Medición de la infectividad del virus

Estos ensayos generalmente se consideran los métodos de cuantificación

viral más antiguos y más ampliamente utilizados. Todos son de naturaleza biológica y
requieren mucho tiempo y trabajo. Además, muchos requieren capacitación
especializada y reactivos específicos para poder realizarlos.

Ensayo de placa viral.

Ensayo de enfoque fluorescente (FFA).
Ensayo de dosis infecciosa de cultivo de tejidos (TCID50).
Evaluación basada en la concentración de antígeno o expresión génica
Se pueden realizar evaluaciones relativas de la producción viral mediante la
cuantificación de antígenos virales específicos o los
niveles de expresión de ciertas secuencias de genes virales. Sin embargo, los valores así
obtenidos pueden no estar directamente
correlacionados con el número de partículas virales. Para los ensayos basados en
proteínas, se esperaría que la presencia de
antígenos disociados libres en solución sesgue los resultados. Para los ensayos basados
en genes, los artefactos creados durante
los pasos de amplificación, la calidad de los reactivos y los cebadores, así como las
diferencias en la experiencia técnica de los
experimentadores también pueden afectar la medición.
Cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).
La cromatografía líquida (HPLC), es una técnica utilizada para separar los componentes
de una mezcla. Consiste en una fase estacionaria no polar (columna) y una fase móvil.
La fase estacionaria es sílica que se ha tratado con RMe2SiCl . La fase móvil actúa de
portador de la muestra. La muestra en solución es inyectada en la fase móvil. Los
componentes de la solución emigran de acuerdo a las interacciones no-covalentes de los
compuestos con la columna. Estas interacciones químicas, determinan la separación de
los contenidos en la muestra. La utilización de los diferentes detectores dependerá de la
naturaleza de los compuestos a determinar.
Ensayo de hemaglutinación (HA). Desarrollado en la década de 1940, el ensayo de HA
se usa específicamente
para evaluar los virus de la influenza en función de su capacidad para agregar glóbulos
rojos (GR). Brevemente,
las muestras de sangre de mamíferos se distribuyen en pozos de fondo redondo de una
placa de paredes
múltiples, y se agregan diluciones de inóculo viral. Las partículas virales que llevan la
proteína hemaglutinina se
unirán a los glóbulos rojos en solución, creando focos de glóbulos rojos agregados que
crecen en redes
incapaces de precipitación normal
Por lo tanto, los pozos se pueden puntuar según si los glóbulos rojos
precipitan o no en el fondo de los pozos, formando puntos visibles.
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Una variación común de este ensayo es el
ensayo de inhibición de HA (ensayo HI), que permite evaluar la presencia de
anticuerpos antivirales en suero.
Al unirse a la proteína hemaglutinina en la superficie de las partículas virales,
En 2009, este ensayo permitió a los investigadores del Centro para el Control de
Enfermedades (CDC) determinar que algunos
adultos poseen anticuerpos circulantes de reacción cruzada contra el H1N1, lo que los
hace menos susceptibles a la infección
severa [9,10]. Sin embargo, aunque es rápido y fácil de realizar, la interpretación de los
ensayos de HA puede ser problemática ya
que varios niveles de aglutinación parcial pueden ser difíciles de clasificar como
positivos o negativos. Además, los ensayos de
HA todavía no alcanzan un nivel razonable de cuantificación viral, ya que solo se
pueden realizar evaluaciones relativas
Inmunodifusión radial simple (SRID). Los ensayos SRID se basan en la difusión radial
de antígenos virales purificados
(estándares) y partículas virales a través de gel de agarosa sembrado con antisueros
policlonales contra un antígeno
viral [11]. En este ensayo, los estándares conocidos y
Las muestras virales se asignan a pequeños orificios perforados en el gel impregnado de
antisueros, y la difusión radial hacia el exterior
ocurre durante un período de tiempo de 10 horas a varios días. Al comparar los tamaños
de los anillos formados alrededor de los pocillos
de muestra y normalizándolos a los anillos formados por los estándares conocidos, se
puede inferir la cantidad aproximada de ese
antígeno viral. En particular, este ensayo parece haber ganado popularidad dentro de la
comunidad de la gripe, donde se usa como un
método ortogonal para HA. Sin embargo, se han planteado inquietudes sobre el tiempo
requerido para realizar estos ensayos [12-13].
Además, se ha informado una considerable variación entre laboratorios, lo que también
ha generado inquietud, particularmente a la luz
de los recientes brotes de influenza pandémica [12]. Más lejos, El costo de crear geles
de agarosa con grandes cantidades de antisueros
policlonales incorporados en sus matrices puede ser una barrera para el uso
generalizado. Un ensayo relacionado, el ensayo de
hemólisis radial simple (SRH), también es de uso común. El ensayo utiliza gel de
agarosa impregnado con glóbulos rojos concentrados
de mamíferos y la posterior observación de la lisis radial de estas células alrededor de
los pozos en los que se han sembrado virus
[14-15]. Este enfoque se utiliza principalmente para evaluar la potencia del anticuerpo
anti-HA en el desarrollo de vacunas estacionales.
Aunque se ha respetado el tiempo, recientemente se han planteado inquietudes debido a
la falta de estandarización, la considerable
variación entre laboratorios y el tiempo necesario para completar [16]. El ensayo utiliza
gel de agarosa impregnado con glóbulos rojos
concentrados de mamíferos y la posterior observación de la lisis radial de estas células
alrededor de los pozos en los que se han
sembrado virus [14-15]. Este enfoque se utiliza principalmente para evaluar la potencia
del anticuerpo anti-HA en el desarrollo de
vacunas estacionales. Aunque se ha respetado el tiempo, recientemente se han planteado
inquietudes debido a la falta de
estandarización, la considerable variación entre laboratorios y el tiempo necesario para
completar [16]. El ensayo utiliza gel de agarosa
impregnado con glóbulos rojos concentrados de mamíferos y la posterior observación
de la lisis radial de estas células alrededor de los pozos en los que se
Ensayo de inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA).
es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta
mediante un anticuerpoenlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable,
como cambio de color o algún otro tipo
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n base al modo en el que se den las interacciones antígeno-anticuerpo, los ELISAs se
clasifican en 4 tipos: ELISA directo, ELISA indirecto, ELISA tipo sándwich y ELISA
competitivo.
1.- ELISA directo
El ELISA directo es el ensayo ELISA más simple y rápido de todos, donde un
anticuerpo primario marcado con una enzima se unirá directamente al antígeno de
interés permitiendo la detección y/o cuantificación del mismo.
El procedimiento simplificado sería el siguiente:
1º El antígeno se inmoviliza sobre una placa
2º Se añade un anticuerpo primario marcado con una enzima que se unirá al antígeno
de interés
3º Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal visible
que permitirá la detección y/o cuantificación del antígeno de interés.
2.- ELISA indirecto
Es un ensayo parecido al ELISA directo pero en dos pasos, lo que permite amplificar la
señal obtenida. En este caso se utilizan dos anticuerpos, uno primario y otro secundario,
y es este último el que irá conjugado a una enzima.
El procedimiento simplificado sería el siguiente:
1º El antígeno se inmoviliza sobre una placa
2º Se añade un anticuerpo primario sin marcar que se une al antígeno de interés
3º Se añade un anticuerpo secundario marcado con una enzima que se unirá al
anticuerpo primario
4º Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal visible
que permitirá la detección y/o cuantificación del antígeno de interés.
LISA tipo sándwich
En el ELISA tipo sándwich el antígeno queda inmovilizado entre dos anticuerpos, uno
de captura y otro de detección también conocidos como pares de anticuerpos, que se
unirán a dos epítopos distintos de un mismo antígeno.
es la porción de una macromolécula que es reconocida por el sistema inmunitario,
específicamente la secuencia a la que se unen los anticuerpos

Los ensayos conocidos como ELISA sándwich utilizan dos anticuerpos específicos
contra el antígeno para capturarlo a manera de emparedado (sándwich) en la placa de
detección. En una primera la primera etapa, el antígeno de interés se añade a un
anticuerpo primario unido a una placa. Durante una segunda incubación, se añade un
anticuerpo secundario al complejo antígeno anticuerpo primario formado en el primer
paso. El anticuerpo secundario puede estar directamente conjugado a una enzima que
sólo requiera la adición del sustrato o estar unido a un marcador que requiera la adición
de un segundo compuesto que es el que reaccionará directamente con el sustrato. los
anticuerpos de detección secundaria conjugados con enzimas como la peroxidasa
de rábano picante (HRP) o la fosfatasa alcalina (AP) se utilizan para marcar los
objetivos unidos al anticuerpo. La cantidad de blanco unido se determina luego por los
cambios colorimétricos provocados por la adición de sustrato, que adquiere color
cuando las enzimas actúan sobre él. La intensidad
de un cambio colorimétrico es proporcional a la cantidad de enzima, que, a su vez, es
proporcional al número de anticuerpos de detección unidos

ELISA competitivo
El ELISA competitivo es una variante más compleja de la técnica ELISA, también
conocido como ELISA de inhibición debido al uso de un antígeno de referencia que
competirá con el antígeno de la muestra por unirse al anticuerpo primario.
Se utiliza generalmente para detectar y/o cuantificar antígenos presentes en muy bajas
cantidades.
El procedimiento simplificado sería el siguiente:
1º El antígeno de referencia se inmoviliza sobre la placa.
2º Por otro lado, un exceso de anticuerpo primario sin marcar se incuba con la muestra
que contiene el antígeno de interés, dando lugar a la formación de complejos antígeno-
anticuerpo
3º Se añade la mezcla antígeno-anticuerpo a la placa, donde el antígeno de referencia
competirá con el antígeno de la muestra por unirse al anticuerpo
4º Se lava la placa eliminando los complejos antígeno-anticuerpo solubles
5º Se añade a la placa un anticuerpo secundario marcado con una enzima que se unirá al
anticuerpo primario anclado al antígeno de referencia.
6º Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal visible
que será inversamente proporcional a la cantidad de antígeno de interés presente en la
muestra.

CITOMETRIA DE FLUJO
Es una técnica que permite obtener información sobre poblaciones celulares a partir de
un estudio individualizado de un gran número de células (habitualmente entre 5000 y
10000) que por tanto serán una muestra lo suficientemente representativa del conjunto
poblacional. La suspensión de células en solución isotónica se hace pasar a través de un
pequeño orificio de modo que cuando salen lo hacen una a una (en fila india) formando
parte de una corriente continua o flujo cilíndrico.

Sobre esta corriente de células se hace incidir un haz de luz láser, cuya dispersión y
reflexión son analizados en duración, intensidad y espectro, los datos obtenidos
almacenados en memoria de ordenador y desde allí pasados a archivos binarios que
posteriormente pueden ser analizados con detenimiento.

Reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa (qPCR). qPCR se puede usar para

cuantificar la cantidad de ADN o ARN viral presente en una muestra dada.
Brevemente, los ácidos nucleicos virales se purifican a partir de una muestra, luego,
usando un cebador específico de virus, la PCR se realiza en presencia de una tinción
de ácido nucleico de dsDNA o un indicador específico de secuencia como TaqMan. A
medida que aumenta la amplificación del ADN, aumenta la señal del fluoróforo que
informa. La velocidad de este aumento es proporcional a la cantidad de material fuente
nuclear inicial presente. El número de termociclos necesarios para producir un
nivel mínimo de fluorescencia (llamado valor Ct) se compara con el de un estándar
diluido en serie. Esta comparación produce el número de genomas en comparación
con un estándar viral. La PCR cuantitativa tiene muchas ventajas: es relativamente
rápida, bastante específico y utiliza equipos fácilmente disponibles en un laboratorio de
biología molecular. Sin embargo, tiene varios inconvenientes. Uno es el requisito de
cebadores específicos de virus de alta calidad para llevar a cabo la reacción de PCR.
Si se trata de muchos tipos de virus, o cepas estacionalmente diferentes, los cebadores
deben diseñarse específicamente para cada virus o cepa viral.
Conteo directo de partículas virales en solución
El conteo directo de partículas virales es un enfoque atractivo para cuantificar y
caracterizar cultivos
virales. Sin embargo, un medio para lograr esto ha sido, hasta hace poco, muy limitado.
Microscopía electrónica de transmisión (TEM). El conteo de partículas virales a través
de TEM se ha considerado durante
mucho tiempo como un "estándar de oro" en la cuantificación absoluta de partículas
virales. En TEM, los haces de electrones
se transmiten a través de muestras biológicas que han sido fijadas con aldehído y teñidas
positiva o negativamente. Las
manchas positivas etiquetan las partículas virales, mientras que las manchas negativas
etiquetan el fondo, creando contraste
entre las partículas virales y la superficie subyacente.
En general, los protocolos de tinción positiva proporcionan
información como el tamaño de partícula viral y el recuento a obtener, mientras que la
tinción negativa permite resolver
los detalles estructurales [18]. La preparación de muestras para el análisis con TEM
puede ser extensa y tediosa y, a
menudo, debe desarrollarse con el tiempo. Además, debido a que el método requiere
que los técnicos cuenten
directamente las partículas virales, existe una variabilidad sustancial entre los
operadores. No es sorprendente que TEM
requiera equipo especializado, capacitación extensa y soporte técnico y recursos
experimentados.
El Virus Counter® 3100. El contador de virus es un citómetro de flujo diseñado
específicamente para detectar partículas de
virus utilizando sistemas de control de fluidos patentados y una tecnología de etiquetado
de doble mancha. Está optimizado
para la cuantificación rápida de virus con un tiempo de análisis de menos de 5 minutos y
se puede convertir en una
plataforma de análisis totalmente automatizada. Con el sistema Combo Dye, los
genomas virales (y los ácidos nucleicos en
general) y las proteínas de la envoltura se tiñen con tintes fluorigénicos que se emiten en
las regiones amarilla y roja del
espectro visible. Este enfoque para la tinción permite la detección de una amplia
variedad de virus usando un simple
ensayo sin lavado. Usando tecnología de fluidos patentada, las partículas virales teñidas
se enfocan hidrodinámicamente
en una corriente estrecha y pasan a través de un punto de interrogación láser en el
Contador de virus. La fluorescencia
emitida se detecta en dos canales ópticos separados donde los elementos de hardware y
software de compensación óptica
corrigen cualquier diafonía entre canales. Las explosiones de fluorescencia en cada
canal se cuentan en función del
tiempo.
es esencial utilizar métodos alternativos y
adicionales [36] . Entre estos, la detección de pulso resistivo sintonizable (TRPS) y el
análisis de
seguimiento de nanopartículas (NTA) son adecuados para la determinación de partículas
que van
desde unas pocas decenas hasta varios cientos de nanómetros, de acuerdo con muchos
virus.
estas técnicas permiten la determinación simultánea de la
distribución y concentración del tamaño de partícula. [37 - 43] . Se demostró que TRPS
mide
adecuadamente las concentraciones de dispersiones biológicas de nanopartículas [37] ,
como los
virus
[38,39] . NTA es apropiado para contar virus tan pequeños como el virus de la
encefalomiocarditis o el
virus del mosaico de Brome [42] , con un diámetro de alrededor de 35 nm y para la
detección de partículas
de hasta 1000 nm, deter
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detector de detección de pulso resistivo (RPS), que se basa en la medición de
resistencia. Revisamos
APLICACIONES DE RPS PARA DETECCIÓN DE VIRUS Los detectores PRS
generalmente se componen de sensores electrónicos y nanoporos que permiten que cada
nanopartícula en una muestra pase a través de ellas una por una. La electrónica de
detección comúnmente incluye electrodos Ag / AgCl, un amplificador de corriente, un
filtro y una unidad de adquisición de datos, mientras que los nanoporos pueden variar
claramente en dimensión, material, geometría y estructura
algunos poros son cilíndricos y generan un pulso simétrico, aunque la abrumadora
mayoría de los poros tienen forma cónica y producen un pulso asimétrico que indica la
dirección de la translocación ( Davenport
 que partículas, suspendidas en un fluido débilmente conductor, fluya a través de un
nanoconstriction, y se detectan eléctricamente por electrodos colocados en cada lado de la
nanoconstriction.

Aquí, llevamos a cabo mediciones de espectroscopía de dominio de tiempo THz

Radiación de terahercios (TDS) para demostrar la detección de
los virus bacteriófagos PRD1 (60 nm) y MS2 (30 nm), que son virus representativos de
ADN bicatenario y ARN
monocatenario, respectivamente. Sus tamaños van desde λ / 5,000 a λ / 10.000 de las
ondas de THz incidentes. Los
metamateriales se fabricaron con micro y nano espacios, y los cambios de resonancia de
los metamateriales se observaron
en función de las densidades de la superficie del virus.