c y la mayor diferencia se obtuvo cuando el
ganado infectado y vacunado se analizó por separado ( Tabla 2 ) El porcentaje de inhibición medido por ccELISA y
hcELISA en ganado infectado y no infectado se muestra en Fig. 5A ; esos niveles para el ganado infectado con A.
marginale o vacunado con A. centrale se muestran en Fig. 5B . Para la población negativa, la mediana de los valores
de% I de hcELISA-tMSP5c y hcELISAtMSP5cm fueron similares y estadísticamente diferentes de hcELISA-tMSP5m y
ccELISA (p <0,0001). Para la población positiva, la mediana de los valores de% I de hcELISA-tMSP5m,
hcELISA-tMSP5cm y ccELISA fueron similares y estadísticamente diferentes de hcELISAtMSP5c (<0.0001) ( Tabla 3 )
Discusión
En este trabajo, MSP5 truncado de A. marginale y A. centrale se expresó sin una proteína chaperona, con alto
rendimiento, solubilidad y pureza, sin perder la inmunoreactividad. El reemplazo de MBP-MSP5 de A. marginale en el
ccELISA con cualquiera de las tres variantes del MSP5 truncado de A. marginale ( tMSP5m) o A. centrale ( tMSP5c) o
ambos juntos como proteína de fusión (tMSP5cm) mejoraron el rendimiento de hcELISA, particularmente al aumentar
la especificidad, que se logró eliminando las reacciones cruzadas contra MBP.
Actualmente, ccELISA se utiliza en Argentina para identificar rebaños de ganado con inestabilidad enzoótica para la
anaplasmosis, que deben ser protegidos por A. centrale vacuna viva y para evaluar la respuesta inmune después de la vacunación [ 13
, 25 , 26 ] A. marginale MSP5 ha demostrado distintivo
Tabla 2. Sensibilidad y especificidad de cELISA comercial (ccELISA) y tres versiones de en la casa Desarrollo de cELISA (hcELISA) para el diagnóstico serológico de bovinos infectados con Anaplasma marginale o
vacunado con A. centrale.
Antígeno (punto de corte) hcELISA ccELISA
tMSP5m (% tMSP5c (% tMSP5cm (% MBP-MSP5 (%

I> 30) I> 29) I> 29) I> 28)
Especificidad (%) 99,5 99,5 99,5 96,3
Sensibilidad (%) 95,5 97,2 96,2 95,5
Sensibilidad (%) 97,3 95,6 95,6 95,1
Sensibilidad (%) 93,1 99,4 97,1 96,0
% I: porcentaje de inhibición.

Fig. 5. Resultados de inhibición porcentual obtenidos por hcELISA-tMSP5m (Am), -tMSP5c (Ac), -tMSP5cm (Acm) y ccELISA (C). UNA) Anaplasma spp.
nPCR ganado negativo y positivo, y B) A. marginale- infectado (izquierda) y A. centrale- ganado vacunado (derecho). Los valores de corte para ccELISA y hcELISA
se indican con una línea continua y una línea de puntos, respectivamente.
atributos para ser considerado la proteína de elección para el diagnóstico de anaplasmosis. MSP5 está codificado por un solo gen de
copia, conservado en A. marginale aislados de diferentes orígenes geográficos, y muestra una alta identidad con MSP5 de otras
especies de Anaplasma [ dieciséis - 18 años ] Knowles y col. (1996) desarrollaron un cELISA basado en la proteína de fusión
MBP-MSP5 y el mAb ANAF16C1, que fue validado utilizando sueros de A. marginale ganado infectado de forma natural o
experimental [ 14 ] Esta prueba también se ha utilizado para detectar anticuerpos contra A. centrale;
Tabla 3. Rango medio e intercuartil de porcentaje de inhibición (% I) calculado para cada una de las tres versiones de hcELISA y ccELISA para detectar anticuerpos en bovinos infectados naturalmente con A. marginale vacunado
con A. centrale y en ganado no infectado.
hcELISA (% I) ccELISA (% I)
Antígeno tMSP5m tMSP5c tMSP5cm MBP-MSP5
Ganado negativo (n = 216) 16 (9–22) si 9 (4–17) una 9 (5–17) una 1 (-7-9) C
Ganado positivo (n = 399) 71 (52–87) una 87 (61–95) si 72 (54–85) una 70 (53–82) una
Infectado (n = 226) 77 (62–91) una 82 (52–92) una 75 (56–89) una 74 (56–85) una
Vacunados (n = 173) 57 (43–77) una 93 (78–97) si 69 (52–81) una 66 (48-79) una
Entre paréntesis: rango intercuartil. Dentro del mismo grupo de ganado, las diferentes letras de superíndice que siguen los valores indican significancia estadística (p <0.0001).

sin embargo, su rendimiento real no se ha estudiado en este contexto. A pesar de su utilidad, la prueba tiene algunas
desventajas inherentes a la proteína de fusión que afecta la especificidad [ 14 , 19 ]
Sobreexpresión de la proteína MSP5 de longitud completa en E. coli produce cuerpos de inclusión insolubles. Expresión de alto
nivel de muchas proteínas recombinantes en E. coli conduce a la formación de proteínas altamente agregadas comúnmente
conocidas como cuerpos de inclusión. La solubilidad de los antígenos recombinantes es un requisito para desarrollar una prueba de
diagnóstico serológico. Para este propósito, los agregados de proteínas deben solubilizarse y replegarse, con el inconveniente
adicional de que solo se recupera una pequeña fracción de la proteína inicial [ 27 ] Se han desarrollado varios reactivos (nuevos
vectores, cepas del huésped) y estrategias (coexpresión de chaperona, inducción a baja temperatura, composición de los medios
de cultivo) para optimizar la expresión soluble de proteínas recombinantes en E. coli [ 28 ] Knowles y col. (1996) evitaron la
precipitación de MSP5 en cuerpos de inclusión mediante la coexpresión con la molécula de chaperona MBP, que aumentó la
solubilidad y el replegamiento, mejorando el rendimiento de la proteína recombinante soluble [ 14 ] MBP ha demostrado ser más
eficiente para solubilizar las proteínas asociadas que GST y tiorredoxina (Trx), otras dos proteínas de chaperón de uso común [ 29 ]
Sin embargo, MBP está involucrado en el sistema de maltosa / maltodextrina de E. coli e interfiere con la prueba de diagnóstico [ 19 ]
Esta bacteria ubicua es a menudo la causa de infecciones entéricas y mamarias en bovinos, y provoca anticuerpos contra la MBP.
Por lo tanto, los sueros analizados por cELISA basados en MBP-MSP5 requieren una adsorción previa con MBP para evitar
reacciones falsas positivas [ 14 ] La sensibilidad y especificidad reportadas para ccELISA en A. marginale El ganado infectado
naturalmente varió de acuerdo con el estándar de oro utilizado para la clasificación bovina, con una sensibilidad que oscila entre
65.2% y 99.2% y especificidad
83,3% a 99,5% [ 10 , 15 , 30 ]
los en silico El análisis mostró que la condición más favorable para expresar la proteína MSP5 recombinante soluble era
sin su región transmembrana. La clonación y expresión de proteínas recombinantes sin la región transmembrana puede
aumentar drásticamente los niveles de expresión y la solubilidad de las proteínas heterólogas expresadas en E. coli [ 31 ] El
reemplazo de la proteína de fusión MBP-MSP5 en ccELISA con proteínas MSP5 truncadas (tMSP5m, tMSP5c o tMSP5cm)
redujo el tiempo de ejecución y aumentó la sensibilidad y la especificidad de la prueba para detectar anticuerpos contra
ambos A. marginale y A. centrale. Los nuevos antígenos cumplieron los requisitos para determinar el estado epidemiológico de
Anaplasma spp. en el área endémica donde no se requiere discriminación entre estas especies.
En este trabajo, la expresión de la MSP5 truncada sin hélice transmembrana N-terminal (residuos 1–27) de A.
marginale ( tMSP5m), A. centrale ( tMSP5c) o proteína de fusión (tMSP5cm) se obtuvo en la fracción soluble con
alta pureza en un solo paso y no formó agregados durante su conservación. Chung y col. (2014) expresó
GST-MSP5 en
E. coli solubilizando la hélice transmembrana en micelas de detergente y la fracción soluble bruta se usó en un ccELISA para
detectar anticuerpos contra A. marginale. El reemplazo de MBP-MSP5 con GST-MSP5 mostró una mayor especificidad, una
sensibilidad comparable y una resolución mejorada del ccELISA [ 19 ] Sin embargo, no se informó el rendimiento, la
estabilidad y la facilidad de producción de la proteína de fusión; La eficacia de esta prueba para identificar el ganado
vacunado con A. centrale tampoco fue reportado. El ccELISA se desarrolló en los Estados Unidos, donde A. centrale no es
presente. En Argentina, así como en otros países, la cepa de vacuna de A. centrale se usa en cohortes de terneros de hasta
10 meses de edad en áreas con inestabilidad enzoótica y en terneros de zonas libres de anaplasmosis que se trasladarán a
una región endémica [ 32 - 34 ]
Un cELISA basado en crudo A. centrale el antígeno pudo discriminar A. marginale en ganado infectado naturalmente de A.
centrale en bovinos vacunados con 97.3% o 98.6% de sensibilidad para ganado de carne y leche, respectivamente, y 98.8% de
especificidad para ambos. Sin embargo, los antígenos crudos son difíciles de estandarizar y no hay pruebas comerciales disponibles
para ese propósito [ 35 ]

Los nuevos antígenos, que carecen de una proteína chaperona, nos han permitido simplificar el protocolo ccELISA (antígeno
MBP-MSP5), evitando el paso de adsorción de suero utilizado para eliminar la mayoría de las reacciones falsas positivas. Las tres
versiones de hcELISA mostraron un mejor rendimiento que ccELISA en ganado infectado con A. marginale así como en aquellos
inmunizados con A. centrale. La alta especificidad (99.5%) observada para hcELISA-tMSP5m, -tMSP5c y tMSP5mc, reveló la
eliminación de las reacciones cruzadas detectadas por ccELISA, incluso después de la adsorción de suero con MBP.
La hcELISA mostró una sensibilidad idéntica (hcELISA-tMSP5m) o superior (hcELISA-tMSP5c y - tMSP5cm) que la
detectada por ccELISA. Curiosamente, la sensibilidad más alta fue detectada por hcELISA-MSP5c, seguido por
hcELISA-tMSP5cm, ambos incluidos MSP5 de A. centrale. Cuando los sueros de bovinos infectados y vacunados se
evaluaron por separado, la sensibilidad y los valores medios del% I (hcELISA) aumentaron cuando se usaron antígenos
homólogos. El uso de la proteína de fusión (tMSP5cm) aumentó la sensibilidad general al mejorar el nivel de detección en
el grupo vacunado.
En conclusión, la proteína MSP5 truncada permitió un aumento en la especificidad de cELISA al 99.5% y la

generación de una proteína de fusión entre A. centrale y A. marginale
La proteína tMSP5 permitió un aumento en la sensibilidad de cELISA cuando se analizaron los animales vacunados.
Expresiones de gratitud
La revisión del estilo inglés por Jorgelina Brasca y la asistencia estadística de Marcelo Signorini son muy
reconocidas.
Contribuciones de autor
Conceptualización: Mari á E. Primo.
Conservación de datos: Mariá E. Primo.
Análisis formal Mari á E. Primo.
Adquisición de fondos: Mari á E. Primo, Susana T. de Echaide.
Investigación: Mari á E. Primo, Carolina S. Thompson, Atilio J. Mangold.
Metodología: Beatriz S. Valentini, Macarena Sarli, Marı á B. Novoa.
Administración de proyecto: Mari á E. Primo.
Supervisión: Mari á E. Primo.
Visualización: Mari á E. Primo.
Escritura - borrador original: Mari á E. Primo.
Redacción - revisión y edición: Carolina S. Thompson, Susana T. de Echaide.
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ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Desarrollo de una nueva proteína de fusión con

ACCESO ABIERTO Resumen

INTA EEA Rafaela Asoc. Cooperativa. 426100. Los financiadores no tuvieron

ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos,

la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen

PLOSONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211149 23 de enero de 2019 1/13

sensibilidad y especificidad para la detección de portadores de anaplasmosis [ 4 4 ]

PLOSONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211149 23 de enero de 2019 2/13

y se mantuvieron a -20 ° C hasta su uso.

50 μl de agua destilada y se mantuvieron a -20 ° C hasta su uso.

específicamente para cada especie de Anaplasma [ 20 ] Infección de terneros vacunados con A.

PLOSONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211149 23 de enero de 2019 3/13

En silico análisis de MSP5

Alineación de secuencia, presentación y determinación del porcentaje de identidad entre A. marginale

Clonación de truncado msp5 gen de A. marginale y A. centrale

Expresión y purificación de proteínas.

PLOSONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211149 23 de enero de 2019 4/13

Western blot para tMSP5m, tMSP5c y tMSP5cm

tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina (DAB) (Sigma-Aldrich, EE. UU.).

de muestras de suero durante 1 h. Posteriormente, se utilizaron el mismo protocolo y reactivos de ccELISA.

Análisis de los datos

% yo ¼ 100 ½ 1- re Muestra OD = Control Negativo OD Þ

protocolos cELISA se evaluaron mediante una prueba de MannWhitney.

Expresión, purificación y control de calidad de proteínas recombinantes.

La comparación de la secuencia de la proteína MSP5 de A. marginale y A. centrale ( MSP5m y MSP5c, respectivamente)

PLOSONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211149 23 de enero de 2019 5/13

Anaplasma estado de infección basado en resultados de nPCR

ambas cepas (n = 216).

Detección de anticuerpos por ELISA

PLOSONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211149 23 de enero de 2019 6/13

La distribución de frecuencia de% I para ccELISA y hcELISA-tMSP5m en bovinos infectados o vacunados y no

PLOSONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211149 23 de enero de 2019 7/13

Infectado (FN) No infectado (FP)

Total (n = 399) A. marginale ( n = 226) A. centrale ( n = 173) n = 216

ccELISA y hcELISA-tMSP5m 7 (1,7%) 4 (1,8%) 3 (1.7) 0 (0.0%)

ccELISA 11 (2,8%) 7 (3,1%) 4 (2,3%) 8 (3,7%)

hcELISA-tMSP5m 11 (2,8%) 2 (0.9%) 9 (5,2%) 1 (0,5%)

(n = 399) y ganado no infectado (n = 216).

Comparación entre ccELISA y hcELISA

, 25 , 26 ] A. marginale MSP5 ha demostrado distintivo

Antígeno (punto de corte) hcELISA ccELISA

tMSP5m (% tMSP5c (% tMSP5cm (% MBP-MSP5 (%

Especificidad (%) 99,5 99,5 99,5 96,3

Sensibilidad (%) 95,5 97,2 96,2 95,5

Sensibilidad (%) 97,3 95,6 95,6 95,1

Sensibilidad (%) 93,1 99,4 97,1 96,0

PLOSONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211149 23 de enero de 2019 8/13

Antígeno tMSP5m tMSP5c tMSP5cm MBP-MSP5

Ganado negativo (n = 216) 16 (9–22) si 9 (4–17) una 9 (5–17) una 1 (-7-9) C

Vacunados (n = 173) 57 (43–77) una 93 (78–97) si 69 (52–81) una 66 (48-79) una

PLOSONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211149 23 de enero de 2019 9/13

65.2% y 99.2% y especificidad

para ese propósito [ 35 ]

PLOSONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211149 23 de enero de 2019 10/13

En conclusión, la proteína MSP5 truncada permitió un aumento en la especificidad de cELISA al 99.5% y la

Conceptualización: Mari ´a E. Primo.

Conservación de datos: Mari´a E. Primo.

Análisis formal Mari ´a E. Primo.

Adquisición de fondos: Mari ´a E. Primo, Susana T. de Echaide.

Investigación: Mari ´a E. Primo, Carolina S. Thompson, Atilio J. Mangold.

Metodología: Beatriz S. Valentini, Macarena Sarli, Marı ´a B. Novoa.