UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL DE LOS LLANOS CENTRALES

"RÓMULO GALLEGOS"
DECANATO DEL ÁREA CIENCIAS DE LA SALUD PROGRAMA DE MEDICINA
"DR. JOSÉ FRANCISCO TORREALBA”

MICROBIOLOGÍA Y MEDIOS DE CULTIVO

Trabajo de investigación presentado como requisito de evaluación
de la Carrera de Medicina protocolo Universidad en Casa

Autores:
Jeanmary Mendoza

Tutor:
Dra. Nancy Gutiérrez

San Juan de los Morros, Agosto, 2020

 RESUMEN

Los medios de cultivo representan técnicas utilizadas en microbiología para proporcionar a

los microorganismos un entorno adecuado para desarrollarse. Para lograr eso debemos
tomar en cuenta varios aspectos bioquímicos: nutrientes, pH, temperatura, aireación,
concentración de sales y fuerza iónica del medio. Los cultivos suelen usarse en estudios
microbiológicos de materiales naturales o para aislar un microorganismo en particular. En
este sentido los medios de cultivo pueden clasificarse de diversas formas: selectivos, no
selectivos, enriquecidos, diferenciales, naturales, sintéticos, semisintéticos, medios vivos,
líquidos, sólidos, semisólidos y especializados, entre otros.

Para la realización de un cultivo es necesario seguir ciertas instrucciones sin dejar nunca de
lado la respectiva técnica aséptica, así se evitan errores o contaminación del mismo. En la
identificación de especies de deben tomar en cuenta características de las colonias,
genómicas y bioquímicas. De esta forma el medio de cultivo constituye un método útil para
identificar una gran variedad de microorganismos.
 INTRODUCCIÓN

La microbiología como ciencia tiene muchos métodos diagnósticos, entre ellos, tenemos los
medios de cultivo, una técnica muy útil en caso de enfermedades causadas por
microorganismos, ya sean bacterias, virus u hongos. El uso de medios de cultivo remonta
sus inicios a los experimentos realizados por Koch y Pasteur. En sus investigaciones
lograron identificar ciertos medios, con determinados elementos permitían el crecimiento
de formas bacterianas. Pero por supuesto, estos medios tienen características especiales que
deben adaptarse a las exigencias de cada microorganismo. Con la evolución de la
microbiología hoy en día se conocen los requerimientos nutricionales, la constitución
genética y la biología de los distintos gérmenes existentes.

En base a esto, sabemos que hay especies que proliferan en medios más ácidos y otros en
medios alcalinos, unos bajo ciertas exigencias de oxígeno (aerobios) o no (anaerobios),
como existen formas que pueden desarrollarse en ambos medios. Algunas bacterias por
ejemplo, tienen la capacidad de atacar los glóbulos rojos y destruirlos (hemolisis) y en
consecuencia producen ciertas características fenotípicas en un medio, por ello se ha
desarrollado cultivos que cumplan con la presencia de sangre. Asimismo, hay
microorganismos que requieren de nutrientes, compuestos en específicos, temperatura y
fuentes de energía para crecer adecuadamente.

Por lo general los microorganismos tienen la capacidad de formar colonias, sin embargo,
para esto existen distintos medios que se han elaborado con la finalidad de permitir de
alguna manera fijarlos y poder estudiarlos, confirmando el tipo de germen, así, estos
medios de cultivo pueden ser selectivos, no selectivos, diferenciales (por ejemplo el agar
sangre, el agar chocolate, agar McConkey, Lowenstein Jensen, por nombrar algunos). Por
supuesto, para realizar el cultivo es necesario que se haga en un medio previamente
esterilizado y con las condiciones adecuadas. En algunos casos existen faltas en la técnica
aséptica, por ende en el cultivo se aislaran otros contaminantes no deseados.
 MICROBIOLOGÍA Y MEDIOS DE CULTIVO

En líneas generales, el cultivo en microbiología implica un proceso mediante el cual se

proporciona a los microorganismos el medio y las condiciones adecuadas para su
proliferación o crecimiento, recordando que en fase de proliferación, estos son capaces de
replicarse a sí mismos. Sin embargo, hay que destacar que, para poder proporcionar un
medio adecuado donde los microorganismos puedan replicarse hay que tener en cuenta
varios factores, entre ellos: nutrientes, pH, temperatura, aireación, concentración de sales y
fuerza iónica del medio. Todos estos son elementos que permiten que un medio sea
realmente eficaz, al favorecer al proceso metabólico de cada especie. En este sentido puede
constituir un buen método para el diagnóstico.

Se puede decir que los antecedentes históricos de la identificación microbiológica se

remontan a 1676, cuando Anton van Leeuwenhoek observo bacterias en el agua utilizando
uno de los primeros microscopios. 200 años después Pasteur cultivó bacterias en
laboratorio en un medio de cultivo creado con levaduras, azúcar y sales de amonio. Para
1881 utilizó agar para solidificar un medio, factor que le permitió el desarrollo de colonias
y su visualización macroscópica. Este fue un hallazgo importante que ha influido en los
laboratorios de microbiología clínica a lo largo de su evolución. Hoy en día, los medios de
cultivo siguen siendo una técnica útil, sin embargo, ha sido reemplazada por otros métodos
como la detección de antígenos y pruebas moleculares.

En muchos casos, constituye una alternativa para especificar el germen; de esta forma, se
realizan todas las pruebas avanzadas pero se opta también por el cultivo ya que en muchas
enfermedades es un hallazgo concluyente, que en consecuencia va a orientar en el
diagnóstico más adecuado.

Se puede decir que los medios de cultivo o cultivo in vitro, es una de las formas más
sensibles y específicas de diagnóstico, por lo que también es el más utilizado. Un medio de
cultivo ha de permitir el crecimiento de la mayoría de bacterias y hongos, no obstante, en el
caso de los microorganismos intracelulares obligatorios (por ejemplo, rickettsias, virus),
solo podrán aislarse en cultivos a partir de células eucariotas vivas. Aun así, al colocar una
sola bacteria en un medio de cultivo con las características apropiadas está ha de
multiplicarse lo necesario para poder observarse. Es posible también, cultivar parásitos pero
esto requiere de procedimientos de laboratorio especiales.

PRINCIPIOS BIOQUÍMICOS

Para entender los requerimientos de los microorganismos, es necesario conocer su

naturaleza bioquímica, cómo están constituidos y cuáles son los requisitos energéticos,
como todo ser vivo, se necesita de energía y nutrientes de forma fundamental para que
puedan crecer, multiplicarse y accionar. Por lo mismo, orientarnos en la estructura y
necesidades del microorganismo nos ayuda a entender su mecánica.

La materia orgánica constituye la mayor parte del peso de los microorganismos, la misma
contiene elementos como carbono, hidrógeno, nitrógeno, oxígeno, fósforo y azufre.
Además, se necesitan iones inorgánicos como potasio, sodio, hierro, magnesio, calcio y
cloruro para facilitar los procesos enzimáticos y mantener los gradientes químicos a través
de la membrana celular. En su mayor parte, la materia orgánica consiste en macromoléculas
formadas por enlaces entre sus bloques de construcción. La síntesis de enlaces anhidro
requiere energía química, la cual es proporcionada por dos enlaces fosfodiéster contenidos
en el trifosfato de adenosina.

La energía adicional necesaria para mantener la composición citoplásmica relativamente

constante durante la proliferación se deriva de la fuerza motriz protónica, que consiste en
energía potencial que puede derivarse del paso de protones a través de una membrana. En
las células eucariotas la membrana puede ser parte de las mitocondrias o de los
cloroplastos. En células procariotas la membrana corresponde a la membrana citoplásmica
de la célula.

La fuerza motriz protónica es un gradiente electroquímico con dos componentes: una

diferencia en pH (concentración de iones hidrógeno) y diferencia en la carga e iónica. La
carga en el exterior de la membrana bacteriana es más positiva que en el interior, y la
diferencia en las cargas contribuye a la liberación de energía libre cuando un protón entra al
citoplasma desde fuera de la membrana. La energía libre puede utilizarse para el
desplazamiento de la célula, para mantener los gradientes iónicos o moleculares a través de
la membrana, para sintetizar enlaces anhidro en el ATP o para diversos propósitos
combinados.

Asimismo, la célula puede utilizar una fuente de ATP con sus enlaces anhidro de energía
para crear una fuerza motriz protónica que a su vez puede utilizarse para desplazar la célula
y conservar los gradientes químicos. Para su desarrollo, un microorganismo requiere todos
los elementos en su materia orgánica y cantidades adecuadas de iones para la producción de
energía y reacciones catalíticas. En este sentido, debe haber una fuente de energía para
establecer la fuerza motriz protónica y permitir la síntesis de macromoléculas. Los
microorganismos varían ampliamente en sus demandas nutricionales y sus fuentes de
energía metabólica.

Fuentes de energía metabólica

Los tres mecanismos principales para la generación de energía metabólica son

fermentación, respiración y fotosíntesis. Para el desarrollo del microorganismo debe
utilizarse al menos uno de estos mecanismos, los cuales se describen a continuación.

Fermentación

La transformación de ATP en la fermentación no se acopla con la transferencia de

electrones. La fermentación se caracteriza por la fosforilación del sustrato, un proceso
enzimático en el cual los enlaces de pirofosfato se donan directamente al trifosfato de
adenosina (ATP) por un intermediario metabólico fosforilado. El intermediario fosforilado
se forma por procesos metabólicos de sustrato susceptibles de fermentación como la
glucosa, lactosa o arginina. La fermentación no se acompaña de cambios en el estado
general de oxidación-reducción del sustrato fermentable y por tanto la composición
elemental de los productos de fermentación debe ser idéntica a la de los sustratos. Por
ejemplo, la fermentación de una molécula de glucosa (C6H12O6) por la vía de Embden-
Meyerhof produce una ganancia neta de dos enlaces de pirofosfato en el ATP y produce
dos moléculas de ácido láctico (C3H6O3).
Respiración

La respiración es análoga a los procesos de acoplamiento dependientes de energía para

descargar una batería. La reducción química de un oxidante (aceptor de electrones) a través
de una serie específica de transportadores de electrones en la membrana establece la fuerza
motriz protónica a través de la membrana bacteriana. El reductor (donador de electrones)
puede ser un compuesto orgánico o inorgánico: por ejemplo, el ácido láctico actúa como
reductor en algunos microorganismos, en tanto que el gas hidrógeno es reductor para otros.
A menudo se utiliza oxígeno gaseoso (O2) como oxidante, pero algunos microorganismos
pueden utilizar oxidantes alternativos como dióxido de carbono (CO2), sulfato (SO42−) y
nitrato (NO3−).

Conocer el mecanismo de respiración de la bacteria es importante al momento del cultivo,

recordando que existen unas que utilizan la respiración aerobia y otros microorganismos
son anaerobios.

Fotosíntesis

La fotosíntesis es similar a la respiración en el sentido de que la reducción de un oxidante a

través de una serie específica de transportadores de electrones establece una fuerza motriz
protónica. La diferencia en los dos procesos consiste en que en la fotosíntesis se crean el
reductor y el oxidante por medios fotoquímicos por medio de energía luminosa absorbida
por los pigmentos en la membrana; así, la fotosíntesis continúa en tanto exista una fuente de
energía luminosa. Las plantas y algunas bacterias son capaces de invertir cantidades
sustanciales de energía luminosa para hacer del agua un reductor para el dióxido de
carbono. El oxígeno participa en este proceso y se produce materia orgánica. La
respiración, la oxidación favorable desde el punto de vista energético de la materia orgánica
por un aceptor de electrones como el oxígeno puede proporcionar a los microorganismos
con capacidad de fotosíntesis energía en ausencia de una fuente luminosa.

Nutrición
La nutrición en medios de cultivo debe contener todos los elementos necesarios para la
síntesis biológica de un nuevo microorganismo, de lo contrario no será posible cultivarlo o
identificarlo adecuadamente.

Fuentes de carbono

Como se mencionó antes con respecto las plantas y algunas bacterias, estas son capaces de
utilizar energía de fotosíntesis para reducir el dióxido de carbono a expensas de agua. Estos
microorganismos pertenecen al grupo de microorganismos autótrofos, seres vivos que no
necesitan nutrientes orgánicos para su desarrollo. Otros microorganismos autótrofos son los
quimiolitótrofos, que utilizan sustratos inorgánicos como hidrógeno y tiosulfato como
reductor y dióxido de carbono como fuente de carbono.

Los microorganismos heterótrofos, para su desarrollo, requieren carbono orgánico que debe
encontrarse en una forma que puedan asimilar. Por ejemplo, el naftaleno proporciona todo
el carbón y energía necesarios para el desarrollo de microorganismos heterótrofos
respiratorios, pero muy pocos microorganismos poseen la vía metabólica necesaria para la
asimilación de naftaleno. Por otra parte, la glucosa puede sustentar el desarrollo mediante
procesos de respiración o fermentación en muchos microorganismos.

Es importante que los sustratos de crecimiento se suministren a niveles apropiados para la

cepa microbiana que se está cultivando: las concentraciones que sostienen el desarrollo del
microorganismo pueden inhibir el desarrollo de otro. El dióxido de carbono es necesario
para varias reacciones de fotosíntesis. Muchos microorganismos respiratorios producen más
del dióxido de carbono necesario para satisfacer sus necesidades, en tanto que otros
requieren fuentes de dióxido de carbono en su medio de cultivo.

Fuentes de nitrógeno

El nitrógeno es un constituyente importante de las proteínas, ácidos nucleicos y otros

compuestos, y constituye casi 5% del peso seco de una bacteria típica. El nitrógeno
inorgánico molecular (N2), es muy prevalente pues constituye casi 80% de la atmósfera
terrestre. Es un compuesto muy estable, principalmente porque se requieren altas
cantidades de energía de activación para romper su triple enlace entre ambos átomos de
nitrógeno. Sin embargo, éste puede proporcionarse en diversas formas y los
microorganismos varían en cuanto a su capacidad para asimilarlo. El producto terminal de
todas las vías para la asimilación de nitrógeno es la forma más reducida del elemento, el
amoniaco (NH3). Cuando se cuenta con NH3, se difunde hacia el interior de la mayor parte
de las bacterias a través de conductos transmembrana como gas disuelto en lugar de forma
de ionamonio (NH4+).

La capacidad de asimilar nitrógeno inorgánico molecular en forma reducida (NH3) como

proceso denominado fijación de nitrógeno, es una propiedad singular de las células
procariotas y muy pocas bacterias son capaces de desdoblar el triple enlace entre ambos
átomos de nitrógeno. Este proceso necesita grandes cantidades de energía metabólica y se
desactiva con facilidad por el oxígeno. La capacidad de fijación de nitrógeno se encuentra
en bacterias muy divergentes que han evolucionado con estrategias bioquímicas bastante
diferentes para proteger sus enzimas fijadoras de nitrógeno de la exposición con el oxígeno.

La mayor parte de los microorganismos pueden utilizar NH3 como única fuente de
nitrógeno y muchos microorganismos poseen la capacidad de producir NH3 a partir de
aminas (R—NH2) o a partir de aminoácidos, por lo general en el interior de la célula. La
producción de NH3 por desaminación de aminoácidos se denomina amonificación. El
amoniaco se introduce en la materia orgánica por vías bioquímicas que incluyen al
glutamato y glutamina.

Muchos microorganismos poseen la capacidad de asimilar nitrato (NO3−) y nitrito (NO2−)

mediante la conversión de estos iones en NH3. Tales procesos se conocen como reducción
de nitratos por asimilación y reducción de nitritos por asimilación, respectivamente. Estas
vías para la asimilación difieren de las vías utilizadas para catabolizar nitratos y nitritos.
Las vías catabólicas utilizadas por microorganismos emplean estos iones como aceptores
terminales de electrones en la respiración. Todavía está en proceso la comprensión del ciclo
del nitrógeno. La reacción NH4+ + NO2− → N2 + 2H2O en la cual un nitrito oxida al
amoniaco, es un proceso microbiano que ocurre en aguas anóxicas en el océano y es la
principal vía por la cual regresa el nitrógeno hacia la atmósfera.

Fuentes de azufre
Al igual que el nitrógeno, el azufre es un componente de muchas sustancias orgánicas de
las células. Forma parte de la estructura de varias coenzimas y se encuentra en las cadenas
laterales de cisteinil y metionil de las proteínas. El azufre en su forma elemental no puede
utilizarse por plantas o animales. Sin embargo, algunas bacterias autótrofas pueden
oxidarse a su forma de sulfato (SO42−). La mayor parte de los microorganismos pueden
utilizar sulfato como fuente de azufre, al reducir el sulfato al nivel de ácido sulfhídrico
(H2S). Algunos microorganismos pueden asimilar H2S directamente del medio de cultivo,
pero este compuesto puede ser tóxico para muchos de ellos.

Fuentes de fósforo

El fosfato (PO43−) es necesario como componente del ATP, ácidos nucleicos y coenzimas
como NAD, NADP y flavinas. Además, muchos metabolitos, lípidos (fosfolípidos, lípido
A), componentes de las paredes celulares (ácido teicoico), algunos polisacáridos capsulares
y algunas proteínas sufren fosforilación. El fosfato siempre se asimila en forma de fosfato
inorgánico libre (Pi).

Fuentes de minerales

Numerosos minerales son necesarios para la función de las enzimas. El magnesio (Mg2+) y
el ion ferroso (Fe2+) también se encuentran en derivados de porfirina: el magnesio en las
moléculas de clorofila, el hierro como parte de las coenzimas de los citocromos y
peroxidasas. Mg2+ y K+ son esenciales para la función e integridad de los ribosomas. El
calcio es necesario como constituyente de las paredes celulares de bacterias grampositivas,
aunque es indispensable para las bacterias gramnegativas. Muchos microorganismos
marinos requieren Na+ para su desarrollo.

Durante la elaboración de un medio para el cultivo de la mayor parte de los

microorganismos, es necesario proporcionar fuentes de potasio, magnesio, calcio e hierro,
por lo general en sus formas iónicas (K+, Mg2+, Ca2+ y Fe2+). Son necesarios muchos
otros minerales, éstos con frecuencia pueden suministrarse en agua corriente o como
contaminantes de otros ingredientes de los medios de cultivo.
La captación de hierro, que forma hidróxidos insolubles a pH neutro, es facilitada en
muchas bacterias y hongos por la producción de sideróforos, compuestos que tienen la
capacidad de generar y favorecer su transporte en forma de complejo soluble. Esto incluye
a los hidroxamatos, conocidos como sideraminas y derivados de catecoles. Los sideróforos
determinados por plásmidos desempeñan una función importante en la capacidad de
invasión de algunos patógenos bacterianos.

Factores de crecimiento

Un factor de crecimiento es un compuesto orgánico que debe contener la célula a fin de

desarrollarse, pero que es incapaz de sintetizar. Muchos microorganismos que reciben los
nutrientes mencionados antes son capaces de sintetizar todos los bloques para la
construcción de macromoléculas: aminoácidos, purinas, pirimidinas y pentosas (precursores
metabólicos de ácidos nucleicos); carbohidratos adicionales (precursores de polisacáridos)
y ácidos grasos y compuestos isoprenoides. Además, los microorganismos de vida libre
deben ser capaces de sintetizar complejos vitamínicos que actúan como precursores de
coenzimas. Cada uno de estos compuestos esenciales se sintetiza por una secuencia de
reacciones enzimáticas; cada enzima se produce bajo el control de un gen específico.

Cuando un microorganismo sufre una mutación genética que da origen a la falla en una de
estas funciones enzimáticas, la cadena se rompe y ya no se elabora el producto terminal. El
microorganismo debe obtener el compuesto de su entorno: el compuesto se transforma en
un factor de crecimiento para el microorganismo. Este tipo de mutación puede inducirse
con facilidad en el laboratorio. Diferentes especies microbianas varían ampliamente en
cuanto a sus necesidades de factores de crecimiento. Los compuestos involucrados se
encuentran y son esenciales en todos los microorganismos; las diferencias en cuanto a
necesidades refleja las diferencias en sus capacidades de síntesis. Algunas especies no
requieren factores de crecimiento, en tanto que otras (como los lactobacilos) perdieron
durante su evolución la capacidad de sintetizar hasta 30 a 40 compuestos esenciales y por
tanto necesitan obtenerlos de su medio ambiente.

Factores ambientales que afectan el crecimiento

Un medio de cultivo adecuado debe contener todos los nutrientes necesarios para el
microorganismo a cultivar y tales factores incluyen pH, temperatura y aireación que deben
ser controlados con gran cuidado. Se utiliza un medio de cultivo líquido; al medio de
cultivo puede añadirse agar o gel de sílice para que adquiera consistencia de gel para
situaciones especiales. El agar es un polisacárido extraído de algas marinas que es singular
para el cultivo microbiano por su resistencia a la acción microbiana y porque se disuelve a
100°C pero no forma placas de gel hasta que se encuentra por debajo de 45°C; las células
pueden suspenderse en el medio a 45°C y enfriar con rapidez dicho medio de cultivo hasta
que adquiera la consistencia de gel, sin lesionar a las bacterias

Otros factores incluyen la humedad adecuada y la luz ambiental. Un nivel mínimo de

humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen
desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el
mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37°C
proporcionando una adecuada fuente de agua que mantenga la humedad necesaria para el
crecimiento de los cultivos y así evitar que se deseque el medio. Por otra parte, la mayoría
de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar.
Hay excepciones evidentes como sería en el caso de los microorganismos fotosintéticos.

Nutrientes

Una vez que se han descrito los nutrientes y sustancias necesarias, se puede decir que en
general, debe suministrarse lo siguiente: donadores y aceptores de hidrógeno (casi 2 g/L),
fuente de carbono (casi 1 g/L), fuente de nitrógeno (casi 1 g/L), minerales (azufre, fósforo,
casi 50 mg/L de cada uno) y oligoelementos (0.1 a 1 mg/L de cada uno), factores de
crecimiento como aminoácidos, purinas, pirimidinas (casi 50 mg/L de cada uno) y
vitaminas (0.1 a 1 mg/L de cada uno).

Para estudios del metabolismo microbiano, por lo general es necesario preparar un medio
completamente sintético en el cual se conocen las características y concentración exactas de
cada uno de los ingredientes. Es mucho menos costoso y más simple utilizar materiales
naturales como extractos de levaduras, proteínas ingeridas o sustancias similares. La mayor
parte de los microbios de vida libre se desarrollan bien en extractos de levaduras; las
formas parasitarias pueden necesitar sustancias especiales que se encuentran sólo en la
sangre o en extractos de tejidos de animales. Sin embargo, hay microbios parasitarios
(como el Treponema pallidum) que no pueden cultivarse in vitro o que crecen en el interior
de células eucariotas (Chlamydia trachomatis).

Para muchos microorganismos, un compuesto simple (como un aminoácido) puede actuar

como fuente de energía, de carbono y nitrógeno en tanto que otras requieren compuestos
separados para cada uno de estos elementos. Si los materiales naturales para medios no
sintéticos son deficientes en algún nutriente particular, deben realizarse
complementaciones.

Concentración de iones hidrógeno (pH)

La acidez o alcalinidad de un medio de cultivo se expresa por su pH. Para la mayoría de las
bacterias el pH óptimo de crecimiento está entre 6,5 y 7,5 aun cuando algunas pocas
especies pueden crecer en los extremos del rango de pH. Las levaduras y los mohos pueden
crecer a valores de pH más bajos. Cuando se cultivan los microorganismos en un medio de
cultivo originalmente ajustado a un pH dado, 7 por ejemplo, es probable que este pH
cambie como resultado del metabolismo de esos microorganismos, el cambio de pH puede
ser tan grande que eventualmente podría inhibir el crecimiento de esos microorganismos.
Para mantener un pH relativamente constante durante el crecimiento microbiano, se le
añaden sustancias buffer a muchos medios de cultivo.

La mayor parte de los microorganismos tienen un pH óptimo muy estrecho. El pH óptimo

debe determinarse empíricamente para cada especie. La mayor parte de los
microorganismos (neutrolófilos) proliferan mejor en un pH de 6.0 a 8.0, aunque algunas
formas (microorganismos acidófilos) encuentran su cifra óptima con pH de 3.0 y otros
(alcalófilos) tienen un pH óptimo de hasta 10.5.

Los microorganismos regulan su pH interno pese a la amplia gama de cifras de pH externo

mediante el bombeo de protones hacia el interior o al exterior de la célula. Los
microorganismos acidófilos mantienen su pH interno en casi 6.5 sobre un pH externo de 1.0
a 5.0; las células neutras mantienen un pH interno cercano a 7.5 con intervalos externos de
pH de 5.5 a 8.5; los microorganismos alcalófilos mantienen un pH interno de casi 9.5 sobre
intervalos externos de 9.0 a 11.0. El pH interno está regulado por un grupo de sistemas de
transporte de protones en la membrana citoplásmica, lo que incluye una bomba de protones
controlada por ATP y un intercambiador de Na+/H+. El sistema de intercambio de K+/H+
parece contribuir a la regulación del pH interno en microorganismos con pH neutro.

Temperatura

Las diferentes especies microbianas varían ampliamente en cuanto a sus intervalos óptimos
de temperatura para su proliferación. Los psicrófilos se desarrollan mejor en temperaturas
bajas (15 a 20°C) los mesófilos a 30 a 37°C y los termófilos a temperaturas de 50 a 60°C.
Algunos microorganismos son hipertermófilos y pueden desarrollarse a temperatura de
ebullición, la cual existe en sitios con alta presión como en las profundidades del océano.
La mayor parte de los microorganismos son mesófilos; 30°C es la temperatura óptima para
muchas formas de vida libre y la temperatura corporal del hospedador es óptima para
simbiontes homeotermos. El extremo superior de las temperaturas toleradas por cualquier
especie dada se correlaciona bien con la estabilidad térmica general de las proteínas de
dicha especie, medidas en extractos celulares.

Los microorganismos comparten con las plantas y animales la respuesta al golpe de calor,
que consiste en la síntesis transitoria de un grupo de “proteínas de golpe de calor” cuando
se exponen a incrementos súbitos en la temperatura por arriba de la temperatura óptima de
proliferación. Tales proteínas parecen ser inusualmente resistentes a la temperatura y
estabilizan a proteínas celulares sensibles al incremento térmico.

Además de sus efectos sobre la tasa de proliferación, las temperaturas extremas matan a los
microorganismos. La temperatura muy elevada se utiliza para esterilizar preparaciones. El
frío extremo también destruye microorganismos, aunque no puede utilizarse con seguridad
con fines de esterilización. Las bacterias también muestran el fenómeno conocido como
choque de enfriamiento: las células mueren con el enfriamiento rápido (a diferencia de lo
que ocurre con el enfriamiento lento). Por ejemplo, el enfriamiento rápido de Escherichia
coli de 37 a 5°C puede destruir 90% de las células. Varios compuestos protegen a las
células del choque de calor o de congelamiento; a menudo se utilizan glicerol y dimetil
sulfóxido.
Psicrófilos: Microorganismos capaces de crecer a bajas temperaturas. Existen varias
definiciones de psicrófilos, en un inicio se definía como Psicrófilo a cualquier
microorganismo que podía crecer a 0 ºC. Sin embargo, parecen haber dos grupos diferentes
que pueden crecer a esa temperatura. El primer grupo está constituido por los psicrófilos
estrictos o aquellos microorganismos que pueden crecer a 0 ºC pero cuya temperatura
óptima es de 15 ºC. El otro grupo los constituyen aquellos microorganismos que pueden
proliferar a 0 ºC pero que tienen temperaturas óptimas más elevadas 20 - 30 ºC llamados
psicrófilos facultativos. Por ejemplo, las Pseudomonas.

Mesófilos: Microorganismos cuya temperatura óptima de crecimiento se encuentra dentro

de un rango de 25 – 40 º C. Dentro de este grupo se encuentran la mayoría de los
microorganismos contaminantes de los productos farmacéuticos, alimentos y cosméticos y
los microorganismos patógenos para el hombre. Por ejemplo, Neisseria gonorrhoeae.

Termófilos: Microorganismos cuya temperaturas óptima es de 50 - 60 ºC, hay algunos con

temperaturas óptimas aún más altas 80 - 121 ºC, a estos se les denomina hipertermófilos o
termófilos extremos. Como ejemplo de estos tenemos: Thermus aquaticus (temperatura
óptima 72 ºC; crece entre 50 - 80 ºC).

Aireación

Muchos microorganismos son aerobios obligados, es decir, de manera específica necesitan

oxígeno como aceptor de hidrógeno; algunos anaerobios son facultativos, es decir, tienen la
capacidad de vivir de forma aerobia o anaerobia; en tanto que otros son anaerobios
obligados, pues requieren una sustancia diferente al oxígeno como aceptor hidrógeno y son
sensibles a la inhibición con oxígeno. Los productos secundarios naturales del metabolismo
aerobio son compuestos reactivos de peróxido de hidrógeno y superóxido. En presencia de
hierro estas sustancias generan radicales hidroxilo que pueden dañar cualquier
macromolécula biológica.

Muchos microorganismos anaerobios y anaerobios tolerantes al aire se protegen de estos

productos por la presencia de superóxido dismutasa, una enzima que cataliza la reacción y
por la presencia de una catalasa, una enzima que cataliza la reacción. Algunos
microorganismos fermentados (por ejemplo, lactobacillus plantarum) son tolerantes al aire
pero no contienen catalasa o superóxido dismutasa. Todos los anaerobios estrictos carecen
de superóxido dismutasa y catalasa. Algunos microorganismos anaerobios (como el
peptococcus anaerobius) tienen tolerancia considerable al oxígeno como consecuencia de
su capacidad para producir cifras elevadas de la enzima (NADH oxidasa) que reduce
oxígeno a agua con base en la reacción.

El proporcionar aire a los cultivos de bacterias aerobias es un problema técnico mayor. Por
lo común se lleva a cabo un mezclado mecánico para introducir oxígeno al medio de
cultivo o bien se fuerza el paso de aire a través del medio de cultivo por medio de presión.
La difusión de oxígeno a menudo se vuelve un factor limitante en la proliferación de
bacterias aerobias; cuando se alcanza una concentración de 4 a 5 × 109/ml de células, la
tasa de difusión de oxígeno limita la tasa de proliferación de las células en gran medida.

Por otra parte, los anaerobios obligados presentan el problema de la eliminación del
oxígeno. Se dispone de muchos métodos para lograr esto: pueden añadirse agentes
reductores como el tioglicolato de sodio a los cultivos líquidos; los tubos de agar pueden
sellarse con una capa de vaselina y parafina; las placas de cultivo deben colocarse en un
contenedor al cual se le retira el oxígeno por medio de vacío o por agentes químicos o bien
el microorganismo puede manipularse en una caja cerrada en un medio anaerobio.

Para cultivar a las bacterias aeróbicas o a las anaerobias facultativas en tubos y fiolas
pequeñas, se incuba el medio en condiciones atmosféricas normales. Cuando se requieren
bacterias aerobias en grandes cantidades, es preferible aumentar la aireación del cultivo por
agitación.

Concentración iónica y presión osmótica

Como los microorganismos dependen del agua para la síntesis de sus componentes
celulares, es necesario que ésta se encuentre disponible en el medio de cultivo para que los
microorganismos la puedan utilizar para su crecimiento. La cantidad disponible de agua
para los microorganismos en un medio de cultivo, no depende sólo de la cantidad que se ha
añadido, ya que en estos medios se pueden encontrar sustancias sólidas disueltas que
disminuyen su disponibilidad.
La actividad del agua (aw) es una expresión para la cantidad de agua disponible en un
sustrato dado y se define como “la centésima parte de la humedad relativa del aire que está
en equilibrio con ese sustrato”. Este valor nos indica la cantidad de agua disponible para ser
utilizada por los microorganismos.

En menor grado, deben controlarse factores como la presión osmótica y concentración de

sales. Para la mayor parte de los microorganismos, las propiedades de los medios de cultivo
ordinarios son satisfactorias; sin embargo, para formas marinas y microorganismos
adaptados para crecer en soluciones hipertónicas de azúcar, por ejemplo, deben tomarse en
consideración tales factores. Existen así microorganismos que requieren concentraciones
elevadas de sales se denominan y aquellos que requieren presiones osmóticas elevadas.

aquellos ciertos microorganismos que pueden crecer en medios con elevadas

concentraciones de solutos y se conocen como osmotolerantes. Los otros microorganismos
necesitan para crecer elevadas concentraciones de solutos, se les denomina osmofílicos.
Hay otros microorganismos que se han llamado halofílicos o halófilos estrictos, éstos
requieren iones Na+ para crecer y lo hacen óptimamente en medios a los que se les ha
añadido NaCl para obtener valores de aw menores de 0,80 y los halófilos facultativos que
crecen a concentraciones de sales capaces de inhibir a la mayoría de las bacterias.

La mayor parte de las bacterias son capaces de tolerar amplias variaciones de presión
osmótica externa y de concentraciones iónicas. La osmolalidad está regulada por transporte
activo de iones de K+ hacia el interior de la célula; la concentración iónica interna se
mantiene constante por excreción compensadora de putresceína, una poliamina orgánica
con carga positiva. Como la putresceína transporta varias cargas positivas por molécula,
una gran reducción en la concentración iónica se lleva a cabo con un pequeño costo en la
concentración osmótica.

MEDIOS DE CULTIVO

La técnica y medio de cultivo utilizados dependen de la naturaleza de la investigación. En

términos generales, pueden encontrarse tres situaciones: 1) tal vez sea necesario cultivar un
grupo de células de una especie en particular que se encuentran a la mano; 2) puede ser
necesario establecer el número y tipo de microorganismos presentes en un material dado, o
3) podría desearse el aislamiento de un tipo particular de microorganismo a partir de una
fuente natural.

Desarrollo celular de una especie dada

Los microorganismos observados en el microscopio pueden proliferar en su ambiente

natural y pueden ser extremadamente difíciles de hacer crecer en un medio de cultivo
artificial puro. Ciertas formas parasitarias nunca han sido cultivadas fuera del hospedador.
Sin embargo, en términos generales puede diseñarse un medio de cultivo apropiado para
reproducir cuidadosamente las condiciones encontradas en el entorno natural del
microorganismo. El pH, temperatura y aireación son fáciles de duplicar; los nutrientes
presentes constituyen el mayor problema. La contribución por el entorno en que se
desarrolla el microorganismo es importante y difícil de analizar; un parásito podría
necesitar un extracto de tejido del hospedador; una forma de vida libre podría necesitar una
sustancia excretada por un microorganismo y con la cual se encuentra asociada. Podría ser
necesaria una gran cantidad de experimentación para establecer las necesidades del
microorganismo y el éxito depende de proporcionar una fuente apropiada de cada uno de
los nutrientes mencionados al inicio de este capítulo.

Estudio microbiológico de materiales naturales

Un material dado puede contener muchos microambientes diferentes y cada uno

proporciona un nicho para diferentes especies. El cultivo de una muestra de material bajo
cierto grupo de condiciones permitirá que un grupo selecto de formas produzca colonias,
pero podría ocasionar que se pasen por alto muchos otros tipos. Por tal razón, se
acostumbra cultivar las muestras de mar utilizando diversos medios de cultivo con
diferentes condiciones de incubación, según sea posible en condiciones prácticas. No es
irracional utilizar seis u ocho medios de cultivo y condiciones de cultivo diferentes si se
van a identificar la mayor parte de las formas presentes.
Cada tipo de microorganismo debe tener la posibilidad de proliferar, por lo que se utilizan
medios sólidos para evitar la aglomeración de colonias. Por otra parte, la competencia
evitará que se formen algunos tipos de colonias.

Aislamiento de un microorganismo en particular

Una pequeña muestra de tierra, si se manipula de manera apropiada, permite el cultivo de

diferentes tipos de microorganismos en cada microentorno presente. Para la tierra fértil
(húmeda, aireada, rica en minerales y material orgánico) esto significa que pueden aislarse
cientos o incluso miles de tipos bacterianos, lo cual se lleva a cabo al seleccionar el tipo
deseado. Por ejemplo, 1 g de tierra se inocula en un frasco de medio de cultivo líquido que
se elaboró con el fin de favorecer el crecimiento de un tipo de microorganismo, por
ejemplo, bacterias aerobias fijadoras de nitrógeno (azobacterias).

En este caso, el medio no contiene nitrógeno combinado y se incuba en un medio

anaerobio. Si las azobacterias están presentes en la tierra, proliferan bien en este medio de
cultivo; las formas incapaces de fijar nitrógeno crecerán sólo en la medida que la tierra
tenga contaminantes que fijen nitrógeno en el medio. Cuando el cultivo se ha desarrollado
por completo, el porcentaje de azobacterias en la población total se habrá incrementado en
gran medida; este método se denomina “cultivo enriquecido”. La transferencia de una
muestra de este cultivo a un medio fresco dará origen a un enriquecimiento adicional de las
azobacterias; después de varias transferencias seriadas el cultivo puede colocarse en un
medio de cultivo sólido enriquecido, lo que permite el aislamiento de colonias de
azobacterias. El medio líquido se utiliza para permitir la competencia y por tanto la
selección óptima, incluso cuando el tipo deseado es representado en la tierra por sólo una
pequeña cantidad de células en la población de millones. Pueden obtenerse ventajas del
“enriquecimiento natural”.

Por ejemplo, al observar oxidantes de queroseno, se elige tierra contaminada con aceite,
porque éste es un medio ya enriquecido para tales formas bacterianas. El enriquecimiento
de cultivos es un procedimiento por medio del cual se prepara el medio de cultivo para
duplicar el ambiente natural (“nicho”) del microorganismo deseado, por lo que se permite
su selección. Un principio importante involucrado es el siguiente: el microorganismo
seleccionado será del tipo del cual se han satisfecho sus necesidades nutricionales. Por
ejemplo, las azobacterias crecen en un medio de cultivo que contiene nitrógeno orgánico,
pero sus necesidades mínimas consisten en la presencia de N2; por tanto, se elige un medio
de cultivo que contenga N2 como la única fuente de nitrógeno.

Si se añade nitrógeno orgánico al medio de cultivo, las condiciones ya no serán selectivas

para azobacterias, sino que serán para formas para las cuales el nitrógeno orgánico es una
necesidad mínima. Cuando se busca un tipo particular de microorganismo en material
natural es ventajoso cultivar los microorganismos obtenidos en un medio de cultivo
diferencial, si éste se encuentra disponible. Un medio de cultivo diferencial es aquel que
ocasiona que las colonias de un tipo particular de microorganismo tengan un aspecto
distintivo.

Por ejemplo, las colonias de E. coli tienen un color verdoso iridiscente característico al
cultivarse en agar que contiene eosina y azul de metileno (agar EMB). El agar EMB
contiene altas concentraciones de un carbohidrato que ocasiona que los microorganismos
que fermentan azúcar formen colonias de color rojizo. Los medios de cultivo diferenciales
se utilizan para propósitos como la identificación de bacterias entéricas en agua o leche y la
presencia de ciertos patógenos en muestras clínicas. Sin embargo, pese a los mejores
esfuerzos, muchos ambientes contienen numerosas bacterias no cultivadas.

A lo largo de los últimos 100 años, los microbiólogos han desarrollado incontables medios
auxiliares para el aislamiento e identificación de bacterias y hongos de importancia médica.
Sólo unos cuantos han llegado a utilizarse en forma rutinaria en los laboratorios clínicos;
desde un punto de vista se pueden clasificar como medios nutritivos, selectivos o
indicadores.

Medios nutritivos

El componente nutritivo de un medio está diseñado para satisfacer los requisitos de

crecimiento del organismo a fin de permitir su aislamiento y propagación. Para propósitos
médicos, el medio ideal permitiría el crecimiento rápido de todos los agentes. No existe tal
medio; sin embargo, existen varios que son suficientes para la propagación adecuada de la
mayoría de las bacterias y hongos de importancia médica. Estos medios se preparan con los
productos digeridos enzimáticos o ácidos de productos animales o vegetales tales como
músculos, leche o soya.

El digerido reduce la proteína original a una mezcla de polipéptidos y aminoácidos que

también incluye metales traza, coenzimas y diversos factores de crecimiento indefinidos;
por ejemplo, un caldo común contiene un digerido pancreático de caseína (proteína láctea)
y un digerido papaico de harina de soya. A esta base nutritiva se le pueden añadir sales,
vitaminas líquidos corporales como suero a fin de proporcionarles a los patógenos las
condiciones necesarias para su desarrollo óptimo. Los medios se preparan a partir de
productos animales o vegetales.

Medios selectivos

Los medios selectivos se utilizan cuando se buscan organismos patogénicos específicos en

sitios con una flora normal extensa En estos casos, las demás bacterias pueden desarrollarse
más que la especie etiológica sospechada en un medio nutritivo sencillo, ya sea porque el
patógeno crece más lentamente o porque se presenta en cantidades mucho más pequeñas.
Por lo general, los medios selectivos contienen pigmentos, otros aditivos químicos o
antimicrobianos en concentraciones diseñadas para inhibir la flora contaminante pero no el
patógeno sospechado. Los organismos indeseados se inhiben con químicos o
antimicrobianos

Medios indicadores.

Los medios indicadores contienen sustancias diseñadas para mostrar las características
bioquímicas o únicas de otro tipo de patógenos o grupos de organismos. A menudo se
utiliza la adición de uno o más carbohidratos y un indicador de pH al medio. Un cambio de
color en la colonia indica la presencia de productos ácidos y, por ende, de fermentación u
oxidación del carbohidrato por parte del organismo. Añadir eritrocitos a las placas permite
que se utilice la hemólisis que producen algunos organismos como característica de
diferenciación.

En la práctica, es muy frecuente que se combinen las propiedades nutritivas, selectivas e

indicadoras a diversos grados dentro de un mismo medio. Es posible incluir un sistema
indicador dentro de un medio altamente nutritivo y también hacerlo selectivo al añadir los
antimicrobianos adecuados. Las propiedades metabólicas de las bacterias se exhiben
mediante sistemas de sustrato e indicación

También según las sustancias primarias los medios de cultivo se pueden clasificar en:

Medios naturales: son aquellos medios empleados tal como se encuentran en la naturaleza
para cultivar microorganismos, como ejemplo de estos medios encontramos la
leche, los extractos vegetales o la sangre diluida.

Medios sintéticos: como su nombre lo indica son medios que han sido creados por
el hombre y por lo tanto se conoce su formulación completamente, son utilizados
para el cultivo de microorganismos coincidiendo de antemano los requerimientos
nutricionales que estos or ganismos necesitan. Como ejemplo se pueden mencionar
todos los medios deshidratados que distribuyen las casa comerciales.

Medios semisintéticos: son medios de cultivo que llevan una mezcla de medio
naturales y medios artificiales, ya que algunos de los componentes pueden ser
susceptibles a los tratamientos empleados durante la elaboración de estos medios o
tratamientos posteriores. Como ejemplo de estos medios podemos encontrar el agar Baird
Parker o el agar sangre.

Medio vivos: son aquellos medios que contienen células u organismos vivos y que
son ampliamente utilizados para demostrar reacciones susceptibles de
organismos superiores en presencia de microorganismos causantes de
alteraciones, también tienen importancia en el estudio y cultivo de los virus.
Ejemplos de estos medios pueden ser las células de riñón de mono, huevos
embrionados o células de intestino de cobayos y conejos

Condiciones atmosféricas

Aeróbicas

Una vez inoculados, los cultivos de la mayoría de las bacterias anaerobias se colocan en
una incubadora con una temperatura constante entre 35 y 37 °C. En ocasiones, se utilizan
temperaturas ligeramente mayores o menores para favorecer un cierto organismo o grupo
de organismos en forma selectiva. La mayoría de las bacterias que no son anaerobias
obligadas crecen en el aire; sin embargo, algunas requieren de CO2 y el mismo compuesto
potencia el crecimiento de otras. Las incubadoras que mantienen una concentración de 2 a
5% de CO2 en el aire se utilizan con frecuencia para el aislamiento primario porque este
nivel no es dañino para ningún tipo de bacteria y mejora el aislamiento de algunas. Un
método más sencillo es el frasco con vela, en el que se deja que una vela prendida se queme
hasta consumirse en un frasco sellado que contiene las placas. Este método añade 1 a 2% de
CO2 a la atmósfera. La temperatura y atmósfera de incubación varían según el organismo

Anaeróbicas.

Las bacterias estrictamente anaerobias no crecen bajo las condiciones antes descritas y
muchas mueren al verse expuestas al oxígeno atmosférico o a altos potenciales de
oxidorreducción. La mayoría de los anaerobios de importancia médica crecen en las
profundidades de medios líquidos o semisólidos que contienen cualquier variedad de
agentes reductores, tales como cisteína, tioglucolato, ácido ascórbico o, incluso, limaduras
de hierro. Es posible lograr un ambiente anaeróbico para la incubación delas placas al
reemplazar el aire con una mezcla de gases que contenga hidrógeno, CO2 y nitrógeno y
permitiendo que el hidrógeno reaccione con el oxígeno residual en un catalizador para que
forme agua.

Un sistema comercial conveniente logra esto en forma química en un paquete al que se le

añade agua antes de sellar el frasco. Las muestras que se sospeche contienen números
significativos de anaerobios deben procesarse bajo condiciones diseñadas para minimizar la
exposición al oxígeno atmosférico en toda etapa. Los anaerobios requieren de condiciones
de reducción y protección del oxígeno.

A fin de estudiar las propiedades de un microorganismo dado, es necesario manipularlo en

cultivos puros sin otros tipos de microorganismos. Para llevar a cabo esto, debe aislarse una
sola célula de todas las demás y cultivarse de forma tal que su progenie permanezca aislada.
Se dispone de varios métodos.
Según sus requerimientos de oxígeno los microorganismos pueden ser: Aerobios estrictos,
que requieren oxígeno para crecer (Mycobacterium tuberculosis), anaerobios facultativos,
que pueden crecer en presencia o en ausencia de oxígeno (por ejemplo: Levaduras,
enterobacterias), anaerobios estrictos: crecen en ausencia de oxígeno. En presencia de
oxígeno su crecimiento cesa, algunos mueren rápidamente (por ejemplo las Especies del
género Clostridium), anaerobios aerotolerantes, crecen en ausencia de oxígeno, pero la
presencia de oxígeno no perjudica su crecimiento (Lactobacillus) y microaerofílicos, que
requieren pequeñas concentraciones de oxígeno para crecer (Spirillum).

Las bacterias anaeróbicas estrictas sólo pueden crecer si se les excluye el oxígeno del
medio, lo cual puede hacerse de varias maneras: a) Utilizando agentes reductores en el
medio para disminuir el contenido de oxígeno. Por ejemplo; El tioglicolato de sodio; b) Por
remoción mecánica de oxígeno y reemplazándolo por otro gas (nitrógeno); c) Mediante
reacción química, el oxígeno disponible se convierte en CO2, esto ocurre si se enciende una
vela dentro de un recipiente cerrado o utilizando jarras Gaspak, en esta última la reacción
del bicarbonato de sodio y el borohidruro de sodio en presencia de agua, produce la
liberación de hidrógeno y CO2, ese hidrógeno liberado se combina con el oxígeno
atmosférico para formar agua en presencia de un catalizador de paladio.

Cultivo en placa

A diferencia de las células en medio líquido, las células en un medio de gel se encuentran
en moles. Por tanto, si se colocan pocas células en un medio de gel, cada célula prolifera en
una colonia aislada. El agente ideal para la formación de gel para la mayor parte de los
medios de cultivo microbiológico es el agar, un polisacárido ácido extraído de ciertas algas
rojas. Una suspensión al 1.5 a 2% en agua se disuelve a 100°C, dando origen a una solución
clara que se gelifica a 45°. Así, una solución de agar estéril puede enfriarse a 50°, se añaden
bacterias u otro microorganismo y más tarde la solución se enfría con rapidez por debajo de
45° para formar un gel. Aunque la mayor parte de las células microbianas se destruyen a
50°, el proceso de destrucción es lo suficientemente lento a esta temperatura para permitir
que se lleve a cabo el procedimiento.
Una vez formado el gel, el agar no vuelve a tornarse líquido hasta que se calienta por arriba
de 80°, de manera que cualquier temperatura es apropiada para la incubación de un medio
de cultivo microbiano. En el método de vertido en placa se mezcla una suspensión de
células con agar líquido a 50° y se vierte en una caja de Petri. Cuando el agar se torna
sólido, las células permanecen inmóviles en éste y proliferan dando origen a colonias. Si la
suspensión celular está lo suficientemente diluida, las colonias se encontrarán bien
separadas, de forma que cada una tiene una alta probabilidad de derivarse de una sola
célula. Sin embargo, para tener la certeza es necesario tomar una colonia del tipo deseado,
suspenderla en agua y repetir el procedimiento. La repetición de este procedimiento en
varias ocasiones asegura que se obtenga un cultivo puro.

Otro método consiste en crear estrías de la suspensión original sobre una placa de agar con
un asa de alambre (técnica de estriado en placa). Conforme se continúa con la creación de
estrías, cada vez queda un menor número de células en el asa y por último el asa depositará
una sola célula en el agar. La placa se incuba y cualquier colonia bien aislada se retira, se
vuelve a suspender en agua y se repite el procedimiento en agar. Si la suspensión se vuelve
a someter al método de estriado en placa (no sólo una parte de la colonia), este método es
tan fiable y mucho más rápido que el método de vertido en placa.

En la técnica de extensión en placa, un pequeño volumen de suspensión microbiana diluida

que contiene 30 a 300 células se transfiere hacia el centro de la placa de agar y se extiende
en forma uniforme sobre la superficie con una varilla de cristal estéril, doblada. Las células
dispersadas dan origen a colonias. El número de colonias debe ser similar al número de
microorganismos viables en la muestra, y por tanto la técnica de extensión en placa puede
utilizarse para contar la población microbiana.

Dilución

Un método mucho menos fiable es el de la dilución hasta la extinción. Se realizan

diluciones seriadas de la suspensión y las muestras de cada dilución se cultivan en placa. Si
sólo unas cuantas muestras de una dilución en particular muestran crecimiento, se supone
que algunas de las colonias iniciaron a partir de una sola célula. Este método no se utiliza a
menos que sea imposible el cultivo en placa por alguna razón. Una característica indeseable
de este método es que sólo puede utilizarse para aislar el tipo predominante de
microorganismo en una población mixta.

Aislamiento e identificación de bacterias y hongos

Casi todas las bacterias de importancia médica se pueden desarrollar fuera del hospedador
en medios de cultivo artificiales. Una sola bacteria colocada en las condiciones de cultivo
apropiadas se multiplicará en cantidades suficientes para que se perciban a simple vista.
Los medios bacteriológicos son recetas similares a sopas preparadas a partir de digeridos de
proteínas animales o vegetales suplementados con nutrientes tales como glucosa, extracto
de levadura, suero o sangre para satisfacer los requisitos metabólicos del organismo.

Su composición química es compleja y su éxito depende de que cumplan con los requisitos
nutricionales de la mayoría de los seres vivos heterótrofos. Los mismos enfoques y algunos
de los mismos medios de cultivo que se utilizan para las bacterias también se usan en el
caso de los hongos. Las bacterias crecen en medios similares a sopas. La propagación en
medios preparados en estado líquido (caldos) es evidente cuando el número de bacterias es
suficiente para producir turbidez o aglutinaciones macroscópicas. La turbidez es el
resultado de la cantidad de luz que se refleja de las bacterias; dependiendo del tamaño del
organismo, se requiere de más de 106 bacterias por mililitro de caldo. La adición de un
agente gelificante a un caldo de cultivo permite su preparación en sólido en forma de placas
en cajas de Petri. El agente gelificante universal para la bacteriología diagnóstica es el agar-
agar, un polisacárido que se extrae de algas marinas.

El agar-agar es conveniente en cuanto a que se licua a cerca de 95 °C, pero no retorna a un

estado de gel sólido hasta que se enfría a menos de 50 °C. Esto permite añadir al cultivo
sustancias lábiles al calor, tales como sangre, antes de que gelifique. A las temperaturas que
se utilizan en el laboratorio diagnóstico (37 °C o menos) el agar-agar existe como un gel
nutritivo liso y sólido. Este medio, normalmente denominado “agar”, puede calificarse con
la descripción de cualquier suplemento que contenga (agar sangre). Los grandes números
de bacterias en un caldo de cultivo producen turbidez

El agar es un agente gelificante conveniente para cultivos sólidos. Una útil característica de
las placas de agar es que las bacterias pueden separarse al extender una pequeña muestra
del espécimen sobre su superficie. Las células bacterianas bien separadas de las demás
crecen en colonias aisladas que a menudo alcanzan los 2 a 3 mm de diámetro después de
incubarse durante la noche. Esto permite aislar las bacterias en un cultivo puro porque se
asume que la colonia ha surgido a partir de un solo organismo. Las colonias varían
enormemente en cuanto a su tamaño, forma, textura, color y otras características
denominadas morfología colonial.

Las colonias de diferentes especies o géneros a menudo difieren en forma sustancial,

mientras que aquellas derivadas de la misma cepa suelen ser consistentes. Las diferencias
en morfología colonial son de gran utilidad para separar a las bacterias dentro de una
mezcla y para obtener pistas en cuanto a su identidad. Es posible separar a las bacterias en
colonias aisladas en placas de agar. Las colonias pueden tener características consistentes y
distintivas.

También se están utilizando nuevos métodos que no dependen de los cambios visuales en el
medio de cultivo o en la formación de colonias para detectar la propagación bacteriana en
un cultivo. Estas técnicas incluyen los cambios ópticos, químicos y eléctricos que se
producen en el medio a causa del número creciente de células bacterianas o de sus
productos metabólicos. Muchos de estos métodos son más sensibles que las técnicas
clásicas y, por ende, pueden detectar la propagación horas o, incluso, días antes que los
métodos tradicionales.

Algunos también se han rediseñado en cuanto a instrumentación y automatización; por

ejemplo, un sistema totalmente automatizado que detecta el metabolismo bacteriano por
fluorometría puede llevar a cabo una identificación bacteriana y una prueba de
susceptibilidad antimicrobiana en dos a cuatro horas. El crecimiento se puede detectar por
medio de métodos ópticos, químicos y eléctricos
Los micoplasmas tienen requerimientos nutricionales especiales. Los medios de cultivo se
deben enriquecer con suero animal (caballo o conejo) o líquido ascítico humano. Estos
líquidos aportan los ácidos grasos no saturados y los esteroles que se requieren para la
síntesis de la membrana citoplasmática. El medio de cultivo más utilizado para los
micoplasmas contiene: caldo cerebro-corazón suplementado con 0,5% de glucosa, 0,2% de
arginina, 10% de extracto de levaduras, 20% de suero de caballo, rojo fenol, penicilina o
acetato de talio (250 μg/ml) y agar 0,6-0,8%.

Hongos (organismos celulares heterótrofos con pared celular)

Los hongos se pueden estudiar usando los mismos métodos generales de cultivo de las
bacterias. Casi todos crecen aeróbicamente en los medios de cultivo usuales de
bacteriología, a temperaturas entre 20 y 30° C; como crecen más lento que las bacterias,
cuando se quieren aislar de un inóculo que posea ambos tipos de microorganismos, es
necesario ajustar las condiciones de manera de inhibir el crecimiento de las bacterias y
favorecer el de los hongos, esto puede hacerse de varias maneras, ya sea acidificando el
medio (pH 5,6), incorporando al medio una concentración de azúcar relativamente alta
(4%), añadiéndole al medio un agente antibacteriano.

El medio más utilizado para el cultivo de los hongos es el de sabouraud, que tiene un
contenido alto de azúcar y un pH ligeramente ácido. Los hongos patógenos a menudo son
más exigentes para su cultivo y requieren medios enriquecidos. En el caso de rickettsias,
clamidias y virus (parásitos intracelulares obligados). Debido a que son parásitos
intracelulares obligados, es necesario cultivarlos en tejidos de animales susceptibles. Las
rickettsias y clamidias usualmente se cultivan en el saco vitelino de embriones de pollo o en
cultivos de tejidos.

De acuerdo a los nutrientes los medios de cultivo pueden ser:

Medios simples: son medios que poseen los nutrientes mínimos para permitir el
desarrollo de microorganismos menos exigentes, como ejemplo encontramos el caldo
nutritivo o el agar nutritivo.
Medio enriquecidos: son aquellos medios a los cuales se les han incorporado
sustancias que proporcionan características complementarias nutritivas para que el
medio pueda servir como sustrato para los microorganismos más exigentes. Estos
medios, tales como agar sangre, suero o chocolate en caldo o en agar, se emplean
para conseguir el crecimiento de aquellos microorganismos sensibles que no crecen
en medios corrientes.

Medios selectivos: son aquellos medios a los que se les incorporan sustancias para
inhibir al crecimiento de la mayor parte de los microorganismos con
excepción de aquellos para los que fueron ideados, por ejemplo, el medio telurito para el
bacilo productor de la difteria y el agar citrato-dexosicolato para los grupos de Salmonella
sp y Shigella sp.

Medios diferenciales: son medios que contienen sustancias o indicadores que

permiten la diferenciación de un microorganismo a otro. Por ejemplo, el agar Mac-Conkey
permite distinguir los microorganismos fermentadores de la lactosa de los no
fermentadores por la coloración que toman. Otro ejemplo claro de estos medios es
el agar sangre que permite distinguir los microorganismos que lisan o producen
hemólisis de los eritrocitos de aquellos que no son, es decir, que al mismo tiempo
se pueden distinguir microorganismos productores de hemólisis alfa, beta o gamma.

Medio auxanográficos: son determinados medios a los que les faltan ciertos factores
nutritivos. El medio, generalmente sólido se inocula con un microorganismo, y
luego se distribuye por la superficie discos con diferentes compuestos nutritivos que
puedan requerir los microorganismos en estudio y de esta manera determinar que
nutrientes favorecen o no al desarrollo por el crecimiento del microorganismo
alrededor del disco.

Medios para transporte o carriers: son medios sólidos o semisólidos que pueden
contener o no sustancias selectivas. Se preparan para detener la viabilidad de los
microorganismos durante varias horas o días, permitiendo de esta manera el aislamiento de
las especies menos resistentes después de transcurrido cierto tiempo entre la toma de la
muestra y la entrega al laboratorio
En base a lo anterior, y específicamente los medios selectivos o no, enriquecidos y
diferenciales, se pueden desglosar cuatro grupos principales: 1) medios enriquecidos no
selectivos; 2) medios selectivos; 3) medios diferenciales, y 4) medios especializados. A
continuación se resumen algunos ejemplos de estos.

Medios de cultivo no selectivos enriquecidos

Estos medios están diseñados para permitir el crecimiento de la mayor parte de los
gérmenes que no necesitan unas condiciones exigentes.

Los más empleados son:

Agar sangre

Los laboratorios clínicos utilizan muchos tipos de medios de cultivo agar sangre. Los
medios contienen dos componentes fundamentales: un medio basal (por ejemplo, soja
tríptica, infusión de cerebro-corazón, base de Brucella), y sangre (de oveja, caballo o
conejo). Se pueden añadir varios suplementos más para ampliar el número de gérmenes que
se pueden cultivar en estos medios de cultivo. El agar sangre permite el crecimiento de la
mayoría de las bacterias de importancia clínica. Es un método diferencial que permite
comprobar si las bacterias son hemolíticas, es decir, si tienen la capacidad para romper los
glóbulos rojos presentes en el medio. Recordando que existen tres tipos de hemólisis:
betahemólisis (lisis o eliminación total de los glóbulos rojos, esto genera un halo
transparente en la zona donde crece este tipo bacteriano), alfahemólisis (lisis parcial de los
glóbulos rojos, desarrollando un halo verdoso en torno a las zonas donde crecen las
bacterias) y gammahemólisis (ausencia de hemólisis).

Agar chocolate. Se trata de un agar modificado. Cuando se añade sangre o hemoglobina al

medio de base calentado, se vuelve marrón (de ahí su nombre). Este medio permite el
crecimiento de la mayor parte de las bacterias, incluidas algunas que no crecen en el agar
sangre (como Haemophilus y algunas cepas de Neisseria patógenas). Es un medio
enriquecido muy parecido al agar sangre; la diferencia es que los glóbulos rojos están
lisados y liberan al medio nutrientes como la hemoglobina, factor X (hemina) y factor V
(NAD). La lisis se produce cuando se añade el agar base fundido a la sangre. La hemólisis
le confiere un color marrón característico parecido al del chocolate, de ahí su nombre. Se
utiliza para el cultivo de bacterias exigentes que necesitan estos factores para su desarrollo,
como es el caso de Neisseria gonorrhoeae (agente causal de la gonorrea) y varias especies
del género Haemophilus.

Agar Mueller-Hinton. Se trata de un medio recomendado para estudios convencionales de

susceptibilidad bacteriana. Su composición está bien definida e incluye extractos de ternera
y caseína, sales, cationes divalentes y almidón soluble necesario para que los resultados
sean reproducibles

Medio de tioglicolato. Se trata de uno de los medios de cultivo de enriquecimiento

empleados para recuperar cantidades pequeñas de bacterias aerobias y anaerobias. Se
emplean diversos compuestos, pero la mayor parte incluyen caseína, glucosa, extracto de
levadura, cisteína y tioglicolato sódico. El suplemento de hemina y vitamina K mejora la
recuperación de las bacterias anaerobias. Es un medio de enriquecimiento muy utilizado
para el diagnóstico bacteriológico porque contiene factores nutritivos que permiten el
desarrollo de la mayoría de las bacterias con importancia clínica. Contiene un 0,075 % de
agar, para evitar el flujo de oxígeno y favorecer así el crecimiento de anaerobios estrictos
(en el fondo del tubo, donde no llega oxígeno). También permite el crecimiento de aerobios
estrictos en la parte superior del tubo, donde el oxígeno llega con facilidad. Las bacterias
anaerobias facultativas (pueden crecer tanto en presencia como en ausencia de oxígeno)
crecen por todo el tubo.

Agar dextrosa de Sabouraud. Se trata de un medio de cultivo enriquecido que contiene

caseína y tejido animal digeridos suplernentados con glucosa; se emplea para aislar hongos.
Se han desarrollado diversas fórmulas, aunque la mayor parte de los micólogos utilizan la
que tiene baja concentración de glucosa y un pH neutro. Al reducir el pH y añadir
antibióticos para inhibir las bacterias, este medio de cultivo puede ser selectivo de hongos.
Es un medio utilizado para el aislamiento e identificación de hongos. Algunos contienen
antibióticos que inhiben a la mayoría de las bacterias como, por ejemplo, SGC (Sabouraud
gentamicina y cloranfenicol

Medios de cultivos selectivos y diferenciales

Los medios de cultivo selectivos se diseñan para poder recuperar gérmenes específicos que
pueden estar presentes en una mezcla de otros gérmenes. Los medios se enriquecen con
inhibidores que suprimen el crecimiento de los gérmenes no deseados. Estos medios se
hacen diferenciales añadiendo ingredientes específicos que permiten la identificación del
germen en una mezcla (añadiendo lactosa y un indicador de pH para identificar los
gérmenes que fermentan la lactosa).

Los medios diferenciales no contienen sustancias inhibidoras, es decir, permiten el

crecimiento de muchos tipos de microorganismos, pero si contienen indicadores de
productos derivados de la actividad metabólica de los microorganismos sobre algunos de
los componentes del medio. Se utilizan para la identificación de los microorganismos. En
algunos casos se combinan en un solo medio las características de ser selectivos y
diferenciales en consecuencia tenemos los siguientes son ejemplos de medios de cultivos
selectivos y diferenciales.

Agar MacConkey. Se trata de un agar selectivo para las bacterias gramnegativas y

diferencial para distinguir las bacterias que fermentan la lactosa y las que no. Este medio
incluye peptonas digeridas, sales biliares, lactosa, rojo neutro y violeta cristal. Las sales
biliares y el violeta cristal inhiben las bacterias grampositivas. Las bacterias que fermentan
la lactosa producen ácidos, que precipitan las sales biliares y provocan un color rojo del
indicador rojo neutro. Es un medio diferencial muy utilizado para el aislamiento e
identificación de enterobacterias.

Agar sal manitol. Se trata de un medio de cultivo selectivo empleado para aislamiento de
estafilococos. El medio incluye extractos de caseína y tejidos animales digeridos, extracto
de ternera, manitol, sales y rojo fenol. Contiene, además de nutrientes, una concentración
de sal al 7,5 % que impide el crecimiento de la mayoría de las bacterias, permitiendo el
crecimiento selectivo de estafilococos. Los estafilococos pueden crecer en presencia de una
elevada concentración de sal y S. aureus puede fermentar manitol, produciendo colonias de
color amarillo en este agar.

Agar xilosa-lisina-desoxicolato. Se trata de un agar selectivo utilizado en la detección de

Salmonella y Shigella en cultivos entéricos. Es un ejemplo de un abordaje muy inteligente
para la detección de bacterias importantes en una mezcla compleja de bacterias
insignificantes. El medio corresponde a un extracto de levaduras con xilosa, lisina, lactosa,
sacarosa, desoxicolato sódico, tiosulfato sódico, citrato amónico férrico y rojo fenol. El
desoxicolato sódico inhibe el crecimiento de la mayor parte de las bacterias no patógenas.
Las bacterias que crecen típicamente fermentan la lactosa, la sacarosa o la xilosa y dan
lugar a colonias amarillas. Shigella no fermenta estos carbohidratos, de forma que sus
colonias serán rojas. Salmonella fermenta la xilosa, pero también decarboxila la lisina y
genera el producto alcalino

Diamino-cadaverina. Este producto neutraliza los productos de fermentación de los

ácidos, de manera que las colonias serán rojas. Dado que la mayor parte de Salmonellas
producen ácido sulfhídrico a partir del tiosulfato sódico, las colonias se vuelven negras en
presencia de citrato amónico férrico, lo que permite diferenciar Salmonella de Shigella.

Medio de Lowenstein-Jensen (LJ). Este medio, utilizado para aislar micobacterias,

contiene glicerol, harina de patata, sales y huevos coagulados (para solidificar el medio). Se
añade verde malaquita para inhibir las bacterias grampositivas.

Agar Middlebrook. Este medio de cultivo de agar se emplea también para aislar
micobacterias. Contiene nutrientes necesarios para el crecimiento de las micobacterias (es
decir, sales, vitaminas, ácido oleico, albúmina, catalasa, glicerol, glucosa) y verde
malaquita para inhibir las bacterias grampositivas. A diferencia del medio LJ, se solidifica
con agar.

CHROMagar. Se trata de un agar selectivo diferencial utilizado para aislar e identificar

algunas especies distintas usando cloranfenicol para inhibir a las bacterias y una mezcla de
sustratos cromogénicos especiales. Las distintas especies de Cándida cuentan con enzimas
que permiten emplear uno o más de los sustratos liberando el compuesto coloreado y
generando colonias de colores. Por ejemplo: C. albicans genera colonias verdes, C.
tropicalis genera colonias m oradas y G krusei las genera rosadas.

Agar de levaduras inhibidor. Este medio de cultivo es un compuesto selectivo

enriquecido que se emplea para aislamiento de hongos patógenos distintos de los
dermatofitos. Se añade cloranfenicol para suprimir el crecimiento de las bacterias
contaminantes.

Medios especializados

Se han creado muchos medios de cultivo especializados distintos para detectar gérmenes
específicos, que pueden ser exigentes o que se presentan mezclados con muchos otros.

Cultivo celular

Algunas bacterias y todos los virus son gérmenes intracelulares estrictos, de forma que sólo
se pueden cultivar en células vivas. En 1949 Enders describió una técnica para cultivar
células de mamífero y aislar poliovirus. Esta técnica se ha ampliado para poder cultivar la
mayor parte de los gérmenes intracelulares estrictos. Los cultivos celulares pueden ser
células que crecen y se dividen sobre una superficie (es decir, una monocapa de células) o
células suspendidas en un medio de cultivo.

Algunos cultivos celulares están bien establecidos y se pueden mantener de forma

indefinida. Estos medios se comercializan en general. Otros cultivos celulares se deben
preparar inmediatamente antes de infectarlos con bacterias o virus y no se pueden mantener
en el laboratorio más de unos pocos ciclos de división (cultivos celulares primarios). La
entrada a las células se suele regular por la existencia de receptores específicos, de forma
que se puede emplear la capacidad diferencial de infectar líneas celulares específicas para
predecir la identidad de una bacteria o virus.

La presentación clínica de la mayor parte de las enfermedades (es decir, septicemia,

neumonía, gastroenteritis, infecciones intraabdominales) se puede asociar a muchos
gérmenes. De hecho, resulta excepcional sospechar un germen específico en un proceso
(carbunco provocado por Bacillus anthracis, histoplasmosis causada por Histoplasma
capsulatum, gripe por el virus influenza). Por tanto, es importante que el laboratorio de
diagnóstico seleccione los medios de cultivo apropiados para recuperar la mayor parte de
los gérmenes habituales y seleccionar medios especializados cuando el médico sospeche un
germen específico.
En general, las muestras obtenidas de sitios normalmente estériles (es decir, líquidos
estériles como la sangre o el líquido cefalorraquídeo, tejidos) se inoculan en agares o caldos
de cultivo no selectivos enriquecidos (agar chocolate o sangre, tioglicolato u otros medios
de enriquecimiento). Si la muestra puede estar contaminada con la flora de gérmenes
normales del paciente, se añaden medios diferenciales y selectivos (agar Mac-Conkey). Si
se sospecha un germen específico, se deberá añadir también el medio para recuperarlo. Por
tanto, se pueden inocular los gérmenes en muchos medios. Esto se complica todavía más si
se tienen que elegir medios de cultivo para recuperar bacterias, micobacterias y hongos.

Es importante elegir con cuidado el número de cultivos y pruebas de otro tipo, sobre todo
cuando la cantidad de muestra sea limitada. Si se realizan demasiados cultivos, tinciones,
estudios antigénicos y pruebas basadas en los ácidos nucleicos, la muestra podría quedar
tan diluida que la cantidad resultará inadecuada para todas las pruebas solicitadas. Por este
motivo, es importante que el microbiólogo y el clínico colaboren para elegir las pruebas
más sensibles y adecuadas. En muchos casos esta colaboración lleva a eliminar las
tinciones microscópicas y las pruebas antigénicas para maximizar la cantidad de muestra
que se puede cultivar.

Ahora bien, según el formato de presentación del medio de cultivo tenemos: sólido en
placas (medios con agar envasados en placas de Petri), sólido en tubo (en este caso suele
ser agar inclinado (se deja enfriar en esta posición para que la superficie del medio sea
mayor).líquido en tubo (por ejemplo, agua de peptona) y semisólido en tubo (por ejemplo,
caldo de tioglicolato). Bajo esta perspectiva, los cultivos pueden ser sólidos o líquidos. Los
medios de cultivo líquidos (o caldos) son aquellos que no contienen ningún agente
gelificante, por lo que los microorganismos crecen por todo el medio. El crecimiento en
este tipo de medios es más rápido puesto que la movilidad permite acceder de una forma
más fácil a los nutrientes.

Los medios de cultivo se preparan con frecuencia en forma semisólida o sólida mediante la
adición al medio líquido de un agente solidificante. Los medios sólidos inmovilizan a las
células permitiéndoles crecer y formar masas aisladas visibles llamadas colonias. Tienen
una proporción de agar de aproximadamente el 1.5%. El crecimiento se desarrolla en la
superficie del medio. Por otra parte, los medios de cultivo semisólidos son aquellos que
contienen una proporción de agar inferior a 0,5%. Suelen utilizarse para pruebas
bioquímicas y de movilidad.

Las colonias bacterianas pueden ser de formas y tamaños variables dependiendo del
microorganismo, las condiciones del cultivo, el suministro de nutrientes (como la cantidad
de oxígeno presente) y otros parámetros fisiológicos. Algunas bacterias producen
pigmentos que dan color a las colonias. Independientemente de su posible pigmentación,
las colonias permiten al microbiólogo reconocer la pureza del cultivo; las placas que
contengan más de un tipo de colonias no fueron sembradas en un cultivo puro (axénico). De
este modo la placa de Petri se ha venido utilizando por más de un siglo como criterio para
establecer la pureza en los cultivos.

Los medios sólidos se preparan igual que los líquidos salvo que antes de esterilizar los
medios, se les añade agar como agente gelificante, normalmente al 1,5%. El agar se funde
durante el proceso de esterilización y el medio fundido se vierte sobre placas de cristal o de
plástico y se deja solidificar antes de usar.

En la virología diagnóstica se utilizan tres tipos básicos de monocapas de cultivos celulares.

El cultivo celular primario, en el que todas las células tienen un conteo cromosómico
normal (diploide), se deriva del crecimiento inicial de células de una fuente de tejido. Una
segunda dispersión y propagación producen el cultivo celular secundario, que por lo normal
retiene características similares a aquellas del cultivo primario (cuenta cromosómica
diploide y susceptibilidad a virus). Las células renales embrionarias de monos y humanos
son ejemplos de cultivos celulares primarios y secundarios de uso común.

Las dispersiones y cultivos posteriores de los cultivos celulares secundarios por lo general
conducen a uno de dos resultados: las células mueren con el tiempo o pasan por una
transformación espontánea en la que cambian las características del desarrollo, varía la
cuenta cromosómica (haploide o heteroploide) y difiere la susceptibilidad a la infección
vírica en contraste con el cultivo original. Estos cultivos celulares tienen características de
“inmortalidad”; es decir, pueden volver a dispersarse y cultivarse en diversas ocasiones
(pases seriados de cultivos celulares).
También pueden obtenerse a partir de células de tejido canceroso o producirse mediante
exposición a agentes mutagénicos in vitro. Tales cultivos se conocen comúnmente como
líneas celulares. Una línea celular de uso diagnóstico común es la Hep-2, derivada de un
carcinoma epitelial humano. Un tercer tipo de cultivo a menudo se denomina cepa celular.
Este cultivo consiste en células diploides, a menudo fibroblásticas, que pueden volver a
dispersarse y cultivarse un número finito de veces; por lo general pueden hacerse 30 a 40
pases del cultivo celular antes de que la cepa se agote o presente transformaciones
espontáneas. Los fibroblastos embrionarios de amígdalas y pulmones son cepas celulares
comunes de uso diagnóstico rutinario.

Actualmente, algunos laboratorios han incorporado además de los medios de cultivo

tradicionales otros medios denominados cromogénicos. Este tipo de medios de cultivo
incorporan sustancias cromogénicas que al ser utilizadas por un microorganismo dan como
resultado un color que caracteriza a cada especie o grupo y las diferencia de otras. Es una
herramienta potente y rápida para la identificación visual de microorganismos.

Técnica aséptica

Dado que los microorganismos son ubicuos, como lo indicó Pasteur, los medios de cultivo
deben ser esterilizados antes de usarse. Todos los medios de cultivo han de estar
perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar,
enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especímenes
inoculados en dichos medios.

Para la mayoría de los medios de cultivo esto se realiza por calor, habitualmente mediante
calor húmedo en un gran recipiente a presión llamado autoclave. Una vez preparado el
medio de cultivo estéril, puede recibir un inóculo de un cultivo puro y cultivarlo
nuevamente. Esto requiere el uso de la técnica aséptica. La técnica aséptica consiste en una
serie de procedimientos que evitan la contaminación durante la manipulación de los
cultivos y de los medios de cultivo estériles. Su aprendizaje es esencial para tener éxito en
el laboratorio de microbiología y representa uno de los primeros métodos que tiene que
dominar un microbiólogo.
El problema más común es la contaminación ambiental a través del aire, ya que este
siempre contiene polvo en suspensión que generalmente lleva una comunidad de
microorganismos. Cuando las placas o tubos se abren deben manejarse de tal modo que los
contaminantes del aire no penetren. La transferencia aséptica de un cultivo desde un tubo
con medio a otro se realiza habitualmente con el asa o aguja de siembra previamente
esterilizada a la llama por incandescencia. Los cultivos en los que ha habido crecimiento se
pueden transferir luego a la superficie de placas con agar.

Donde se desarrollarán las colonias como resultado del crecimiento y división de las
células aisladas que han sido sembradas. La toma y resiembra por extensión de una colonia
aislada es un método idóneo para obtener cultivos axénicos o puros a partir de mezclas
complejas que contienen muchos organismos diferentes.

Preparación de medios de cultivo

Los medios de cultivo puede adquirirse comercialmente listos para su uso o se pueden
preparar en el laboratorio a partir de material deshidratado (el cual contiene los
componentes necesarios para elaborar cada uno de los tipos de medios existentes). Para su
elaboración hay que seguir las instrucciones dadas por el fabricante, que se especifican en
el prospecto del envase. Siempre es recomendable y se incluye como una regla básica
la de leer las instrucciones de las etiquetas de los medios de cultivo, por ello no se
recomienda reenvasar los medios sino, mantener los en los recipientes originales.

Normalmente consiste en disolver el medio deshidratado en agua destilada, proceso que se

conoce como reconstitución. La cantidad de agua será la que indica el fabricante. En el caso
de medios que contienen agar como agente gelificante, hay que disolver agitando y
calentando a la vez, debido a que el agar funde en torno a 100 ºC.

Para ello se puede utilizar un termoagitador magnético (que evita una ebullición
prolongada). Una vez reconstituido el medio de cultivo, hay que esterilizarlo para
asegurarse de que no crecerá ningún microorganismo contaminante, ya que el objetivo del
cultivo es determinar el crecimiento de los microorganismos presentes en muestras clínicas
para su posterior identificación. La esterilización se realiza en una autoclave a 121 ºC
durante 15-20 min. Los medios de cultivo en tubo se fraccionan antes de esterilizar y se
introducen en el autoclave tapados con algodón graso y papel de aluminio.

Sin embargo, los medios sólidos en placa se suelen esterilizar en recipientes grandes
(botellas o matraces) con tapón de plástico o algodón graso. Posteriormente se recomienda
esperar a que la temperatura baje a unos 45-50 ºC para fraccionarlo en placas, siempre
cerca del mechero para evitar contaminación ambiental tal. El fraccionamiento consiste en
depositar una pequeña cantidad en la placa, hasta que alcance unos 4 mm de altura. Dejar
enfriar a temperatura ambiente hasta que solidifique por completo. Una vez sólido, se
invierte (de tal forma que la superficie de apoyo sea la tapa de la placa) y se almacena
refrigerado a 4 ºC.

Los medios de cultivo que incluyen en su composición sustancias termolábiles, es decir,

que se alterarían tras someterse a un tratamiento con calor, necesitan un procedimiento
alternativo para su esterilización. Generalmente se realiza filtración con membranas de un
diámetro de poro de 0,2 a 0,45 μm. Los virus no se eliminan, pero sí las bacterias y hongos
que pudieran contaminar el medio. Serían ejemplos de sustancias termolábiles el suero y
determinados antibióticos.

Servido de los medios de cultivo

Una vez estéril los medios de cultivo deben ser enfriados a temperatura promedio
de 45º - 55ºC para ser adicionados en los recipientes finales teniendo en cuenta
nuevamente las técnicas asépticas. Los materiales a utilizar serán: 3 erlenmeyers de 100 ml,
6 cajas de petri , 2 tubos de ensayo, 1 pipeta de 10 ml, 1 probeta de 100 ml, Espátula,
Balanza, Pesasal, Autoclave, estufa y horno, Agares SPC (estándar para conteo en
placa), EMB (eosina azul de metileno), OGY (oxitetraciclina glucosa yeast), y caldo
nutritivo. En el procedimiento se deben realizar los cálculos respectivos para agar y
caldo teniendo en cuenta que para cada caja deben servir 15-18 ml de agar y para
cada tubo entre 7-10 ml de caldo. Por ejemplo, para preparar 6 cajas con agar SPC, se
debe multiplicar 6 por 15 ml = 90 ml, luego se mide el volumen de agua destilada según sus
cálculos. Teniendo en cuenta el volumen de agua a utilizar, se hace la relación de polvo de
agar que se debe pesar de acuerdo a lo especificado en la etiqueta del medio. Pese la
cantidad del medio necesario de acuerdo a los cálculos. Luego, hay que mezclar el polvo
con la mitad del volumen de agua medida anteriormente, se agita y se adiciona el restante
de agua. Se hierve si es necesario (en caso de los Agares). Se esteriliza en el autoclave a 15
lb de presión a 121ºC por 15 minutos. Posteriormente se sirven 15-18 ml aproximadamente
de agar en cada caja cuando la temperatura este a 50-55ºC, se tapan y se deja solidificar. Lo
mismo con los caldos, se sirven 7-10 ml en cada tubo y se tapan. Se dejan enfriar y se
guardan en la nevera hasta su utilización

Sistemas de microbiología clínica

Se requieren sistemas de rutina en el laboratorio para procesar muestras provenientes de

diversos sitios porque no existe un solo medio o atmósfera que sea ideal para todas las
bacterias. Las combinaciones de caldos y placas sólidas, así como de incubación aeróbica,
en CO2 y anaeróbica, deben ajustarse según los organismos esperados para cualquier
localización o circunstancia clínica particular. En general, no resulta práctico incluir medios
especializados para el aislamiento de organismos inusuales como Corynebacterium
diphtheriae. Para la detección de éstos y otros organismos poco comunes, es necesario que
el médico informe al laboratorio puntualmente en cuanto a la posibilidad de su presencia.
Entonces, se pueden incluir medios y procedimientos especiales. Los sistemas de rutina
están diseñados para detectar los organismos más comunes.

Identificación

Una vez que se detecta crecimiento en cualquier medio, empieza el proceso de

identificación. La identificación implica métodos para la obtención de cultivos puros de
colonias individuales, seguidos de pruebas diseñadas para la caracterización e
identificación del aislado. Los análisis y sus secuencias precisas varían según los distintos
grupos de organismos, y el nivel taxonómico (género, especie, subespecie y demás) de
identificación que se necesita varía de acuerdo con la utilidad médica de la información. En
algunos casos, sólo se necesita una descripción general o la exclusión de ciertos organismos
específicos. Por ejemplo, un informe de “flora oral mixta” en una muestra de esputo o
“ausencia de N. gonorrhoeae” en una muestra cervical puede ofrecer toda la información
que se necesita. El nivel de identificación se relaciona con su pertinencia médica
Características que se utilizan para la clasificación de bacterias y hongos

Características culturales

Las características culturales incluyen la demostración de propiedades tales como los

requisitos nutricionales únicos, producción de pigmento y capacidad de crecer en presencia
de ciertas sustancias (cloruro de sodio, bilis) o en ciertos medios (agar MacConkey,
nutritivo). También se utiliza un análisis de la capacidad de desarrollo a ciertas
temperaturas o de ocasionar hemólisis en placas de agar sangre. En el caso de los hongos, la
proliferación como colonia de levaduras o moho es el separador primario; en el caso de los
mohos, la morfología de las estructuras del moho (hifas, conidios, etc.) es el medio
principal de identificación. El crecimiento bajo condiciones diversas tiene un valor
diferencial, es decir, determinar los requisitos de cada uno de los medios para poder
favorecer el crecimiento microbiano es indispensable para establecer un diagnóstico
diferencial entre especies.

Características bioquímicas

La capacidad de atacar diversos sustratos o de fabricar productos metabólicos particulares

tiene una amplia aplicación para la identificación de bacterias y levaduras. Ciertos
microorganismos tienen mayor tropismo o afinidad por productos en específico, por ende,
utilizarlos en el medio nos pueden ayudar a determinar si se trata de una bacteria o de un
hongo, esto recordando que existe el conocimiento previo de los componentes a los que
responde cada especie. Las pruebas bioquímicas y de cultivo para la identificación
bacteriana se analizan por referencia a cuadros que muestran los patrones de reacción
característicos de especies individuales. De hecho, los avances en el análisis computarizado
se han aplicado en la actualidad a la identificación de muchos grupos bacterianos y
fúngicos. Estos sistemas utilizan los mismos principios bioquímicos junto con bases de
datos computarizadas a fin de determinar la identificación más probable a partir de los
patrones de prueba observados. Las reacciones bioquímicas analizadas mediante tablas y
computadoras proporcionan una probable identificación

Producción de toxinas y patogenicidad.

Las toxinas pueden ser producidas por bacterias, virus y hongos, dependiendo de su
naturaleza, y este, es un factor determinante de su patogenecidad, es decir, su capacidad
para producir la enfermedad. Las toxinas pueden describirse como compuestos que produen
los microorganismos para evadir los mecanismos de la respuesta inmune del hospedador.
Rara vez se necesita evidencia directa de virulencia en animales de laboratorio para la
confirmación de un diagnóstico clínico. En algunas enfermedades ocasionadas por la
producción de una toxina específica, es posible detectar a la misma in vitro a través de
cultivos celulares o de métodos inmunológicos. La neutralización del efecto tóxico por
medio de una antitoxina específica suele ser el enfoque habitual para la identificación de la
toxina. La detección de una toxina específica puede definir la enfermedad.

Estructura antigénica.

Los virus, bacterias, hongos y parásitos poseen muchos antígenos, como polisacáridos
capsulares, proteínas superficiales y componentes de la pared celular. La serología implica
el uso de anticuerpos de especificidad conocida para detectar a los antígenos presentes en
organismos enteros o libres en extractos (antígenos solubles).

Estructura genómica.

El parentesco entre secuencias de ácidos nucleicos según se determina por homología y por
comparaciones directas entre secuencias se ha convertido en un determinante primario de
las decisiones taxonómicas. Cada microorganismo posee ciertas características basándose
en su genética, así, su introducción en un medio de cultivo y su desarrollo en el mismo con
ciertas características fenotípicas (color, disposición, morfología), nos aportará información
sobre las bases genéticas de la bacteria y por supuesto se logrará su identificación

En consecuencia y por lo anteriormente explicado, el éxito de los métodos de cultivo

depende de la biología del microorganismo, del lugar de la infección, de la respuesta
inmunitaria del paciente frente a la misma y de la calidad del medio de cultivo. Por
ejemplo, la bacteria Legionella es un patógeno respiratorio importante; sin embargo, nunca
se consiguió cultivar hasta que se reconoció que su recuperación dependía de disponer de
un medio enriquecido con hierro y L-cisteína. Campylobacter, un importante patógeno
entérico, no se consiguió recuperar de las muestras de heces hasta que se incubaron medios
altamente selectivos a 42 0C en una atmósfera microaerófila.

Chlamydia, una importante bacteria responsable de enfermedades de transmisión sexual, es

un patógeno intracelular obligado que debe ser cultivado en células vivas. Staphylococcus
aureus, que es la causa del síndrome del shock tóxico estafilocócico, produce la enfermedad
mediante la liberación de una toxina hacia el sistema circulatorio. El hemocultivo siempre
será negativo, mientras que el cultivo de la lesión en la que crece el germen sí permite
detectarlo. En muchas infecciones (gastroenteritis, uretritis, faringitis), el germen
responsable de la infección se asocia a otros muchos gérmenes que son parte de la flora
microbiana normal de la región infectada.

Se han desarrollado muchos medios de cultivo que permiten suprimir estos gérmenes
existentes en condiciones normales y facilitan la detección de los que tienen importancia
clínica. La inmunidad innata y adaptativa del paciente pueden suprimir el patógeno, de
forma que con frecuencia se necesitan técnicas de cultivo muy sensibles. Del mismo modo,
algunas infecciones se caracterizan por la existencia de relativamente pocos gérmenes (por
ejemplo, la mayoría de los pacientes sépticos tienen menos de un germen por mL de
sangre), por lo que es necesario a menudo el uso de cultivos enriquecidos. Por último, se
debe controlar con cuidado la calidad de los medios de cultivo para garantizar que su
rendimiento se corresponde con el exigido.

Relativamente pocos laboratorios preparan en la actualidad sus propios medios de cultivo.

La mayor parte son producidos por empresas con experiencia en la fabricación de los
mismos. Aunque esto aporta evidentes ventajas, también implica que la mayoría de los
medios de cultivo no sean “recientes”. Aunque en general esto no representa un problema,
puede condicionar la recuperación de algunos gérmenes complicados (Bordetella pertussis).
Por tanto, los laboratorios que realizan pruebas sofisticadas con frecuencia disponen de la
capacidad de fabricar una cantidad limitada de medios de cultivo especializados. Se
comercializan fórmulas deshidratadas de la mayor parte de estos medios de cultivo, lo que
permite esta fabricación con mínimas dificultades.
 CONCLUSIONES

En primer lugar, para la proliferación microorganismos es necesaria la existencia de alguna

forma de energía, como todo ser vivo, esta fuente de energía puede venir de la respiración,
de la fermentación o de la fotosíntesis; también, hay que tomar en cuenta los
requerimientos nutricionales, tomando en cuenta entre estos nutrientes fundamentales el
carbono, el fosforo, el azufre, nitrógeno, minerales como el magnesio y por supuesto iones
orgánicos como el sodio, el potasio, el calcio, entre otros. Existen por otra parte factores
ambientales que pueden o no, dependiendo del germen, favorecer al desarrollo en el medio
de cultivo, estos factores ambientales incluyen la temperatura, el oxígeno, la concentración
de hidrogeniones, la luz y otros.
En base a estos elementos mencionados, y con el conocimiento base de las necesidades
para cada bacteria, virus u hongo, se debe seleccionar el medio más adecuado. Esto va a
depender de nuestros intereses, si se quieren aislar un germen en específico de puede
utilizar un medio selectivo (por ejemplo: agar-chocolate para Neisseria Gonorreae), así hay
medios específicos para microorganismos afines a betahemólisis, glocosa, sales y otros
componentes. Con la adición de nutrientes, obtenemos un medio enriquecido. Dependiendo
del resultado que se desea en un medio líquido los microorganismos van a crecer en todo el
medio, en un medio sólido se usan sustancias para inmovilizarlos y favorecer la formación
de colonias.

A pesar de los avances en estudios diagnósticos en microbiología, todavía el cultivo se

considera uno de los métodos vigentes y más utilizados para ofrecer el diagnóstico
concluyente de cualquier enfermedad causada por microorganismos. Existen también
medios especializados (para organismos intracelulares obligatorios) sin embargo estos
requieren de técnicas avanzadas. No obstante convencionalmente se preparan tubos o
placas previamente esterilizados por autoclave a 121 ºC durante 15-20 min, a los cuales se
añaden los elementos necesarios de acuerdo a el tipo de medio que se desea realizar.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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