Bacteriología

Morfología, tinciones y medios de cultivo

BACTERIAS
Son un grupo diverso de microorganismos unicelulares, procariotas, que se pueden
encontrar prácticamente en cualquier ambiente (suelos, aguas, aire)

 No poseen membrana nuclear

 Único cromosoma circular
 Poseen pared celular compuesta de peptidoglicano
 Se dividen por fisión binaria
 Apéndices: Flagelos, pilis y fimbrias

ENVOLTURA BACTERIANA

Las estructuras externas de la bacterias están compuestas por

 Membrana celular: Consiste en una bicapa lipídica similar a otras membranas

biológicas
 Pared celular: Ubicada por fuera de la membrana plasmática. Compuesta por
peptidoglicano o mureína.
El peptidoglicano o mureína es un gran polímero compuesto por dos
aminoazúcares: N-acetilglucosamina y N-acetilmurámico; unidos entre sí de
manera alternante. Una cadena peptídica de cuatro aminoácidos está conectada a
un N-acetilmurámico. A su vez estos tetrapéptidos entre sí por puentes de
pentaglicina. (conocer esta estructura es fundamental para entender el
funcionamiento de muchos antibióticos)
  Cápsula: Algunas bacterias presentan una cápsula por fuera de la pared
compueta por polisacáridos

Como vamos a ver en la tinción de gram, a la mayoría de las bacterias las vamos a dividir
en gram positivas y gram negativas ya que se tiñen de forma distinta debido a las
diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares.
La pared de la célula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas
de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. La pared de la célula gram-negativa,
por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y
está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y
lipoproteínas. (las bacterias gram negativas poseen membrana externa)
Morfología
La mayoría de las bacterias se presentan en estas formas básicas:

1. Cocos: Bacterias de forma más o menos esférica

2. Bacilos: Bacterias de forma cilíndrica
3. Cocobacilos: se presentan como bacilos pequeños y redondeados
4. Vibriones: Bacterias curvas (en forma de coma).
5. Espiroquetas: son microorganismos helicoidales y flexibles.

Disposición

Los cocos se pueden disponer en:

 Diplococos: que son los cocos que permanecen en pares luego de la división.
 En cadenas: luego de la división permanecen en cadenas de cuatro o más células.
 Tétradas: Son agrupaciones de cuatro cocos en una disposición cuadrada
 En racimos: Se agrupan en forma de racimos, no siguen un patrón regular de
orientación en divisiones sucesivas.
Los bacilos a su vez puede disponerse
 En empalizada: un bacilo al lado del otro
 En V: formando la letra V
 En letras chinas: Formando letras chinas

TINCIONES

Las tinciones en microbiología son las primeras herramientas que se utilizan en el

laboratorio para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. La tinción de Gram se
considera básica en la valoración inicial de muestras para análisis bacteriológico, mientras
que la tinción de Ziehl-Neelsen, que se utiliza para el diagnóstico de enfermedades como
la tuberculosis o la actinomicosis

TINCIÓN DE GRAM

Es definida como una tinción diferencial, ya que utiliza dos colorantes y clasifica a las
bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram negativas y bacterias Gram positivas.
Los principios de la tinción de Gram están basados en las características de la pared
celular de las bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes a cada
microorganismo. La pared celular de las bacterias Gram negativas está constituida por
una capa fina de peptidoglicano y una membrana celular externa, mientras que las
bacterias Gram positivas poseen una pared celular gruesa constituida por peptidoglicano,
pero no cuentan con membrana celular externa. La tinción de Gram se basa en colocar
como colorante primario cristal violeta (de color violeta), el cual tiene afinidad con el
peptidoglicano de la pared bacteriana. Posteriormente, se coloca lugol, el cual sirve como
mordiente e impide la salida del cristal violeta por la formación de un complejo cristal
violeta-yodo que satura los espacios del peptidoglicano de la pared bacteriana. En
seguida, se coloca una mezcla de alcohol-acetona, la cual deshidrata la pared bacteriana
y cierra los poros de la misma, también destruye la membrana externa de las bacterias
Gram negativas debido a que ésta es soluble a la acción de solventes orgánicos, como la
mezcla de alcoholacetona.
Las bacterias Gram positivas, al contener una gran cantidad de peptidoglicano, retienen
con mayor fuerza este complejo, mientras que las Gram negativas no lo pueden retener
por tener menos cantidad de peptidoglicano. Por último, se coloca fuscina o safranina (de
color rosa) la cual funciona como un colorante secundario o de contratinción y sirve para
teñir las bacterias que no pudieron retener el complejo cristal violeta-yodo.
De esta manera las bacterias Gram positivas que retuvieron el primer colorante se ven
de color violeta mientras que las bacterias Gram negativas que no lo retuvieron se tiñen
con el segundo colorante (fuscina) y se ven de color rosa.

PASO 1 PASO 2 PASO 3 PASO 4

TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN

La tinción de Ziehl-Neelsen es la técnica comúnmente usada en el diagnóstico de

micobacterias. Esta tinción permite diferenciar a las bacterias en dos grupos: aquellos que
son capaces de resistir la decoloración con alcohol-ácido y aquellos que no lo son. Las
bacterias que resisten esta decoloración se denominas ACIDO ALCOHOL
RESISTENTES. El fundamento de la tinción se basa en que bacterias acido alcohol
resistentes contienen gran cantidad de ácidos micólicos.
Los pasos de la tinción de Zihel Nelseen son:
1. Fijación
2. Coloración con fuscina
3. Calor con llama
4. Decoloración con alcohol ácido
5. Coloración con azul de metileno

La tinción se basa en colocar fucsina (color fucsia) y calentar la preparación

ligeramente para solubilizar lípidos y otros ácidos grasos de la pared celular para que
permita el paso libre del colorante, el cual tiene una enorme afinidad por los ácidos
micólicos presentes en la pared. Al enfriar, los componentes de la pared vuelven a
solidificar, resistiendo la acción abrasiva del alcohol-ácido, y el azul de metileno se
utiliza como contratinción.
De esta forma las bacterias ácido alcohol resistentes se ven fucsias, mientras que las
que no lo son se ven azules
Las micobacterias por ser bacilos son llamados comúnmente Bacilos ácido alcohol
resistentes (BAAR)

BAAR, Se ven fucsias con los componentes de fondo teñidos de azul

MEDIOS DE CULTIVOS

El medio de cultivo es aquel que contiene agua y una serie de nutrientes, necesarios para
permitir el crecimiento de microorganismos en el laboratorio. Normalmente se utilizan
placas de Petri con agar más nutrientes específicos (según el microorganismo que se
desea aislar), aunque también existen medios de cultivo en tubo.

En la foto aparece un medio de cultivo sólido en placa de Petri y, en el fondo, medios de

cultivo en tubo.
No todos los microorganismos son cultivables en el laboratorio, pero sí una enorme
cantidad de ellos. Existen diferentes medios de cultivo que presentan los nutrientes
necesarios para los distintos requerimientos de las bacterias.
Tipos de medios de cultivo

Según la proporción de agar, existen tres tipos:

 Líquidos (caldos). No contiene ningún agente gelificante, por lo que los
microorganismos crecen por todo el medio. El crecimiento en este tipo de medios
es más rápido puesto que la movilidad permite acceder de una forma más fácil a
los nutrientes.
 Sólidos. Tienen una proporción de agar de, aproximadamente, el 1,5%. El
crecimiento se desarrolla en la superficie del medio. Estos medios pueden
depositarse en placas de Petri o en tubos de ensayo.
 Semisólidos. Son aquellos que contienen una proporción de agar inferior al 0,5%.
Se utilizan para pruebas bioquímicas y de movilidad.

En microbiología diagnóstica existen cuatro tipos, según su utilidad:

 Nutritivos. Permiten el crecimiento de la mayoría de los microorganismos, por ser
muy generales. Como ejemplo de este tipo de medios están el agua de peptona y
el caldo de tripticasa-soja.
 De enriquecimiento. Contienen componentes adicionales (además de los
básicos) para permitir el desarrollo de microorganismos exigentes, que no
crecerían en un medio general.
 Selectivos. Presentan algún componente que impide el desarrollo de
microorganismos no deseados. Esto hace que el microorganismo que se desea
cultivar lo haga con mayor facilidad. Por ejemplo, el agar MacConkey contiene
cristal violeta, que inhibe el crecimiento de bacterias grampositivas y hongos,
facilitando el desarrollo de bacterias gramnegativas.
 Diferenciales. Contienen sustancias que ponen de manifiesto alguna
característica de la especie o grupo de microorganismos. Por ejemplo, el agar
 MacConkey contiene lactosa y rojo neutro (como indicador); las bacterias
fermentadoras de lactosa (lactosapositivas) aparecen de color rosa intenso,
mientras que las no fermentadoras de lactosa son incoloras.

Medios de cultivo frecuentemente utilizados en microbiología

Agar sangre. Permite el crecimiento de la mayoría de las bacterias con importancia

clínica. Está compuesto por un medio base rico en nutrientes más un suplemento de
sangre animal en una proporción del 5-10 %.
Es un medio diferencial porque permite comprobar si las bacterias son hemolíticas,
es decir, si tienen capacidad para romper los glóbulos rojos presentes en el medio.
Existen tres tipos de hemólisis:
 Betahemólisis. Consiste en la lisis o eliminación total de los glóbulos rojos. Esto
general un halo transparente en la zona donde crece este tipo bacteriano. En este
caso se habla de bacterias betahemolíticas.
 Alfahemólisis. Lisis parcial de los glóbulos rojos, desarrollando un halo verdoso
en torno a las zonas donde crecen estas bacterias (alfahemolíticas).
 Gammahemólisis. Es la ausencia de hemólisis.

Agar chocolate. Es un medio enriquecido muy parecido al agar sangre; la diferencia es

que los glóbulos rojos están lisados y liberan al medio nutrientes como la hemoglobina,
factor X (hemina) y factor V (NAD). La hemólisis le confiere un color marrón característico
parecido al del chocolate, de ahí su nombre. Se utiliza para el cultivo de bacterias
exigentes que necesitan estos factores para su desarrollo, como es el caso las especies
del género Haemophilus. (muy importante!! Esta bacteria no crece en agar sangre..
Requiere factor X y V)
Agar MacConkey. Es un medio diferencial y selectivo muy utilizado para el aislamiento
e identificación de enterobacterias (bacilos gramnegativos). Llevan en su composición
sales biliares y cristal violeta que inhiben el crecimiento de grampositivos y hongos.
Contienen también lactosa y rojo neutro como indicador de pH. Las bacterias
fermentadoras de lactosa (lactosa+) acidifican el medio y adquieren un color rosado
(por ejemplo, E. coli), mientras que las no fermentadoras de lactosa (lactosa–) aparecen
incoloras (por ejemplo, Salmonella).

Agar S-S (Salmonella y Shigella). Es un medio selectivo y diferencial para el

aislamiento y diferenciación de especies del género Salmonella y Shigella. Entre otros
componentes, tiene sales biliares que retrasan el crecimiento de otras bacterias,
favoreciendo el desarrollo de especies de Salmonella y Shigella, agentes productores de
diarreas.
Agar Thayer-Martin. Es un medio de enriquecimiento, que además es selectivo para
varias especies de Neisseria como N. gonorrhoeae (agente causal de la gonorrea) y N.
meningitidis o meningococo (uno de los agentes causales de meningitis).

Agar CLED (cistina-lactosa deficiente en electrolitos). Es un medio diferencial

utilizado para aislar microorganismos del tracto urinario en muestras de orina
(urocultivos). Las colonias amarillas pertenecen a bacterias lactosa+, como por ejemplo E.
Coli, y las colonias verdes, azules e incoloras a bacterias lactosa–.
Medios para hemocultivo. Son medios de enriquecimiento que favorecen el
crecimiento de bacterias presentes en la sangre. Se utilizan para detectar bacteriemia
(infección del torrente sanguíneo). Estos medios se comercializan en “frascos o botellas
de hemocultivo”. Actualmente existen equipos automatizados para la incubación de
hemocultivos y para la detección del crecimiento microbiano.