UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO

FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS

INFORME DE PRÁCTICA DE LABORATORIO
Nivel Octavo Bioquímica
Docente Cecilia Carpio
Ciclo académico Setiembre 2019 – enero 2020
Fecha de Presentación: 1/10/ 2019
Integrantes: Leonardo Aldás
Elizabeth Falcón
David Núñez
Andrés Robalino

“DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD CATALÍTICA Y DEL CONTENIDO DE

PROTEÍNAS DE EXTRACTOS ENZIMÁTICOS Y ENZIMAS COMERCIALES”

1. OBJETIVOS
Objetivo General

 Determinar la actividad catalítica y el contenido de proteínas de extractos

enzimáticos y enzimas comerciales

Objetivo especifico

 Calcular la concentración de proteínas de las soluciones de enzima invertasa y

glucoamilasa mediante el método de Biuret.
 Comparar la actividad específica de las enzima invertasa y glucoamilasa
 2. DATOS Y RESULTADOS

Tabla 1. Datos de los estándares de Glucosa

V.
P. Estánd. Vol. P. Total [Glc] Abs
Tubo N° Estánd.
g Agua. mL g mg/g 540nm
ml
0 0 0 0 0 0 0
1 0,1 0,0993 0,9 0,9879 0,2010711 0,099
2 0,3 0,2904 0,7 0,9814 0,59192127 0,316
3 0,5 0,4926 0,5 0,987 0,99836798 0,56
4 0,7 0,6863 0,3 0,9871 1,39080497 0,773
5 0,9 0,8935 0,1 0,9963 1,7939809 1
Solución Madre
Peso Glucosa Peso Sln Concentración
50 mg 24,9952 g 2,00038407 mg/g

Gráfico 1. Curva estándar de Glucosa

Curva Estándar de Glucosa

1.2

1
f(x) = 0.56 x − 0.01
R² = 1
Absorbancia 540nm

0.8

0.6

0.4

0.2

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2
[Glucosa] mg/g

 Glucoamilasa

Tabla 2. Concentración de glucosa obtenida con Glucoamilasa

 Absorbancia 540 nm [Glucosa] (mg/g) Tiempo
Tubos
Prueba 1 Prueba 2 Prueba 1 Prueba 2 (min)
0 0 0 0 0 0
1 0,115 0,15 0,21890016 0,28118882 1
2 0,231 0,215 0,42534259 0,39686777 2
3 0,348 0,298 0,63356469 0,54458089 3
4 0,444 0,356 0,8044136 0,6478021 4
5 0,567 0,449 1,02331376 0,81331198 5

Gráficos 2 y 3. Concentración de Glucosa obtenida con Glucoamilasa vs Tiempo de reacción

Prueba 1
1.2
1
f(x) = 0.2 x + 0.01
[Glucosa] (mg/ml)

0.8 R² = 1

0.6
0.4
0.2
0
0 1 2 3 4 5 6
Tiempo (min)

Prueba 2
0.9
0.8
f(x) = 0.15 x + 0.07
0.7 R² = 0.97
[Glucosa] (mg/ml)

0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 1 2 3 4 5 6
Tiempo (min)

 Invertasa

Tabla 3. Concentración de glucosa obtenida con Invertasa

Absorbancia 540nm [Glucosa] (mg/g) Tiempo

Tubos
Prueba 1 Prueba 2 Prueba 1 Prueba 2 (min)
0 0 0 0 0 0
1 0,084 0,064 0,1637302 0,1281366 1
 8
0,2598327 0,2438156
2 0,138 0,129 2
1 3
0,3683929
3 0,199 0,201 0,3719523 3
5
0,5339028 0,4449190
4 0,292 0,242 4
3 2
0,5392418
5 0,295 0,314 0,5730557 5
6

Gráficos 4 y 5. Concentración de Glucosa obtenida con Invertasa vs Tiempo de reacción

Prueba 1
0.6
f(x) = 0.11 x + 0.03
0.5 R² = 0.97
[Glucosa] (mg/ml)

0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 1 2 3 4 5 6
Tiempo (min)

Prueba 2
0.7
0.6
f(x) = 0.11 x + 0.01
[Glucosa] (mg/ml)

0.5
R² = 1
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 1 2 3 4 5 6
Tiempo (min)

Tabla 4. Curva Estándar de BSA de datos obtenidos previamente

Std BSA g P. Total g Conc. Std Pepsina Absorbancia

mg/g (ml)

0 0 0 0
0,0508 0,253 3,5138 0,111
0,0957 0,2485 6,7394 0,215
 0,1497 0,2509 10,4414 0,333
0,2001 0,2518 13,9069 0,434
0,24 0,2496 16,8269 0,514

Gráfico 6. Curva Estándar BSA

Curva Estándar BSA

0.6

0.5 f(x) = 0.03 x + 0

R² = 1

0.4

0.3

0.2

0.1

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Tabla 5. Concentración de pepsina por la prueba de Biuret

Concentración
Absorbancia
Enzima Absorbancia Promedio de pepsina
del blanco
(mg/ml)
0,098
Glucoamilas 0,100
0,000 0,099 3,0847
a 0,099
Prueba 1
0,112
Glucoamilas 0,077
0,000 0,089 2,7698
a 0,079
Prueba 2
0,149
Invertasa 0,160 0,000 0,158 4,9957
Prueba 1 0,164
0,173 0,000 0,177 5,6363
 Invertasa 0,176
Prueba 2 0,183

Tabla 6. Actividad específica del extracto

Enzima Actividad Concentración de Actividad Específica

Enzimática (UI/ml pepsina (mg/m) (UI/mg)
enzima)
Glucoamilasa
1123,89 3,0847 364,34
Prueba 1
Glucoamilasa
843,33 2,7698 304,47
Prueba 2
Invertasa
12,43 4,9957 2,49
Prueba 1
Invertasa
12,51 5,6363 2,22
Prueba 2

3. DISCUSIÓN
La hidrólisis enzimática del almidón se produjo de manera eficiente como se puede
observar en las gráficas 2 y 3. La prueba 1 muestra que a medida que avanzó el tiempo
de reacción la enzima glucoamilasa hidrolizó el almidón de manera continua, por lo
tanto el coeficiente de determinación de la recta proporciona un valor óptimo, esto
quiere decir que mientras el tiempo avanza las enzimas desarrollan su trabajo
correctamente. Para el caso de la prueba 2 dicho coeficiente disminuyó, puede deberse a
errores cometidos en la práctica. Es así que a los cinco minutos de reacción es cuando
más glucosa se obtuvo. Como mencionan Pardo, Rivera, Castellano y González (2004),
el tiempo óptimo para que se hidrolice la mayor cantidad de almidón posible es
alrededor de dos horas, pero si se mantiene durante más tiempo, por lo general a las 6
horas de reacción la producción tiende a bajar debido a la repolimerización de los
azúcares ya hidrolizados.
En el caso de la invertasa como se observa en la Tabla 3 la concentración de glucosa es
menor que la obtenida con glucoamilasa, como mencionan Rubio, Latina & Navarro
(2012) esto podría deberse a la concentración de sustrato que en este caso es sacarosa,
ya que se producen efectos inhibitorios de la enzima cuando la concentración de
azúcares es alta tanto sustrato como producto.
Como se observa en la Tabla 6, la concentración de proteína mediante el método de
Biuret proporcionó cantidades bajas, según Mera & Carrera (2005) esto es señal de que
la solución de enzimas se encuentra con un nivel de pureza óptimo, ya que si hubiera
mayor concentración de proteína se debería realizar una refinación de las soluciones
para obtener mayor rendimiento. En lo que concierne a la actividad enzimática la que
mayor actividad presentó fue la glucoamilasa de la prueba 1 con 1123,89 UGA/ml
enzima, según Rico (2010) la mayor actividad de este tipo de enzimas se consigue con
un pH 4 y una temperatura de 60ºC.

4. CONCLUSIONES
  La actividad catalítica es menor en el extracto de enzima, es decir, en la
invertasa causado por el sustrato, ya que al ser sacarosa producen efectos
inhibitorios de la enzima, sin embargo el contenido de proteínas es mayor
debido a que la enzima comercial glucoamilasa se realizó una mayor dilución.
 La concentración de las soluciones de Glucoamilasa fueron de 3,0847 y 2,7698
mg/ml, asimismo de invertasa que fueron de 4,9957 y 5,6363 mg/ml mediante el
método de Biuret, se observó que los resultados son parecidos entre los
subgrupos, por lo cual se afirma un buen desempeño en práctica de laboratorio,
sin embargo no se asevera que son los idóneos debido a las condiciones de
trabajo.
 Glucoamilasa presentó mayor actividad específica al ser una enzima comercial
ya que contiene mayor grado de pureza que la invertasa extraída en el
laboratorio así mismo los valores entre los subgrupos no variaron
significativamente.

5. RECOMENDACIONES
 No superar los tiempos establecidos en la hoja guía para la actividad catalítica de
un enzima ya que a tiempos más largos, el progreso de la reacción se aparta de la
linealidad
 Repetir el ensayo si la absorbancia superara 0,514 diluyendo más la enzima.
 Calibrar el espectrofotómetro con el blanco de cada solución antes de la
medición de la absorbancia.

6. CUESTIONARIO
¿A partir de que otra fuente se puede extraer invertasa?
La invertasa en la naturaleza existe en diferentes isoformas. En levaduras está presente
como invertasa extracelular o Invertasa intracelular. En las plantas tres subgrupos
bioquímicos de invertasa: vacuolar (ácido soluble), invertasa citoplasmática (alcalina
soluble) y unida a la pared celular
La invertasa está ampliamente distribuida entre la biosfera principalmente en plantas y
microorganismos como:
 Microorganismos como S.cerevisiae, Candida utilis.
 Se encuentra en el crecimiento silvestre, en la piel de uvas y otras frutas.
 Plantas como la pera japonesa (Pyrus pyrifolia), gisantes (Pisum sativum), avena
(Avena sativa).
 Hongos filamentosos A. niger
(Kulshrestha, Tyagi, Sindhi & Yadavilli, 2013)
¿Qué ocurre si no se elimina todas las partículas del extracto en la medición de la
absorbancia tanto para azucares reductores como para cuantificar proteínas?
Si no se elimina todas las partículas del extracto para la medición de la absorbancia el
resultado se verá afectado debido a la relación que existe entre la cantidad de energía
absorbida y la cantidad de materia las cuales vienen establecidas por las leyes de
Lambert y Beer, en la que se establece que la cantidad de luz absorbida por un medio es
independiente de la intensidad de radiación y dependiente del espesor de la muestra y
las características que esta posea, por lo que la cantidad de radiación absorbida es
proporcional al número total de moléculas que se encuentra en el recorrido de la luz
(Roca, Oliver & Rodríguez, 2004).

Figura 1.absorción y transmisión de radiación a una determinada onda (Roca, Oliver &
Rodríguez, 2004)

7. BIBLIOGRAFÍA
Castellanos Domínguez, Ó. F., Pardo, M., Rivera, P., & González, G. Estudio cinético
de la hidrólisis enzimática de almidón de papa. Ingeniería e Investigación; Vol. 24,
núm. 1 (2004):(54); 66-84 Ingeniería e Investigación; Vol. 24, núm. 1 (2004):(54); 66-
84 2248-8723 0120-5609.
Kulshrestha, S., Tyagi, P., Sindhi, V., & Yadavilli, K. (2013). Invertase and its
applications – A brief review. Journal Of Pharmacy Research, 7(9), 792-797. doi:
10.1016/j.jopr.2013.07.014
Rico, Y. (1990). Producción, purificación y caracterización parcial de una glucoamilasa
de aspergillus niger. Revista Colombiana de Química, 19(1), 61-71.
Roca, P., Oliver, J., & Rodríguez, A. (2004). Bioquímica (pp. 83-84). Madrid: Editorial
Hélice.
Rubio, C., Latina, C., & Navarro, A. (2012). Producción de fructooligosacáridos por
invertasa de Aspergillus niger IB56: un prebiótico de importancia para la salud humana
y animal. Boletín Micológico, 27(1).
ANEXOS

 Cálculo de la Actividad Enzimática de la Glucoamilasa e Invertasa

Actividad Enzimática de la Glucoamilasa (UGA/ml enzima)
 UGA mgGlc 1 mmol 103 umol Glc 1 umol Sac 0,3 ml
=0,2023 x x x x x 1000
ml enzima ml . min 180 mg Glc 1 mmol 2 umol Glc 0,15 ml enz

UGA umol Sac

=0,2023 x (5555,56 )
ml enzima min .ml enz

UGA
1123,89 ( Prueba 1)
ml enzima

UGA
843,33 (Prueba 2)
ml enzima

Actividad Enzimática de la Invertasa (UI/ml enzima)

UI mg Glc 1 mmol 10 3 uml Glc 1umol Sac 0,3 ml

=0,1119 x x x x x 20
ml enzima ml . min 180 mg Glc 1mmol 2 umol Glc 0,15 ml enz

UGA umol Sac

=0,1119 x (111,1112 )
ml enzima min .ml enz

UI
12,43 ( Prueba 1)
ml enzima

UI
12,51 (Prueba2)
ml enzima

 Ejemplo de cálculo de la concentración de pepsina (mg/ml) por la prueba de Biuret

Media ¿
( y−0,0043)
Curva Estánda r → y =0,0307 x+ 0,0043→ x=
0,0307
( 0,099−0,0043)
y= =3,0847 mg/ml
0,0307
 Ejemplo de cálculo de la Actividad específica del extracto AE (UI/mg de proteína)

AE (UI /mg)= Actividad (UI /ml)/ Proteína(mg/mL)

1123,89
AE (UI /mg)=
3,0847

AE=364,34 ( UImg )