See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.

net/publication/264551854

Biotecnología Vegetal (texto básico biotecnología en español)

Book · April 2005

CITATIONS READS

0 12,664

5 authors, including:

Humberto Prieto Miguel Jordan

Instituto de Investigaciones Agropecuarias Universidad Mayor
70 PUBLICATIONS   396 CITATIONS    34 PUBLICATIONS   378 CITATIONS   

SEE PROFILE SEE PROFILE

L. Pedro Barrueto Cid

Embrapa-Cenargen-Brasília, DF
14 PUBLICATIONS   217 CITATIONS   

SEE PROFILE

Some of the authors of this publication are also working on these related projects:

Frontiers' Research Topic "New Developments in Agrobacterium-Mediated Transformation of Tree Fruit Crops" View project

Frontiers in Plant Sciences Research Topic: Leeway to Operate with Plant Genetic Resources View project

All content following this page was uploaded by Humberto Prieto on 08 August 2014.

The user has requested enhancement of the downloaded file.

 Biotecnología Vegetal

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES AGROPECUARIAS

MINISTERIO DE AGRICULTURA

B IOTECNOLOGÍA

V EGETAL

Humberto Prieto E.
Miguel Jordan Z.
L. Pedro Barrueto Cid
María Cristina R. Cordeiro
Don J. Durzan
ISSN O717 - 4713

Santiago de Chile, 2005

1
COLECCIÓN LIBROS INIA Nº 15
 Biotecnología Vegetal

BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

© 2005, Instituto de Investigaciones Agropecuarias, INIA,

Centro Regional de Investigación La Platina,
Santa Rosa 11610, La Pintana, Teléfono (56-2) 7575100,
Fax: (56-2) 5417667. Casilla 439, Correo 3, Santiago, Chile.

Nº Inscripción: 149.346

ISBN: 956-7016-23-2

ISSN: 0717-4713

Prohibida la reproducción parcial o total de esta obra sin

permiso del Instituto de Investigaciones Agropecuarias,
Ministerio de Agricultura.

Diseño y diagramación: Jorge Berríos V.

Impresión: PROGRAF Impresores.

Cantidad de ejemplares: 1.000

Santiago, Chile, 2005.

2
 Biotecnología Vegetal

en recursos humanos. Esto limita sus posibilidades de utiliza-

ción efectiva. Debido a su novedad y a su explosivo desarrollo,
las distintas biotecnologías son rápidamente reemplazadas por
otras más modernas y algunas de ellas abren nuevos problemas
en el ámbito de la bioseguridad, e incluso en la ética. A pesar
de lo anterior, cada día, estas herramientas toman un papel más
importante y las instituciones de investigación destinan más re-
cursos a su implementación.

Parece obvio señalar que la capacitación en estas nuevas tec-

nologías resulta clave al momento de decidir aplicarlas a la
solución de los problemas tecnológicos de la agricultura. El li-
bro "Biotecnología Vegetal", representa un esfuerzo comparti-
do de distinguidos profesionales especialistas en sus aspectos o
ramas más relevantes, para exponer de una manera didáctica y
sencilla, las principales estrategias actualmente en uso. El Insti-
tuto de Investigaciones Agropecuarias, ha decidido cooperar
en este esfuerzo al incluir esta publicación dentro de su "Co-
lección Libros INIA", serie que ha hecho una importante contri-
bución al conocimiento de aspectos relevantes para la agricul-
tura nacional. Con la inclusión de este nuevo título, aspiramos
también a cubrir la demanda por información más allá de nues-
tras fronteras, pues creemos que este libro puede transformarse
en un texto de referencia para la enseñanza de la biotecnología
en el ámbito latinoamericano.

Paulina Sepúlveda Ramírez.

Directora Regional
INIA - La Platina.

6
INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
L a selección, mejoramiento genético
y desarrollo de plantas, puede ser
trazada desde tiempos prehistóricos
(Cowan y Watson, 1985). Las tribus pri-
mitivas seleccionaban cuidadosamente
plantas, semillas o estacas, en su inten-
to por domesticarlas y con el propósito
de usarlas como alimento, fibras, curas
de enfermedades, tratamiento de heridas
y también, por qué no decirlo, de sus
necesidades espirituales. Un ejemplo de
esto es el uso del canelo (Drimys winteri)
en Chile en ritos sagrados por los
mapuches.
En los últimos decenios, los mejoradores
de plantas han realizado cruzamientos
intentando obtener descendencias que
proporcionen nuevas características de
interés y beneficios para horticultores,
agricultores y su economía local
(Simmonds, 1979). Este aspecto repre-
senta ya una inconsciente utilización del
concepto "biotecnología de plantas", y
a su vez manifiesta del mismo modo el
requerimiento de una colección de
germoplasma y de la mantención de una
amplia gama de diversidad genética. La
finalidad última: poseer una fuente de
genes, con mapas genéticos que permi-
tan la obtención de plantas de interés
económico (Tanksley y McCouch, 1997).
La manera más fácil de capturar y fijar
una ventaja genética es a través de la
propagación vegetativa del genotipo
CAPÍTULO 1
Don J. Durzan
deseado. Sin embargo, algunas seleccio-
nes son difíciles de propagar (usando
medios baratos, simples y fáciles de rea-
lizar). Por otro lado, la domesticación
por clones podría aumentar los riesgos
de plagas y enfermedades si éstos son
colocados en sistemas de producción no
directamente relacionados con sus ni-
chos o en sus respectivos ecosistemas
naturales. Por ello también la necesidad
de efectuar pruebas preliminares de in-
troducción en cada región.
Para mejorar la calidad, productividad,
utilidad y acelerar la introducción de
características superiores en los produc-
tos agrícolas, la biotecnología de plan-
tas ha desarrollado métodos para la in-
troducción de genes exógenos en espe-
cies económicamente importantes. Esto
comprende todos los métodos de modi-
ficación genética, fusión de células, cru-
zamientos controlados, apomixia y cul-
tivo de tejidos conducentes a la obten-
ción de clones y a la fijación de carac-
terísticas ventajosas propias de cada
zona, región o país. Y esto último es muy
importante a la hora de definir progra-
mas de desarrollo biotecnológico en
países como el nuestro.
La biotecnología de plantas requiere la
integración económica de las ciencias
biológicas con la producción y utiliza-
ción tanto de los sistemas agronómicos
como silvícolas. Es un hecho objetivo
17

que, independiente del modelo econó-
mico en boga, la nueva industria emer-
gente proveerá de productos y servicios
que generarán un mejor desempeño de
la propia economía en su conjunto
(Enríquez, 1998). Estas innovaciones sin
duda, tendrán un impacto en la calidad
ambiental y la salud y exigirán de mane-
ra consustancial una evaluación y moni-
toreo de estas nuevas tecnologías den-
tro de la relación costo/beneficio. Un
claro ejemplo de ello lo representa la
incorporación de la tecnología de los
cultivos genéticamente modificados.
La nueva era genómica que está desper-
tando, está forzando a algunas compa-
ñías más poderosas del mundo a rein-
vertir en ellas mismas para integrar
biotecnología, agricultura, ciencias fo-
restales, alimentos, química de cosmé-
ticos, farmacia, medio ambiente e indus-
tria informática y así permanecer viables
en el nuevo mundo de la economía de
la globalización (Lander y Weinberg,
2000). Sin embargo, cierta oposición por
parte de una legislación genómica de-
masiado rigurosa, podría inhibir el pro-
greso de nuevas técnicas de diagnósti-
co en el área, por ejemplo, de la salud
(Chahine, 2002). El problema surge de
la posición que países en desarrollo de-
ban adoptar con respecto a la adopción
de estas nuevas ramas de la ciencia y la
discusión sobre la necesidad de ellas
dentro del conjunto de requerimientos
que podrían bien plantearse para ven-
cer estas condiciones de sub-desarrollo.
Sin perjuicio de que más adelante en
este libro se traten tópicos pormenori-
18
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
zados de biotecnología de plantas, a
continuación se efectuará una visión si-
nóptica aunque actualizada, sobre esta
excitante promesa de la biotecnología
en esta época llamada también de "era
del conocimiento". Ésta, a modo de con-
tribuir a una percepción más global y co-
herente sobre esta materia; esfuerzo nada
fácil, considerando que cada vez es más
difícil precisar lo que debe ser omitido o
incluido en una prospección, por la ex-
plosiva velocidad con que el conoci-
miento científico avanza. Sin embargo,
inevitable y útil para ir depurando a las
ciencias de errores o conceptos ingenuos.
La necesidad de una biotecnología
de plantas para una mejor
calidad de vida.
La biotecnología está ofreciendo muchos
beneficios para la agricultura, medicina,
medio ambiente e industria. Estas nue-
vas alternativas están relacionadas
inexorablemente con el crecimiento
asombroso de nuestra población mun-
dial, la pobreza, el desempleo crecien-
te, la asistencia médica y los cambios
climáticos globales que limitan las co-
sechas. Ello involucra no solamente a la
industria y gobiernos, sino que particu-
larmente a los agricultores (que deberán
también absorber las nuevas biotecno-
logías) y a los consumidores.
La llegada de plantas transgénicas pro-
mete ayudar a incrementar la flexibili-
dad del manejo de los cultivos. Por
ejemplo, disminuyendo la fuerte depen-
dencia de los agroquímicos y reducien-
INTRODUCCIÓN
do la alta contaminación de los suelos,
ríos y lagos. Al mismo tiempo, aumen-
tando la producción, favoreciendo la
precocidad de las cosechas y en gene-
ral, adicionando mayor valor agregado
a los productos al aumentar el valor nu-
tritivo y haciendo los productos menos
perecibles (por ejemplo, proveyendo de
mayor tiempo de almacenaje). Sin em-
bargo, una vez que se haya evaluado
adecuadamente el impacto de la tecno-
logía, ella deberá ser probada como se-
gura (y aquí nuevamente surgirán discu-
siones sobre cómo hacerlo). Deberán ser
también de costo adecuado y aceptable
para los productores y consumidores.
Por ello, se requiere de métodos para se-
leccionar, preservar y clonar nuevos
genotipos. Entretanto, la producción y
utilización de sistemas biotecnológicos
deben ser flexibles o lo suficientemente
operantes, para adaptar y usar tierras
m a rg i n a l e s , p o c o p r o d u c t i v a s ( e s t o
involucrará disponer de genotipos resis-
tentes al frío, salinidad, altura, etc.). En
general, minimizar los riesgos debidos
a diversas contingencias en el campo.
Selección y propagación vegetativa
de plantas difíciles de propagar.
La investigación sobre plantas transgé-
nicas, buscando alterar selectivamente,
adicionar o remover características es-
pecificas de ellas, debe ser realizada
considerando las necesidades regiona-
les. Características tales como, resisten-
cia al frío, calor, sequía, contenido de
fibras, gusto, color, fragancia, son bue-
nos ejemplos de esto. Es importante tam-
bién seleccionar para resistencia a pla-
gas y enfermedades de árboles de im-
portancia económica. Esto, tanto para
especies de clima tropical como el "mog-
no-brasileiro", Switenia macrophylla,
(Fam. Meliaceae), así como para las es-
pecies del género Nothofagus del sur de
Chile (Nothofagus pumilio, N. obliqua,
N. alpina y N. leonii) o para las conífe-
ras de California (Pinus torreyana,
Sequoia sempervirens, Taxus brevifolia,
etc.). El manejo de la variabilidad gené-
tica de especies arbóreas podrá incre-
mentar la probabilidad de resistencia
para insectos barrenadores (Coleoptera)
u hongos que atacan el tronco (cancro)
y que dificultan así su uso comercial.
Ello especialmente en una época donde
la demanda por maderas está aumentan-
do junto al aumento de la población. Las
expectativas son que, de aquí a diez
años, el consumo de madera, será alre-
dedor de un 20% más de lo que repre-
senta hoy.
Para la propagación vegetativa, el enrai-
zamiento de estacas es a menudo el sis-
tema clonal elegido (ejemplo híbrido en-
tre Eucalyptus grandis x E. urophylla para
la producción de celulosa). Entretanto,
los factores que afectan la capacidad del
enraizamiento son numerosos, especial-
mente en especies frutales, siendo pro-
cesos aún escasamente comprendidos. La
propagación de plantas mediante condi-
ciones in vitro: organogénesis y embrio-
génesis somática (ver capítulo 3), son
parte del arsenal de técnicas (Figuras 1.1
a 1.5) que han sido empleadas en la
biotecnología de plantas (Hartmann et
al., 2002).
19
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

Figuras 1.1 a 1.5. Poliembriogénesis. Tipo de embriogénesis somática frecuente en coníferas,

inducida bajo condiciones in vitro. Sin embargo, es un proceso distinto al de embriogénesis
somática de dicotiledóneas, pero que, como ésta, puede permitir la multiplicación de
embriones en grandes cantidades en biorreactores. Figura 1.1, muestra el aspecto de un
embrión cigótico (2 mm) de Picea abies (Abeto de Noruega), en el cual se distinguen muy bien
sus cotiledones. Pequeñas cantidades de estos embriones, al ser colocados en frascos tipo
"nipple" y en presencia de un determinado medio nutritivo básico, se multiplican
asexuadamente por simple ruptura longitudinal. Figura1.2, Los frascos permanecen en
oscuridad, girando a 1 rpm (clinostato). Figura1.3, presenta una muestra de embriones (0,5 mm),
que se destacan por su coloración rojiza, debido a la tinción con acetocarmín. En azul, el
suspensor teñido con azul de Evans. Los embriones ya maduros presentan el aspecto de la
Figura1.4. Por tanto, son muy parecidos a los embriones originarios de semillas (sexuales).
Más adelante, los embriones son hechos germinar, transformados en plantas llevadas al campo
para su observación y evaluación. Figura 1.5, plantas (primer plano) con siete años de edad,
las cuales no evidenciaron variabilidad genética (variación somaclonal), en relación a sus
congéneres obtenidas por semillas. Dependiendo del interés forestal, carga de trabajo del
laboratorio etc., los embriones (Figura 1.4) se pueden criopreservar pudiendo de
esta manera, distribuir mejor su disponibilidad durante el año.

20
INTRODUCCIÓN
Los factores que son considerados im-
portantes dentro de esta perspectiva,
corresponden a la aplicación de regula-
dores de crecimiento y/u hormonas ve-
getales (ver capítulo 2: Figuras 2.2 y 2.3;
Tabla 2.2), procurando encontrar corre-
laciones entre respuestas experimenta-
les y dosis aplicadas. Ello dentro de un
contexto de diversos factores tales como
humedad, CO 2 y temperatura. En algu-
nos casos, el pre-acondicionamiento, así
como el conocimiento del origen de
dónde serán retirados los explantes en
la planta madre (zona juvenil, adulta o
embrionaria), son necesarios para me-
jorar la respuesta morfogénica, definidas
antes de proceder a extraer el material.
Una estrategia que ha sido ampliamen-
te utilizada para la selección clonal, por
ejemplo en áreas tropicales, como es el
caso de Hevea brasilensis, es el escruti-
nio de un gran número de plántulas. Esto
como una forma opuesta a la selección
de árboles maduros, sobre la base de su
aparente superioridad, ya que muchos
caracteres son influidos ambientalmente.
Plantas transgénicas
Las plantas trangénicas fueron una con-
secuencia natural del desarrollo de téc-
nicas como el cultivo de tejido in vitro
de plantas, pero éste era y es, fundamen-
talmente, una técnica conservativa (ver
capítulo 2). El problema de tornar el me-
joramiento más rápido y factible en mu-
chas especies de importancia agronó-
mica, quedaba todavía abierto con ese
vasto arsenal de técnicas que el cultivo
in vitro despliega (haploides, fusión de
protoplastos, células en suspensión,
etc.). Por eso entonces, el surgimiento
de plantas transgénicas era una cuestión
de tiempo.
Una especie se caracteriza por su incapa-
cidad natural para entrar, bajo circunstan-
cias normales, en una unión sexual fue-
ra de la especie. La biotecnología de
plantas modifica esta imposición, prove-
yendo en cambio, nuevos y útiles méto-
dos para introducir variación genética sin
participación sexual (ver capítulo 4). Los
biólogos de plantas ya han obtenido gran-
des ventajas de la reproducción asexuada
para fijar aquellas características obteni-
das vía cruzamiento.
Una gran utilidad de las plantas transgé-
nicas es la de producir nuevos benefi-
cios y proveer servicios que remuevan
las dificultades inherentes para un de-
sarrollo sustentable de la agricultura.
Sustentable, se utiliza en este contexto,
como sinonimia de respeto al medio
ambiente, siendo ésta la tónica que más
tarde o temprano se impondrá en el
gerenciamiento y producción del agro-
negocio. Los transgénicos también po-
drán ofrecer nuevas opciones para la
substitución de material, cuando los re-
cursos vegetales estén próximos a la ex-
tinción.
En la actualidad, hay muchos ejemplos
de plantas transgénicas en producción,
como es la incorporación de resistencia
al herbicida glifosato, utilizado en remo-
lacha, soya, raps, tomate, tabaco, algo-
dón, etc. (Jayaraman, 2002). El glifosato
es un potente exterminador de malezas
eliminando aquellas plantas que poseen
la vía del ácido shiquímico. La resisten-
cia contra insectos también se ha con-
seguido a través de la introducción en
la planta, del gen que codifica una toxi-
na de Bacillus thuringensis, la cual pro-
voca alteraciones fatales en el intestino
del insecto; a pesar de que, la gran plas-
21

ticidad genómica de estos, puede desa-
rrollar resistencia a esta toxina (Huang
et al., 1999). Otras alteraciones gené-
ticas han sido la modificación de la com-
posición de aceites de algunas olea-
ginosas en favor de ácidos grasos más
compatibles con la salud humana. El en-
riquecimiento del endosperma del arroz
con pro-vitamina A, no deja de ser una
esperanza para la población de bajos in-
gresos (Ye et al., 2000). También es im-
portante mencionar el problema de la
maduración del tomate y retraso de este
proceso, conseguido por vía transgénica
mediante la alteración de la síntesis del
etileno, la hormona vegetal justamente
decisiva en la maduración de éste. En
frutillas, especie conocida por su corta
vida de post-cosecha, la vía transgénica
ha conseguido aumentar su período de
almacenamiento mediante la incorpora-
ción de secuencias antisentido del gen
que codifica para la enzima pectato-
liasa, relacionada con el ablandamien-
to del fruto (Jiménez-Bermudez et al.,
2002). Siendo larga la lista de ejemplos,
no se puede dejar de mencionar los es-
fuerzos por inducir la síntesis de antí-
genos en las plantas (vacunas) para in-
munizar poblaciones infantiles de sec-
tores de bajos recursos contra diversas
infecciones bronquiales o intestinales
(Tariq et al., 1995; ver capítulo 6).
Algunos intentos por identificar otras
familias de genes, como los genes res-
ponsables de características cuantitati-
vas "QTL", (Quantitative Trait Loci; ver
capítulo 7), se han visto frustrados por
la complejidad de los genomas. Para
ilustrar esta afirmación, debe asumirse
que muchos árboles tienen un genoma
varias veces mayor al genoma humano.
Es así como en la Familia Pinaceae por
22
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
ejemplo, se encuentran árboles con al-
rededor de 20 billones de pares de ba-
ses, o sea, siete veces más que lo halla-
do en humanos. Las limitaciones tecno-
lógicas del uso de QTLs, es que su ma-
nejo no implica el manejo de genes, sino
que éstos identifican efectos genéticos
que pueden estar ligados a muchos
genes. Por otro lado, los QTL no detec-
tan interacciones epistáticas entre loci.
De esta forma, mapas de alta resolución
genética y experiencias de mutagénesis,
pueden potenciar la relación entre genes
candidatos y el análisis con QTL (Flint y
Mott, 2001).
Dentro del arsenal moderno de otras téc-
nicas, se pueden señalar la sintenia y la
quimeraplastia. La primera, es un méto-
do que compara mapas de genes de di-
ferentes especies, pudiendo ser usada
para evaluar la función de genes basa-
dos en la similitud de secuencias y po-
siciones dentro de la hebra de DNA. La
segunda, se refiere al método de inser-
tar segmentos de DNA/RNA en la célula
vegetal, visualizando la inducción de
mutaciones de un gen específico. En
maíz, se puede lograr un gran número
de mutaciones por vía de inserción de
DNA. El silenciamiento de RNA o la so-
bre-expresión de genes, han sido tam-
bién usados para desactivar o activar
genes en las plantas, respectivamente.
Mayor eficiencia en la producción.
Gracias a la ingeniería genética, genes
de especies incompatibles pueden ser
introducidos en plantas para aumentar
la producción y calidad de los cultivos.
Para la agricultura, tales aspectos en
concordancia con componentes ecológi-
INTRODUCCIÓN
cos conforman un enfoque conveniente
y, por lo demás, altamente demandado
hoy en día. Por otro lado, en la parte fo-
restal (Durzan y Campbell, 1974; Campi-
nhos et al., 1992; Ferreira, 1995; Campi-
nhos, 1999), no menos importante ha si-
do la contribución del uso de los mar-
cadores moleculares, la propagación
clonal y el uso de micorrizas, en la pers-
pectiva de aumentar la densidad de la
plantación para disminuir costos (Lander
y Weinberg 2000). A consecuencia de
esto, surgen también preguntas fisioló-
gicas fundamentales, como por ejemplo,
¿Cuáles son los efectos de la competen-
cia por luz, por nutrientes, por agua, por
espacio, por crecimiento alométrico y
por problemas de fitosanidad? (Sinclair
y Gardner, 1998).
Cambios en el clima global
Es ampliamente aceptado que existen
cambios en el clima global que afectan
la atmósfera, hidrósfera y litósfera de
muchas partes del mundo (Watson y
Team, 2001). O tal vez, que los cambios
en estas últimas hayan llevado a cam-
bio en el clima global. Nuestra mayor
evidencia científica sugiere poderosa-
mente que un importante componente
de estos cambios es debido a la acción
humana. Entretanto, se necesitan más
estudios para llegar a comprender las
causas más profundas que los han origi-
nado, sus implicaciones a mediano pla-
zo y las posibles soluciones, a objeto de
direccionar más adecuadamente las pre-
dicciones y soluciones más plausibles.
Por ejemplo, ¿cuánto tiempo va a durar
la falta de agua en el norte de Chile?,
¿cuánto será su abundancia en el sur y
cómo serán afectadas las poblaciones
naturales de los diferentes ecosistemas?
Por ello, se tendrán que desarrollar nue-
vas plataformas tecnológicas (Durzan y
Durzan, 1993).
Nuevas plataformas tecnológicas
para el progreso de la
producción agrícola
El estudio del genoma de las plantas está
presentándose más difícil de lo imagi-
nado, de modo que se tienen que desa-
rrollar nuevos métodos. Dentro de esta
perspectiva, los investigadores de plan-
tas podrán utilizar los "transposones" y
crear mutantes que ayudarán a identifi-
car efectos fenotípicos en su compara-
ción con los efectos ejercidos por genes
normales.
Una importante nueva tecnología para
el estudio de plantas es el "DNA
microarray" (microarreglos de DNA),
conocido también por "DNA chip" o sim-
plemente "chip" (Dhiman et al., 2002;
ver capítulo 8). Esta poderosa herramien-
ta capacita un rápido y simultáneo aná-
lisis de un gran número de experimen-
tos de hibridación de ácidos nucleicos
para identificar genes en respuesta a
"estrés" ambiental y cambios relaciona-
dos con etapas del desarrollo. Por ejem-
plo, saber cuántos genes intervienen en
la formación de una manzana, un me-
lón, o una papa. Así, la tecnología del
"microarray" ayuda a la identificación de
genes expresados ante un estímulo es-
pecífico y levanta el perfil transcrip-
cional de un determinado fenotipo, per-
mitiendo separar o identificar los efec-
tos adversos cuando la planta es some-
23

tida a variados estímulos. La técnica ge-
nera modelos más amplios de análisis
para entender los factores involucrados
en el "diseño" de nuevos genotipos y
para el desarrollo de productos más es-
pecíficos, tales como drogas y vacunas,
por ejemplo, contra la mastitis en ani-
males.
En el futuro, laboratorios biotecnológi-
cos podrán usar también fuerzas atómi-
cas minúsculas y nanotecnologías para
investigar el DNA. Así, los productos
serán mejor ajustados a las necesidades
de los genotipos deseables (Anon, 1999).
La explosión de nuevos datos de los es-
tudios genómicos y de la biología
molecular en general, ha conducido al
nacimiento de la bioinformática como
un paso crítico en la realización del ple-
no potencial de la revolución biotecnol-
ógica (Gwynne y Page, 2000). La bio-
informática nos permite pensar de ma-
nera bastante asertiva la construcción de
la filogenia de las plantas. Por ejemplo,
en lo que se denomina evaluación lineal
de secuencias de DNA. El próximo ni-
vel de diagnóstico bioinformático com-
prende el abordaje del genoma funcio-
nal basado en el análisis de DNA, RNA,
proteínas y metabolitos (Risch, 2000).
Esto involucra la identificación de la fun-
ción y del gen, su organización y con-
trol sobre vías genéticas que influencian
la fisiología del organismo. Por cierto
que la bioinformática será decisiva en
esta cuestión. Así, los datos provenien-
tes de la bioinformática ayudarán a es-
tablecer la posición relativa de un parti-
cular gen en un cromosoma, demarcar
su posición y esclarecer el papel en una
vía metabólica, las que en plantas exis-
ten muchas por conocer mejor todavía.
Es claro que la identificación funcional
24
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
de un gen significa conocer su produc-
to; en este sentido, el proteoma envuel-
ve toda la terminología usada para des-
cribir la expresión funcional de proteí-
nas responsables de un fenotipo dado
(Pandey y Mann, 2000). En adición a
esto, la biotecnología de plantas tiene
que explorar la fármaco-genómica, o el
estudio de cómo las diferencias ge-
notípicas influyen en las consecuentes
y variadas respuestas de las plantas fren-
te a los agroquímicos (herbicidas, y
fungicidas). Ello implica entre otras co-
sas, seguir la pista de un determinado
metabolito en la célula (Roses, 2000; Shi
et al., 2001). El término "metanómico"
justamente está relacionado con este
concepto (Bailey, 1991). El diagnóstico
"metanómico", por otro lado, ha gene-
rado el concepto de "metabolómico".
Este comprende la idea del análisis de
conjunto de perfiles metabólicos en el
interior de la célula, envolviendo por
tanto, aislamiento, separación, identifi-
cación y caracterización de esos perfi-
les o secuencias bioquímicas. Esto, en
un esfuerzo por realizar modelos que re-
lacionen estructura y función (Hunter,
1993; Kauffman,1993).
La tecnología de los protoplastos, sin
duda, ha generado interés desde este
punto de vista. Al permitir fusionar cé-
lulas, podría ofrecer mayores posibilida-
des de estudios de genomas susceptibles
o resistentes. El potencial de estudio
parece amplio y vasto. Así no será ex-
traño producir algún día, híbridos inter-
específicos. Por ejemplo, introduciendo
cloroplastos en la célula animal. Entre-
tanto, cabe mencionar que estos abor-
dajes han sido pocos exploradas en fun-
ción del limitado interés.
INTRODUCCIÓN
Planta, biotecnología
y medio ambiente.
El excesivo uso de recursos renovables
y no renovables debido al incremento
de la población y otros factores, coloca
bajo severa amenaza al medio ambien-
te, implicando la producción de óxido
de azufre, compuestos nitrogenados y
carbónicos.
La biotecnología e industria química han
dependido fuertemente de derivados del
petróleo para la producción de bienes y
servicios. Con los recientes progresos de
la biotecnología de hoy, existe una con-
siderable promesa para el uso de plan-
tas y recursos renovables que puedan
aminorar este problema. La plataforma
tecnológica de la bioingeniería de plan-
tas está sensibilizada con el problema e
incluye en sus procesos, nuevos abor-
dajes que puedan resultar en manufac-
turas con menor impacto ambiental.
Se han realizado esfuerzos significativos
para crear positivos beneficios en áreas
como las siguientes: Producción y uso
de energía, Reducción de polución,
Reciclaje de materiales de desperdicio,
Progresos en agricultura y ciencias fo-
restales, Armas biológicas. En este sen-
tido, la fermentación de biomasa reno-
vable y reciclable, representa un esfuer-
zo integrado que puede disminuir los
problemas. Así ella produce un produc-
to energético (etanol) de "fuentes ver-
des", que provoca menos polución que
su análogo fósil. Por otro lado, los bio-
rreactores y digestores al producir gas
metano, con el consiguiente reciclaje de
desechos y producción de energía, es-
tán dando su contribución efectiva con-
tra la polución. Los organismos genéti-
camente modificados podrían reducir los
desechos industriales evitando el impac-
to negativo del progreso (Wiseman,
1988). Hongos y plantas podrían ser pro-
gramados para ser usados como indica-
dores de la calidad ambiental detectan-
do y absorbiendo tóxicos y metales pe-
sados; en fin, disminuyendo los riesgos
de cáncer u otro tipo de enfermedades.
Nosotros estamos justamente comenzan-
do a comprender cómo las plantas cre-
cen y funcionan molecularmente, inclu-
sive con el uso de modelos de micro-
gravedad (Durzan, 2000). También se re-
quiere de mejores modelos para definir
cómo la vida de las plantas se podría
extender a ambientes hostiles fuera de
nuestro planeta; por eso, la necesidad
de construir plataformas espaciales.
Tratándose del medio ambiente, es bue-
no hacer un poco de historia. Ésta nos
recuerda que nuestro ambiente nos ha
impuesto pesadas tragedias, causadas
por minúsculos enemigos (microorganis-
mos). Fue así con las papas en Irlanda
en 1875, con el café en Ceylán en 1870,
con los castaños en Estados Unidos en
1904 y en general, con ataques epidé-
micos en cereales. Todos estos hechos
nos sugieren que agentes patogénicos y
más recientemente plantas transgénicas,
podrían ser utilizados con fines milita-
res o terroristas (United Nations, 1969).
Los objetivos podrían ser los productos
agrícolas y/o reservas de germoplasmas
naturales.
25

Cuatro pre-condiciones podrían ser se-
ñaladas para provocar estas amenazas:
1. Una gran población de plantas hos-
pederas debería estar presente.
2. El agente debería ser capaz de reco-
nocer y atacar una particular pobla-
ción.
3. Cantidades adecuadas del agente in-
feccioso o vector deberían estar dis-
ponibles.
4. El ambiente debería ser favorable a la
propagación del vector. Los agentes
podrían ser lanzados desde aviones,
misiles, aerosoles, etc.
El uso de otros métodos tales como la
radiación electromagnética y el rayo lá-
ser, aplicados por avión, no podría ser
descartado. Esto permitiría irradiar plan-
tas afectando su ciclo natural de desa-
rrollo, quebrando su dominancia apical,
ciclo floral, producción de yemas, etc.
(Durzan y Campbell, 1979; Durzan,
1980). Empero, es bueno precisar que
sería el hombre, y no la ciencia, el res-
ponsable por el mal uso de ella.
La biotecnología de plantas,
la industria y la salud
A través del control de procesos metabóli-
cos y fisiológicos, la ingeniería bioquími-
ca podría mejorar y modificar la produc-
ción de metabolitos secundarios que no
pueden ser sintetizados por problemas
químicos o económicos. Esto incluye hor-
monas, drogas anticáncer, modificación
de vitaminas, contenidos de carbohidra-
tos, etc. Las plantas podrían ser clonadas
y cruzadas para proveer la apropiada di-
versidad genética, necesaria para la pro-
ducción a gran escala en el campo.
26
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
Entretanto, ya a nivel de laboratorio, la
biotecnología ha producido una serie de
productos farmacéuticos. Entre ellos
pueden citarse: la insulina, el interferón
para el tratamiento de infecciones virales
y cáncer, la hormona del crecimiento,
interleuquinas contra el cáncer y
péptidos neuroactivos para disminuir la
intensidad del dolor. Existe una amplia
variedad de antibióticos y agentes
antimicrobiales. Sin embargo, muchos
de estos productos necesitan todavía del
visto bueno de aprobación por agencias
gubernamentales.
La fármaco-genómica, como rama emer-
gente de la biotecnología, tendrá gran
preponderancia en este sentido en el
futuro. Ello se debe a que requerirá exa-
minar detenidamente las variaciones in-
dividuales en respuesta a la terapia con
drogas, polimorfismo genético, marca-
dores y análisis de ligamiento, sin llegar
necesariamente a involucrarse con tera-
pia genética o clonaje de órganos hu-
manos.
Desafíos futuros
La producción sustentable de alimentos,
fibras, maderas, combustible, etc., per-
manecen como desafío frente a cuestio-
nes candentes, como lo es el explosivo
aumento de la población mundial. Po-
blación que hoy ya casi alcanza los seis
billones de habitantes, la exclusión so-
cial, la polución, seguridad social, la dis-
minución de los recursos naturales re-
novables y la corrupción. Por otro lado,
la cantidad de tierra disponible para la
agricultura, aprovechamiento de la ener-
gía solar a un costo más barato y la dis-
minución de las fuentes de agua dulce,
INTRODUCCIÓN
levantan preocupaciones colocando lí-
mites para los modelos propuestos de
producción sustentable. La llegada de la
biotecnología y toda su amalgama de
derivados, es solamente una fracción de
las posibles soluciones para vencer todo
este abanico de desafíos que se aveci-
nan (Mann y Plummer, 2002). Sin em-
bargo, las soluciones tendrán que ser
probadamente seguras y públicamente
aceptadas, aspecto muchas veces nada
fácil. En ello debemos considerar la se-
rie de factores que pesan sobre ellas,
entre las cuales pueden citarse, la mis-
ma ciencia, la religión, la filosofía, la
economía, los derechos humanos y la
infaltable política. Existe eso sí, la con-
vicción de que tomado en su conjunto,
este proceso biotecnológico, al final de
cuentas, llevarán a mejorar la salud pú-
blica, la industria y el conjunto de la
economía. Para esto, es clave partir de
una apropiada legislación, pro-activa y
con agentes reguladores confiables, los
que a su vez gocen de la existencia de
recursos financieros y humanos apropia-
dos (Stock, 2002). Con todo esto en la
mano, los esfuerzos biotecnológicos
conseguirán: más con menos, calidad en
lugar de cantidad, reducción de riesgos
y proveer una existencia humana más
digna y duradera (Fukuya, 2002).
REFERENCIAS.
Anon. 1999. Biotech Mania. Research and
Development Magazine June:22-27.
Bailey, J. 1991. Toward a science of metabolic
engineering. Science 252:1668-1675.
Campinhos, E. 1992. The use/place of clonal
multiplication in tree breeding and pro-
pagation programmes: Prerequisites for
success and failure. 18 p. In: Regional
Symposium on Recent Advances Mass
Clonal Multiplication of Forest Trees for
Plantation Programmes. Edición Diciembre
108. FAO and UNDP, Bogor, Indonesia.
Campinhos, E., La-Tarraca, S., Laranjeiro, A. y
Penchel F. 1993. The use/place of clonal
multiplication in tree breeding and
propagation programmes: Prerequisites for
success and failure. pp. 9-30. In: Davidson,
J. (ed.). Regional Symposium on Recent
Advances Mass Clonal Multiplication of
Forest Trees for Plantation Programmes,
Bogor, Indonesia, 1-8 Dec 1992. FAO,
Rome, Italy.
Campinhos, E. 1999. Sustainable plantations
of high-yield Eucalyptus trees for produc-
tion of fiber : the Aracruz case. New Forests,
17:129-143.
Cowan, C. y Watson, P. (eds.). 1985. The origins
of agriculture. An international perspective.
224 p. Smithsonian Institution Press, Was-
hington, D.C., USA.
Chahine, K. 2002. Industry opposes genomic
legislation. Nature Biotechnology 20:419.
Dhiman, N., Bonilla, R., O'Kane, D. y Poland,
G. 2002. Gene expression microarrays; a
21st century tool for directed vaccine design.
Vaccine 20:22-30.
Durzan, D. y Campbell, R. 1974. Prospects for
the mass production of improved stock of
forest trees by cell and tissue culture. Can.
J. Forest Res. 4:151-174.
27

Durzan, D. y Campbell, R. 1979. Inhibition of
female cone production in white spruce by
red light treatment during night under field
conditions. J. Exp. Env. Biol. 19:133-144.
Durzan, D. 1980. Progress and promise in
forest genetics. pp. 31-60. In: Proceedings
of the Conference on Paper Science and
Technology, The Cutting Edge. Fiftieth
Aniversary Year, The Institute of Paper
Chemistry, Appleton, WI, USA.
Durzan, D. y Durzan, M. 1993. Opportunities
for biotechnology transfer to developing
countries. HortTechnology 3:268-279.
Durzan, D. 2000. Metabolic engineering plant
cells in a space environment. Biotechnol.
Genet. Eng. Rev. 17:349-383.
Enríquez, J. 1998. Genomics and the world's
economy. Science 281:925-926.
Ferreira, M. y Grattapaglia, D. 1995. Intrudução
ao uso de marcadores RAPD e RFLP em aná-
lise genética. 220 p. EMBRAPA/CENARGEN,
Brasilia D.F., Brasil.
Flint, J. y Mott, R. 2001. Finding the molecular
basis of quantitative traits: Successes and
pitfall. Nature Reviews Genetics 2:237-445.
Fukuya, F. 2002. Our posthuman future
consequences of the biotechnology
revolution. 300 p. Farrar, Straus & Giroux,
New York, USA.
Gwynne, P. y Page, G. 2000. Bioinformatics
moves to center stage in the genetics
revolution. Science 288:1845-1859.
Hartmann, H., Kester, D., Davies, F. y Geneve,
R. 2002. Plant Propagation. Principles and
Practices. 7 th ed. 800 p. Prentice Hall, NJ,
New York, USA.
Huang, F., Buschman, L., Higgins, R. y McGau-
ghey, W. 1999. Inheritance of resistance to
Bacillus thuringiensis toxin in the European
corn borer. Science 284:965-968.
28
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
Hunter, L. (ed.) 1993. Artificial intelligence and
molecular biology. 480 p. AAAI Press/MIT
Press, Menlo Park, CA, USA.
Jayaraman, K. 2002. India approves GM cotton.
Nature Biotechnology 20:415.
Jiménez-Bermudez, S., Redondo-Nevado, J.,
Muñoz-Blanco, J., Caballero, J., López-
Aranda, J., Valpuesta, V., Pliego-Alfaro, F.,
Quesada, M. y Mercado, J. 2002. Manipu-
lation of strawberry fruit softening by
antisense expression of a pectate lyase gene.
Plant Physiol. 28:751-759.
Kauffman, S. 1993. The Origins of Order. Self-
organization and selection in evolution.
709 p. Oxford Univ. Press, Oxford, England.
Lander, E. y Weinberg, R. 2000. Genomics:
Journey to the center of biology. Science
287:1777-1782.
Mann, C. y Plummer, M. 2002. Forest Biotech
edges out of the lab. Science 295:1626-
1629.
Pandey, A. y Mann, M. 2000. Proteomics to
study genes and genomes. Nature 405:837-
846.
Risch, N. 2000. Searching for genetic
determinants in the new millennium. Nature
405:846-856.
Roses, A. 2000. Pharmacogenetics and the
practice of medicine. Nature 405:857-865.
Shi, M., Mehrens, D. y Dacus, K. 2001.
Pharmacogenomics: changing the health
care paradigm. Modern Drug Discovery
4:27-39.
Simmonds, N. 1979. Principles of Crop
Improvement. 408 p. John Wiley & Sons,
New York, USA.
Sinclair, T. y Gardner, F. 1998. Principles of
ecology in plant production. 189 p. CAB
Internacional, Oxon, England.
INTRODUCCIÓN
Stock, G. 2002. Redesigning humans. Our in-
evitable genetic future. 265 p. Houghton
Mifflin, Boston, USA.
Tanksley, S. y McCouch, S. 1997. Seed banks
and molecular maps: Unlocking genetic
potential from the wild. Science 277:1063-
1066.
Tariq, A., Mason, H., Clements, J. y Arntzen,
C. 1995. Oral immunization with a recom-
binant bacterial antigen produced in
transgenic plants. Science 268:714-716.
United Nations. 1969. Chemical and bacterio-
logical (Biological) weapons and effects of
their possible use. 100 p. In: Report of the
Secretary General, Department of Political
and Security Council Affairs, United
Nations, New York, USA.
Watson, R. y Core Writing Team (eds.) 2001.
Climate change 2001: Synthesis Report.
Contribution of Working Groups I, II, III to
Third Assessment Report of Intergovern-
mental Panel on Climate Change. 408 p.
Cambridge University Press, Cambridge and
New York, USA.
Wiseman, A. (ed.) 1988. Principles of Biotech-
nology. 211 p. Surrey University Press, New
York, USA.
Ye, X., Al-Babili, S., Klöti, A., Zhang, J., Lucca,
P., Beyer, P. y Potrykus, I. 2000. Engine-
ering the provitamin A (β-carotene) biosyn-
thetic pathway into (carotenoid-free) rice
endosperm. Science 287:303-305.
29
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

30
EL CULTIVO DE TEJIDOS
EL CULTIVO DE TEJIDOS
ANTECEDENTES HISTÓRICOS
DEL CULTIVO DE TEJIDOS
VEGETALES
E n la teoría sobre totipotencialidad
formulada por Schleiden y Schwann
en 1838, cada célula vegetal es autóno-
ma y capaz de regenerar una planta com-
pleta cuando está sometida a condicio-
nes especiales (Pierik, 1987a). Esta teo-
ría, adelantada para su época, represen-
ta el primer paso para el desarrollo de
las técnicas de cultivo de tejidos in vitro.
Basado en ella, en 1902, Haberlandt, un
fisiólogo austro-húngaro, intentó mante-
ner explantes foliares in vitro buscando
perpetuar su potencial mitótico. Sin
embargo, sus resultados fueron negati-
vos (Dodds y Roberts, 1982) y su fraca-
so tuvo como principal causa la falta de
asepsia y el no uso de hormonas. Pocos
años después (1910), trabajos realizados
por Carrel y otros investigadores en cul-
tivos de células animales y humanas in
vitro, demostraron a través de sus resul-
tados, un avance significativo.
Las investigaciones en el área vegetal
continuaron. En 1922, se obtuvieron in-
teresantes resultados preliminares en tra-
bajos con raíces de tomate (Robbins,
1922), los que más tarde se confirmaron
por White (1934), quien mostró que és-
tas no paraban de crecer in vitro, incluso
tras un largo tiempo, asombrando así a
la comunidad científica de la época.
CAPÍTULO 2
L. Pedro Barrueto C.
En la década de 1930, se logró estable-
cer que el uso de vitaminas como B 1, B 6
y también la inclusión de compuestos or-
gánicos, tales como la sacarosa, permi-
tían el enriquecimiento de los medios
nutritivos utilizados anteriormente. Así
se posibilitó la mantención contenida de
especies antes imposibles de ser introdu-
cidas al laboratorio, dando un empuje
significativo al desarrollo de plantas cul-
tivadas in vitro. Aquí, merece especial
atención Skoog, en los Estados Unidos,
porque logra inducir regeneración de
plantas a partir de explantes iniciales de
médula de tabaco (Skoog y Tsui, 1948).
Por otro lado, en Francia, Morel y Martin
(1952), revolucionaban el ambiente al
promover el crecimiento de dalias libres
de virus a partir de yemas apicales.
Al final de la década de 1950, Reinert
en Alemania y Steward en los Estados
Unidos (Steward et al.,1958; Reinert,
1959), logran de manera casi simul-
tanea, inducir embriones no cigóticos de
zanahorias, haciendo disponible así una
metodología de propagación clonal en
gran escala con especial repercusión en
las empresas forestales (ver capítulo 1:
Figuras 1.1-5) y de comercialización de
flores.
Por otro lado, al comenzar la década del
1960, Cocking en Inglaterra (Cocking,
1960) obtiene protoplastos (células sin
pared celular) y Murashige y Skoog
(1962), publican su medio nutritivo para
31

el cultivo de plantas in vitro, siendo esta
publicación tal vez la más citada en el
ámbito del cultivo de tejidos vegetal de
todos los tiempos.
La suma de descubrimientos no se de-
tiene y en la misma década Guha y
Maheshwari (1964), dos investigadores
indios, consiguen obtener plantas
haploides a partir de granos de polen
inmaduros y algunos años más tarde en
los Estados Unidos, son publicados los
primeros resultados sobre selección in
vitro (Carlson, 1970). Mientras tanto,
Power hace lo mismo sobre fusión de
protoplastos (Power et al., 1970). Avan-
zando en el tiempo, Larkin y Scowcroft
(1981), introdujeron en la nomenclatu-
ra del cultivo de tejidos de planta, el
término de variación somaclonal. En la
misma década, comienzan a aparecer
los primeros trabajos con Agrobacterium
tumefaciens y biobalística, en el campo
de la transformación genética de plan-
tas (Larebeke et al., 1974; Klein, et al.,
1987).
Todas estas investigaciones, además de
reafirmar la vitalidad de la teoría de la
totipotencialidad, tuvieron un profundo
impacto en biología de plantas, agricul-
tura y especialmente, en el cultivo de
tejido de plantas, técnica que ofrece en-
tre otras, las siguientes ventajas:
• Permite fijar características de híbri-
dos, en menor tiempo, que el méto-
do clásico de mejoramiento vía cru-
zamientos repetitivos.
• Produce gran cantidad de propágulos
(clones), a partir de un número redu-
cido de los mismos.
• Los propágulos a su vez, pueden re-
32
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
presentar características superiores a
sus congéneres oriundos de semillas.
• Provee material clonal durante todo
el año, con la ventaja que este mate-
rial está libre de contaminantes. Por
tanto, sin riesgo de diseminar plagas
o enfermedades a nuevas áreas.
• Sirve de base para trabajos de inge-
niería genética y transformación de
plantas,
• Da soporte técnico para la investiga-
ción básica en diferentes campos de
la biología, genética, fisiología,
fitopatología, etc.
• Puede facilitar enormemente el inter-
cambio de germoplasma entre países.
LA BASE DEL CULTIVO in vitro,
EL MEDIO NUTRITIVO
Componentes inorgánicos
a.- Agua.
El agua es el componente más abundante
de los seres vivos, pudiendo constituir
aproximadamente hasta el 90 % del peso
fresco de los mismos. Por eso, no sólo
es fundamental en el medio nutritivo,
sino que también es el componente prin-
cipal.
Sus propiedades físicas y químicas son
resultantes de su estructura molecular.
A pesar de ser eléctricamente neutra, es
un dipolo que presenta carga positiva y
negativa. Una consecuencia de esto, es
su capacidad de disolver o neutralizar
la atracción de cargas eléctricas de cris-
tales como NaCl, los cuales son desar-
mados como tales para ser convertidos
en iones hidratados aislados. Esta capa-
EL CULTIVO DE TEJIDOS
cidad del agua como disolvente de subs-
tancias iónicas, está reflejada en su alta
constante dieléctrica (en torno de 78),
si se compara con la de un líquido orgá-
nico no polar como el etanol, que es 24
(Hopkins, 1999a).
Otra propiedad resultante de aquella es-
tructura bipolar, es la atracción electros-
tática entre las moléculas de agua a tra-
vés de puentes de hidrógeno. Por esta
propiedad, cada molécula de agua pue-
de ligarse a cuatro otras vecinas, confi-
gurando una red fantástica de conexio-
nes. Esto, sin duda, otorga un grado de
fuerza de cohesión molecular. Sin em-
bargo, estas ligaciones por puentes de
hidrógeno son débiles (5 Kcal/mol), lo
cual hace que se rompan casi instantá-
neamente. Debido a la fuerza electrostá-
tica de las cargas de la molécula, que
están siempre presentes, estos puentes
se reconstituyen casi con la misma ve-
locidad. Así, el estado líquido del agua
al final de cuentas, es un estado osci-
lante entre esta red de moléculas de
agua que se hace y deshace, que se arma
y desarma. De esta forma, se va gene-
rando la fluidez que para todos nosotros
es tan familiar a temperatura ambiente
y, que es fundamental para el transporte
de nutrientes, reacciones metabólicas,
eficiencia físico-química del coloide
protoplasmático, presión osmótica y de
turgor de la célula vegetal (Voet y Voet,
1995).
La existencia de esa alta capacidad de
formar puentes de hidrógeno entre las
moléculas de agua, también es respon-
sable por su alto calor de fusión y de
vaporización. Calor de fusión es la can-
tidad de energía necesaria para que una
substancia pase del estado sólido al lí-
quido. En el caso del agua, este valor es
de 80 cal/g (ó 1,4 Kcal/mol). Por otro
lado, calor de vaporización es la canti-
dad de energía necesaria para una subs-
tancia dejar el estado líquido y pasar al
estado gaseoso. En el caso particular del
agua a 25 °C, el calor de vaporización
es de 583 cal/g (ó 10 Kcal/mol ó 44 KJ/
mol), que es a todas luces, un alto valor
para cualquier líquido. Debido a que la
mayor parte de esta energía es usada para
quebrar los puentes de hidrógeno, es pre-
cisamente el agua, el elemento indicado
para que los seres vivos la utilicen en los
procesos fisiológicos de regulación de
temperaturas fisiológicas, como lo es la
transpiración y el control de la tempera-
tura foliar (Taiz y Zeiger, 2002).
Desde el punto de vista práctico, en un
laboratorio de cultivo de tejidos, además
de destilar el agua, es conveniente pa-
sarla por un sistema de desionización
para conferirle una mayor pureza. Ge-
neralmente puede aceptarse una resis-
tencia eléctrica de aproximadamente 10
mega-Ohm. Por otro lado, los recipien-
tes donde ésta se almacena, también
deben ser motivo de cuidado, siendo los
de vidrio Pyrex preferibles a los no
Pyrex, pues estos últimos pueden libe-
rar impurezas, como algunas sales en
forma de silicatos, propio de vidrios po-
co procesados. También son útiles reci-
pientes plásticos, pero muchos de éstos
no son autoclavables.
b.- Sales Minerales.
Las sales minerales que encontramos en
un medio nutritivo disueltas en el agua,
son denominados de macro y micronu-
trientes y están constituidos por aproxi-
madamente 17 elementos. Esta denomi-
33
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

nación alude al hecho de que los pri-

meros, se adicionan al medio en mayor
cantidad que los segundos. Así por ejem-
plo, el KNO 3 se puede adicionar hasta
1900 mg/L en el medio Murashige y
Skoog (MS), contra 6,2 mg/L de H 3 BO 3
(un micronutriente) en este mismo clá-
sico medio “MS”. La inclusión de estos
17 elementos está relacionada con el ca-
rácter esencial de ellos para la planta.
Esto quiere decir que, ésta no se desa-
rrolla adecuadamente en su ausencia.
De esta forma, los elementos esenciales
son irremplazables por otros, aún estan-
do estos vecinos en la Tabla Periódica.
Estos elementos son los siguientes: car-
bono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno,
fósforo, potasio, calcio, magnesio, azu-
fre, boro, cloro, cobre, fierro, mangane-
so, molibdeno, zinc y níquel (Salisbury
y Ross, 1992). Existen varias formulacio-
nes de medios nutritivos, entre ellas está
el medio: White, MS, B5, Nitsch, SP, etc.
(Tabla 2.1). En la actualidad, se cuenta
con medios específicos para la induc-
ción de diferentes morfogénesis, consi- Figura 2.1.
derando por ejemplo si los explantes Plántula de Eucalyptus globulus
provienen de plantas leñosas o herbá- de 20 días de edad.
La planta ha sido germinada in vitro en
ceas, e incluso se han descrito medios medio SP más Phytagel, con fotoperíodo de
preferenciales dependiendo de ciertas 8 horas luz y temperatura de 25 ± 2 ºC.
familias o grupos de plantas taxo- Las semillas, antes de ser colocadas a
nómicamente afines (Figura 2.1). germinar, fueron desinfectadas con
hipoclorito de sodio al 5 % durante
30 minutos y provenían de un lote
En muchos casos, la esencialidad o no almacenado durante 4 años a 10 ºC
de un elemento en la planta, o en el rei- aproximadamente. En la figura se
no vegetal, todavía no está clara. Res- puede observar el vigoroso desarrollo
pecto al fósforo y el magnesio por ejem- del hipocótilo y ausencia del epicótilo.
plo, deduciremos fácilmente que unos
de sus papeles fundamentales en las
plantas se relacionan obviamente con la
constitución del DNA y clorofila, respec-
tivamente. Pero en el caso del silicio,
este rol (o roles) se desconoce (n); así,
puede ser encontrado en muchas plan-

34
EL CULTIVO DE TEJIDOS

Tabla 2.1. Composición de algunos medios nutritivos (mg/L)

1 2 3 4 5
Componentes MS B5 White Heller SP
**
(NH4)2SO4 134,0

(NH4)2NO3 1.650,0 825,0

NaNO3 600,0
KNO3 1.900,0 2.500,0 80,0 950,0
Ca(NO 3)2 300,0
CaCl2 . 2H 2O 440,0 150,0 75,0 220,0
MgSO 4 . 7H2O 370,0 250,0 720,0 250,0 185,0
Na2SO 4 200,0
KH2PO 4 170,0 125,0 85,0
NaH2PO4 . H2O 150,0 16,5
KCl 65,0 750,0
*
FeSO4 . 7H2O 27,8 27,8 13,9
Na2EDTA 37,3 37,3 18,65
FeCl3 . 6H2O 1,0
Fe2(SO4)3 2,5
MnSO4 . 4H2O 22,3 7,0 0,01 22,0
MnSO4 . H 2O 10,0
ZnSO4 . 7H2O 8,6 2,0 3,0 1,0 8,0
H3BO3 6,2 3,0 1,5 1,0 6,0
KI 0,83 0,75 0,75 0,01
Na2MoO 4 . 2H2O 0,25 0,25 0,25
CuSO4 . 5H2O 0,025 0,025 0,03 0,25
CoCl2 . 6H2O 0,025 0,025 0,25
NiCl2 . 6H2O 0,03
AlCl3 0,03
Mio-inositol 100,0 100,0 50,0
Ácido nicotínico 0,5 1,0 0,5 1,0
Piridoxina . HCl 0,5 1,0 0,1 1,0
Tiamina . HCl 0,1 10,0 0,1 1,0 1,0
Glicina 2,0 3,0
Pantotenato de Calcio 1,0 1,0
Sacarosa 30.000,0 20.000,0 20.000,0 20.000,0 20.000,0
Kinetina 0,04-10,0 0,1
2,4-D 0,1-1,0 6,0
AIA 1,0-30,0
pH 5,7-5,85 5,5 5,5 5,8
1
Murashige, T. y Skoog, F. 1962. Physiol. Plant. 15:473-497.
2
Gamborg, O., Miller, R.A. y Ojima, K. 1968. Exp. Cell Res. 50:151-158.
3
White, P. 1934. Plant Physiol. 9:585-600.
4
Heller, R. 1953. Researches on the mineral nutrition of plant tissue. Ann. Sci. Nat. Bot. Biol. Vég. 14:1-223.
5
Actual versión modificada de: Barrueto Cid, L., Machado, A., Carvalheira, S. y Brasileiro, A. 1999. Plant Cell Tiss. Org.
Cult. 56:17-23.
**Macronutrientes: NO 3, S0 4 , H 2 P04 , Ca, Mg, K.
*Micronutrientes: Fe, Mn, Zn, B, Mo, Cu, Co, Ni, Cl.

35

tas (ejemplo gramíneas), pero no se ha
demostrado su esencialidad en solucio-
nes nutritivas, a pesar de que, en diato-
meas es vital (Epstein, 1975). El selenio
es otro elemento cuya esencialidad no
está declarada para la mayoría de las
plantas, no obstante, algunas lo presen-
tan en relativamente altas concentracio-
nes en sus tejidos, (Astragalus y Atriplex,
por ejemplo) a pesar de ser un elemento
tóxico. El níquel es otro caso sorpren-
dente, se encuentra en la lista de ele-
mentos esenciales, a pesar de que princi-
palmente forma parte de enzimas bacte-
rianas. Entre ellas, la ureasa y monóxido
de carbono (CO) deshidrogenasa, ambas
importantes en el ciclo del N 2 y CO 2 en
la naturaleza (Thauer, 2001).
La interacción de los iones (aniones y
cationes) con la interfase celular, en el
ámbito de la célula vegetal, ha sido es-
tudiada con intensiva atención dentro de
la fisiología vegetal. Por la información
disponible actualmente, el flujo de iones
a través de la membrana celular depen-
de de una serie de factores. Entre ellos
se pueden citar: carga eléctrica de los
iones, concentración, temperatura, res-
piración, configuración de la membra-
na (proteínas intrínsecas y extrínsecas),
potencial eléctrico de membrana,
AT P a s a s , t r a n s p o r t a d o r e s , c a n a l e s ,
acuoporinas, etc. (Clarkson, 1984;
Levitan y Cibulsky, 2001; Taiz y Zeiger,
2002). Estos factores sólo se mencionan
y no se describen, por alejarse del obje-
tivo del presente capítulo.
En el laboratorio el uso de esta extensa
lista de sales minerales, plantea el pro-
blema de cómo manipularlas. Mante-
niendo la premisa de la mínima mani-
pulación de los reactivos para así evitar
36
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
al máximo los focos de contaminación,
es altamente recomendable la prepara-
ción de soluciones madres y su manten-
ción en el refrigerador o congelador
(cuando se pueda). También, es reco-
mendable preparar soluciones madre
para macro y micronutrientes. En una so-
lución madre, las distintas sales se pre-
paran varias veces en su concentración
normal de trabajo por litro. En el caso
de los macronutrientes del medio MS,
por ejemplo, 10x para un litro (lo que
significa hacer un litro de una solución
madre con diez veces la concentración
de usual trabajo de macronutrientes). En
el caso de los micronutrientes, para el
mismo MS, la solución madre podría ser
de 100x para100 mL de agua (lo que sig-
nifica hacer cien mL de una solución
madre con cien veces la concentración
de usual trabajo de micronutrientes). Así,
en la preparación de un litro de medio
(solución de trabajo), deberá utilizarse
1 mL de solución madre de los micro- y
100 mL de solución madre de los
macronutrientes.
Las cantidades de sales presentes en los
medios nutritivos, como los ya mencio-
nados, varía de medio en medio. Una
planta in vitro puede presentar deficien-
cias o consumo en exceso (o lujo), se-
gún se encuentre bajo o sobre la con-
centración crítica del elemento, respec-
tivamente. Esto es, por ejemplo, depen-
diente de si la planta se encuentra sin
raíces o con ellas. Por este motivo, nu-
merosas veces son preferidos medios
más diluidos, como el SP. La concentra-
ción crítica de un elemento, es aquella
un poco menor al nivel que da el creci-
miento óptimo de la planta (Hopkins,
1999b). La información sobre concen-
tración crítica de un elemento, en su
EL CULTIVO DE TEJIDOS
mayoría es proveniente de las condicio-
nes de nutrición de las plantas en el
campo, o de soluciones hidropónicas en
laboratorio. De esta forma, la utilización
de este concepto en el cultivo de teji-
dos, es una extrapolación de la informa-
ción de las condiciones de nutrición. Sin
duda, una línea de estudios que consi-
dere lo señalado, se visualiza promisoria
para la técnica de cultivo de tejidos.
Componentes orgánicos
a.- Vitaminas.
Las vitaminas son una denominación
genérica que incluye un grupo de sus-
tancias orgánicas presentes en pequeñas
cantidades dentro de la célula, partici-
pando de determinadas funciones den-
tro de ella, como por ejemplo, ser un
cofactor no proteico de enzimas.
El nombre de vitaminas está ligado his-
tóricamente al polaco Casimiro Funk,
quién descubrió que este principio acti-
vo estaba vinculado a la prevención del
denominada “beriberi”, una carencia
nutritiva relacionada con la vitamina B 1
en poblaciones que consumían preferen-
temente arroz blanco.
En general, las vitaminas forman parte
de enzimas, por lo que son importantes
para desempeñar una acción catalítica
normal. En este sentido, son cofactores
de las enzimas, igual que muchos ele-
mentos químicos presentes entre los
macro y micronutrientes.
La vitaminas se dividen en liposolubles
(A, D, E, K) e hidrosolubles. Entre estas
últimas tenemos: B 1: tiamina; B 2: ribofla-
vina; B 3: niacina; B 6: piridoxina; biotina;
ácido fólico; B 12 : cobalamina; ácido
ascórbico: vitamina C (Voet y Voet,
1995).
En cultivo de tejidos vegetales básicamen-
te son utilizadas las del complejo B, sien-
do la B1 probablemente la más frecuente-
mente incluida. Es vital para la descar-
boxilación del piruvato, pues es un
aceptor momentáneo del grupo ace-
taldehído, co-auxiliando a la piruvato
descarboxilasa, acetaldehido deshidro-
genasa y α-cetoglutarato deshidrogenasa.
La vitamina B 6 (piridoxina), es grupo
prostético de varias enzimas, siendo el
piridoxal-fosfato la forma más activa como
grupo prostético de enzimas que catalizan
reacciones de aminoácidos, como por
ejemplo, las transaminaciones, en las cua-
les, el grupo amino de un α-aminoácido
es transferido a un α-cetoácido, ejemplo:
glutamato →cetoglutamato; aspartato →
oxaloacetato.
El ácido pantoténico es otra vitamina con
función de coenzima, pues, es un cofactor
importante de la Coenzima A, molécula
que desempeña un papel importante en-
tre la interfase de la glicólisis y el ciclo de
Kreb (piruvato → oxaloacetato) (Stryer,
1992).
Otras vitaminas importantes del comple-
jo B (ácido fólico, vitamina B 12) y vita-
mina C (ácido ascórbico), no son fre-
cuentemente citadas en la literatura del
cultivo de tejidos vegetales. A pesar de
esto, el ácido ascórbico puede ser usa-
do como antioxidante (100-200 mg/L) de
explantes, antes de que éstos sean ino-
culados en el medio nutritivo, para evi-
37

tar el fenómeno de pardeamiento
(“browning”). Éste es bastante proble-
mático en el cultivo de tejidos, especial-
mente en plantas leñosas. Como an-
tecedente técnico, es importante men-
cionar que esta vitamina debe ser cons-
tantemente ingerida por el hombre y que
su carencia produce el escorbuto (hemo-
rragias diversas y sangramiento de las
encías, entre otros).
La niacina (B 3 , ácido nicotínico), como
componente del complejo vitamínico B,
está presente en la mayoría de los me-
dios nutritivos. Además, es precursor de
NAD + (nicotinamida-adenina-dinucleó-
tideo) y NADP + (nicotinamida-adenina-
nucleótideo-fosfato), siendo éste su ver-
dadero rol en la planta. En la mayoría
de las deshidrogenasas donde estos com-
puestos están presentes, se unen transi-
toriamente a ellas durante el ciclo
catalítico, oxidándose (NAD + ) o redu-
ciéndose (NADH), como en el caso de
la malato deshidrogenasa, donde el
malato es deshidrogenado y transforma-
do en oxaloacetato.
b.- Sacarosa
Es el soluto adicionado al medio nutriti-
vo en mayor cantidad como fuente de
energía, y es preferido a otros carbohi-
dratos (White, 1934). La sacarosa, des-
de el punto de vista estructural, está
constituida por la unión de D-glucosa y
D-fructosa ligadas covalentemente a tra-
vés de un enlace glucosídico. Es sinteti-
zada por numerosas plantas, pero no es
sintetizada por los animales superiores.
Constituye un producto intermediario de
la fotosíntesis, extremadamente soluble
38
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
en agua y no tiene poder reductor, sien-
do la forma de transporte de los carbohi-
dratos más utilizada por las plantas des-
de las hojas a otros órganos, proceso que
ocurre vía floema. A través de este re-
corrido, la sacarosa no es degradada por
enzimas, pero, la invertasa la desdobla
en sus componentes naturales, en el in-
terior de las células, en beneficio de la
glucólisis, formación de almidón, celu-
losa, etc. (Salisbury y Ross, 1992).
Su adición al medio se justifica debido a
que, el explante o las plántulas que se
generan in vitro, generalmente presentan
una baja tasa fotosintética debido a sus
condiciones especiales de desarrollo, no
siendo completamente autotróficos.
La concentración más frecuentemente
utilizada varía entre 20 a 30 g/L, pero
dependiendo de los casos, puede adicio-
narse en concentraciones más altas,
como en el cultivo de embriones, orquí-
deas, bulbificación de ajo, etc.
Es oportuno resaltar que la sacarosa pue-
de ser hidrolizada en su paso por el auto-
clave. Aunque, el impacto de esto para el
explante o la planta no está claro, tampo-
co para el potencial osmótico del medio.
En el mercado, son comercializadas a
través de diferentes marcas tales como;
Sigma, Merck, Carlo Erba, Fluka, etc.;
todas ellas con alto grado de pureza, lo
que encarece su costo. Además, es reco-
mendable llamar la atención sobre el
hecho de que el azúcar común de su-
permercado, presenta un alto grado de
sacarosa (tal vez 98 %), pero puede con-
tener impurezas.
EL CULTIVO DE TEJIDOS

Otros carbohidratos como: glucosa, ma- - Auxinas

nosa, fructosa, sorbitol, etc., también
han sido utilizados, sin embargo, no son
de uso frecuente (Tang, 2000).
c.- Hormonas
La mayoría de los cultivos de tejidos
vegetales in vitro necesitan de estas
biomoléculas (Tabla 2.2). No obstante,
la concentración y el tipo de hormona
dependerá de cada caso. En general, son
tres grupos de hormonas las más emplea-
das: auxinas, citoquininas y giberelinas.
Existen otras dos biomoléculas muy im-
portantes dentro de las hormonas: el
etileno y el ácido abscísico, que aunque
son menos utilizados, juegan papeles
importantísimos dentro del metabolismo
del explante in vitro. Por ejemplo, el
etileno es capaz de activar enzimas re-
lacionadas con la senescencia y oxida-
ción fenólica del tejido (Davies, 1995).
Entre éstas (Tabla 2.2, Figura 2.2), está
el ácido indolil-3-acético (AIA), cuya
síntesis es realizada a partir del triptó-
fano, el cual dependiendo de la planta,
por vía enzimática puede primeramente
descarboxilarse o desaminarse, para des-
pués dar origen al indol-3-acetaladehí-
do, el cual, por oxigenación da origen
al AIA. Esta hormona es sintetizada a
partir de tejidos meristemáticos en la
planta (meristema apical, radicular, ye-
mas embriones, etc.). El ácido naftalena-
cético (ANA), picloram (ácido 3,5,6
tricloropicolinico), ácido indolbutírico
(AIB), ácido 2,4-diclorofenoxiacético
(2,4-D), ácido 4-cloroindol-3-acético (4-
Cl-AIA), etc., son ejemplos de auxinas.
No todas las auxinas son hormonas, es
así como el ANA, picloram, 2,4-D, etc.,
son denominados reguladores de creci-

Tabla 2.2. Lista de algunos reguladores de crecimiento y de hormonas

usadas en cultivo de tejidos de plantas.

Nombre Abreviatura Peso molecular (g)

Ácido indolil-3-acético AIA 175,2

Ácido indolil-3-butírico AIB 203,2
Ácido diclorofenoxiacético 2,4-D 221,0
Ácido α-naftalenacético ANA 186,20
Ácido p-clorofenoxiacético APCF 186,60
Ácido 2,4,5-triclorofenoxiacético 2,4,5-T 225,49
Ácido 2-metoxi-3,6-diclorobenzoico Dicamba 221,0
Ácido 4-amino-3,5,6-tricloropicolínico Picloram 241,46
Ácido abscísico ABA 264,3
Adenina A 135,13
6-(4-hidroxi-3-metil-trans-2-butenilamino) purina Zeatina 219,0
N 6-furfuriladenina, o, 6-furfurilaminopurina Kinetina 215,2
6-bencilamino purina,o,6-benciladenina BAP, BA 225,3
6-(γ,γ-dimetilalilamino) purina,o, 2-isopenteniladenina 2iP 203,25
1-fenil-3-(1,2,3-tiadiazol-5-il) urea TDZ 220,2

39
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

A B
CH 2COOH CH 2CH 2CH 2OOH

N N
H

OCH 2COOH CH 2COOH

C D
Cl

Cl

OCH 2COOH OCH 2COOH

E F Cl

Cl
Cl Cl
G COOH H NH 2
CH 3O Cl Cl
Cl

Cl Cl COOH
N

Figura 2.2. Estructura química de algunas auxinas

usadas en micropropagación.
A: AIA; B: AIB; C: 2,4-D; D: ANA; E: APCF; F: 2,4,5-T;
G: Dicamba; H: Picloram. Ver Tabla 2.2.

miento y no hormonas, pues no son pro- - Citoquininas.

ducidos por la planta.
La cantidad de auxinas usadas en los
medios nutritivos es baja, con concen-
traciones en el orden micromolar (µM).
En cantidades mayores, producen efec-
tos de herbicida y por lo mismo, son
tóxicas. Pueden ser disueltas en KOH o
NaOH 0,1 N y almacenadas en conge-
lador como una solución madre. Entre
las acciones fisiológicas promovidas por
las auxinas en la micropropagación es-
tán: la inducción de callos, inducción
de raíces, establecimiento de suspensión
celular, metilación de la citocina, forma-
ción de frutos, etc. (Fernandez, 2000).
Este grupo de hormonas (Figura 2.3) es
normalmente usado en el cultivo de te-
jidos para promover el desarrollo de ye-
mas adventicias a partir de callos o
embriogénesis somática (Barrueto Cid et
al., 2004). Esto ha tenido un gran im-
pacto, por ejemplo, en la industria de la
floricultura. También se ha demostrado
su influencia en la tuberización de pa-
pas (Solanum tuberosum) in vitro
(Palmer y Smith, 1969).
Las citoquininas pueden ser encontradas µ
libres o formando parte de anticodón de
tRNAs, como en el caso del tRNA de la

40
EL CULTIVO DE TEJIDOS

A NH 2 B CH 3
N CH 2 - CH= C
N CH 2OH
NH
N
N N
N H

N
N H
C
NHCH 2
N
N O

CH 2
N
N D
H NH
N
CH 3 N
CH 2 - CH= C
E CH 3
NH N
F N H
N
N N CH O
H H
N C N C N
N
N H S

Figura 2.3. Estructura química de algunas citoquininas.

A: Adenina; B: Zeatina; C: Kinetina; D: BAP; E: 2iP; F: TDZ. Ver Tabla 2.2.

serina (Hall, 1973). La biosíntesis de las
citoquininas en plantas, Arabidopsis, es
preferentemente vía ATP o ADP con
isopentenilpirofosfato (∆ 2-iPP) para dar
iPTP (isopenteniladenosina- 5’-trifosfato
en el caso de ser usado ATP). En este
paso metabólico participa la enzima
isopentenil transferasa (IPT) y es primor-
dial para la síntesis de citoquininas. IPTP
es un producto clave en la biosíntesis
de la zeatina: 6-(4-hidroxi-3-metil-trans-
2-butenilamino purina). A partir de IPTP
ésta se origina, siendo la zeatina, una
de las citoquininas más activas en el
cultivo de tejidos. En bacterias, su sín-
tesis es a partir de AMP y no de ATP o
ADP como en Arabidopsis.
En general, los trabajos pioneros sobre
citoquininas fueron iniciados por Folke
Skoog en la Universidad de Wisconsin,
cuando trataba de encontrar algún com-
puesto que estimulara la proliferación
celular en cultivos de tejidos in vitro
(Fosket, 1994).
La zeatina y 2iP [ (6 γ-γ-dimetilamino-
purina, conocida también por IPA (iso-
pentenil adenina) ] , son dos citoquininas
naturales en oposición a la Kinetina (6-
furfurilamino-purina) y BAP (6-bencila-
mino-purina), que son dos reguladores
del crecimiento. TDZ (N-fenil-N-1,2,3-
tidiazol-5-il urea) es una citoquinina sin-
tética del grupo de la urea, no púrica,
teniendo un poderoso efecto citociníni-
co en muchas plantas cultivadas in vitro
(Murthy et al.,1998).

41

Las citoquininas también son usadas en
pequeñas cantidades (µM), son solubles
en HCl 0,1 N y mantenidas como solu-
ción madre congeladas.
Las citoquininas, a pesar de ser un com-
ponente fundamental en los protocolos
de micropropagación, pueden estimular
hiperhidricidad, fenómeno en el cual la
planta toma un aspecto vitrificado, por
tanto, sin valor comercial. La hiperhidri-
cidad es un desorden fisiológico de la
planta in vitro, caracterizado por hojas
rígidas y quebradizas, anormalidad esto-
mática y deficiente formación de la cutí-
cula. La vitrificación puede tener otras
causas también, por ejemplo, exceso de
humedad relativa dentro del frasco, al-
tos niveles de NH4 y citoquininas
(Daguin y Letouzé, 1986; Leshem, et al.,
1988; ver capítulo 4).
- Etileno.
El etileno en su relación con la planta,
fue conocido primero como un agente
químico externo con poderosos efectos
fisiológicos. Mucho más tarde, se des-
cribió en efecto como una hormona ve-
getal propiamente tal, esto es, como un
principio activo producido por la plan-
ta (Johnston, 2000). Su síntesis está li-
gada a precursores como la metionina,
un aminoácido que contiene un grupo
R apolar con S y CH 3 presentes.
Entre los efectos fisiológicos de este gas
pueden citarse: ruptura de dormancia de
papas, inducción de maduración de fru-
tas e inducción de abscisión foliar. Pa-
ralelamente a esto, el etileno tiene un
efecto regulador sobre otras actividades
de la planta, como respuesta a las heri-
42
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
das del tejido y estrés. En este sentido,
se le ha descrito induciendo poblacio-
nes de mRNAs de varios genes, entre
ellos, aquel que codifica para celulasas
(Tal e Imber, 1970). Vale la pena señalar
que etileno posee ya un rol asumido en
el proceso de defensa de las plantas, el
cual sería aportar en una respuesta de-
fensiva de tipo sistémico.
Interesante es que el CO 2 puede anular
algunos de sus efectos, lo que preferen-
temente se observa en la inhibición de
proceso de maduración de frutos clima-
téricos. Del mismo modo, la ciclohexi-
mida y la actinomicina D, pueden inhi-
bir respuestas al etileno, sugiriendo la
mediación de eventos relacionados con
la transcripción y transducción, respec-
tivamente; debido a que estos compues-
tos actúan a estos niveles de la síntesis
proteica (Leopold y Kriedemann, 1975).
El efecto local o a distancia, tal vez no
esté mediado por ningún tipo de inter-
mediación, por que como gas, se movi-
liza conforme a la ley de Fick, o sea, por
una gradiente de concentración.
En el cultivo de tejidos, sus efectos son
contradictorios, pues existen casos don-
de participa promoviendo eventos, como
la embriogénesis somática y casos don-
de tiene un efecto inhibitorio, como en
la morfogénesis (Hatanaka et al., 1995;
Kumar et al., 1998).
El explante tiene capacidad para produ-
cir esta olefina y por tanto, influir en su
concentración dentro del frasco afectan-
do favorablemente o no, la dirección de
un proceso morfogénico. Una manera de
disminuir el efecto perjudicial del
EL CULTIVO DE TEJIDOS
etileno presente en el tejido, es a través
del uso de AgNO 3 . Este es un inhibidor
c o m p e t i t i v o d e l a h o r m o n a ( B e y e r,
1976). También se puede incluir el uso
de CoCl 2 y NiCl 2 , los cuales son inhi-
bidores de su síntesis (Biddington, 1992).
En relación a la naturaleza gaseosa del
etileno, es oportuno mencionar que ade-
más en las plantas existe el óxido nítri-
co (NO) (Wojtaszek, 2000), un gas que
se comporta como un potente modu-
lador de numerosos procesos biológicos.
Entre ellos: apoptosis, lignificación de la
pared celular, defensa de la planta fren-
te a patógenos, etc. (Beligni y Lamattina,
2001; Pedroso et al., 2000; Orozco-Cár-
denas y Ryan, 2002). Como modulador,
se ha descrito su acción en relación con
la síntesis de guanosín-monofosfato cí-
clico (cGMP), a partir de la enzima
guanilato ciclasa. El cGMP es conside-
rado un segundo mensajero y por lo tan-
to, está comprometido en reacciones de
transducción de señales al interior de la
célula. En este sentido, NO también está
ejecutando roles de transdución de se-
ñales a nivel de fitocromo, otra molécu-
la de carácter regulatorio en las plantas.
En los animales, NO es sintetizado vía
L-arginina por la enzima óxido nítrico
sintasa (NOS). En plantas, hasta ahora
esta vía no ha sido plenamente acepta-
da, entre otras razones, porque esta en-
zima no ha sido aislada. Como radical
libre, NO puede producir fragmentación
del DNA e inactivación de ciertas enzi-
mas, por lo tanto, puede provocar la
muerte celular. Finalmente, se discute si
el NO esta metabólicamente ligado al
etileno (Magalhães et al., 1999).
- Giberelinas.
La historia de la giberelinas (GA) está
ligada a los arrozales del Japón, en co-
mienzos del siglo XX. En efecto, se ob-
servó que plantas contaminadas con el
hongo Gibberella fujikuroi, crecían más
que sus congéneres (Matsumoto, 2000).
Las innumerables giberelinas existentes
en las plantas, son diterpenoides con tres
anillos aromáticos, cuya base estructu-
ral, en último término, es el isopreno,
un compuesto de cinco carbonos. Las
plantas producen una enorme cantidad
de isoprenoides, entre ellos, las resinas
de los pinos y el látex del caucho. Entre
los precursores de la biosínteis de las
giberelinas están el ácido mevalónico,
isopentenilpirofosfato, kaureno, en una
larga sequencia de pasos metabólicos
hasta culminar en el citosol, con la for-
mación de este tipo de hormonas.
Entre los efectos fisiológicos de las
giberelinas, puede citarse la elongación
de: plantas enanas (maíz, poroto), plan-
tas en roseta (repollo), hipocótilo de le-
chuga y producción de alfa amilasa en
semillas de gramíneas. Resulta interesan-
te el hecho que existan sustancias que
pueden anular estos efectos, porque pue-
den afectar a su biosíntesis; entre ellas:
AMO 1618, CCC, Fosfon D, Ancymidol,
etc. (Wareing y Phillips, 1982).
Entre los sitios de síntesis, puede citarse
el meristema apical y radicular, no exis-
tiendo evidencias muy poderosas sobre
su polaridad en la translocación, porque
ha sido detectado tanto en el floema
como en el xilema. En el cultivo de teji-
dos vegetales, no es frecuente su uso.
43

Sin embargo, existen registros de su uti-
lización en la elongación de brotes ad-
venticios de callos. Además, debe tener-
se presente que las enérgicas condicio-
nes de temperatura y presión del auto-
clave, degradan la molécula y su presen-
cia en el medio de cultivo, pudiendo in-
hibir el enraizamiento de las plántulas.
- Ácido abscísico.
El ácido abscísico (ABA) es un compues-
to hormonal que tiene más acción
inhibitoria que estimuladora. Depen-
diendo de la posición del grupo car-
boxilo, presenta dos formas isoméricas
cis/trans (referido esto a la posición de
los grupos sustituyentes en el doble en-
lace), pero, en función de una asimetría
del C 1, presenta también isomería ±. Sin
embargo, en la planta, la forma + y cis
son las más abundantes. La oxidación de
la xantofila, un carotenoide, constituye
una vía de síntesis (Lemus, 2000), sien-
do en esta ruta, la 9’cis-neoxantina un
intermediario importante capaz de ori-
ginar a la xantoxina (C 15), el precursor
más inmediato de la síntesis del ABA
(Walton y Li, 1995).
El estrés hídrico en la planta estimula la
síntesis de ABA en la hojas, la que parte
en los cloroplastos (Orozco-Cárdenas y
Ryan, 2002). También, algunos plastidios
podrían sintetizarlo (Cutler y Krochko,
1999). Desde el punto de vista fisiológi-
co, el ABA estimula el cierre de los
estomas, desempeñando un papel fun-
damental en la economía hídrica de la
planta (Walton y Li, 1995). Algunos
mutantes carecen de la capacidad para
cerrar sus estomas, presentando un mar-
chitamiento permanente. Las evidencias
44
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
experimentales en este caso han mostra-
do que la falta de ABA provocaría tal
fenómeno, debido a que, aplicaciones
exógenas con ABA restituyen la condi-
ción hídrica normal (Tal y Imbert, 1970).
Por otro lado, trabajos más recientes, in-
dican que el NO y más específicamente
el cGMP, serían intermediarios a través
de los cuales el ABA ejercería su acción
(Steven et al., 2002).
En cultivo de tejidos vegetales su uso es
muy restringido, pero hay referencias de
su utilización en la embriogénesis somá-
tica (Ammirato, 1983) y en la poliembrio-
génesis (Cutler y Krochko, 1999), ya sea
para inhibir la germinación de embrio-
nes mal conformados o como requeri-
miento del proceso de maduración de los
mismos. Otros antecedentes dan cuenta
de que el ABA ha sido usado para alma-
cenar embriones cigóticos durante algún
tiempo bajo condiciones in vitro. Luego
de este período, al remover la hormona,
los embriones germinan aparentemente
en forma normal. Tal práctica tendría uti-
lidad en la conservación de germoplasma
de semillas recalcitrantes, como por
ejemplo en café (Murthy et al., 1998).
- Ácido jasmónico.
El ácido jasmónico (JA) y los jasmonatos
en general, se encuentra en forma natu-
ral en una serie de plantas desempeñan-
do un papel fundamental en el desarro-
llo de las mismas, especialmente en
cuanto a respuestas a estrés ambiental.
Respecto a su efecto sobre el desarro-
llo, JA y sus derivados pueden afectar la
maduración de los frutos a través de su
acción estimulante sobre la ácido 1-ami-
nociclopropano 1-carboxílico sintetasa
EL CULTIVO DE TEJIDOS
(ACC-sintasa) y la ACC-oxidasa, dos en-
zimas claves en la síntesis del etileno.
En relación al estrés ambiental, pueden
activar el sistema de defensa de la plan-
ta, la ya mencionada protección sisté-
mica frente a ataques de hongos o insec-
tos, interacción en la cual desempeña un
papel importante la sistemina, polipép-
tido hormonal que gatilla la síntesis de
JA. Éste a su vez, activa la expresión de
ciertos genes, por ejemplo los relacio-
nados con la inhibición de proteinasas
(Creelman y Mullet, 1997). La ruta bio-
sintética del ácido jasmónico comienza
con el ácido linolénico (18:3), un com-
ponente de la membrana celular y la
acción de lipoxigenasas (LOX) (Peña -
Cortés, 2000).
En cultivo de tejidos, su uso ha sido más
bien discreto y se lo ha vinculado a la
producción de microtubérculos in vitro
en especies tuberizantes (Pelacho y
Mingo-Castel, 1991), inhibidor del cre-
cimiento de callos y de la germinación
de semillas, cuando es aplicado exóge-
namente (Steven et al., 2002).
- Triacontanol.
Dentro del conjunto de hormonas y re-
guladores del crecimiento de plantas que
tradicionalmente han sido utilizados en
la micropropagación, se suma ahora
también el Triacontanol, como promo-
tor de inducción de yemas y enraiza-
miento (Reddy et al., 2002). Este com-
puesto es un alcohol primario de cade-
na larga [CH 3 (CH 2 ) 28 CH 2 OH], con peso
molecular de 438,8 g cuya biosíntesis no
es bien conocida. Se encuentra presen-
te en la composición de la cutícula de
las hojas, mezclado con otros compo-
nentes de la matriz cuticular; entre ellos,
ácidos grasos simples, hidroxilados o
esterificados y ceras. El compuesto es
soluble en cloroformo y puede ser
autoclavado (121ºC / 20 min). En Malus
domestica, ha sido utilizado en concen-
traciones que van entre 2 a 20 µg/L. En
esta especie actúa estimulando la
brotación y el enraizamiento (Tantos et
al., 2001). Esto permite incrementar las
respuestas regenerativas especialmente
en plantas de carácter leñoso más recal-
citrantes. Además, es conveniente recal-
car que su uso aún no es generalizado.
d.- Agentes gelificantes
El agente gelificante es un carbohidrato
(hetero-polisacárido) cuya concentra-
ción puede variar entre 50 a 90 %. Estos
agentes son necesarios para dar consis-
tencia al medio nutritivo, de modo que
el explante quede en la superficie. En el
mercado se ofrece en diferentes marcas
(Sigma, Merck, nacionales) y precios. La
cantidad por litro puede variar desde 2
g/L en el caso de “Gelrite” hasta 6 a 8 gr
por litro, en el caso del agar puro y sim-
ple. El agente gelificante se disuelve en
el agua a 100º C y solidifica alrededor
de los 45º C. Este último dato es impor-
tante, porque en el caso de que sustan-
cias termolábiles deben adicionarse al
medio después de autoclavado, esto
debe hacerse un poco antes de que la
temperatura del medio llegue a ese va-
lor. Otras preocupaciones respecto a este
tipo de ingrediente es que puede ir
acompañado de sales, producir vitri-
ficación en las plantas obtenidas y de-
pendiendo del pH, puede ser hidro-
lizado en su paso por el autoclave
(George, 1993b).
45

Dentro del amplio espectro de ingredien-
tes del medio nutritivo, el precio del
agente gelificante es uno de los más ele-
vados (sobre US$ 100/Kg). Por eso, a ve-
ces, se utilizan alternativas más baratas
como es el almidón de maíz, maicena
(Barrueto Cid et al., 1994) o soportes de
papel de cromatografía (Pierik, 1987c).
Sin embargo, la posibilidad de usar estas
alternativas más baratas dependerá de la
complejidad del experimento; por ejem-
plo, en el caso de la embriogénesis
somática de vides el agente gelificante de
los medios debe ser de máxima calidad.
e.- Otros.
Es oportuno señalar que los medios nu-
tritivos pueden ser complementados con
una amplia gama de otras sustancias,
conforme su finalidad. Por ejemplo, en
el caso de selección para tolerancia a
estrés u obtención de mutantes, pueden
contener variadas concentraciones de
NaCl; metales pesados (Cd, Al y otros);
análogos de aminoácidos (5-metiltrip-
tofano, p-fuorofenilalanina); análogos de
bases púricas o pirimídicas (bromodeo-
xiuridina:BUdR; 8-azaguanina, etc);
antibióticos (cefotaxima, puromicina,
kanamicina, etc.); toxinas de hongos,
etc. El estrés es considerado como sinó-
nimo de cualquier causa ambiental ca-
paz de desencadenar efectos hacia el
interior de la célula, estos cambios pue-
den ser elásticos (reversibles) o plásti-
cos (permanentes). En este último caso,
con la adquisición o pérdida de una ca-
racterística en particular.
Diversos trabajos en el área, como ob-
tención de mutantes, exigen normalmen-
te cultivos de células en medio líquido,
46
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
las cuales se someten por algún tiempo
a un tipo de mutágeno tal como etilme-
tano-sulfonato o radiación gamma. Pos-
teriormente, las células se transfieren a
un medio sólido en presencia de un
agente de selección deseado, el cual,
puede ser un antibiótico, herbicida,
NaCl, etc., en diferentes concentracio-
nes. Las células que se multiplican bajo
condiciones de una concentración alta
de cualquiera de estos agentes, estarán
presentando una resistencia a tal condi-
ción y, por lo tanto, sugiriendo la pre-
sencia de un mutante. Posteriormente,
estas células son inducidas a multipli-
carse para formar callos y a partir de
aquí, regenerar plantas. Finalmente, és-
tas se someterán a las pruebas corres-
pondientes para verificar si se ha gene-
rado realmente un mutante y, si su des-
cendencia presenta o no, tal caracterís-
tica. Este tipo de trabajos tiene bastante
impacto en el área agrícola, especial-
mente en el área fitopatológica, donde
la búsqueda de materiales resistentes a
enfermedades es muy persistente
(Thakur et al., 2002).
Finalmente, habría que señalar que el
cultivo de tejidos de plantas no es una
ciencia, sino una técnica, como cual-
quier otra. Así, el cultivo de tejidos uni-
do a otras técnicas tales como: la inmu-
nofluorescencia para el estudio de mi-
crotúbulos, el análisis citométrico para
determinar cantidad de DNA en el ciclo
celular, la autorradiografía para rastrear
y localizar compuestos radioactivos por
los “pasajes secretos” de la célula y la
transformación genética para el mejora-
miento de plantas, ha permitido grandes
avances en el estudio de la biología de
plantas y en la comprensión del fenó-
EL CULTIVO DE TEJIDOS
meno biológico. De esta forma, el culti-
vo de tejidos de vegetales ocupa un lu-
gar clave dentro de lo que se ha deno-
minado “la segunda revolución verde”,
refiriéndose a los grandes avances de la
biotecnología, justamente, por todas
esas ventajas enumeradas al final del
capítulo anterior.
ALGUNOS ASPECTOS PRÁCTICOS
SOBRE EL LABORATORIO DE
CULTIVO DE TEJIDOS
DE PLANTAS.
Como toda técnica, el cultivo de tejidos
tiene necesidad de una infraestructura y
equipamientos básicos para operar
(George, 1993a). En relación a la infra-
estructura, son varios los espacios nece-
sarios para desarrollar un trabajo adecua-
do. Si se excluye la producción de
plántulas a gran escala y si consideramos
una unidad académica o de investiga-
ción, la infraestructura básica considera
cinco salas, incluyéndose una ó dos
como fitotrones. Una sala de lavado y
secado del material de vidrio, una segun-
da de autoclavado, una tercera para pre-
paración de medios y balanzas, una cuar-
ta de inoculación y una quinta de man-
tención y crecimiento, con fotoperíodo
y temperatura controlada. Se estiman 15
m 2 aproximadamente por sala, alcanzán-
dose 75 m 2 de superficie total.
Esta estructura sólo podría sustentarse
con un proyecto de investigación y/o
venta de algún tipo de servicio, como
por ejemplo, plántulas o plantines para
el área agrícola, forestal u ornamental.
En el ítem sustancias químicas, se inclu-
ye una extensa lista que considera; sa-
les, hormonas, vitaminas, agar, antibió-
ticos, etc. Por otro lado, no menos exten-
sa es la lista de material de vidrio que
invariablemente incluye, matraces
Erlenmeyer, tubos de ensayo, vasos pre-
cipitados, placas Petri, etc., todos de
diferentes capacidad volumétrica y re-
sistentes al autoclavado, de vidrio Pyrex
o polímeros plásticos.
A estas listas deben agregarse todavía los
equipos, tales como cámara de flujo la-
minar, pH-metros, balanzas, lupas, mi-
croscopios, micropipetas, refrigeradores,
congeladores, centrífuga y equipos es-
pecializados según sea el caso, por
ejemplo agitadores, electroporador, ul-
tracentrífugas, biorreactores, etc. Todo
eso sin contar con el personal técnico y
de apoyo que debe gerenciar y ejecutar
las actividades corrientes de un labora-
torio con estas características.
Por consideraciones de costos, los labo-
ratorios de cultivo de tejidos de plantas,
están cada vez más restringidos y es fre-
cuente encontrarlos compartiendo de-
pendencias con el área de transforma-
ción genética, que también emplea la
misma infraestructura señalada.
Con el propósito de disminuir costos de
mantención, el cultivo de tejidos de plan-
tas ha desarrollado nuevas estrategias o
soluciones innovativas, como es el caso
de los biorreactores. Estos sistemas de
propagación de plantas en medios líqui-
dos de cultivo, pueden disminuir costos
de mantención de una producción de
plántulas a gran escala (Barrueto Cid et
al., 2002; Teixeira, 2002).
Considerando que la asepsia del ambien-
te y del material de trabajo es primordial,
47

el orden en el laboratorio y un equipo
como el autoclave, a pesar del costo de
adquisición, son elementos básicos. Ade-
más, es oportuno llamar la atención que
no todos los componentes de un medio
nutritivo se pueden autoclavar, como por
ejemplo, antibióticos, L-glutamina, GA 3,
pantotenato de calcio, colchicina, extrac-
tos de plantas, etc. (Pierik, 1987b). Para
el uso de estos componentes, es necesa-
rio disponer también de un sistema de
filtración adicional.
En el momento de abrir un frasco de cul-
tivo para inocular un explante, el aire
circulante debe estar libre de microorga-
nismos. Eso sólo es posible en presen-
cia de una cámara de flujo laminar, cuyo
aire circulante es siempre renovado y li-
bre de micropartículas. Por otro lado, el
mencionado frasco conteniendo el me-
dio nutritivo en su interior, ya debería
haber sido previamente esterilizado
(120°C, 1 atmósfera por 20 minutos) para
anular el crecimiento de cualquier pa-
tógeno en su interior, pues el ambiente
interno es un ambiente propicio para el
desarrollo de esporas de bacterias y hon-
gos. En la Tabla 2.3, se muestra algunos
de los desinfectantes más usados en un
laboratorio de cultivo de tejidos (Ba-
rrueto Cid, 2001).
Tabla 2.3. Agentes desinfectantes empleados en la
asepsia de explantes.
Agente desinfectante
Alcohol etílico
Cloruro de mercurio
Hipoclorito de calcio
Hipoclorito de sodio
Peróxido de hidrógeno
48
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
La concentración y los tiempos de ex-
posición dependen del tipo de explante.
Es así como, las semillas requieren de
períodos más prolongados y concentra-
ciones más altas que un explante foliar.
Las pinzas y bisturí, que es el material
que se pone en contacto con el explante,
puede ser esterilizado a través de flameo
en el momento de la inoculación. Por
lo tanto, es suficiente introducir el ma-
terial en el recipiente (generalmente un
tubo de ensayo con alcohol 95 %) y
retirarlo, luego exponerlo una sola vez
a la llama del mechero y después apo-
yarlo en una placa Petri. Si la lámina de
alcohol cubrió toda la superficie útil de
la pinza o bisturí, la llama generada será
suficiente para lograr la desinfección, no
siendo necesario repetir la operación.
El uso de luz UV ha disminuido como
agente de esterilización a partir de la apa-
rición de las cámaras de flujo laminar, en
el laboratorio de cultivo de tejidos.
Los frascos usados para el trabajo de cul-
tivo de tejidos presentan una gran va-
riabilidad de formas y capacidad volu-
métrica. El volumen de medio requeri-
do comúnmente puede variar de 30 a 15
mL dependiendo si es placa de Petri o
Concentración Tiempo
(%) (minutos)
75-95 0,5 -1
0,1-1,0 1-5
7-10 5-20
2,5 –9 5-20
2-10 5-12
EL CULTIVO DE TEJIDOS
tubo de ensayo. Lo importante es que
éste deje un espacio interior libre de 70-
80% del volumen total del frasco. Esto
no es sólo válido para medios sólidos,
sino que también para medios líquidos,
como es el caso de células en suspen-
sión, las cuales requieren de buenos y
poderosos agitadores para mantener las
células en constante movimiento por
períodos prolongados.
El medio nutritivo, representa una diver-
sidad enorme de sustancias (consultar
Tabla 2.1) para las necesidades nutricio-
nales del explante o de las plantas en el
interior de los frascos de cultivo. Esto de-
termina que el pH del medio normal-
mente quede en un rango muy ácido 3,5
– 4,0 cuando éste termina de preparar-
se. Este pH es poco adecuado fisiológi-
camente para la mantención y creci-
miento del material micropropagado.
Por eso, la necesidad de contar con un
pH-metro para elevar el pH del medio
nutritivo antes de adicionar el agar y pro-
ceder a autoclavar, a niveles más com-
patibles con la “absorción” de los iones,
evitando de este modo provocar defi-
ciencias o toxicidad por exceso de ab-
sorción. El valor de pH establecido en
cultivo de tejidos de planta ha sido em-
píricamente fijado en 5,8. Este valor pue-
de ajustarse con K OH o Na OH 0,1-1,0
N (Torres, 1989), sin haberse observado
efectos adversos o tóxicos sobre la cé-
lula. Como la escala del pH es expo-
nencial, la diferencia entre 4 y 5, por
ejemplo, no es de una unidad sino de
10, por eso la preocupación con este
factor. El uso del pH-metro requiere cier-
tos cuidados, como por ejemplo, no des-
cuidar la calibración periódica ni dejar
secar el electrodo. En la eventualidad de
que el medio posea carbón activado, la
medición del pH también debe ser rea-
lizada antes de adicionar el carbón acti-
vado. Después de autoclavado el medio
y en la cámara de flujo laminar, es reco-
mendable agitarlo para que tanto el agar
como el carbón queden bien distribui-
dos en los frascos o tubos de ensayos.
49
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

REFERENCIAS. Clarkson, D. 1984. Ionic relations, pp. 319-

353. In: Wilkins, M. (ed.), Advanced plant
physiology. Pitmar Pub., Massachusetts,
Ammirato, P. 1983. Embryogenesis, pp. 82-123,
USA.
In: Evans, D. et al. (eds.), Handbook of plant
cell culture. Vol.1. Techniques for propa-
Creelman, R. y Mullet, J. 1997. Biosynthesis
gation and breeding. Macmillan Publishing
and action of jasmonates in plants. Ann.
Co., New York, USA.
Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48:355-
381.
Barrueto Cid, L., Illg, R. y Piedrabuena, A.
1994. Regeneration of garlic plants (Allium
Cocking, E. 1960. A method for the isolation
sativum L. Cv. "Chonan") via cell culture in
of plant protoplast and vacuoles. Nature
liquid medium. In vitro 30:150-155.
187:927-929.
Barrueto Cid, L., Machado, A., Carvalheira, S.
Cutler, A. y Krochko, J. 1999. Formation and
y Brasileiro, A. 1999. Plant regeneration
breakdown of ABA. Trends in Plant Science
from seedling explants of Eucalyptus grandis
4:472-478.
x E. Urophylla. Plant Cell, Tissue and Organ
Culture 56:17-23.
Daguin, F. y Letouzé, R. 1986. Ammonium-
induced vitrification in cultured tissues.
Barrueto Cid, L. 2000. Citocininas, pp. 55-74.
Physiologia Plantarum 66:94-98.
In: Barrueto Cid, L. (ed.), Introdução aos hor-
mônios vegetais. EMBRAPA Recursos Gené-
Davies, P. 1995. Plant Hormones: Their nature,
ticos e Biotecnologia, Brasilia, D.F., Brasil.
occurrence, and functions. pp. 1-38. In: Da-
vies, P. (ed.). Plant Hormones: Physiology,
Barrueto Cid, L. 2001. A propagação in vitro
Biochemistry and Molecular biology.
de plantas. O que é isso?. Biotecnologia
Kluwer Academic Pub., Dordrecht, The
Ciência & Desenvolvimento 3:16-21.
Nederlands.
Barrueto Cid, L., Cruz, R. y Teixeira, J. 2002.
Dodds, J. y Roberts, L. 1982. Experiments in
Biorreatores de imersão permanente.
plant tissue culture. Cambridge University
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento
Press, Cambridge, England.
4:50-53.
Epstein, E. 1975. Nutrição mineral das plantas
Barrueto Cid, L., Cruz, A. y Castro, L. 2004.
princípios e perspectivas. pp. 43-69. Univer-
Somatic, embryogenesis from three coffee
sidad de São Paulo, Rio de Janeiro, Brasil.
cultivars:"Rubi", "Catuaí Vemelho 81", and
"IAPAR 59". HortScience 39:130-131.
Fernandez, G. 2000. Auxina. pp. 15-53. In:
Barrueto Cid, L. (ed.). Introdução aos
Biddington, N. 1992. The influence of ethylene
hormônios vegetais. EMBRAPA Recursos
in plant tissue culture. Plant Growth
Genéticos e Biotecnologia, Brasília D.F.,
Regulation 11:173-187.
Brasil.
Beligni, M. y Lamattina, L. 2001. Nitric oxide:
Fosket, D. 1994. Plant growth and develop-
a non traditional regulator of plant growth.
ment. A molecular approach. pp. 311-312.
Trends in Plant Science 6:508-509.
Academic Press, San Diego, USA.
Beyer, E. 1976. A potent inhibitor of ethylene
Gamborg, O., Miller, R. y Ojima, K. 1968.
action in plants. Plant Physiol. 58:268-271.
Nutrient requirements of suspension
cultures of soybean root cells. Experimen-
Carlson, P. 1970. Induction and isolation of
tal Cell Research 50:151-158.
auxotrophic mutants in somatic cultures of
Nicotiana tabacum. Science 168:487-489.

50
EL CULTIVO DE TEJIDOS
George, E. 1993a, Plant propagation by tissue
culture. Part 1: the technology. pp. 95-129.
Exegenetics Ltd., Reading, England.
George, E. 1993b. Plant propagation by tissue
culture. Part 1: the technology. pp. 337-
343. Exegenetics Ltd., Reading, England.
Guha, S. y Maheshwari, S. 1964. In vitro pro-
duction of embryos from anthers of Datura.
Nature 204:497.
Hall, R. 1973. Cytokinins as a probe of
developmental processes. Ann. Rev. Plant
Physiol. 24:415-444.
Hatanaka, T., Sawabe, E., Azuma, T., Uchida,
N. y Yasuda, T. 1995. The role of ethylene
in somatic embryogenesis from leaf discs
of Coffea canephora. Plant Science
107:199-204.
Heller, R. 1953. Researches on the mineral
nutrition of plant tissue. Ann. Sci. Nat. Bot.
Biol. Veg. 14:1-223
Hopkins, W. 1999a. Introduction to plant
physiology. pp. 26-27. John Wiley & Sons
Inc., New York, USA.
Hopkins, W. 1999b. Introduction to plant
physiology. pp. 67-68. John Wiley & Sons
Inc., New York, USA.
Johnston, M. 2000. Etileno. pp. 107-130. In:
Barrueto Cid, L. (ed.). Introdução aos
hormônios vegetais. EMBRAPA Recursos
Genéticos e Biotecnologia, Brasilia D.F.,
Brasil.
Klein , T., Wolf, E., Wu, R. y Sanford, J. 1987.
High velocity microprojectiles for delivering
nucleic acids into living cells. Nature
327:70-73.
Kumar, P., Lakshmanan, P. y Thorpe, T. 1998.
Regulation of morphogenesis in plant tissue
culture by ethylene. In vitro 34:94-103.
Larebeke, N., Engler, G., Holsters, M., Elsacker,
S., Zaenen, I., Schilperoort, R. y Schell, J.
1974. Large plasmid in Agrobacterium
tumefaciens essential for crown gall-
inducing ability. Nature 22:169-170.
Larkin, P. y Scowcroft, W. 1981. Somaclonal
variation - a novel source of variability from
cell culture for plant improvement. Theor.
App. Gen. 60:197-214.
Lemus, E. 2000. Ácido Abscísico. pp. 159-180.
In: Introdução aos hormônios vegetais.
EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecno-
logia, Brasilia D.F., Brasil.
Leopold, A. y Kriedemann, P. 1975. Plant
growth and development. pp. 169-181.
McGraw-Hill Pub. Com., New York, USA.
Leshem, B., Shaley, D. e Izhar, S. 1988.
Cytokinin as an inductor of vitrification in
melon. Annals of Botany 61:255-260.
Levitan, I. y Cibulsky, S. 2001. TRP ion channels-
two proteins in one. Science, 293:1270-1271.
Magalhaes, J., Pedroso, M. y Durzan, D. 1999.
Nitric oxide, apoptosis and plant stresses.
Physiolol. Mol. Biol. Plants 5:115-125.
Matsumoto, K. 2000. Giberelinas. pp. 83-105.
In: Barrueto Cid, L. (ed.). Introdução aos
hormônios vegetais. EMBRAPA Recursos
Genéticos e Biotecnologia, Brasilia D.F.,
Brasil.
Morel, G. y Martin, C. 1952. Guérison de
dahlias atteins d'une maladie à virus.
Compt. Rend. Acad. Sc. 235:1324-1325.
Murashige, T. y Skoog, F. 1962, A revised
medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue cultures. Physiologia
Plantarum 15:473-497.
Murthy, B., Murch, S. y Saxena, P. 1998.
Thidiazuron: a potent regulator of in vitro
plant morphogenesis. In vitro 34:267-275.
51

Naidu, M. y Sreenath, H. 1999. In vitro culture
of coffee zygotic embryos for germplasm
preservation. Plant Cell Tissue and Organ
Culture 55:227-230.
Orozco-Cárdenas, M. y Ryan, C. 2002. A nitric
oxide negatively modulates wound
signaling in tomato plants. Plant Physiol.
130:487-493.
Palmer, C. y Smith, O. 1969. Cytokinins and
tuber initiation in the potato Solanum
tuberosum L. Nature 221:279-280.
Pedroso, M., Magalhães, J. y Durzan, D. 2000.
A nitric oxide burst precedes apoptosis in
angiosperm and gymnosperm callus cells
and foliar tissues. J. Exp. Botany 51:1027-
1036.
Pelacho, A. y Mingo-Castel, A. 1991. Jasmonic
acid induces tuberization of potato stolons
cultured in vitro. Plant Physiol. 97:1253-
1255.
Peña-Cortes, H. 2000. Ácido jasmônico. pp.
131-157. In: Barrueto Cid, L. (ed.). Intro-
dução aos hormônios vegetais. EMBRAPA
Recursos Geneticos e Biotecnologia, Brasi-
lia D.F., Brasil.
Pierik, R. 1987a. In vitro culture of higher plants.
p. 21. Martinus Nijhoff Pub., Dordrecht, The
Nederlands.
Pierik, R. 1987b. In vitro culture of higher
plants. pp. 32-43. Martinus Nijhoff Pub.
Dordrecht, The Nederlands.
Pierik, R. 1987c. In vitro culture of higher
plants. pp. 54-60. Martinus Nijhoff
Plublishers, Dordrecht, The Netherlands.
Power, J., Cummins, S. y Cocking, E. 1970.
Fusion of isolated plant protoplasts. Nature
225:1016-1018.
Reddy, B., Giridhar, P. y Ravishankar, G. 2002.
The effect of triacontanol on micropropa-
gation of Capsicum frutescens and
Decalepis hamiltonii W & A. Plant Cell
Tissue and Organ Culture 71:253-258.
52
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
Reinert, J. 1959. Über die Kontrolle der
Morphogenese und die Induktion von
Adventivembryonen an Gewebekulturen
aus Karotten. Planta 53:318-333.
Robbins, W. 1922. Cultivation of excised root
tips and stem tip under sterile conditions.
Botanical Gazette 73:376-390.
Salisbury, F. y Ross, C. 1992. Plant Physiology.
pp. 116-135. Wadsworth Pub. Comp.,
Belmont, CA, USA.
Skoog, F. y Tsui, C. 1948. Chemical control of
growth and bud formation in tobacco stem
segments and callus cultured in vitro. Am.
J. Botany 35:782-787.
Steven, J., Desikan, R., Clarke, A. y Hanck, J.,
2002. Nitric oxide is a novel component of
abscisic acid signaling in stomatal guard
cells. Plant Physiol. 128:13-16.
Steward, F., Mapes, M. y Smith, J. 1958. Growth
and organized development of cultured
cells. I. Growth and division of freely sus-
pended cells. Am. J. Botany 45:693-703.
Stryer, L. 1992. Bioquímica. pp. 259-272.
Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, Brasil.
Taiz, L. y Zeiger, E. 2002. Plant Physiology. pp.
33-46. Sinauer Associates Inc. Pub., Sun-
derland, Massachusetts, USA.
Tal, M. e Imber, D. 1970. Abnormal stomatal
behavior and hormonal imbalance in
flacca, a wilty mutant of tomato. Plant
Physiol. 46:373-376.
Tang, W. 2000. High-frequency plant
regeneration via somatic embryogenesis
and organogenesis and in vitro flowering
of regenerated plantlets in Panax ginseng.
Plant Cell Reports 19:727-732.
Tantos, A., Mezarios, A., Farkas, T. y Szalai, J.
2001. Triacontanol-supported micropropa-
gation of woody plants. Plant Cell Reports
20:16-21.
EL CULTIVO DE TEJIDOS
Teixeira, J. 2002. Biorreatores. Biotecnologia
Ciência & Desenvolvimento 4:36-41.
Thakur, M., Sharma, D. y Sharma, S. 2002. In
vitro selection and regeneration of
carnation (Dianthus caryophyllus L.) plants
resistant to culture filtrate of Fusarium
oxysporum f. sp. dianthi. Plant Cell Reports
20: 825-828.
Thauer, R. 2001. Nickel to the fore. Science
293:264-265.
Torres, K. 1989. Tissue culture techniques for
horticultural crops. pp. 3-25. In: An AVI
Book, New York, USA.
Voet, D. y Voet, J. 1995. Biochemestry. pp. 29-
41. John Wiley & Sons Inc., New York, USA.
Walton, D. y Li, Y. 1995. Abscisic acid biosyn-
thesis and metabolism. pp. 140-157. In:
Davies, P. (ed.). Plant Hormones: Phy-
siology, Biochemestry and Molecular
Biology. Kluwer Academic Pub., Dordrecht,
The Nederlands.
Wareing, P. y Phillips, I. 1982. Growth & diffe-
rentiation in plants. pp. 145-147. Pergamon
Press, Oxford, England.
White, P. 1934. Potentially unlimited growth
of excised tomato root tips in a liquid
medium. Plant Physiol. 9:585-600.
Wojtaszek, P. 2000. Nitric oxide in plants to
NO or not to NO. Phytochemistry 54:1-4.
53
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

54
ESTADIOS DEL CULTIVO DE TEJIDOS
ESTADIOS DEL CULTIVO
DE TEJIDOS
ESTABLECIMIENTO
DEL EXPLANTE
P ara el establecimiento del explante,
la asepsia es una condición relevan-
te y del todo imprescindible para el éxi-
to e inducción morfogénica del material
bajo condiciones in vitro. Una premisa
es que cualquier tipo de explante utili-
zado debe estar además libre de patóge-
nos endógenos, normalmente presentes
en la planta madre. Dado que se utili-
zan fragmentos de órganos o parte de
tejidos, éstos deben ser extraídos del te-
jido madre. En muchos casos existen
patógenos externos y el hecho de mani-
pulación crea nuevos focos potenciales
de contaminación. Se han descrito va-
rios protocolos vinculados con la pre-
esterilización, esterilización y post-este-
rilización de diferentes órganos vegeta-
les que son universalmente utilizados en
diferentes laboratorios (Yeoman, 1973;
Bonga, 1982a). El lavado de los explan-
tes con productos desinfectantes bajo
condiciones asépticas, elimina patóge-
nos superficiales, pero puede ocasionar
daños en las células, produciendo
pardeamiento o necrosis y afectando
eventualmente a las respuestas morfogé-
nicas. En general, de acuerdo a la su-
perficie de contacto y naturaleza del ex-
plante, existen tratamientos que vincu-
lan concentraciones óptimas de usar pa-
ra cada desinfectante versus tiempo de
exposición. Concentraciones muy bajas
CAPÍTULO 3
Miguel Jordan Z.
y tiempos de exposición cortos, produ-
cen desinfección incompleta del mate-
rial y posible contaminación durante el
cultivo. Tiempos largos y concentracio-
nes mayores, impiden el desarrollo de
patógenos, pero pueden afectar la via-
bilidad y/o respuestas morfogénicas
inducibles en las células del explante.
Algunos protocolos de desinfección se
indican en el Capítulo 2. Otros com-
puestos que apoyan tratamientos para
eliminación de patógenos son diversos
antibióticos, los cuales deben ser mani-
pulados cuidadosamente por su toxici-
dad y/o especificidad. Entre ellos se pue-
de citar para contaminación bacteriana:
Carbenicilina, Cefotaxima, Geneticina,
Kanamicina, Higromicina y Rifampicina
y sus mezclas (soluciones de Guillard y
Provasoli). Los niveles de concentración
empleados son del orden de 5-100 µg/
mL. Una especial precaución debe ser
tomada al usar Kanamicina, pues inhibe
la morfogénesis en algunas especies
(Mihaljevic et al., 2001; Obando y
Jordan, 2001). Entre los antimicóticos,
Amfotericina B, Captafol, Carbendazi-
ma, Fenbendazole, Imazalil y Nistatina,
son los más frecuentemente usados. En
la práctica, tratándose de órganos de
mayor volumen obtenidos en terreno y
de los cuales se va a aislar un explante,
desinfecciones previas con Captan y
Benomyl durante algunas horas, y el uso
posterior de algunos de los antimicóticos
55

indicados más arriba, son eficientes en
la remoción de patógenos.
Frente a infecciones virales, es sólo po-
sible el tratamiento en conjuntos de cé-
lulas o tejidos específicos. Por ejemplo,
en meristemas caulinares y no en el res-
to de la planta. Existen productos que
han probado tener acción viricida, el
más conocido es Virazole (Ribavirina)
[1-B-D-ribofuranosil 1,2,4-triazol-3-
carboxamida), un nucleósido análogo,
con el cual fue posible eliminar in vitro
e in vivo el virus PVX en papa (Jordan et
al., 1983), como en otras especies que
comúnmente se reproducen por vía
vegetativa. Aunque el crecimiento de los
explantes y sus respuestas morfogénicas
pueden verse afectadas parcialmente en
esta especie, concentraciones del orden
de 50 mg/L permitieron erradicar total-
mente PVX en cuatro clones de papa en-
sayados al cabo de 90 días de cultivo
(Jordan et al., 1983). En papa, común-
mente se presenta también un viroide
(PSTV); el cual puede ser erradicado me-
diante la termoterapia; es decir, manten-
ción del tejido madre a altas temperatu-
ras en condiciones de humedad (30-
35ºC o más por uno o varios días).
En general, durante la termoterapia, se
induce una intensa división y elongación
celular en las regiones meristemáticas;
ello permite tener una porción de teji-
dos libres de patógenos en aquellos con-
juntos celulares ubicados en la porción
más distal del meristema. La eliminación
de patógenos se debe también a que en
dichas regiones existen más comunica-
ciones celulares de tipo simplástico lo
cual reduce la velocidad de contamina-
ción de células infectadas a aquellas
56
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
nuevas en activo crecimiento, provocán-
dose una dilución gradual con erradica-
ción total dependiendo del tratamiento.
OXIDACIÓN FENÓLICA
Los explantes de diferente origen, aun-
que predominantemente de material le-
ñoso o especies particulares y, según
condiciones de cultivo, no prosperan
muchas veces a causa de un pardea-
miento (“browning”) de sus tejidos, el
cual se manifiesta superficial o interna-
mente comprometiendo varios estratos
de células, superficiales y/o más profun-
das. Los explantes de especies que mues-
tran pardeamiento a causa de un meta-
bolismo fenólico oxidativo, generalmen-
te no prosperan. El pardeamiento impli-
ca la muerte celular y se debe, por lo
general, a la oxidación conjunta de di-
versos productos fenólicos presentes en
la célula por acción de polifenoloxida-
sas, de efecto poco específico (Jordan y
Feucht, 1977; George, 1993). El efecto
puede ocurrir en compuestos fenólicos
de diversa complejidad, entre ellos;
fenoles simples, ácidos fenilcarbónicos,
fenilpropanos y derivados de flavonas.
El proceso se origina durante la excisión
del explante o con el proceso de desin-
fección. Dado que enzimas y substrato
se encuentran en compartimentos celu-
lares distintos (en general fenoles en la
vacuola y tonoplasto, polifenoloxidasa
en el citoplasma); no existe reacción en
condiciones in situ. Sin embargo, duran-
te la extracción o desinfección del ex-
plante, donde ocurre muerte celular en
las zonas expuestas, dicha oxidación es
causal del pardeamiento celular. El daño
puede ser incrementado dependiendo de
ESTADIOS DEL CULTIVO DE TEJIDOS
la estabilidad y metabolismo de estratos
celulares más internos, pudiendo com-
prometer totalmente el explante.
La oxidación química resulta de la ge-
neración de quinonas en el anillo aro-
mático, condición que es altamente tóxi-
ca por su poder óxido-reductor (George,
1993). Dado que las polifenoloxidasas
son poco específicas, las reacciones
afectan a varios compuestos fenólicos
diferentes químicamente. Debido a que
las plantas leñosas sintetizan grandes
cantidades de lignina y sobre la base de
que los precursores de lignina son com-
puestos fenólicos (ácidos ferúlico, si-
napínico, y p-coumárico), la producción
de pardeamiento es más común en ma-
terial leñoso. Por otro lado, los niveles
endógenos de fenoles determinan la
condición fisiológica del explante. Es
sabido que muchos fenoles actúan en
forma inhibitoria frenando las respues-
tas de crecimiento, efecto que se visua-
liza principalmente en invierno. La dor-
mancia de muchos árboles está definida
por altos niveles endógenos de fenoles;
entre ellos el mismo ácido p-coumárico.
En invierno (época en que se produce
receso vegetativo), existe un mayor con-
tenido de fenoles en los tejidos y se pro-
duce normalmente una menor respues-
ta morfogénica ante niveles apropiados
de reguladores promotores incorporados
al medio de cultivo.
Por el hecho que la condición de la plan-
ta madre afecta significativamente la res-
puesta del explante, una práctica común
para obviar o reducir el problema de
pardeamiento es el uso de material ju-
venil. El material juvenil expresa igual-
mente un potencial morfogénico mayor
que explantes de origen adulto. Existen
características genéticas fijadas y que se
expresan diferencialmente entre ambos
tipos de explantes de una u otra condi-
ción y que además son heredables al
proceder a la propagación vegetativa
(Bonga, 1982b). En muchos casos, y en
aquellas especies que sintetizan
antocianinas en sus explantes juveniles,
dichos pigmentos no afectan normal-
mente una posterior morfogénesis. Por
el contrario, explantes que expresan un
metabolismo oxidativo, no desarrollan
estos pigmentos al desdoblarse sus pre-
cursores con anterioridad. Es importan-
te considerar que no es en sí limitante
el nivel o contenido endógeno de com-
puestos fenólicos, sino su metabolismo
bajo condiciones in vitro. En general, las
especies que muestran un metabolismo
oxidativo más activo, con pardeamiento
de explantes, son aquellos que o bien
presentan niveles altos de fenoles al co-
mienzo del cultivo, o que incrementan
dicho nivel durante el transcurso del cul-
tivo, afectando el proceso morfogénico.
En algunos casos, cuando se trata espe-
cíficamente de la síntesis del grupo de
antocianinas, la morfogénesis no se ve
afectada (Jordan y Feucht, 1977). En es-
tos explantes la síntesis de fenoles ha
llegado a uno de los destinos finales sin
ocurrir oxidación fenólica de compues-
tos intermedios (Tabla 3.1). Las antocia-
ninas son frecuentemente observables en
material juvenil el cual es considerado
de particular carácter morfogénico, com-
parado con el material adulto (Bonga,
1982b).
57
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

Tabla 3.1. Niveles de fenoles totales y respuestas morfogénicas en hojas y anteras

de algunas especies frutales antes y después de 40 días de cultivo in vitro.

Fenoles Fenoles
Antes del Posterior al
Espécies cultivo cultivo Resultados

(†) (†)
Carica pubescens 0,18 0.02 Hojas y callos amarillos.
(†) (†)
Carica x pentagona 1,28 0.59 Hojas café y nuevos brotes
verdes, morfogénesis.
(††) (††)
Cyphomandra betacea 0,16 0,05 Hojas café y nuevos brotes
verdes, morfogénesis.
(†) (†)
Pouteria lucuma 2,0 0,17 Hojas y nuevos brotes verdes

(†) (†)
Solanum muricatum 0,21 0,38 Hojas y nuevos brotes verdes

(†) (†)
Annona cherimola 0,1 0,93 Hoja y tallo de color marrón

(‡) (‡)
Prunus avium 0,54 0,22 Anteras y callo color marrón

(‡) (‡)
Prunus x Pandora 0,36 1,24 Anteras y callos rojizos
(antocianinas), androgénicos,
sin pardeamiento
†)
Absorbancia a 730 nm con el reactivo de Folin-Ciocalteau/100 mg de tejido fresco.
(††)
µM fenoles/100 mg de tejido fresco.
(‡)
% Fenoles en el peso fresco.

USO DE ANTIOXIDANTES igualmente en varios procesos químicos,

En algunas especies el efecto de pardea-
miento puede ser reducido lavando con
agua corriente esterilizada la zona de
corte o escisión del explante por tiem-
pos diversos (2-4 horas), antes de pro-
ceder al cultivo. Con ello, los compues-
tos fenólicos presentes en las células da-
ñadas son retirados. Si es posible, con-
viene realizar este proceso con una me-
nor tensión de O 2 , pues este gas eleva
el potencial redox, haciendo la oxida-
ción de fenoles más rápida (George,
1993). En la práctica, se usan los antioxi-
dantes (o reductores), los cuales pueden
aplicarse durante las fases de desinfec-
ción o incorporarlas a los medios de cul-
tivo (Bonga, 1982a). Dichos productos
son de naturaleza diferente y actúan
ya sea impidiendo la formación de qui-
nonas o retirando compuestos inhibito-
rios del medio por propiedades físicas
de adsorción/absorción, como también
evitando la oxidación de fenoles en el
medio. Dentro de los productos más co-
múnmente usados se tiene: PVP o polivi-
nilpirrolidona, de diferentes pesos mole-
culares; entre ellos PVP-360 o PVP-
6755; cisteína; glutation; DIECA (Die-
tilditiocarbamato de sodio); ác. amino-
oxiacético; mezclas de ác. ascórbico
con ác. cítrico, (durante la desinfección
o en el cultivo); ß-mercaptoetanol; tiou-
rea y carbón activado. Este último, jun-
to a PVP, parece adsorber varios com-
puestos fenólicos que producen tejidos
heridos en el medio, conjuntamente con
productos de carácter tóxico derivados

58
ESTADIOS DEL CULTIVO DE TEJIDOS
de la transformación de azúcares (saca-
rosa) por autoclavado (hidroximetilfur-
fural). Los otros antioxidantes actúan en
forma reductora, impidiendo, ya sea la
generación de quinonas o de peróxido
de hidrógeno, o bien manteniendo los
grupos tioles en forma reducida, activan-
do en este caso la síntesis de proteínas
(George, 1993). Lo anterior implica que,
indirectamente, también varios com-
puestos de acción antioxidante pueden
promover crecimiento u organogénesis
en algunas especies (glutation, ác.
ascórbico, tiourea), como también acti-
var el crecimiento en condiciones de
receso (tiourea). Directamente, algunos
fenoles se comportan in vitro como fac-
tores promotores, ya sea del crecimien-
to, inducción de nuevos brotes y como
enraizantes (Lane, 1990), asumiéndose
una acción protectora de la degradación
del ácido indolacético (AIA) endógeno
o actuando como compuestos sinérgicos
al AIA. Entre estos compuestos se en-
cuentran el floroglucinol, el glicósido
floridzina, el catecol, resorcinol, ác.
clorogénico, ác. cafeico y varios flavo-
noides. El primero, parece necesario de
incluir en medios para crecer algunas
especies frutales del género Prunus; el
segundo, por otro lado, estimula la rizo-
génesis (Jordan, no publicado).
Existen otros productos que han sido
usados con éxito aunque no represen-
tan en sí condición de antioxidantes.
Estos han demostrado buena eficiencia
en algunas especies de carácter muy oxi-
dativo y difíciles de cultivar, como por
ejemplo Annona cherimola, en la cual
el uso de sorbitol e hidrolizado de caseí-
na ácida más PVP, favorece la inducción
de brotes de novo (Jordan et al., 1991;
1993). El efecto puede ser igualmente fa-
vorecido al usar un menor contenido de
sacarosa o reemplazando parcial o to-
talmente la sacarosa por sorbitol (Jordan,
1975). En algunos casos, la condición de
los gelificantes igualmente tiene efectos
sobre el pardeamiento. Muchas veces la
marca del agar produce una respuesta
diferencial; en otros casos, el uso de Gel-
rite, agarosa o el reemplazo general de
geles por papel Whatman Nº1 (en me-
dio líquido), puede evitar o contrarres-
tar parcialmente el pardeamiento. Para
el caso de algunos cultivos leñosos, la
elección del agar es determinante (Pierik
et al., 1997). El nivel de algunos micro-
elementos en la solución debe ser igual-
mente ajustado según el tipo de explante
y especie; por ejemplo, la concentración
final del ión Cu en la solución, al con-
formar parte del grupo prostético de las
polifenoloxidasas, puede favorecer la
oxidación. Al respecto se ha informado
también que agentes quelantes adicio-
nados al medio, entre ellos EDTA o
EDDHA, inhiben parcialmente el
pardeamiento de algunas especies; ello
por la capacidad de fijar igualmente el
ion Cu o Fe en solución, formando
quelatos.
La calidad de la luz es especialmente
importante en el control del pardea-
miento. Por un lado, la práctica reco-
mienda evitar la luz y dejar los cultivos
dos a tres días en oscuridad antes de
exponerlos a la radiación. Por otra par-
te, es importante considerar que el fito-
cromo en presencia de luz roja (660 nm)
activa a la enzima fenilalanina-amonio-
liasa, que convierte el aminoácido fe-
nilalanina al primer compuesto fenólico,
el ácido trans-cinámico. Desencadena
así, la biosíntesis posterior con incre-
mento de otros fenoles de la cadena;
59

entre ellos, por ejemplo, el ácido p-cou-
márico con varios efectos de carácter
inhibitorio (Mohr, 1976). Sólo, o como
componente precursor de la lignina, el
ácido p-coumárico presenta un rol de
defensa química contra el ataque de in-
sectos y animales fitófagos, en alelopa-
tía, como factor de competencia espa-
cial de las plantas, en forma intra e inter-
específica y fisiológicamente en la fun-
ción de inhibición de la germinación en
algunas especies.
MULTIPLICACIÓN DE PLANTAS
(MORFOGÉNESIS, ORGANOGÉNESIS,
EMBRIOGÉNESIS)
La generación de nuevas formas y estruc-
turas, como ser órganos o embriones ori-
ginados de algunos tipos de explantes
donde no los había, se denomina morfo-
génesis o más específicamente, organo-
génesis o embriogénesis, siendo todas de
carácter adventicio. Para poder generar
una morfogénesis, los diferentes tipos de
explantes (células, tejidos y órganos cul-
tivados in vitro), deben poseer la infor-
mación y las condiciones endógenas y
del medio, conducentes a expresar las
diferentes respuestas morfogénicas, posi-
bles. Éstas son organogénesis caulinar
(brotes de novo), organogénesis radicu-
lar o rizogénesis (raíces) y embriogénesis
(formación de embriones).
La respuesta posible a inducir está de-
terminada, por el potencial de “totipo-
tencia celular”; o capacidad inherente
de cualquier célula vegetal viable, de
recapitular toda la información existen-
te en el genoma y de expresar ésta a tra-
vés de la diferenciación y desarrollo, ha-
60
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
cia la formación de plantas completas
de igual característica genética. En este
proceso se debe definir la condición ce-
lular o de órgano y el origen del mate-
rial, de carácter juvenil y/o adulto. Es
bien sabido que explantes de carácter
adulto poseen bajo o nulo potencial
morfogénico in vivo o in vitro, versus
material de condición juvenil, de mane-
ra que éste debe ser preferido. El Mate-
rial juvenil, más morfogénico o embrio-
génico, evidencia un grado de metila-
ción menor del DNA como también una
mayor proporción de conjugados de
poliaminas libres que material adulto,
pudiendo causar efectos sobre la acti-
vación/desactivación de genes (Fraga et
al., 2002; Joyce y Cassells, 2002; San-
tos y Fevereiro, 2002). La primera res-
puesta inductora de cualquier explante,
consiste en la desdiferenciación de una
célula diferenciada. En todas las plan-
tas conformantes del Reino Vegetal exis-
te solamente un número reducido de cé-
lulas, cada una con una diferente carac-
terística de diferenciación según la fun-
ción a desarrollar, todas derivadas de
una célula embrionaria conformante de
la cigota. En todos los vegetales del pla-
neta, toda la anatomía y arquitectura
posible a generar se basa en el ordena-
miento de este reducido número de cé-
lulas estables o permanentes, entre al-
gunas de ellas: célula meristemática,
parenquimática (varios tipos), fibra
esclerenquimática / colénquima, tráquea
/ traqueida, tubo criboso; célula de guar-
da y célula epidérmica. Dichas células
conforman a su vez tejidos especializa-
dos. La desdiferenciación consiste en el
potencial de cualquiera de éstas de vol-
ver a su condición de origen de tipo
meristemático. Las únicas células no
ESTADIOS DEL CULTIVO DE TEJIDOS
totipotentes y que tampoco pueden cam-
biar su patrón de expresión, son las que
carecen de núcleo, como las traqueidas,
las tráqueas del floema o los tubos
cribosos correspondientes al floema.
Durante la diferenciación se pueden re-
conocer cuatro eventos fundamentales:
a) señal inductiva y de percepción don-
de se le atribuye un especial rol a la
auxina (AIA); b) expresión de genes que
especifican la identidad celular; c) ex-
presión de genes para conformar las es-
tructuras especificas y actividades de la
célula diferenciada y d) actividad de pro-
ductos génicos y sus cambios en la es-
tructura celular para hacer efectiva la
función de la célula diferenciada. La re-
sultante de un conjunto de células con
actividad meristemática bajo condicio-
nes in vitro es, inicialmente, la forma-
ción de nuevas células del tipo paren-
quimático que conforman un agregado
celular. De acuerdo a ciertas condicio-
nes inductivas, dadas por niveles endó-
genos/exógenos de auxina versus cito-
quininas y en algunos casos de sacaro-
sa, algunas de estas células se diferen-
cian en elementos floemáticos como
también del tipo tráqueas, creándose
una cierta polaridad en el sistema. En
otros, casos células desdiferenciadas se
diferencian nuevamente para formar un
primordio; de allí derivan nuevos bro-
tes o nuevas raíces. El arreglo longitu-
dinal de estas células constituye poste-
riormente la raíz funcional.
Cabe indicar que la máxima expresión
de totipotencia se puede citar en dos
ejemplos: 1) protoplastos, que corres-
ponden a células aisladas carentes de
pared celular. En este caso, estos pue-
den, junto con recapitular a plantas, ge-
nerar y resintetizar su pared celular, pro-
vistos los elementos en el medio de cul-
tivo (por ejemplo diversas pentosas) y 2)
microsporas (polen); cuyo programa on-
togénico, determinado y establecido fi-
logénicamente, consistente en la forma-
ción de gametos, puede ser alterado y
transformado en otro programa embrio-
génico (nunca realizado antes, ni esta-
blecido por filogenia), conducente a la
generación de plantas; en este caso, de
nuevas plantas haploides. De acá pue-
de establecerse el hecho de que el total
de la información conducente a la rege-
neración de plantas (totipotencia), aún
se mantenía presente en el genoma de
esta célula. La morfogénesis finalmente
puede ocurrir de dos maneras diferentes:
a) a partir de células diferenciadas sin la
proliferación de tejido indiferenciado o
b) a partir de células no especializadas,
no organizadas y desdiferenciadas de ca-
llo o suspensiones celulares.
ORGANOGÉNESIS CAULINAR
Y RADICULAR
La inducción de brotes o de raíces pue-
de ser derivada de acuerdo a los niveles
hormonales presentes en un explante. Si
se considera un explante in vitro con
adición de hormonas del tipo auxina
(AIA y análogos sintéticos) y citoquinina
(varias formas), ambas en concentracio-
nes relativamente altas, las células
desdiferenciadas generarán simplemen-
te tejido parenquimático con algunos
elementos de vasos presentes. Si las mis-
mas hormonas se encuentran en propor-
ciones diferentes; un bajo nivel relativo
de la citoquinina, sin alterar la auxina,
61

el conjunto tisular será menor, pero ge-
nerará exclusivamente raíces. Si en cam-
bio se incrementa el nivel de la citoqui-
nina, reduciendo el de auxina, se gene-
rarán exclusivamente brotes (Skoog y Mi-
ller, 1957). Este patrón de respuesta, que
se halló antes de los años 60 específica-
mente para tabaco, se ha generalizado en
el tiempo para un gran número de espe-
cies de carácter herbáceo y leñoso.
Los azúcares, en cuanto a su tipo y con-
centración, también influyen en las res-
puestas morfogénicas. Normalmente, se
indica una asociación de sacarosa a la
formación de xilema, vinculado a pro-
cesos de diferenciación muy tempranos
de la nueva raíz. La sacarosa es el azú-
car más comúnmente usado en trabajos
in vitro, aunque también han sido usa-
dos otros azúcares en menor frecuencia.
La glucosa y la fructosa son menos co-
munes, posiblemente por representar a
azúcares reductores (se asume que por
este motivo son también muy escasos en
la composición de la savia de las plan-
tas con apenas el 1% o menos con res-
pecto al contenido de sacarosa). Sin em-
bargo, para el cultivo de la conífera Se-
quoia sp., la fructosa aparece como el
azúcar más adecuado, como asimismo
las pectinas y el almidón (Koblitz, 1972).
En el caso de la zanahoria, después de
la sacarosa, la glucosa y la maltosa tam-
bién sirven en forma satisfactoria
(Koblitz, 1972); la maltosa promueve
también el contenido de clorofila apo-
yando los fenómenos vinculados con la
org a n o g é n e s i s e n b a b a c o ( C a r i c a x
pentagona) (Jordan y Piwanski, 1997).
Mientras la glucosa produce en general
bajas respuestas o gran pardeamiento en
tejidos de Prunus avium, este efecto pue-
62
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
de ser superado mediante el sorbitol
(Jordan, 1975). En presencia de sorbitol
(aunque no ante sacarosa), bajo iguales
niveles hormonales, se facilita la induc-
ción brotes en Annona cherimola (Jordan
et al., 1991). Finalmente, manitol pro-
mueve la regeneración de brotes en ho-
jas en menta (Mentha x piperita y M.
spicata).
EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA
La embriogénesis es consistente en la ge-
neración de un embrión somático y pos-
teriormente de plántulas, a partir de una
célula somática (o en algunos casos ga-
mética). Este proceso, bajo condiciones
in vitro, reviste las mismas etapas de de-
sarrollo que ocurren in vivo. Pueden for-
marse embriones somáticos en forma
directa o indirecta; la primera es a par-
tir de una sola célula aislada flotando
en un medio de cultivo o fijada a un
substrato, generalmente derivada de una
suspensión celular (Litz y Gray, 1992).
La segunda forma de generación indirec-
ta, ocurre igualmente a partir de una sola
célula que forma parte de un tejido no
organizado (callo) o de un órgano (por
ejemplo cotiledones, hoja, hipocótilo)
que se cultiva in vitro.
La iniciación del proceso de embriogé-
nesis se caracteriza por presentar, ini-
cialmente, divisiones celulares desigua-
les, conformantes de una célula apical
y otra basal; siendo la primera constitu-
yente del embrión. Ello determina la ge-
neración de un patrón de eje apical-
basal, determinado por una expresión
génica específica durante la primera di-
visión celular, de carácter asimétrica.
ESTADIOS DEL CULTIVO DE TEJIDOS
Durante la ontogenia del embrión, se ex-
presan genes específicos que controlan
ya sea la formación del futuro meristema
apical, de la raíz primaria, así como ge-
nes encargados de la mantención de la
polaridad apical-basal (Taiz y Zeiger,
2002). Según el estado de desarrollo y ta-
maño, se distinguen tres estadios embrio-
génicos: el globular, estado de corazón y
de torpedo.
Embriogénesis directa (ED)
Es la formación directa de embriones so-
bre los tejidos correspondientes al ex-
plante, sin mediar mayormente prolife-
ración celular intermedia. Ello ocurre
también naturalmente in vivo o in vitro,
como es el caso de cítricos, café y otros
cultivos. En general, a partir de óvulos y
de sus integumentos, de embriones nu-
celares, o tejidos nucelares, pueden ori-
ginarse embriones somáticos directa-
mente como también en células epidér-
micas, pecíolos y aún de protoplastos
derivados de lámina de hojas.
Embriogénesis indirecta
(o adventicia) (EI)
Se induce a partir de un callo o agrega-
do celular no organizado o de suspensio-
nes celulares. Este tipo de proceso in-
ductivo es más frecuente que la ED. Por
lo general, existen varios tipos de reque-
rimientos: a) el genotipo particular debe
ser capaz de poder llevar a cabo la mor-
fogénesis con el apoyo de un medio de
cultivo y de reguladores de crecimien-
to, b) el explante debe ser cultivado en
presencia de auxina para su iniciación,
siendo el tiempo de permanencia un fac-
tor crítico, c) el nivel de sacarosa en los
medios de cultivo es crítico (sobre cier-
tos niveles no se produce inducción), d)
después del cultivo en presencia de au-
xina, por lo general procede un subcul-
tivo con niveles menores o en ausencia
de ella, e) existe requerimiento de un ni-
vel adecuado de N, el cual puede ser
suplementado por el ión NH 4 + o un ami-
noácido, como es el caso de glutamina
o alanina. Otra forma común de produc-
ción de embriones somáticos consiste en
la embriogénesis secundaria, la cual
ocurre sobre otro embrión en desarro-
llo. Se considera este proceso como una
anomalía, pero en algunos casos el fe-
nómeno puede servir en una mayor efi-
ciencia en la generación de material de
una especie.
Poliembriogénesis
(o poliembriogénesis somática)
En el caso particular de muchas conífe-
ras, se ha descubierto que embriones
cigóticos maduros o inmaduros, son ca-
paces de iniciar un proceso de embrio-
génesis múltiple, conducente a la gene-
ración de embriones de igual condición
genética en forma simultánea (Gupta y
Durzan, 1986; Fowke y Attre, 1996). El
proceso tiene diferentes fases de cultivo,
el cual procede en oscuridad. La fase de
inducción y/o maduración sincrónica de
embriones es crítica y requiere de regu-
ladores de crecimiento de carácter inhi-
bitorio (como es el áci d o abscísico
(ABA)). También de potenciales hídricos
bastante negativos en el medio, genera-
dos por incremento de azúcares u otros
osmóticos, (especialmente polietilen-
glicol (PEG), como también manitol o
sorbitol) (Attre et al., 1995). Determinante
en algunas especies es la presencia de al-
tos niveles de uno o más aminoácidos
particulares.
63

Androgénesis
Este tipo de embriogénesis es uno de los
ejemplos que mejor representa la totipo-
tencialidad celular. Consiste en que un
grano de polen, en una fase temprana
de su ontogenia (microspora unicelular
o uninuclear, cuya función es fecundar
a la megaspora), cambia de función y
constituye un embrión de origen gamé-
tico, con la reducción de su porción cro-
mosomal (n). Dado que el proceso se
realiza por cultivo de anteras, los em-
briones gaméticos se forman directa-
mente dentro de las tecas, proceso que
puede acontecer al finalizar un mes. Los
primeros antecedentes datan del año
1964, en que a través del estudio de la
morfogénesis de anteras bajo condicio-
nes in vitro, se evidenció la totipotencia
del polen en su capacidad de cambiar
su programa fijado filogénicamente a la
fecundación a la generación directa de
plantas (Guha y Maheshwari, 1964;
1966; 1967). Para la década de los años
90, una gran cantidad de reportes infor-
maron sobre la posibilidad de obtener
plantas haploides en cereales y especies
leñosas y sobre sus aplicaciones en
biotecnología y mejoramiento genético
(Bajaj, 1990).
El proceso tiene gran importancia en el
mejoramiento genético de plantas dado
que: a) es posible en la práctica usar di-
rectamente la planta de características
haploides a través de la variación ga-
metoclonal (ejemplo la generación de
material de características enanas o
enanizante para uso como patrones de
injerto; generación de mutantes “waxy”
con mayor contenido en cera y, por tan-
to, mayor resistencia a patógenos, cam-
bios en el período de floración, cambio
64
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
en el contenido de metabolitos secun-
darios, cambios en morfología, etc.); b)
es posible hallar caracteres genéticos
que pueden estar enmascarados en cru-
zamientos normales, dada la incompati-
bilidad que se presenta en algunas espe-
cies; c) es posible diploidizar tejidos o
partes de la planta, obteniendo plantas
doble haploides (homocigotos diploi-
des), con lo cual se pueden seleccionar
directamente pares de genes dominan-
tes o recesivos en una sola generación y
haciendo posible emplear este material
en cruzamientos posteriores; y d) proce-
der a realizar mutaciones en células ha-
ploides, con lo cual se puede generar
material diverso con propiedades gené-
ticas de importancia (Bajaj, 1990). Dada
la mutación frente a agentes químicos
(por ejemplo toxinas, pesticidas/herbici-
das, metales pesados, etc.), las células
sobrevivientes al expresar dicha toleran-
cia, regeneran plantas tolerantes (Mali-
ga, 1984). La diploidización de ellas
conlleva a genotipos dobles haploides
(ambos genes dominantes o recesivos).
El cambio de la información conducen-
te a la inducción de respuestas androgé-
nicas, puede ser inducido sólo bajo con-
diciones in vitro. El cultivo de anteras
con sus microsporas en fase uninuclear;
o usando microsporas directamente, de-
be ser, por lo general, mantenido en pre-
sencia de los reguladores del tipo auxina
y citoquininas. Niveles de ácido naftale-
nacético (ANA) con benciladenina (BA)
de 1,0 mg/L, permiten dichas respuestas
en varias especies. El proceso de induc-
ción consiste en que a partir de la pri-
mera gran mitosis conducente a un nú-
cleo ó célula vegetativa y un núcleo o
célula generativa (o célula espermática),
la ontogenia se desarrolla en forma di-
ESTADIOS DEL CULTIVO DE TEJIDOS

ferente. En condiciones normales, sólo el mando un “grano de polen multicelular”.

núcleo generativo se divide una vez más,
conformando así los tres núcleos para el
desarrollo del tubo polínico, la formación
del zigoto y del endosperma. En el caso
de la inducción androgénica, la célula ge-
nerativa, por lo general no se divide más;
en cambio, el núcleo o célula vegetativa,
constituye divisiones repetitivas confor-
Esta estructura se organiza posteriormen-
te en forma de un pro-embrión y la mani-
festación de la polaridad conduce a un
embrión gamético al cabo de 4-5 sema-
nas (Figuras 3.1 a 3.4). Las respuestas
androgénicas de algunas especies frutales
estudiadas y sus condiciones de inducción
están resumidas en la Tabla 3.2.

Figura 3.1. Desarrollo de la microesporogénesis

normal y androgénesis in Vitro.

Figura 3.2. Polen multicelular (pro-embrioides) de peral (Pyrus sp.)

finalizadas tres semanas de cultivo in vitro, mostrando
dos planos (A y B) de la tabicación celular interna.

65
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

Figura 3.3. Figura 3.4. Emergencia de una plántula

Algunos estados de desarrollo en la haploide de tabaco (Nicotiana tabacum) a
andrógenesis de lúcumo (Pouteria lucuma) partir de polen después de 35 días de cultivo.

Tabla 3.2. Diferentes condiciones inductivas de la

androgénesis en varias especies frutales.
Respuestas
Morfogénicas/ Carica Pouteria Cyphomandra Prunus X Prunus Solanum Annona
Condiciones pubescens lucuma betacea Pandora avium muricatum cherimola

% Generación
de Embrioides(†) 6,5 3,7 0,0 39,7 3,1 0,0 0,0
% Formación de callo 91,1 80,0 <5,0 100 100 <5,0 <5,0
% Pardeamiento 5,7 51,9 90,0 <5,0 95,0 95,0 100
Medio de
Cultivo MS-mod(2) NN(3) MS,NN,G(1) NN NN NN NN
Reguladores de AIA 1.0 ANA 1.0 Diferentes ANA 1.0 ANA 1.0 Diferentes Diferentes
Crecimiento (mg/L) BA 1.0 BA 1.0 combin. BA 1.0 BA 1.0 combin. combin.
Conc. de 60 40 Diferentes 20 20 20 20
Sacarosa (g/L) niveles
Requerimientos Ninguno 8 días — Ninguno Ninguno — —
de bajas temp. a 8ºC
(†)
Porcentaje estimativo de inducción respecto a anteras sembradas [Gamborg et al., 1968 (1); Murashige y Skoog,
1962 (2); Nitsch y Nitsch, 1969 (3)].

66
ESTADIOS DEL CULTIVO DE TEJIDOS
Finalmente, es importante considerar
que los mecanismos que inducen la di-
visión asimétrica para la diferenciación
de la célula generativa durante la
ontogenia normal, pueden ser alterados
in vitro mediante aplicación de colchici-
na, que inhibe la formación del huso mi-
tótico. Al contrario del efecto de altas
dosis de colchicina, que inhibe total-
mente la división celular, bajos niveles
de colchicina, aún permisivos para la di-
visión de la microspora uninucleada,
provocan divisiones simétricas confor-
mando dos células vegetativas, como
ocurre durante la inducción de la an-
drogénesis de la microspora uninucle-
ada. Alternativamente, existe la posibi-
lidad de obtener también plantas
haploides, no a partir de gametos, sino
del tejido megagametofito femenino pre-
sente en gimnospermas, ofreciendo
igualmente un gran herramienta en el
mejoramiento genético particular de
coníferas. El gametofito femenino de
gimnospermas está constituido por cé-
lulas haploides genéticamente idénticas
y que constituyen este tejido de función
nutricional para el embrión (Cardemil y
Jordan, 1982; Chavez y Litz, 1999).
ENRAIZAMIENTO In vitro
El enraizamiento in vitro depende del
potencial de la especie, del tipo de
explante y de las condiciones de culti-
vo y del tipo y niveles de reguladores
que son usados. Muchas especies tien-
den a enraizar fácilmente; otras, como
algunas trepadoras, lo realizan con mu-
cha dificultad o manifiestan escasa fre-
cuencia. El pardeamiento del material
puede provocar también falta de res-
puestas. En general, la norma es que in
vitro, el grado de facilidad de inducción
es semejante al de las plantas bajo con-
diciones de campo. A veces, el material
denota intensa proliferación de brotes
pero no de raíces o viceversa. En la prác-
tica, se procede a usar mayormente el
ácido indolbutírico (AIB) como único
regulador, aunque también se ha citado
de usarse junto con AIA u otros regula-
dores, como ANA. Varias condiciones
del medio también aparecen como idó-
neas; entre ellas, el uso de soluciones
nutritivas de baja tonicidad, la reducción
del contenido de azúcar (sacarosa) de
2% a 1%, aumento de pantotenato de
calcio (5 mg/L), tiamina y la adición de
otros compuestos pueden ser útiles. Por
ejemplo el carbón activado, que junto
con prevenir un excesivo crecimiento de
callo puede condicionar la promoción
de raíces.
ACLIMATACIÓN
Las plántulas que se desarrollan bajo
condiciones in vitro, lo hacen con altos
contenidos de humedad tanto en el me-
dio como en su microambiente. Las
adaptaciones endógenas no consideran
entonces, en fases tempranas, la forma-
ción de cutícula en las hojas ni los me-
canismos regulatorios del control esto-
mático, vinculados a la retención de
agua e intercambio gaseoso. Por un lado,
aunque el número de estomas puede
variar en las hojas de las plantas in vitro
comparado con plantas en condiciones
de crecimiento externas, más relevante
es el hecho que su forma sea diferente y
estén situados en zonas superficiales de
la hoja, en vez de encontrarse más bien
67

sumergidos bajo la capa epidérmica,
aparte de su incapacidad en el funcio-
namiento de cierre en respuesta de estrés
hídrico.
En mayor medida, el efecto más perju-
dicial en la deshidratación de una hoja
es la falta de producción de cera
epicuticular. Su carencia implica que el
total de la superficie de las hojas permi-
ta la libre entrega de agua de la planta
al ambiente, efecto causado por diferen-
cia de potenciales hídricos en el siste-
ma. El resto de la planta recién desarro-
llada es también un material muy deli-
cado, que recién está generando las es-
tructuras con sus sistemas enzimáticos
que le permiten su vida. Específicamen-
te, las plántulas, de condición mixotró-
fica o heterotrófica, recién están comen-
zando a entrar a la fase de autotrofía.
Ello implica la generación de pigmentos
y organelos, pasando de una fase de con-
sumo de nutrientes orgánicos del medio
(por ejemplo sacarosa como fuente de
carbono) a su síntesis a través de la fo-
tosíntesis. Al respecto, se han estudiado
estas primeras fases de aclimatación y
se ha visto que, aunque durante la pri-
mera semana la fotosíntesis neta bajaba
al detectarse alta fluorescencia, existía
recuperación posterior.
Por otro lado, los niveles de sacarosa du-
rante el cultivo in vitro son relevantes,
puesto que concentraciones de 6% en
el medio, dificultan más la capacidad
adaptativa a plena fotosíntesis y auto-
trofía. Igualmente, la condición lumínica
es crítica en esta fase; mientras que una
intensidad de luz baja promueve la acli-
matación, los flujos de luz muy inten-
68
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
sos provocan fotoinhibición y severo es-
trés en este estado. Adicionalmente,
existe un problema de generación de
enzimas antioxidantes. La catalasa y la
superóxido-dismutasa son las enzimas
antioxidantes más eficientes en las plan-
tas, que evitan la formación de “espe-
cies de oxígeno activadas”, cuya resul-
tante es la formación de radicales de O 2 ,
d e O H y d e H 2O 2. A m b a s e n z i m a s
incrementan su contenido en los teji-
dos a medida que aumenta el grado de
estrés de plantas creciendo en su hábi-
tat natural.
Plántulas recién transferidas de la fase in
vitro a la de aclimatación, expresan es-
casa actividad de ambas enzimas, la cual
se incrementa posteriormente (a partir de
2 ó 4 semanas), efecto dependiente de
las condiciones favorables de adaptación
en esta fase, especialmente de acuerdo a
los niveles adecuados de humedad rela-
tiva y luz del invernadero. Cabe desta-
car que aún a condiciones de muy alta
humedad en el medio, por ejemplo HR
de 99%, las tensiones ejercidas por la at-
mósfera ya son muy altas correspondien-
do a aproximadamente –1.38 MPa (Me-
gapascal) mientras en condiciones más
normales aun, por ejemplo de HR 50%,
el potencial asciende a aproximadamente
–93.6 MPa. El hecho de no poder regular
entonces la demanda de agua, aún exis-
tiendo ésta en el nuevo substrato, puede
conducir a un alto porcentaje de pérdi-
da del material. En estos casos se usa una
estrategia intermedia que dependerá nue-
vamente del tipo de planta, por ejemplo,
induciendo un lento endurecimiento de la
planta mediante el traspaso a etapas par-
ciales antes de su paso a invernadero.
ESTADIOS DEL CULTIVO DE TEJIDOS
En algunas condiciones se usan osmó-
ticos e inhibidores in vitro, que desenca-
denan por sí algunas respuestas. Por
ejemplo, altos niveles de sacarosa apli-
cados durante la fase de germinación de
embriones somáticos han estimulado la
síntesis de antocianinas, de lípidos y de
alcaloides. Los cambios en los niveles
de CO 2 en envases herméticos de los cul-
tivos en la fase previa al transplante,
pueden afectar las densidades estomata-
les, el índice estomático y la apertura y
cierre de estomas de acuerdo al cultivo,
efecto también influenciado por la inten-
sidad lumínica (Ross-Karstens et al.,
1998). Sin embargo, a nivel de inverna-
dero, una acción benéfica importante se
ha encontrado mediante el uso de com-
puestos diversos de acción antitranspi-
rante, que se aplican por aspersión so-
bre la superficie de las hojas. Con ello
se puede crear una película muy fina,
que actúa como reflectora de luz, redu-
ciendo de esta manera, la pérdida de
agua por evapotranspiración, mientras
se genera la cutícula y operen los me-
canismos de apertura y cierre estomatal.
Se debe tener especial cuidado con la
selección y preparación de dichos pro-
ductos pues pueden generar toxicidad.
Uno de los compuestos usados ha sido
una resina polivinílica, el polivinilace-
tato o combinaciones de parafina de
bajo punto de fusión y/o grasa de petró-
leo con 50% glicerol acuoso, disuelto en
dietiléter. Otro problema frecuente vin-
culado con la adaptación, pero también
con respuestas morfogénicas, es el efec-
to llamado “vitrificación” o condición
“hiperhídrica” que se presenta en teji-
dos de algunas especies bajo condición
in vitro y que se analiza más adelante.
La aclimatación en ambientes controla-
dos también está vinculada a mejorar el
desarrollo y funcionamiento de órganos.
En muchos casos, las raíces formadas in
vitro no prosperan en condiciones de
substrato. Sin embargo, explantes enrai-
zados fácilmente regeneran nuevas raí-
ces. Con respecto a esto, se ha reportado
que niveles altos de CO 2 (aproximada-
mente 750 ppm) en presencia de ciertos
niveles lumínicos (80 µmol m -2 s -1), favo-
recen el desarrollo radicular, al mismo
tiempo que condicionan una mejor acli-
matación de las plántulas en tiempos me-
nores (George, 1993). A fin de lograr la
mejor aclimatación ambiental de las
plántulas a condiciones ex vitro, se de-
ben tener además presentes los siguien-
tes factores/condiciones: a) alta hume-
dad, sombra, asepsia; b) eliminación de
agar con el objeto de eliminar la presen-
cia de azúcar disuelta; c) uso de subs-
tratos porosos, empleando en mezclas:
perlita, arena, vermiculita, pumicita, tur-
ba y suelo; desinfectados con fungicidas
entre ellos Benomil, Propamocarb, Cap-
tan, Thiram, Mancozeb, etc. y sus combi-
naciones, en concentraciones bajas cada
dos semanas; d) según sea el caso de la
especie y substrato y una vez formadas
las raíces (y follaje), aplicación de macro
y micronutrientes mediante soluciones
nutritivas concentradas o diluidas que in-
cluyan elementos menores en forma so-
luble.
69

REFERENCIAS
Attre, S., Pomeroy, M. y Fowke, L. 1995.
Development of white spruce (Picea glau-
ca [Moench.] somatic embryos during
culture with abscisic acid and osmoticum,
and their tolerance to drying and frozen
storage. J. Exp. Bot. 46:433-439.
Bajaj, Y. 1990. Haploids in crop improvement
I. pp. 3-44. In: Bajaj, Y. (ed.). In vitro pro-
duction of haploids and their use in cell
genetics and plant breeding, Biotechnology
in Agriculture and Forestry 12. Springer-
Verlag, Berlin-Heidelberg, Germany.
Bonga, J. 1982a. Tissue culture techniques. pp.
4-35. In: Bonga, J. y Durzan, D. (eds.),
Tissue Culture in Forestry. Martinus Nijhoff/
Dr. W. Junk Publishers, Dordrecht, The
Nederlands.
Bonga, J. 1982b. Vegetative propagation in re-
lation to juvenility, maturity and rejuve-
nation. pp. 387-412. In: Bonga, J. y Durzan,
D. (eds.). Tissue Culture in Forestry,
Martinus Nijhoff / Dr. W. Junk Publishers,
Dordrecht, The Nederlands.
Cardemil, L. y Jordan, M. 1982. Light and
electron microscopic study of in vitro
cultured female gametophyte of Araucaria
araucana (Mol.) Koch seeds. Z. Pflanzen-
physiologie 107:329-338.
Chavez, V. y Litz, R. 1999. Organogenesis from
megagametophyte and zygotic embryo
explants of the gymnosperm Dioon edule
Lindley. Plant Cell Tissue and Organ Culture
58:219-222.
Fraga, M., Cañal, M. y Rodríguez, R. 2002. In
vitro morphogenic potential of different aged
Pinus radiata trees correlates with polya-
mines and DNA methylation levels. Plant
Cell Tissue and Organ Culture 70:139-145.
Fowke L. y Attre, S. 1996. Conifer somatic
embryogenesis: studies of embryo develop-
ment and the cell biology of conifer cells
and protoplasts. Plant Tissue Culture and
Biotechnology 2:124-130.
70
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
Gamborg, O., Miller R. y Ojima, O. 1968.
Nutrient requirements of suspension cultures
of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50:151-
158.
George, E. 1993. Plant Propagation by Tissue
Culture, Part 1. Part 1: the technology. Exe-
getics Exegenetics Ltd. Edington, Reading,
England.
Guha, S. y Maheshwari, S. 1964. In vitro pro-
duction of embryos from anthers of Datura.
Nature 204:497.
Guha, S. y Maheshwari, S. 1966. Cell division
and differentiation of embryos in the pollen
grains of Datura in vitro. Nature 212:97-98.
Guha, S. y Maheshwari, S. 1967. Development
of embryos from pollen grains of Datura in
vitro. Phytomorphology 17:454-461.
Gupta, P. y Durzan, D. 1986. Somatic polyem-
bryogenesis from callus of mature sugar
pine embryos. Biotechnology 4:643-645.
Jordan, M. 1975. Histologische und physio-
logische Untersuchungen zur Kapazität der
Androgenese bei in vitro kultivierten
Prunus-Pyrus-Ribes- und Nicotiana-
Antheren. Ph.D. Thesis, Justus-Liebig Uni-
versity, Giessen, Germany.
Jordan, M. y Feucht, W. 1977. Differenzierun-
gsprozesse und Phenolstoffwechsel bei in
vitro kultivierten Antheren von Prunus
avium und Prunus x “Pandora“. Angew.
Botanik 51:69-76.
Jordan, M., Montenegro, G. y Apablaza, G.
1983. Regeneración de plántulas de seis
cultivares de papa libres de virus X por cul-
tivo de ápices caulinares y tratamientos de
Virazole in vitro. Ciencia e Investigación
Agraria 10:249-256.
Jordan, M., Iturriaga, L., Roveraro, C. y Goreux,
A. 1991. Promotion of Annona cherimola
in vitro shoot morphogenesis as influenced
by antioxidants. Gartenbauwissenschaft 56:
224-227.
ESTADIOS DEL CULTIVO DE TEJIDOS
Jordan, M., Obando, M, Iturriaga, L., A. Goreux
y Velozo, J. 1993. Organogenesis and rege-
neration of some Andean fruit species. Acta
Horticulturae 336:279-284.
Jordan, M. y Piwanski, D. 1997. Regeneration
of babaco (Carica pentagona [Heilborn]
Badillo) using leaf explants and shoot-tip
culture. Phyton 61:109-115.
Joyce, S. y Cassells, A. 2002. Variation in potato
microplant morphology in vitro and DNA
methylation. Plant Cell Tissue and Organ
Culture 70:125-137.
Koblitz, H. 1972. Zell- und Gewebezüchtung
bei Pflanzen. Gustav Fischer Verlag, Stut-
tgart, Germany.
Lane, W. 1990. Micropropagation of apple
(Malus domestica Barkh.). pp. 229-243. In:
Bajaj, Y. (ed.). Biotechnology in Agriculture
and Forestry 18, High-Tech and Micropropa-
gation II. Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg,
Germany.
Litz, R. y Gray. D. 1992. Organogenesis and
somatic embryogenesis. pp. 3-34. In: Ham-
merschlag F, y Litz, R. (eds.). Biotechnology
of Perennial Fruit Crops, Biotechnology of
Agriculture Series Nº 8. CAB International,
Wallingford, United Kingdom.
Maliga, P. 1984. Isolation and characterization
of mutants in plant cell culture. Ann. Rev.
Plant Physiol. 35:519-542.
Mihaljevic, S., Peric, M. y Jelaska, S. 2001. The
sensivity of embryogenic tissue of Picea
omorika (Panc.) Purk. to antibiotics. Plant
Cell Tissue and Organ Culture 67:287-293.
Mohr, H. 1976. Pflanzenphysiologie. Springer-
Verlag, Heidelberg, Germany.
Murashige, T. y Skoog, F. 1962. A revised
medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue culture. Physiologia
Plantarum 15:473-497.
Nitsch, J. y Nitsch, C. 1969. Haploid plants
from pollen grains. Science 163:85-87.
Obando, M. y Jordan, M. 2001. Regenerative
Responses of Cyphomandra betacea (Cav.)
Sendt. (tamarillo) cultivated in vitro. Acta
Horticulturae 560:429-432.
Pierik, R., Oosterkamp, J, Manschot, G., Barth,
T. y Scholten, H. 1997. Agar brand, a
dominating factor for shoot growth of
juvenile and adult Quercus robur L.
‘Fastigiata´ in vitro. Plant Tissue Culture and
Biotechnology 3:27-31.
Ross-Karstens, G., Ebert, G. y Lüdders, P. 1998.
Influence of in vitro growth conditions on
stomatal density index and aperture of
grape, coffee and banana plantlets. Plant
Tissue Culture and Biotechnology 4:21-27.
Santos, D. y Fevereiro, P. 2002. Loss of DNA
methylation affects somatic embryogenesis
in Medicago trunculat. Plant Cell Tissue and
Organ Culture 70:155-161.
Skoog, F. y Miller, C. 1957. Chemical regulation
of growth and organ formation in plant
tissues cultured in vitro. Symposia of the So-
ciety for Experimental Biology 11:118-130.
Taiz, L. y Zeiger, E. 2002. Plant Physiology.
Sinauer Associates Inc. Publishers, Massa-
chusetts, USA.
Yeoman, M. 1973. Tissue (callus) culture-
techniques. pp. 31-58. In: Street, H. (ed.).
Plant Tissue and Cell Culture. Blackwell Sci.
Publ., Oxford, England.
71
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

72
APLICACIONES DE LA TÉCNICA DE CULTIVO DE TEJIDOS

CAPÍTULO 4

APLICACIONES DE LA TÉCNICA
DE CULTIVO DE TEJIDOS Miguel Jordan Z.

PROPAGACIÓN CLONAL De acuerdo a varios autores, las venta-

jas de la micropropagación son varias,

L as plantas pueden propagarse me-

diante dos ciclos de vida; la vía
sexual y la asexual. En la vía asexual o
entre ellas: necesidad de contar sólo
con pequeños explantes (Figura 4.1) pa-
ra producir grandes cantidades de mate-
vegetativa, los caracteres individuales de rial élite en tiempos relativamente cor-
las plantas madres son mantenidas en tos; posibilidad de multiplicación du-
sus descendientes, dado que el proceso rante todo el año; escasos requerimien-
ocurre a través de células somáticas que tos de espacio y energía; posibilidad de
se copian exactamente y no recombinan obtención de plantas libres de patóge-
ni segregan como ocurre en la vía sexual nos o de eliminar estos de madres infec-
(semillas). Muchas selecciones se han tadas; y reducción de costos cuando
obtenido sobre la base de mutaciones otros métodos aparecen excesivamen-
espontáneas que han ocurrido en algu- te costosos, dependiendo de la especie.
nos tejidos. Tales características pueden La micropropagación es, además, la he-
igualmente perpetuarse, usando estos rramienta central en la amplificación de
como material madre. Al grupo de plan- material genético de alta calidad, per-
tas reproducidas a partir de esta mane- mitiendo además, el establecimiento y
ra, se denomina clon. perpetuación de germoplasma o genoti-
pos modificados a través de la ingenie-
Las técnicas de micropropagación, no ría genética.
sólo permiten mantener la homogenei-
dad o constancia del genotipo (salvo
excepciones), sino que también perpe-
túan la condición fisiológica de los
explantes. Por ejemplo, expresar y man-
tener la condición de juvenilidad o ma-
durez existentes en los explantes mater-
nos, o de poder mantener o de capturar
rasgos poco comunes en una población
(Maynard, 1988). Igualmente por ejem-
plo, perpetuar hábitos arbustivos o de
tronco en poblaciones de ambas carac-
terísticas. De igual manera, material en
floración o con yemas florales, genera-
Figura 4.1. Organogénesis caulinar
rá material con expresión inmediata de (formación de brotes) en una sección de hoja
características adultas. de pepino (Solanum muricatum) de 1 cm2.

73

CULTIVO DE EMBRIONES
En diversos programas de mejoramiento
genético, es conveniente combinar ca-
racterísticas genéticas importantes que
se encuentran en variedades, como tam-
bién en especies afines, mediante la ob-
tención de material híbrido. Ello puede
realizarse mediante cruzamientos intra
e interespecíficos. Sin embargo, la ferti-
lidad puede ser extremadamente baja
por problemas de incompatibilidad
genética, lo que provoca la muerte de
los embriones en desarrollo, o bien, per-
mite completar sólo parte de su desarro-
llo (Raghavan y Srivastava, 1982). La in-
compatibilidad genética puede darse a
nivel de la polinización (no penetra el
polen por el estigma), a nivel del estig-
ma y durante la fecundación.
Existen genes de incompatibilidad que
operan evitando los cruzamientos inter-
específicos naturales entre especies. En
otros casos, el problema puede darse
igualmente entre variedades que son in-
compatibles. Se pueden distinguir dos
tipos de infertilidad:
a) Incompatibilidad pre-cigótica, en la
cual no ocurre la germinación del po-
len y/o crecimiento del tubo polínico,
por lo cual el cigoto no se forma.
b) Incompatibilidad post-cigótica, en
que se produce el cigoto, pero éste
no es aceptado por el endosperma.
La falta de nutrición del cigoto por par-
te del endosperma, provoca su desinte-
gración o aborto (Dimantoglou y Bani-
las, 1996). En algunos casos, la polini-
zación y desarrollo de embriones pue-
74
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
de darse extrayendo los ovarios de las
flores, después de unos pocos días ocu-
rrida la fertilización y cultivándolos in
vitro después de polinizar estos y pre-
via escisión del estilo (polinización o fer-
tilización in vitro).
Se ha visto que bajo estas circunstancias,
es posible promover el desarrollo de di-
chos embriones subcultivándolos (reti-
rándolos de los factores inhibitorios pre-
sentes en el tejido placental materno) en
estadios tempranos de su ontogenia
(Raghavan y Srivastava, 1982). De esta
manera, es posible realizar el rescate de
embriones derivado de combinaciones
que no hubiesen sido posibles en la na-
turaleza.
Una segunda utilidad, consiste en lograr,
a través del rescate de embriones, la ob-
tención de material con características
juveniles, el que tiene mayor potencial
regenerativo para multiplicación clonal.
Lo mismo también para el material libre
de patógenos, dado que la frecuencia de
transmisión a través de gametos es sólo
de un 5%. También es una estrategia efi-
ciente de obtención de mutaciones, pues
es posible someter polen (haploide) a
tratamientos mutagénicos (radiación
ionizante, UV y productos químicos) y
polinizar posteriormente los ovarios.
Adicionalmente, se ha visto que embrio-
nes generados de esta manera pueden
obviar la demanda de dormancia.
De acuerdo a su estadio de desarrollo
al momento de extracción, los medios
cambian en cuanto a complejidad de
composición. Estadios tempranos de cul-
tivo requieren de vitaminas, aminoáci-
dos, reguladores, agua de coco y otros
APLICACIONES DE LA TÉCNICA DE CULTIVO DE TEJIDOS
compuestos naturales. En cambio em-
briones más desarrollados crecen en pre-
sencia sólo de sales inorgánicas y saca-
rosa. Los parámetros que afectan las fa-
ses conducentes a la obtención de em-
briones somáticos y de ellas, plantas,
está bastante conocida en diferentes es-
pecies, lo que permite automatizar el sis-
tema de cultivo en biorreactores (Ibaraki
y Kurata, 2001).
OBTENCIÓN
DE HAPLOIDES
La generación de haploides (por ejem-
plo genes A B C d), tiene gran importan-
cia en el mejoramiento genético de plan-
tas dado que:
a) Es posible, en la práctica, usar direc-
tamente la planta de características
haploides, a través de la variación ga-
metoclonal (ejemplo patrones de in-
jerto enanizantes);
b) Es posible hallar caracteres genéticos
que pueden estar enmascarados en
cruzamientos normales dada la in-
compatibilidad que se presenta en
algunas especies;
c) Es posible diploidizar tejidos o par-
tes de la planta, obteniendo homoci-
gotos diploides, con lo cual se pue-
den seleccionar directamente pares
de genes dominantes o recesivos en
una sola generación, haciendo posi-
ble emplear este material en cruza-
mientos posteriores; y
d) Proceder a realizar mutaciones en cé-
lulas haploides, con lo cual se puede
generar diverso material con propie-
dades genéticas de importancia.
Dada la mutación frente a agentes quí-
micos (por ejemplo, toxinas, pesticidas/
herbicidas, metales pesados etc.); las cé-
lulas sobrevivientes al expresar dicha to-
lerancia regeneran plantas tolerantes. La
diploidización (Ejemplo AA BB CC dd)
de ellas, conlleva a genotipos homocigo-
tos dominantes (dobles haploides).
a) Androgénesis.
Anteriormente se presentó el potencial
morfogénico existente en gametos a tra-
vés de la androgénesis, que manifiestan
microsporas conducente a la producción
de plantas haploides. Junto a la condi-
ción del genoma, la ventaja de su uso
implicaba aprovechar la variabilidad
gametoclonal en la detección y selec-
ción de varios caracteres agronómicos
de interés. De acuerdo a la expresión de
estos, la condición haploide permite evi-
denciar tempranamente mutantes y, en
el caso de la manipulación genética, los
protoplastos haploides y sus productos
de fusión interespecífica o intergené-
rica, representan el material más apro-
piado en el estudio de la inestabilidad
cromosomal en trabajos de mejoramien-
to genético basado en cruzamiento ge-
nético convencional o en fusiones somá-
ticas bajo condiciones in vitro. Una se-
rie de cambios que implican variación
genética, pueden ocurrir en cultivos de
origen haploide combinados. Estos co-
rresponden a variación cromosomal, al-
teraciones moleculares del genoma nu-
clear y cambios citoplasmáticos (Ziau-
ddin y Kasha, 1990). Dentro de los pri-
meros, se pueden citar translocaciones,
deficiencias y números irregulares de
cromosomas (Chen y Chen, 1980;
D’Amato, 1977); las segundas pueden
estar relacionadas con amplificación de
75

secuencias repetitivas (De Paepe et al.,
1982) y las terceras, con pérdidas de
genes en el DNA-plastidial, causante de
la condición albina en muchas gramí-
neas (Day y Ellis, 1984). Tales variacio-
nes, permiten que con el uso de haploi-
des, la metodología de obtención de
mutantes resistentes a varias pestes, a
patotoxinas, herbicidas y tolerancia a
sales y estrés, se vea altamente facilita-
da y de hecho, gran cantidad de nuevas
líneas y variedades de carácter produc-
tivo, han sido generadas en varias espe-
cies de importancia agronómica (Bajaj,
1990). Igualmente, células y protoplas-
tos de carácter haploide, son una herra-
mienta de especial interés en trabajos de
transformación genética (Zhang y
Lespinasse, 1992).
b) Ginogénesis.
La información concerniente a esta mo-
dalidad de generación de haploides es
muy escasa. El cultivo in vitro de ova-
rios no polinizados, óvulos aislados o en
conexión con tejido placental, se reali-
za preferentemente en el momento en
que el saco embrionario cuenta con
ocho núcleos haploides. Los resultados
no son tan generalizados como a través
de la androgénesis, en menor parte atri-
buible a la dificultad de determinar el
estado del saco embrionario. En plantas
leñosas, las respuestas son aún más limi-
tantes; a la fecha, se ha reportado la for-
mación de callo con estructuras de as-
pecto de embrión, pero que no condu-
jeron a la formación de plantas. Sin em-
bargo, el potencial de esta técnica es alto
por el tipo de material generado de ori-
gen materno, como se indicó anterior-
mente (Yang y Zhou, 1990). Frente a las
76
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
limitaciones actuales, una estrategia
para generar material de características
genéticas importantes de condición “ha-
ploide”, sería la de generar plántulas de
material fecundado cuyo polen hubiese
sido irradiado con altos niveles de ra-
yos X o radiación gamma, o polinizar
con polen infértil de carácter triploide
(Germaná y Chiancone, 2001). La gino-
génesis es relevante en aquellos casos
de genotipos no androgénicos o con es-
terilidad masculina (Zhang y Lespinasse,
1992). En particular, la posibilidad de
obtener haploides a través de ginogéne-
sis en Citrus clementina, aparece como
la única estrategia viable en diferentes
especies de cítricos dado que, por lo
general, diferentes genotipos ensayados
no desarrollan androgénesis (Germaná
y Chiancone, 2001).
c) Potencial del megagametofito fe-
menino de gimnospermas.
El gametofito femenino de gimnospermas
es de relativo gran tamaño y facilidad de
manipulación. Este tejido haploide, con-
formado enteramente por células ha-
ploides idénticas entre sí (rico en almi-
dón), nutre y rodea el embrión de las co-
níferas. En el caso de Araucaria araucana
(Cardemil y Jordan, 1982), se presenta
con células que corresponden a un ce-
nocito; es decir, células con varios nú-
cleos haploides sin tabicación interior.
Intentos de cultivar éste han conducido
a la formación de callo con proliferación
celular y formación de células delimita-
das por pared. Sin embargo, a pesar de
no encontrar respuestas morfogénicas en
A. araucana, se ha reportado morfogéne-
sis conducente a la formación de brotes
en gametofitos de Larix sp. (Nagmani y
APLICACIONES DE LA TÉCNICA DE CULTIVO DE TEJIDOS
Bonga, 1985) y en varias Cycadales del
género Zamia spp., Ceratozamia spp. y
Dioon sp. (Chávez y Litz, 1999).
d) Haploidía por cruzamientos
interespecíficos incompatibles co-
rrespondientes al género Hordeum.
En este caso, durante el cruzamiento de
H. vulgare con H. bulbosum (Konzak et
al., 1951; Kasha y Kao, 1970; Bajaj,
1990), una mitad cromosomal de la
recombinación se pierde (H. bulbosum)
quedando el embrión cigótico F1 en con-
dición haploide, el cual debe ser recu-
perado mediante el cultivo de embriones
poco después de la polinización. Tal es-
trategia es importante en programas de
mejoramiento, dado que puede incluirse
igualmente en cruzas de trigo (Triticum
aestivum) con maíz (Zea mays), de las
cuales se han podido generar embriones
de trigo dobles haploides (Bajaj, 1990).
PRODUCCIÓN DE PLANTAS
LIBRES DE VIRUS.
Las virosis son enfermedades bastante
frecuentes en vegetales. Aunque por se-
millas se transmiten solamente un 5% de
ellas, los problemas por contaminación
son muy importantes en especies que se
propagan vegetativamente. El uso de
bulbos, tubérculos, rizomas, estacas y
otro material posible de multiplicar, (jun-
to a injertos), derivado de plantas con-
taminadas, conlleva dichas infecciones.
En algunos casos, el uso de la propaga-
ción vegetativa es ineludible, puesto que
un cultivo determinado corresponde a
variedades y clones cuya homogeneidad
genética se perdería por uso de semillas.
Por otro lado, el empleo de semillas de-
rivadas de polinización cruzada, por la
variabilidad que expresan, no sería idó-
nea para efectos de mantener la homo-
geneidad y/o productividad de un culti-
vo. Frente a cada caso, debe conside-
rarse que, para muchas comunidades
agrícolas las metodologías ancestrales
de cultivo son mantenidas todavía por
tradición y que cambios por moderniza-
ción, serían socialmente poco viables al
haber hecho uso del mismo recurso es-
pecífico por generaciones.
La propagación vegetativa conlleva di-
chos riesgos, con lo cual una atención
especial debe ser dedicada a la manten-
ción de la calidad clonal y el control
fitosanitario de las plantas madres y des-
cendencia. Al mismo tiempo, la posibi-
lidad de erradicar contaminantes de
material de alto valor cultural debe ser
una constante con este propósito.
Las infecciones de tipo viral son transmi-
tidas principalmente a la planta por in-
sectos ya sea de tipo picador-chupador
(áfidos) o nemátodos a nivel del suelo,
que llevan los patógenos en su sistema
digestivo, adquiriéndolo de otras plan-
tas contaminadas. A medida que la plan-
ta va completando sus fases de desarro-
llo y durante toda su ontogenia, la in-
fección transmitida puede incrementarse
en los tejidos. Aparte de eso, nuevos fo-
cos de infección, con la misma u otras
virosis, pueden aparecer con el tiempo.
En el caso de papayas (Carica papaya);
al cabo de unos años, las plantas deben
ser reemplazadas dado que, por presen-
cia de virus (en este caso Papaya ring-
spot virus, PRV), su productividad baja
considerablemente (Manshard, 1992).
Dado que en este o en otros cultivos se
77

tienen formas más productivas desea-
bles, por ejemplo, (formas florales/plan-
tas masculinas, femeninas, hermafro-
ditas), plantas polinizadoras, o resisten-
tes a varios tipos de estrés biótico o
abiótico, a partir de ellas es posible su
propagación y la obtención de material
libre de patógenos mediante técnicas de
cultivo de tejidos.
Los tejidos meristemáticos en activo cre-
cimiento se encuentran generalmente
libres de diferentes tipos de patógenos,
aún en plantas contaminadas. Dicho po-
tencial es explotable puesto que, de ser
posible su cultivo y conducción a res-
puestas morfogénicas, es de esperar po-
der generar plantas idénticas sanas. Esta
condición está dada porque el movi-
miento transcelular de patógenos, a tra-
vés de las vías simplásticas (más frecuen-
tes en células jóvenes de tejidos meris-
temáticos), aparece como “temporal-
mente demorado” con respecto a la ve-
locidad de crecimiento de zonas api-
Figura 4.2. Obtención de ápices caulinares libres de
patógenos en papa (Solanum tuberosum) mediante
brotación múltiple de secciones nodales y quimioterapia.
78
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
cales. De allí que en las zonas de activa
división (y elongación), más distales,
pueden encontrarse temporalmente li-
bres de contaminación (Figura 4.2). Otra
causa posible es la competitividad por
síntesis de proteínas y ácidos nucleicos
entre patógenos y tejido meristemático,
competitividad que no ocurre en célu-
las más adultas en fase de diferencia-
ción. Finalmente, se postula que la auxi-
na es una hormona determinante que
inicia la síntesis de muchas proteínas,
entre ellas las que otorgarían caracterís-
ticas de resistencia a algunos virus.
El meristema es un centro principal de
síntesis de auxina para la planta. A fin
de lograr por tanto el “escape”, es co-
mún mantener plantas a altas tempera-
turas, según su grado de tolerancia (30-
40ºC, por días o semanas, con alta hu-
medad relativa en el ambiente), lo cual
promueve gran actividad meristemática
y crecimiento. Conjuntamente, puede
darse la condición de oscuridad, la cual
APLICACIONES DE LA TÉCNICA DE CULTIVO DE TEJIDOS
promueve la etiolación del eje central
(y el crecimiento) de las plantas en su
región de elongación celular, localiza-
da debajo del meristema.
Con el aislamiento y cultivo in vitro de
estos tejidos, se pueden obtener plantas
totalmente libres de patógenos. La téc-
nica consiste en aislar y extraer el con-
junto de células o tejidos que conforman
exclusivamente la región meristemática,
del orden de 0.1 mm de diámetro. Como
ello implica un trabajo lento, muchas
veces se cultivan los ápices enteros (con
mayor riesgo de contaminación/menor
erradicación de patógenos), pero se em-
plean posteriormente técnicas de detec-
ción rigurosas para evaluar la calidad
fitosanitaria del explante; por ejemplo,
ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent
Assay), de sensibilidad mil veces mayor
en comparación con técnicas conven-
cionales (por ejemplo, Látex) (Wood,
1985). El grado de confianza de usar esta
metodología, está dado también por el
hecho de que, en algunos casos, la mul-
tiplicación de patógenos en los tejidos
mantenidos in vitro se ve inhibida con
el tiempo y que explantes de mayor ta-
maño (virtualmente contaminados), apa-
recen igualmente libres después de un
período largo de cultivo. Existen estu-
dios específicos realizados en meriste-
mas y callos (tejidos no organizados),
que demuestran una reducción de
patógenos en el tiempo, bajo condicio-
nes in vitro (Ingram, 1973). Varios tra-
bajos en tejidos meristemáticos han em-
pleado compuestos de posible acción
antiviral con respuestas diversas. Entre
ellas, bases análogas (por ejemplo, 8-
azaguanina, 2-tiouracilo), se han mos-
trado eficientes en el control del virus Y
(PVY) de la papa, o verde malaquita
(diaminotrifetilmetano), etc.; especial-
mente Virazole ha mostrado en el tiem-
po, tener efecto antiviral en una serie de
especies. La ventaja de su empleo e in-
clusión in vitro, es que se trata de un
producto estable a altas temperaturas
(autoclavable) y que posee escasa toxi-
cidad en los tejidos. En papas se logró
control de PVX en dosis de Virazole de
5-25 mg/L (Jordan et al., 1983), aunque
niveles de 50 mg/L o mayores, provoca-
ron cierto grado de toxicidad en los ápi-
ces cultivados in vitro, afectando su cre-
cimiento y rizogénesis. Virazole también
fue aplicado directamente a la planta,
previo al cultivo, consiguiéndose erra-
dicación de PVX, bajo ciertas concen-
traciones (Figura 4.2).
Las técnicas anteriores contemplan igual-
mente la termoterapia. Con ella fue posi-
ble eliminar la presencia de un viroide de
la papa (PSTV) y lograr la obtención de
explantes potencialmente libres de
patógenos (Roca, comunicación personal).
CRIOPRESERVACIÓN
Se refiere a la posibilidad de preservar
en el tiempo, el germoplasma existente
en la forma de células u órganos a bajas
temperaturas. El término criopreserva-
ción se refiere mayormente a tempera-
turas cercanas a –196º C. Esta metodo-
logía consiste en transferir material bio-
lógico a almacenamiento en nitrógeno
líquido, temperatura a la cual todo el
metabolismo es suspendido. Teórica-
mente, no existen daños biológicos en
el procedimiento, salvo posibles cam-
bios que involucran radiaciones ioni-
zantes naturales.
79

En la práctica, en la criopreservación
existe la ventaja de poder conservar ma-
terial de valor, de manera que los gastos
operacionales in vivo e in vitro pueden
ser omitidos por períodos prolongados.
Esto es relevante en programas de me-
joramiento genético de especies
arbóreas o material forestal (Smith,
1997), donde se requiere superar un
período de larga juvenilidad y/o esperar
la expresión de características
fenotípicas de las plantas sujetas a su
conservación y propagación sexual pro-
gramada (Haines, 1994). Otro interés de
esta técnica consiste en la posibilidad
de conservar material en inminente pe-
ligro de extinción. Ello es especialmen-
te relevante en áreas poco exploradas
científicamente, donde la explotación
desmedida, por ejemplo, en vastas re-
giones de bosques tropicales, y donde
la maquinaria avanza más rápidamente
que la descripción taxonómica, se sacri-
fica la existencia de especies sin siquie-
ra ser descritas o ser conocida su impor-
tancia para el hombre y cuya elimina-
ción las hará irrecuperables para la hu-
manidad (Raven et al., 1999).
La técnica de conservación es igualmen-
te de utilidad, puesto que bajo algunas
condiciones in vitro, se produce variabi-
lidad por inestabilidad genética; como
ocurre por variación somaclonal, otros
tipos de alteraciones en callo, o suspen-
siones celulares de carácter endógeno o
producido por algunos factores (ejemplo
2,4-D). Por criopreservación se mantie-
ne al alcance inmediato el material ori-
ginal invariable a lo largo del tiempo. En
términos prácticos, la ventaja también re-
side en poder conservar y usar material
o germoplasma que es altamente hetero-
cigoto y donde, por causa de la propaga-
80
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
ción por semillas, pueden ser perdidas las
combinaciones deseables de genes.
Igualmente, es importante para aquellas
semillas de especies que son poco tole-
rantes a las condiciones ambientales, de
escasa viabilidad y en peligro de extin-
ción (Maynard, 1988). La conservación
de polen es una de las alternativas afines
posibles para conservar dicha biodiversi-
dad, al contar solamente con un repre-
sentante de cada cromosoma maximizan-
do su estabilidad genética y tiempo de
almacenamiento (Grout y Roberts, 1995).
Salvo algunas excepciones, especialmen-
te en el caso de semillas o yemas en con-
dición de dormancia, donde se coloca di-
rectamente el material a temperaturas
criogénicas, el proceso es comúnmente
gradual y requiere satisfacer ciertas eta-
pas. Una de ellas es el acondicionamien-
to previo, que puede inducirse mediante
el cultivo de explantes en presencia de
altos niveles de osmóticos y el uso de
crioprotectores. Los primeros, están indi-
cados para reducir el contenido de agua
intracelular de los explantes; los segun-
dos, para impedir la formación de crista-
les de agua que puedan dañar la estruc-
tura celular.
Este proceso de “desecación” permite re-
ducir gradualmente la temperatura del ex-
plante por debajo del punto de congela-
ción sin mayor daño. A continuación, el
proceso puede ser más rápido colocándo-
se el material ya protegido directamente
en el N 2 líquido. En algunos casos, se ha
procedido a una interfase de desecación
previa mediante encapsulado del material
en alginato de Ca. La crioprotección pue-
de lograrse con combinaciones de varios
compuestos; por ejemplo, dimetilsulfoxi-
do (DMSO) al 0,5 M hasta 15%, en presen-
cia de glicerol o con combinaciones que
APLICACIONES DE LA TÉCNICA DE CULTIVO DE TEJIDOS
pueden incluir uno o varios de los siguien-
tes compuestos: polietilenglicol (PEG)
10%, sorbitol 0,4-0,5 M, etilenglicol 10-
15%, sacarosa 2-3%, glucosa 6-10%, pro-
lina 0,5%. Bajo estas condiciones común-
mente se baja la temperatura a razón de
0,5-1,0ºC por minuto hasta -40ºC; para su-
mergir luego directamente en nitrógeno lí-
quido. Alternativamente, la descongela-
ción puede ser más bien rápida hasta
aproximadamente los -40ºC para luego, en
presencia de algunos criopreservantes,
ascender gradualmente hasta el punto de
congelación. A continuación, se transfie-
re el material a medios sin criopreservantes
y se establece la temperatura usual de cul-
tivo (por ejemplo 20-25ºC). En esta fase,
varias modificaciones específicas han con-
tribuido a mejorar la eficiencia en algunos
cultivos; por ejemplo, la substitución de
nitrato por amonio y el empleo de carbón
activado. Detalles sobre metodologías para
criopreservar diferentes órganos de plan-
tas, callos y suspensiones celulares, test de
viabilidad de los explantes y aspectos de
estudio bajo microscopía electrónica, es-
tán igualmente descritos (Withers, 1985).
Figura 4.3. Suspensiones celulares conducentes a la
embriogénesis somática en papaya (Carica pubescens).
SUSPENSIONES CELULARES
Dado el potencial morfogénico de algu-
nas células, es posible obtener gran efi-
ciencia en la regeneración de plantas
mediante embriogénesis somática. Cada
célula en cultivo es, de por sí, poten-
cialmente capaz de regenerar una plan-
ta completa. La eficiencia de este siste-
ma es superior a la regeneración a tra-
vés de organogénesis, con diferencia-
ción secuencial de brotes y raíces, me-
diante subcultivo. En condiciones apro-
piadas, se requiere solamente de uno o
dos subcultivos para lograr la inducción
embriogénica de numerosas células, que
se mantienen por lo general en matraces
(Figura 4.3). La eficiencia en la multipli-
cación puede ser aumentada, dada la ca-
racterística que muchos embriones du-
rante su ontogenia, expresan la forma-
ción de embriones adventicios; ello fren-
te a posibles desbalances hormonales y
condiciones del medio (Jordan y Velozo,
1996). Estos embriones pueden ser se-
parables y aumentar la biomasa resul-
tante. El uso de suspensiones celulares
81

ha sido relevante en la metodología con-
ducente a la poliembriogénesis y, en al-
gunos casos, ha servido directamente en
regeneración clonal de algunas especies
de Pinus (Dimantoglou y Banilas, 1996;
Fowke y Attre, 1996).
Entre las muchas otras ventajas de usar
suspensiones, está la de generar produc-
tos metabólicos, compuestos secunda-
rios y/o estructuras químicas activas
biológicamente, que no pueden ser sin-
tetizados químicamente. Ha sido posi-
ble derivar en líneas y condiciones de
cultivo que puedan maximizar la pro-
ducción de metabolitos específicos.
Igualmente, ha sido posible generar
compuestos metabólicos que no han
sido sintetizados bajo condiciones na-
turales y que pueden tener gran impor-
tancia a nivel medicinal (apoatropina).
De entre los ejemplos de metabolitos se-
cundarios cuya concentración produci-
da in vitro es mayor que en tejidos in-
tactos, se puede citar a: antraquinonas,
berberina, cafeína, saponinas de Gin-
seng, ácido rosmarínico, shikonina, ubi-
quinona 10 (Matsumoto et al., 1982).
Mediante cultivo de raíces se han pro-
ducido también nicotina, atropina, esco-
polamina e hiosciamina; igualmente en
concentraciones mayores que las raíces
in situ.
Con excepción de lo anterior, por lo ge-
neral la metodología es dirigida no tan-
to a la regeneración de células u órga-
nos a plantas, sino más bien dando prio-
ridad a la mantención del metabolismo
secundario, lo cual no favorece necesa-
riamente la regeneración. En estos ca-
sos, nuevamente, el uso de biorreactores
homologando condiciones in vitro apa-
recen de gran utilidad. La metodología
82
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
de uso de células como fuente de pro-
ductos bioquímicos de diferente natura-
leza, ha sido de gran aplicación biotec-
nológica y está profusamente descrita en
la literatura (Staba, 1980).
Las suspensiones celulares se han usa-
do también profusamente como unida-
des de selección in vitro a diversos pro-
ductos como toxinas, herbicidas y me-
tales pesados. Se postula que aquellas
células que son tolerantes a ciertos ni-
veles de compuestos tóxicos para la
planta madre de la cual provienen, pue-
den generar material más resistente y
conducir a plantas adultas con dicha
característica.
Una última ventaja del cultivo de célu-
las en suspensión, reside en el hecho
que las condiciones definidas para la re-
generación de células de una especie a
plantas, pueden ser aplicadas a aquellas
demandadas por protoplastos. Por nor-
ma general, transcurridos los procesos
críticos en cuanto a la viabilidad de pro-
toplastos, las condiciones definidas para
células pueden ser satisfactorias en la
fase de multiplicación celular de proto-
plastos, tratándose de material afín.
PROTOPLASTOS
Corresponden a células vegetales aisla-
das bajo condiciones de cultivo, que se
encuentran temporalmente desprovistas
de su pared celular. La posibilidad de
obtener, mantener y cultivar protoplastos
partió en la época de los años 1960
(Cocking, 1960) y en la década siguien-
te, ya estaban establecidos grandes
avances sobre aspectos básicos de ais-
lamiento y cultivo. (Cocking y Evans,
APLICACIONES DE LA TÉCNICA DE CULTIVO DE TEJIDOS
1973). La viabilidad de protoplastos resi-
de mayormente en las condiciones del
medio de cultivo, su tonicidad y compo-
sición. La delgada membrana plasmática
unitaria, bajo condiciones óptimas, man-
tiene la integridad de los organelos que
contiene; así como de sus funciones me-
tabólicas. Los protoplastos pueden rege-
nerar su pared si parte de sus compo-
nentes nutritivos están presentes o pue-
den ser resintetizados; por ejemplo, en
presencia de un conjunto de pentosas.
La importancia de los protoplastos es do-
ble; por un lado, son una evidencia adi-
cional de la “totipotencia celular”, pues
virtualmente pueden regenerarse plan-
tas a partir de cada protoplasto en parti-
cular, por lo que se les ha designado
como “protoclones”. En segundo lugar,
la posibilidad de usarlos como método
para lograr recombinaciones genéticas,
algunas no ocurrentes en la naturaleza
por incompatibilidad genética (Shiva-
nna, 1982). Más allá, está la posibilidad
de recombinar genes pertenecientes a
otras variedades, especies y plantas de
otro género o familia (fusiones interes-
pecíficas). La forma final aleatoria de re-
combinación genética, determina el pro-
ducto de fusión alcanzado.
Los productos de fusión, cuanto más cer-
canos en parentesco, tienen mayores
probabilidades de expresarse como cé-
lulas totipotentes, y emprender respues-
tas morfogénicas conducentes a plantas.
Sin embargo, es frecuente la inestabili-
dad cariotípica de los productos de fu-
sión (Chaleff, 1981).
Dado que es técnicamente factible jun-
tar dos protoplastos y fusionar estos, lo
que implica la mantención de las estruc-
turas y propiedades contenidas en el
citoplasma (aparte de mitocondrias y
plastidios), se crean fusiones con pro-
ductos diferentes a las fusiones gamé-
ticas; éstas se denominan “fusiones so-
máticas”. Cabe destacar que en las fusio-
nes gaméticas solo el óvulo participa
con su contenido citoplasmático; en fu-
siones somáticas el aporte es de ambas
células. De mayor importancia aún es la
situación de protoplastos haploides, los
cuales sirven como excelentes herra-
mientas para inducir mutaciones con o
sin fusión de otro material recombinante.
El aislamiento de protoplastos se logra a
partir de tejidos en activo crecimiento,
siendo igualmente importante contar
con material que provea de protoplastos
de tamaño homogéneo. Otro factor a
considerar es la presencia de ciertas ca-
racterísticas como tamaño o pigmenta-
ción como por ejemplo, las antociani-
nas; su presencia es práctica ya que pue-
den servir como indicador al fusionar
con protoplastos derivados de otra plan-
ta. El tejido u órgano elegido, primera-
mente se desinfecta y se coloca en solu-
ciones estériles, en presencia de agen-
tes osmóticos (manitol, sacarosa) en alta
concentración. El tratamiento consiste
en lograr plasmolizar el protoplasma,
contrayendo la plasmalema y separán-
dola de la pared celular. Bajo estas con-
diciones, se procede a subcultivar los te-
jidos en un medio similar, pero que con-
tiene las enzimas celulasa, pectinasa y
en algunos casos hemicelulasas (Ishii,
1989). Las primeras, proceden principal-
mente de Trichoderma viride, (con dife-
rentes nombres comerciales) junto a la
driselasa (derivada de Irpex lacteus). Las
pectinasas son obtenidas de Rhizopus
arrhizus, Aspergillus japonicus o Bacillus
83

polymyxa, mientras que las hemicelula-
sas provienen del caracol Helix pomatia
o de Aspergillus niger.
En cuanto a sus concentraciones, combi-
naciones de uso y tiempos de acción óp-
timos, junto a temperaturas y tipos de
explantes a tratar, son todas variables que
deben ser evaluadas. Existen diferencias
a considerar según sea el material, por
ejemplo, en gramíneas, a diferencia de
dicotiledóneas, donde las paredes con-
tienen además glucoarabinoxilanos, las
mezclas de celulasas con xilanasas y pec-
tiliasas fueron más eficientes para varios
cultivos (Ishii, 1989). La incubación con
enzimas resulta en la degradación de la
pared, cuyos restos son eliminados me-
diante centrifugación; así como posterior-
mente los remanentes de enzimas me-
diante varios subcultivos.
Con el objeto de efectuar la fusión y ob-
tención de recombinantes intraespecífi-
cos o interespecíficos, se procede en for-
ma paralela para los protoplastos de la
otra especie o planta a combinar. Finali-
Figura 4.4. Protoplastos de Carica pubescens y
C. papaya, previa fusión (izquierda) y fusionados (derecha).
84
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
zada esta etapa, se subcultivan ambas
alícuotas en forma separada, con un os-
mótico en menor concentración. Esto
permite regenerar la forma globular de
los protoplastos, a niveles de turgencia
que deben ser muy exactos, para así im-
pedir la ruptura celular por ingreso ex-
cesivo de agua y ruptura de la plasma-
lema (Figura 4.4).
Finalmente, se mezclan los medios fusio-
nantes con los protoplastos, pudiendo
aplicar las siguientes tecnologías pobla-
cionales o específicas para inducir su
fusión.
1. Electroporación y electrofusión, con la
cual se descarga temporalmente la car-
ga negativa interna debajo la membra-
na, la cual impide la fusión natural.
2. Agregando CaCl 2 , PEG ó Ca(NO 3 ) 2
con lo cual se logra agregación celu-
lar y fusión al azar.
3. Mediante métodos más específicos
como microinyección; que inmovili-
APLICACIONES DE LA TÉCNICA DE CULTIVO DE TEJIDOS

za un protoplasto por su superficie, (Jordan et al., 1986). En caso de que no

se procede a inyectar DNA, organelos
o núcleos de células deseadas, a tra-
vés de la plasmalema, bajo observa-
ción microscópica.
Otros métodos se indican en la Tabla 4.1.
La regeneración a partir de protoplastos,
procede en primer lugar, con la forma-
ción de la pared celular antes de que ocu-
rra una primera mitosis, e independien-
temente de que se haya procedido a la
modificación del genotipo mediante in-
serción de genes o cromosomas. Sin em-
bargo, dicha capacidad depende de las
compatibilidades derivadas del proceso
de arreglos y reintegración cromosomal
y de la capacidad de su expresión poste-
rior.
Es conocido el fenómeno que cuanto
más distante es el parentesco del mate-
rial a fusionar, existirá una menor pro-
babilidad de viabilidad y respuestas mor-
fogénicas. En algunos casos, como lo
han sido cruzamientos entre especies del
mismo género, incompatibles sexual-
mente, la fusión de protoplastos permi-
te la formación de estructuras globula-
res, semejante a embriones, pero que no
son capaces de continuar su desarrollo
existan limitaciones morfogénicas, la
regeneración a plantas completas pue-
de proceder. Lo más usual es a través de
organogénesis expresada en un conjun-
to celular o callo.
Durante las primeras fases de cultivo los
factores más importantes a ser conside-
rados son: la densidad de plaqueo, la
composición nutritiva del medio y tipo
de substrato (generalmente agarosa o
medio líquido en suspensión), las fito-
hormonas, la presión osmótica, la luz y
la temperatura. Para la inducción de em-
briogénesis u organogénesis es igualmen-
te importante: contar con un medio re-
generativo, provocar un descenso en la
osmomolaridad y cambios sucesivos de
medios y sus hormonas. En algunos ca-
sos se debe acompañar a los protoplastos
con células nodrizas (“nurse cultures“),
a modo de “condicionar el medio nutri-
tivo” con células en activo crecimiento,
(lo que la literatura ha indicado como
requerimiento metodológico en algunos
casos (Reinert y Yeoman, 1982; Kyozuka
et al., 1990)). Bajo condiciones adecua-
das, normalmente los protoplastos empie-
zan a dividirse a los 3-4 días, formando
colonias compactas con pequeñas célu-
las ricas en material citoplasmático.

Tabla 4.1. Técnicas de fusión de protoplastos y sus efectos principales.

• Espontânea Degradación enzimática de protoplastos (células) multinucleadas.

• Medios mecânicos Por presión o compresión (microinjección).
• Sales/Shock osmótico Na2NO3 a conc. 0,025 M provoca ”shock” desplasmolizante
• Ac. grasos y ésteres Fosfolípidos cargados positivamente atraen membranas.
• Iones Ca y alto pH Provocan leve lisis a membranas que no daña a los protoplastos.
• Dextran y D. sulfato Dextran de alto PM agrega y fusiona protoplastos.
• Alcohol Polivinílico Adhiere protoplastos sin afectar viabilidad.
• Polietilenglicol Adhiere protoplastos, usado para diferentes géneros y familias.
• Electrofusión Campos eléctricos de 5-10V, 500Hz y pulsos de 15V, 50 µseg.

85
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

Para aumentar la eficiencia en algunas tes. La incorporación de DNA de organe-

especies, el acompañamiento de las célu-
las nodrizas debe prolongarse hasta 10
días. La primera etapa de crecimiento
también es afectada por la densidad de
protoplastos, siendo la eficiencia de pla-
queo en el rango de 5 x 10 4 a 10 6.. Con-
centraciones inferiores reducen notable-
mente la eficiencia de plaqueo y desa-
rrollo posterior. A partir de 3-8 semanas,
es común ver la formación de nuevos
brotes a partir de callo, siendo kinetina y
zeatina importantes en esta respuesta.
Existen numerosas ventajas de la regene-
ración a partir de protoplastos recombi-
nados a fin de aumentar la variabilidad.
Por ejemplo, es también posible la gene-
ración de cíbridos en los cuales la recom-
binación de protoplastos no sólo conside-
ra recombinar material nuclear, sino tam-
bién posibilita optar por la incorporación
del DNA de cloroplastos y/o mitocondrías
de una o de las dos células recombinan-
los (como cloroplastos o mitocondrias),
hace factible manejar la expresión de di-
chos genes insertos en ellos. Por ejem-
plo, la obtención de esterilidad masculi-
na, factor importante en programas de
mejoramiento en maíz; resulta del con-
trol de un gen ubicado en mitocondrias.
A través del cultivo de protoplastos ha-
ploides (derivados de plantas haploides),
es posible también inducir mutaciones,
las cuales pueden derivar en plantas ho-
mocigotas (2n) en una sola generación.
Protoplastos y células haploides también
pueden ser usados en procesos de selec-
ción in vitro para determinar tolerancia
a toxinas de algunos microorganismos o
frente a metales pesados y diversos pro-
ductos químicos. Las principales fuentes
y técnicas conjuntas posibles de aplicar
para lograr aumentar la variabilidad ge-
nética en plantas, se encuentran resumi-
das en la Tabla 4.2.

Tabla 4.2. Metodologías aplicables a la obtención de variabilidad en plantas.

• Mutaciones inducidas (Rayos X, rayos gamma, radiación UV; mutágenos químicos.

• Variabilidad inherente detectable por cultivo de tejidos (variación somaclonal).
• Variación gametoclonal (†) mediante inducción de androgénesis y ginogénesis.
• Efectos combinados de caracteres de plantas haploides junto a mutagénesis.
• Cruzamientos dirigidos usando polen mutado (in vivo o in vitro).
• Cruzamientos con eliminación natural de cromosomas.
• Fusión simétrica de protoplastos (intraespecífica e interespecífica) in vitro.
• Cibridización (fusión asimétrica con eliminación de uno de los núcleos).
• Cibridización (fusión asimétrica con incorporación/eliminación de mitocondrias
y/o cloroplastos).
• Microinyección.
• Electroporación.
• Transferencia de genes (A.tumefaciens, A. rhizogenes, Biobalística).

(†)
La variación gametoclonal no añade nuevos genes al conjunto existente en la especie. La existencia de un solo juego
cromosomal (en plantas haploides), hace posible la expresión de algunos de ellos (normalmente recesivos), al ser elimi-
nado el efecto del alelo. De esta manera, la o las características de la expresión de variabilidad de algunos genes de-
seables, puede ser conservada por autoduplicación, siendo posible de su incorporación más fácilmente en programas
de mejoramiento.

86
APLICACIONES DE LA TÉCNICA DE CULTIVO DE TEJIDOS

SEMILLAS SINTÉTICAS Bajo condiciones óptimas, la técnica

Corresponde a embriones generados por
técnicas de embriogénesis somática que
a partir de cierto grado de desarrollo, son
encapsulados en compuestos gelifican-
tes que les aportan nutrientes y protec-
ción al desecamiento y de factores bió-
ticos/abióticos (Figura 4.5). Estas “semi-
llas” pueden tratarse, posteriormente,
como semillas naturales, procediéndose
a una siembra con desarrollo de plántu-
las en condiciones de vivero o de cam-
po. Las cubiertas gelificantes se refieren
principalmente a alginatos, que corres-
ponden a ácido algínico derivado de al-
gas (ácido manurónico y ácido glucuró-
nico), en forma de sal de sodio. Las so-
luciones de alginato gelifican posterior
aplicación de iones calcio, protegiendo
al embrión. En esta fase de gelificación,
es posible incorporar diversos produc-
tos fitosanitarios y/o nutrientes que esti-
mulan el crecimiento durante la germi-
nación (Redenbaugh et al., 1988).
permite el almacenaje de material selec-
cionado por períodos de tiempo consi-
derables sin que exista pérdida de via-
bilidad; ello de acuerdo a las caracte-
rísticas genéticas y metabólicas de la es-
pecie vegetal usada (Redenbaugh et al.,
1988). Las semillas sintéticas también
tienen la propiedad de proporcionar un
sistema rápido, barato y universal para
propagar material élite. Con igual obje-
tivo, ha sido también posible la encapsu-
lación con alginatos de ápices caulinares
de varias especies, que se mantienen
viables por períodos prolongados, utili-
zando para ello bajas temperaturas
(Lisek y Orlikowska, 2004). Con este
propósito, la encapsulación puede ser
complementada con posterior criopre-
servación en N 2 líquido, que en el caso
de suspensiones celulares embriogénicas
de cultivares y patrones de injerto de
Vitis spp., dan respuestas de sobreviven-
cia muy satisfactorias (Wang et al.,
2004).

Figura 4.5. Encapsulación de embriones somáticos de

C. pubescens en alginato. Izquierda, mantenidos a 25ºC
en placas tapadas con agar. Derecha, mantenidos a 4ºC
por 30 días. La baja temperatura deshidrata los geles y
reduce la viabilidad de los embriones encapsulados.

87

LIMITACIONES DE LA TÉCNICA
Variación somaclonal
La variación somaclonal es un fenóme-
no que se ha observado en protoplastos,
células en suspensión y explantes de ho-
jas, junto a otros tipos de material. Con-
siste en el aparecimiento, sin mediar
causa conocida, de efectos diversos que
pueden ser tanto heredables como no
heredables. Comúnmente, la variación
fenotípica y genotípica en las plantas re-
generadas, se observa al derivar de al-
gún cultivo celular (Larkin y Scowkroft,
1981). Se asume que pueden acontecer
cambios de carácter genético y epigené-
tico leves, en uno o más cromosomas.
Los cambios genéticos asociados con va-
riación somaclonal, corresponden a mu-
taciones de “punto”, cambios en el
cariotipo, cambios crípticos asociados
con rearreglos cromosomales, secuencia
alterada del número de copias, de ele-
mentos transposables, crossing-over so-
mático, intercambio de cromátidas her-
manas, amplification de DNA y deleción
(Jain y De Klerk, 1998). Al respecto, los
cambios de algunos caracteres en algu-
nas variantes, han sido referidos a
“locus” particulares con cambios en un
solo gen (Dennis et al., 1987). La res-
puesta puede ser diversa, pudiendo ma-
nifestarse tan simplemente en cambios
de expresión de pigmentación, o en for-
ma de una alta frecuencia de variación
en varias características hortícolas, co-
mo de resistencia a enfermedades. Así,
variantes somaclonales en el cv. de papa
Russet Burbank, presentan diferencias en
el crecimiento (de tipo compacto), cam-
bios en la fecha de floración y madura-
ción del tubérculo, en las característi-
88
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
cas del tubérculo y requerimientos de
fotoperíodo del cultivo. Igualmente, al-
gunos variantes somaclonales evidencia-
ron resistencia a pestes como Alternaria
solani y a Phytophtora infestans (Shep-
pard et al., 1980). En álamos, variantes
somaclonales de árboles híbridos mostra-
ron tolerancia aumentada al herbicida
solfometuron-metil (Michler y Haissig,
1988). Cambios en filotaxis han sido atri-
buidos igualmente a variación somaclo-
nal en olivo (Cañas et al., 1992). A pesar
de que el concepto de variación soma-
clonal apareció en la literatura en el año
1980, en el período de 10 años, numero-
sos reportes referidos a especies frutales,
evidenciaron la generalización de este fe-
nómeno como una nueva fuente de va-
riabilidad (Hammerschlag, 1992).
El material derivado con características
diferentes al material donante, se ha de-
nominado como “protoclones” y si deri-
van de “callo”, como “calliclones”. Es
común encontrar variación en la capa-
cidad morfogénica en callos que se han
mantenido por largo tiempo en subculti-
vo; el riesgo de inducción de variación
somaclonal en las plantas derivadas de
estos es bastante frecuente, afectando
también el origen del explante (Negrutiu
y Jacobs, 1978) y tratamientos iniciales
de 2,4-D en su condición embriogénica.
En callos de algunas especies manteni-
dos en forma indiferenciada (sin hormo-
nas), puede ocurrir mayor inestabilidad
genética (Orton, 1984). La variación
somaclonal también se observa en las
células provenientes de una misma hoja
(Brand y Lineberger, 1992), las cuales al
ser tratadas con enzimas degradativas de
la pared celular, presentan volúmenes
diferentes en suspensión, debiendo ser
APLICACIONES DE LA TÉCNICA DE CULTIVO DE TEJIDOS
idénticos (Larkin y Scowkroft, 1981;
Hammerschlag, 1992). Es común que los
brotes “de novo” regenerados a partir de
dichas células, muestren las diferencias
atribuibles a variación somaclonal, con-
sistente en la variación del patrón isoen-
zimático de varias enzimas, entre ellas,
peroxidasas, aminoaspartato-transami-
nasas, como se ha reportado en papas
(Figura 4.6) (Jordan et al., 1991). Como
resultante de la variación somaclonal,
existen regenerantes y productos varia-
dos como ser, plantas de tomate con fru-
tos de color amarillo o naranja, con re-
sistencia al hongo Fusarium y con cam-
bios estructurales morfológicos a nivel
del pedicelo. Dichas respuestas están
adscritas a cambios en los cromosomas
Nº 3 y 10 para la pigmentación y Nº 11
para los otros dos caracteres (Evans, co-
municación personal). Existen muchas
especies donde igualmente se ha demos-
trado la existencia de variación somaclo-
nal; especialmente en tabaco, caña de
azúcar, banana y Pelargonium, donde se
generó a través de esta vía una variedad
Figura 4.6. Variación somaclonal mediante
formación de brotes a partir de hojas en dos
clones de papa (Solanum tuberosum).
nueva. La selección y detección de va-
riantes somaclonales, especialmente en
especies leñosas, puede ser realizada en
microsporas o células haploides en caso
que los genes de utilidad sean expresa-
dos a nivel celular; entre ellos, aquellos
que codifican para tolerancia al estrés,
resistencia a algunos herbicidas y fito-
toxinas (Bonga et al., 1987).
Hiperhidratación (Vitrificación).
Como se ha advertido anteriormente, por
diversas razones del medio y del tipo de
explante, un desorden fisiológico de
"hiperhidratación" se produce en las cé-
lulas del explante, con lo que aumenta
la presión de turgencia celular. Adi-
cionalmente, también ocurre la ligni-
ficación y menor pigmentación de órga-
nos, como por ejemplo, de nuevos bro-
tes (Kevers et al., 2004). El fenómeno se
asocia a un mal funcionamiento de las
células estomatales y defectos en la
constitución de las paredes celulares
de las células epidérmicas. Al mismo
tiempo, estomas hiperhídricos eviden-
cian la presencia del polisacárido callo-
sa, que también se presenta en callos y
tejidos heridos, pero que no está presen-
te en estomas de hojas normales (Ziv y
Ariel, 1992). Lo contrario ocurre con el
nivel de inositol (Zimmerman y Cobb,
1989). El exceso de agua en las células
provoca comúnmente problemas en res-
puestas de diferenciación y deformacio-
nes a nivel tisular (Debergh et al., 1992;
Kevers, et al. 2004). Este tipo de plantas
son extremadamente difíciles de mani-
pular para su adaptación a condiciones
de vivero y ha significado pérdidas de
hasta un 60% en algunos cultivos duran-
t e l a m i c r o p r o p a g a c i ó n c o m e rc i a l
(Paques, 1991). El funcionamiento
89

estomatal tiende a normalizarse a medi-
da que se produce la aclimatización,
aunque en algunos casos, las hojas no
son funcionales y debe esperarse la
brotación de yemas con nuevo desarro-
llo foliar expresando “endurecimiento”
adaptativo al ambiente (Hammerschlag,
comunicación personal). Para evitar este
fenómeno, varios factores deben consi-
derarse y ser evaluados para cada culti-
vo, entre ellos: evitar condiciones de
cultivo deficientes, ajustar la humedad
relativa óptima alrededor del explante,
favorecer la transpiración del explante,
ajustar los potenciales hídricos del me-
dio y evaluar la composición de macro
y micronutrientes en el medio, junto con
la concentración de agar. Se han usado
con éxito varios productos comerciales
que inhiben fuertemente este efecto,
como lo son el agente anti-vitrificante
EM2, un gel que contiene pectina (M-
Gel) y extractos de polisacáridos en al-
gas marinas, algunos muy eficientes en
el cultivo de varias especies/híbridos de
Eucalyptus spp. normalmente muy afec-
tados por este fenómeno (Whitehouse et
al., 2002). La aclimatación implica ade-
más, correcto funcionamiento fotosinté-
tico, metabolismo de carbono y aumen-
to de enzimas de acción antioxidante
contra “especies activadas de oxígeno”,
t a l e s c o m o H 2 O 2 , O 2 * - y O H * ( Va n
Huylenbroeck y Debergh, 1996).
OBSERVACIONES FINALES
Paralelamente al avance del conoci-
miento sobre el potencial morfogénico
y capacidad regenerativa de diferentes
tipos de explantes de variadas especies,
se evidenció un substancial progreso
con el desarrollo de la tecnología del
DNA recombinante. Con ello, se esta-
90
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
blecieron bases fundamentales sobre la
regulación, expresión y recombinación
de genes. Lo anterior posibilitaría, que
a mediados de la década del 80, la
aplicación de la ingeniería genética, pu-
diera vincularse y emplearse directa-
mente con el mejoramiento no conven-
cional en especies vegetales de impor-
tancia económica. Sin embargo, cabe
destacar que si bien hoy día es posible
insertar y expresar un sinnúmero de
genes foráneos en plantas y modificar
éstas genéticamente en forma permanen-
te, la técnica de transformación y su éxi-
to, sigue dependiendo de la expresión
de la totipotencia celular del explante
experimental usado (protoplasto, célula
en suspensión, explante multicelular), y
de su potencial morfogénico in vitro, se-
gún la especie, conducente a la regene-
ración exitosa de una planta fértil y/o
que mantenga estables durante su
ontogenia y descendencia los caracte-
res de los genes insertos y/o modifica-
dos. Dichos aspectos no siempre han
sido resueltos sin necesidad de estudios
particulares, por ejemplo, se requirió de
un largo período de investigación para
hacer exitosa la transformación en va-
rias gramíneas (Vasil, comunicación per-
sonal) y otro tanto en lo concerniente a
especies leñosas, forestales y/o recalci-
trantes. En los capítulos siguientes, se
muestra el potencial de las herramien-
tas que ofrece la tecnología de DNA
recombinante, la posibilidad de insertar
genes junto a su detección a través de
i n g e n i e r í a g e n é t i c a y m a rc a d o r e s
moleculares en plantas superiores.
Un segundo punto que es importante
resaltar, se refiere al hecho que los pará-
metros generales conducente al creci-
miento, diferenciación, morfogénesis y
APLICACIONES DE LA TÉCNICA DE CULTIVO DE TEJIDOS
regeneración establecidos sobre la base
de algunas soluciones nutritivas, de re-
laciones hormonales entre unos pocos
compuestos y la adición de suplemen-
tos a los medios, es suficiente o tan uni-
versal en cuanto a requerimiento
metabólico. Ello permite alcanzar res-
puestas regenerativas en células, tejidos
y órganos de las especies más diversas,
específicas y particulares, sobre las cua-
les no se tienen a priori, mayores ante-
cedentes fisiológicos. Así, han sido
exitosos esfuerzos particulares realiza-
dos en diferentes países a fin de lograr
definir condiciones para iniciar respues-
tas inductivas y regenerativas de espe-
cies relevantes a su flora endémica en
particular. La composición de los varios
medios nutritivos y “addenda” hormo-
nales sustentan así la regeneración/pro-
pagación y saneamiento exitoso de mu-
chas especies, géneros o familias que
hasta ahora han sido de menor interés y
por ello menos conocidas en sus reque-
rimientos y respuestas. Así pueden ser
recuperadas a tiempo varias especies, las
que además de su endemismo, poseen
valor intrínseco como germoplasma,
condición de extinción, importancia
cultural y/o comercial y que a veces tan
escasa y únicas en el mundo. Ello es
particularmente frecuente en varios paí-
ses del continente americano, donde
ocurre sobreexplotación descontrolada
con pérdida irreversible de especies ape-
nas descritas. Tomando como un ejem-
plo la condición de Chile, consideran-
do una extensión longitudinal de 4000
Km. (diferentes latitudes), con grandes
variaciones altitudinales y aislamiento
geográfico, se tiene una flora con un alto
grado de endemismo. De allí, resulta
que, muchas especies relevantes, únicas
de la Región, son recursos valiosos con
propiedades medicinales, ornamentales,
frutales, forestales y/o culturales, que
han formado parte de la cultura y vida
de los habitantes pre-colombinos. Con
dicha valoración, se han emprendido a
la fecha, varios estudios conducentes a
obtener respuestas regenerativas en ta-
les especies, asociado al interés en el
patrimonio genético, recuperación de
germoplasma olvidado y material vege-
tal de gran valor, por hoy ya considera-
do en programas de mejoramiento a ni-
vel nacional e internacional.
Entre los géneros y/o especies chilenas
relevantes, donde ya se cuenta con an-
tecedentes de respuestas regenerativas
se han reportado las siguientes: Allium
spp. (Muñoz, et al., 1988; Tapia, 1996),
Aloysia spp. (Arancibia, 2002), Alstroe-
meria spp. (Lyon, 1991), Annona cheri-
mola (Jordan et al, 1990; 1991, Cama-
cho, 1991), Brassica spp. (Campos et al.,
1993), Corynabutilon spp. (Rodriguez,
1997), Cyphomandra betacea (Obando
et al., 1992; Obando, 1995, Obando y
Jordan, 2001), Drimys winteri (Jordan y
Cortés, 1981; Jordan, 1999), Euphorbia
spp. (Mancinelli et al., 1993), Fabiana
imbricata (Schmeda, et al., 2004),
Fragaria chiloensis (Mieres, 1997),
Fuchsia spp. (Banda, 1998; Chávez,
2002), Gevuina avellana (Grinbergs et
al., 1986), Gomortega keule (Calderón-
Baltierra et al., 1993), Haplopappus spp.
(Norambuena, 2001), Ipomoea batatas
(Tapia et al., 1997), Jubaea chilensis (Ca-
bello, 1990), Lapageria rosea (Jordan et
al., 1983; Seeemann, 1983), Leuco-
coryne spp. (Briones, 2003), Nothofagus
spp. (Jordan y Velozo, 1996; Pedraza,
2000; Cardemil, 2002), Pitavia punctata
(Araneda, 2002), Pouteria lucuma
(Jordan y Oyanedel, 1992; Jordan et al.
91

1994), Prosopis spp. (Jordan y Balboa,
1985); Puya spp. (Campos,1995),
Quillaja saponaria (Jordan y Roveraro,
2004), R h o d o p h i a l a s p p . ( B a s u a l t o ,
2001; Lever, 2001; Ferrando, 2002),
Solanum muricatum (Jordan, 1996),
Solanum tuberosum (Jordan et al., 1991;
Leppe, 1993), Solidago chilensis
(Schmeda et al, 2005), Sophora toromiro
(Iturriaga et al, 1994; Jordan et al.,
2001), Triticum aestivum (Hewstone et
al., 1990; 1992), Ugni molinae (Aven-
daño, 1998; Martínez, 2002), Ullucus
tuberosus (Jordan, et al. 2002).
Se asume que la comunidad científica
reconoce la importancia de este patri-
monio y concuerda que es necesario
conservar la biodiversidad, protegiendo
los recursos nativos a la par del proceso
productivo.
92
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
REFERENCIAS
Arancibia, E. 2002. Evaluación de la capaci-
dad rizogénica in vitro de cedrón (Aloysia
tripilla (L’Herit) Britt.). Tesis Ingeniero Agró-
nomo. Universidad de Talca, Talca, Chile.
Araneda, M. 2002. Alternativas de recuperación
de una especie en peligro de extinción me-
diante cultivo y multiplicación in vitro. El
caso de Pitavia punctata (R. et P.) Mol.
[pitao]. Tesis Ingeniero Forestal, Universidad
de Concepción, Concepción, Chile.
Avendaño, C. 1998. Multiplicación por esta-
cas y cultivo in vitro de murtilla (Ugni
molinae Turcz). Tesis Ingeniero Agrónomo,
Universidad Santo Tomas, Santiago, Chile.
Bajaj, Y. 1990. Induction of haploids, pollen
embryogenesis, ultrastructure, and genetic
stability. pp. 3-44. In: Bajaj, Y. (ed.). Ha-
ploids in crop improvement I, Biotechnology
in Agriculture and Forestry 12. Springer-
Verlag, Berlin-Heidelberg, Germany.
Banda, J. 2001. Propagación por estacas y cul-
tivo in vitro de chilco (Fuchsia magellanica
Lam. var. magellanica). Tesis Ingeniero
Agrónomo, Universidad Santo Tomas, San-
tiago, 1998.
Basualto, A. 2001. Propagación vegetativa in
vitro de Rhodophiala montana (Phil.) Traub.
Tesis Ingeniero Agrónomo, U. de Talca,
Talca, Chile.
Bonga, J., von Aderkas, P. y James, D. 1987. Po-
tential application of haploid cultures of tree
species. pp. 57-77. In: Hanover, J. y Keathley,
D. (eds.). Genetic Manipulation of Woody
Plants, Plenum Press, New York, USA.
Brand, M. y Lineberger, R. 1992. Micropropa-
gation of american sweetgum (Liquidambar
styraciflua L). pp. 3-24. In: Bajaj, Y. (ed.).
Biotechnology in Agriculture and Forestry
18, High-tech and Micropropagation II.
Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, Ger-
many.
APLICACIONES DE LA TÉCNICA DE CULTIVO DE TEJIDOS
Briones, C. 2003. Métodos de esterilización y
efectos ambientales sobre el crecimiento de
bulbos Leucocoryne sp. en cultivo in vitro.
Tesis Ingeniero Agrónomo, Pontificia Uni-
versidad Católica de Chile, Santiago, Chile.
Cabello, A. 1990. Antecedentes sobre la germi-
nación y el cultivo in vitro de la palma chi-
lena (Jubaea chilensis (Mol.) Baillon). Cien-
cias Forestales 6:3-21.
Calderón-Baltierra, X., Perez, F. y Rotella, A.
1993. Micropropagación de una especie
chilena en peligro de extinción Gomortega
keule (Mol.) Baillon (Magnoliopsidae,
Gomortegaceae). Bosque 14:23-28.
Camacho, H. 1991. Evaluación de cuatro pro-
tocolos de desinfección del material vege-
tal para el establecimiento in vitro de ápi-
ces de chirimoyo (Annona cherimola Mill.),
sobre dos medios basales y dos combina-
ciones hormonales. Tesis Ingeniero Agró-
nomo, Pontificia Univerdidad Católica de
Valparaíso, Quillota, Chile.
Campos, H., Muñoz, C. y Ohkawa, Y. 1993.
Cultivo in vitro de microsporas y produc-
ción de embriones androgénicos en raps
(Brassica napus) [genotipos: Rapanui,
Gulliver, Mikado]. Agro Sur 21:10-18.
Campos, J. 1995. Cultivo in vitro en el género
Puya [Bromeliaceae]. Tesis Ingeniero Agró-
nomo, Universidad de Concepción,
Chillán, Chile.
Cañas, L., Avila, J., Vicente, M. y Benbadis. A.
1992. Micropropagation of olive (Olea eu-
ropea L). pp. 493-505. In: Bajaj, Y. (ed.).
Biotechnology in Agriculture and Forestry
18, High-tech and Micropropagation II.
Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, Ger-
many.
Cardemil, L. y Jordan, M. 1982. Light and elec-
tron microscopic study of in vitro cultured
female gametophyte of Araucaria araucana
(Mol.) Koch seeds. Z. Pflanzenphysiologie
107:329-338.
Cardemil, C. 2002. Enraizamiento in vitro de
tres especies de Nothofagus endémicas
[ruil, hualo, huala] de la zona mesomórfica
de Chile. Tesis Ingeniero Agrónomo, Uni-
versidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.
Chaleff, R. 1981. Genetics of Higher Plants.
Cambridge University Press, Cambridge,
England.
Chavez, V. y Litz, R. 1999. Organogenesis from
megagametophyte and zygotic embryo
explants of the gymnosperm Dioon edule
Lindley. Plant Cell Tissue and Organ Culture
58:219-222.
Chavez, V. 2002. Cultivo in vitro y aclimatiza-
cion de Fuchsia magellanica. Lam y Fucsia
lycioides Andr.. Tesis Ingeniero Agrónomo,
U. Santo Tomas, Santiago, Chile.
Chen, C. y Chen, C. 1980. Changes in chromo-
some number in microspore callus of rice
during successive subcultures. Can. J.
Genet. Cytol. 22:607-614.
Cocking, E. 1960. A method for the isolation
of plant protoplasts and vacuoles. Nature
187:927-929.
Cocking, E. y Evans, P. 1973. The isolation of
protoplasts. pp. 100-120. In: Street, H. (ed.).
Plant Tissue and Cell Culture. Blackwell Sci.
Publications, Oxford, England.
D´Amato, F. 1977. Cytogenetics of
differentiation in tissue and cell cultures.
pp. 334-357. In: Reinert J. y Bajaj Y. (eds.).
Applied and fundamental aspects of plant
cell, tissue, and organ culture. Springer-
Verlag, Berlin-Heidelberg. New York, USA.
Day, A. y Ellis, T. 1984. Chloroplast DNA dele-
tions with wheat plants regenerated from
pollen. Possible basis for maternal inheri-
tance of chloroplasts. Cell 30:359-368.
Debergh, P., Aitken-Christie, J., Cohen, D.,
Grout, B. Von Arnold S., Zimmerman, R. y
Ziv, M. 1992. Reconsideration of the term
“vitrification” as used in micropropagation.
Plant Cell Tissue and Organ Culture 30:135-
140.
93

Dennis, E., Bretell, R. y Peacock, W. 1987. A
tissue culture induced Adh 1 null mutant
maize results from a single base change.
Molec. Gen. Genet. 210: 181-183.
De Paepe, R., Prat, D. y Huget, T. 1982.
Heritable nuclear DNA changes in doubled
haploid plants obtained by pollen culture
of Nicotiana sylvestris. Plant Sci. Lett. 18:
11-28.
Dimantoglou, S y Banilas, G. 1996. Pinus pinea
L. (stone pine) and Pinus halepensis Mill.
(Aleppo pine). pp. 389-406. In: Bajaj, Y.
(ed.). Biotechnology in Agriculture and
Forestry 35. Trees IV. Springer-Verlag,
Berlin-Heidelberg, Germany.
Ferrando, M. 2002. Multiplicación in vitro de
las especies Rhodophiala montana (Phil.)
Traub.[añañuca de las montañas],
Rhodophiala rhodolirion (Baker) Traub.
[añanuca de la cordillera] y Rhodophiala
splendens (Rengifo) Traub [añañuca
esplendorosa]. Tesis Ingeniero Agrónomo,
U. Austral de Chile, Valdivia, Chile.
Fowke, L. y Attree, S. 1996. Conifer somatic
embryogenesis: studies of embryo develop-
ment and the cell biology of conifer cells
and protoplasts. Plant Tissue Culture and
Biotechnology 2:124-125.
Germaná, M. y Chiancone, B. 2001. Gynoge-
netic haploids of Citrus after in vitro polli-
nation with triploid pollen grains. Plant
Cell, Tissue and Organ Culture 66:59-66.
Grinbergs, J., Valenzuela, E. y Ramirez, C. 1986.
Germinación in vitro de Gevuina avellana
Mol. (Proteacea). Bosque 7:95-101.
Grout, B. y Roberts, A. 1995. Storage of free
pollen, pollen embryos and the zygotic
embryos of seed by criopreservation and
freeze drying. pp. 63-75. In: Grout, B. (ed.).
Genetic Preservation of Plant Cells in Vitro.
Springer-Verlag, Berlin, Germany.
Haines, R. 1994. Biotechnology in Forest Tree
Improvement. FAO Forestry Paper 118,
Rome, Italy.
94
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
Hammerschlag, F. 1992. Somaclonal Variation.
pp. 35-55. In: Hammerschlag, F. y Litz, R.
(eds.). Biotechnology of perennial fruit crops.
CAB - International, Wallingford, U.K.
Hewstone, N., Muñoz, C. y Cortázar, R. 1990.
Método de cultivo de anteras y capacidad
androgénica de germoplasma chileno de
trigo. Agricultura Técnica 50:130-138
Hewstone, N., Nitsch, C., Hewstone, C. y
Muñoz, C. 1992. Uso del gametocida
Hybrex para aumentar la androgénesis en
trigo. Agricultura Técnica 52:101-104.
Ibaraki, Y. y Kurata, K. 2001. Automatization
of somatic embryo production. Plant Cell
Tissue and Organ Culture 65:179-199.
Ingram, D. 1973. Growth of plant parasites in
tissue culture. pp. 392-421. In: Street, H.
(ed.). Plant Tissue and Cell Culture.
Blackwell Scientific Publications, Oxford,
England.
Ishii, S. 1989. Enzymes for the isolation of
protoplasts. pp. 23-33. In: Bajaj, Y. (ed.).
Biotechnology in Agriculture and Forestry 8.
Plant Protoplasts and Genetic Engineering I.
Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg, Germa-
ny.
Iturriaga, L., Jordan, M., Roveraro, C. y Goreux,
A. 1994. In vitro culture of Sophora toro-
miro (Papilionaceae), an endangered spe-
cies. Plant Cell, Tissue and Organ Culture
37:201-204.
Jain, S. y De Klerk, G. 1998. Somaclonal va-
riation in breeding and propagation of or-
namental crops. Plant Tissue Culture and
Biotechnology 4:63-75.
Jordan, M. y Cortés, I. 1981. Shoot organoge-
nesis in tissue culture of Drimys winteri.
Plant Sci. Letters 23:177-180.
Jordan, M., Cortés, I. y Montenegro, G. 1983.
Regeneration of Lapageria rosea plantlets
through tissue culture (Family Philesiaceae).
Gartenbauwissenschaft 48:97-100.
APLICACIONES DE LA TÉCNICA DE CULTIVO DE TEJIDOS
Jordan, M., Montenegro, G. y Apablaza, G.
1983. Regeneración de plántulas de seis cul-
tivares de papa libres de virus X por cultivo
de ápices caulinares y tratamientos de Vira-
zole in vitro. Ciencia e Investigación Agra-
ria 10:249-256.
Jordan, M. y Balboa, O. 1985. In vitro regene-
ration of Prosopis tamarugo Phil. and Proso-
pis chilensis (Mol.) Stuntz from nodal sec-
tions. Gartenbauwissenschaft 50:138-142.
Jordan, M., Ciudad, G., Rojas, M. y Valverde,
F. 1986. Isolation, culture and fusion of Ca-
rica candamarcensis and C. papaya proto-
plasts. Gartenbauwissenschaft 51:175-178.
Jordan, M., Arce, P. y Roveraro, C. 1990. Micro-
propagacion in vitro de algunas especies
frutícolas de Chile. Ciencia e Investigación
Agraria 17:111-116.
Jordan, M., Roveraro, C., Stipo, A., Aguirre, J.,
Velásquez, L., y Tesser, B. 1991. Inducción
de variantes somaclonales y transformación
en papa (Solanum tuberosum) empleando
Agrobacterium tumefaciens. Ciencia e In-
vestigación Agraria 18:129-136.
Jordan, M., Iturriaga, L., Roveraro, C. y Goreux,
A. 1991. Promotion of Annona cherimola
in vitro shoot morphogenesis as influenced
by antioxidants. Gartenbauwissenschaft
56:224-227.
Jordan, M. y Oyanedel, E. 1992. Regeneration
of Pouteria lucuma (Sapotaceae) plants in
vitro. Plant Cell Tissue and Organ Culture
31:249-252.
Jordan, M., Valenzuela, M. y Velozo, J. 1994.
Respuestas androgénicas en anteras de
lúcumo (Pouteria lucuma (T. et Pav.) O. Kze.
Ciencia e Investigación Agraria 21:53-58.
Jordan, M. 1996. Respuestas morfogénicas y
de transformación en pepino dulce (Sola-
num muricatum). Ciencia e Investigación
Agraria 23:47-52.
Jordan, M. y Velozo, J. 1996. Improvement of
somatic embryogenesis in Highland-Papa-
ya cell suspensions. Plant Cell Tissue and
Organ Culture 44:189-194.
Jordan, M., Velozo, J. y Sabja, A. 1996. Orga-
nogenesis in vitro of Nothofagus alpina (P.et
E.)Oerst. Fagaceae. Plant Cell Reports
15:795-798.
Jordan, M. 1999. Morphogenic responses and
in vitro regeneration of canelo (Drimys
winteri J.R. et Forster), a forest species used
in chilean traditional medicine. Acta
Horticulturae 502:289-294.
Jordan, M., Larraín, M., Tapia, A. y Roveraro,
C. 2001. In vitro regeneration of Sophora
toromiro using seedling explants. Plant Cell
Tissue and Organ Culture 66:89-95.
Jordan, M., Amenábar, A. y Roveraro, C. 2002.
Rapid in vitro propagation and microtuber
production in Ullucus tuberosus (Basella-
ceae). Gartenbauwissenschaft 67:50-54.
Jordan, M. y Roveraro, C. 2004. In vitro culture
of Quillaja saponaria Mol. (Soap-Bark Tree),
Rosaceae. Europ. J. Hort. Sci. 69:73-78.
Kasha K. y Kao, K. 1970. High frequency
haploid production in barley (Hordeum
vulgare L.). Nature 225:874-876.
Kevers, C., Frank, T., Strasser, R., Dommes, J. y
Gaspar, T. 2004. Hyperhydricity of micro-
propagated shoots: a typically stress-
induced change of physiological state. Plant
Cell Tissue and Organ Culture 77:181-191.
Konzak, C., Randolph, L. y Jensen, L. 1951. Em-
bryo culture of barley species hybrids. Cyto-
logical studies of Hordeum sativum x Hor-
deum bulbosum. J. Heredity 42:125-134.
Kyozuka, J., Shimamoto, K. y Ogura, H. 1990.
Regeneration of plants from rice protoplasts.
pp. 109-123. In: Bajaj, Y. (ed.). Biotech-
nology in Agriculture and Forestry 8. Plant
protoplasts and genetic engineering I. Springer
- Verlag, Berlin - Heidelberg, Germany.
95

Larkin, P. y Scowkroft, W. 1981. Somaclonal
variation- a novel source of variability from
cell cultures for plant improvement. Theor.
Appl. Genet. 60:197-214.
Leppe, A. 1993. Producción de plantas transgé-
nicas de papa (Solanum tuberosum) resis-
tentes a Erwinia sp. mediante técnicas de
ingeniería genética con Agrobacterium
tumefaciens. Tesis Ingeniero Agrónomo.
Pontificia Universidad Católica de Chile,
Santiago, Chile.
Lever, C. 2001. Propagación in vitro de Rhodo-
phiala splendens (Phil.) [añañuca] una
bulbosa nativa de Chile, en condiciones
mixotróficas. Tesis Ineniero Agrónomo.
Universidad de Talca, Talca, Chile.
Lisek, A. y Orlikowska, T. 2004. In vitro storage
of strawberry and raspberry in calciumalgi-
nate beads at 4ºC. Plant Cell Tissue and
Organ Culture 78:167-172.
Lyon, G. 1991. Bases biológicas para la rege-
neración in vitro de Alstroemeria. Tesis In-
geniero Agrónomo. Pontificia Universidad
Católica de Chile, Santiago, Chile.
Mancinelli, P., Gnecco, D., Pooley, T. , Cama-
ño, D. y Beratto, V. 1993. Cultivo in vitro
de Euphorbia lactuflua Phil. y Euphorbia
copiapina Phil. (Euphorbiaceae). Gayana
Botanica 50:41-46.
Manshardt, R. 1992. Papaya, In: Hammer-
schlag, F. y Litz, R. (eds.). Biotechnology of
Perennial Fruit Crops. Biotechnology in
Agriculture Nº 8, CAB-International.
Wallingford, UK.
Martinez, M. 2002. Comparación de dos mé-
todos de transmisión in vitro del fitoplasma
causante de escoba de bruja en plantas de
murta (Ugni molinae Turcz). Tesis Ingenie-
ro Agrónomo, Universidad Austral de Chi-
le, Valdivia, Chile.
96
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
Matsumoto, T., Ikeda, T., Okimura, C., Obi, Y.,
Kisaki, T. y Noguchi, M. 1982. Production
of ubiquinone 10 (UQ-10) by UQ highly
producing strains selected by a cell cloning
technique. pp. 275-276. In: Fujiwara, A.
(ed.). Plant Tissue Culture 1982, 5th
International Congress of Plant Tissue and
Cell Culture. Maruzen Co., Tokyo, Japan.
Maynard, C. 1988. Interaction between cloning
success and forest tree improvement, pp.
335-347. In: Valentine, F. (ed.). Forest and
Crop Biotechnology. Springer- Verlag, New-
York, USA.
Michler C. y Haissig, B. 1988. Increased herbi-
cide tolerance of in vitro selected hybrid
poplar. pp. 183-189. In: Ahuja, M. (ed.).
Somatic Cell Genetics of Woody Plants.
Kluver, Dordrech, The Netherlands.
Mieres, M. 1997. Propagación in vitro de frutilla
blanca chilena (Fragaria chiloensis L.
Duchesne). Tesis Ingeniero Agrónomo, Uni-
versidad de Concepción, Chillán, Chile.
Muñoz, C., Escaff, M. e Izquierdo, J. 1988. Ma-
nual de intercambio y manejo de germo-
plasma in vitro de ajo (Allium sativum L.).
FAO-Oficina Regional para America Latina
y el Caribe. FAO-INIA, Santiago, Chile.
Nagmani R. y Bonga, J. 1985. Embryogenesis
in subcultured callus of Larix deciduas. Can.
J. For. Res. 15:1008-1091.
Negrutiu, I. y Jacobs, M. 1978. Regeneration
of the morphogenetic capacity in long-term
callus cultures of Arabidopsis thaliana: The
origin of the explant. Z. Pflanzenphysiologie
90:363-372.
Norambuena, M. 2001. Propagación germina-
tiva de Haplopappus multifolius y Haplo-
pappus taeda. Tesis Ingeniero Agrónomo,
Universidad de Talca, Talca, Chile.
Orton, T. 1984. Chapter 9: Celery. pp. 243-267.
In: Sharp et al. (eds). Handbook of Plant Cell
Culture. McMillan, New York, USA.
APLICACIONES DE LA TÉCNICA DE CULTIVO DE TEJIDOS
Obando, M., Goreux, A. y Jordan, M. 1992.
Regeneracion in vitro de Cyphomandra
betacea (Tamarillo), una especie frutal
andina. Ciencia e Investigación Agraria
19:125-130.
Obando, M. 1995. Potencial de Regeneración
in vitro y Transformación Genetica de
Cyphomandra betacea (Cav.)Sendt. un Fru-
tal Andino. Tesis Magister Sciences, Univer-
sidad Austral, Valdivia, Chile.
Obando M. y Jordan, M. 2001. Regenerative
responses of Cyphomandra betacea (Cav.)
Sendt. (tamarillo) cultivated in vitro. Acta
Horticulturae 560:429-432.
Paques, M. 1991. Vitrification and micropropa-
gation: causes, remedies and prospects.
Acta Horticulturae 319:95-100.
Pedraza, M. 2000. Propagación in vitro de
Nothofagus alpina (Poepp. et Endl) Oerst.
[raulí] a partir de embriones aislados. Tesis
Ingeniero Forestal, Universidad de Concep-
ción, Concepción, Chile.
Raghavan, V. y Srivastava, P. 1982. Embryo
Culture. pp. 195-230. In: Johri, B. (ed.). Ex-
perimental embryology of vascular plants.
Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg, Germany.
Raven, P., Evert, R. y Eichhorn, S. 1999. Biology
of Plants, W.H. Freeman & Company/Worth
Publishers, New York, USA.
Redenbaugh, K., Slade, D., Viss, P. y Kossler, M.
1988. Artificial Seeds: Encapsulation of
somatic embryos. pp. 400-419. In: Valentine,
F. (ed.). Forest and Crop Biotechnology,
Springer-Verlag, New York, USA.
Reinert, K. y Yeoman, M. 1982. Plant Cell and
Tissue Culture. Springer-Verlag, Berlin-
Heidelberg, Germany.
Rodríguez, C. 1997. Cultivo in vitro de especies
vegetales nativas chilenas en peligro de ex-
tinción: Corynabutilon ochsenii Phil., Lobelia
bridgessii Hook. et Arn. y Valdivia gayana
Remy. Tesis Ingeniero Agrónomo. Universi-
dad Austral de Chile, Valdivia, Chile.
Schmeda, G., Jordan, M., Gerth, D., Wilken,
E., Hormazábal, F. y Tapia, A. 2004.
Secondary metabolite content in Fabiana
imbricata plants and in vitro cultures. Z.
Naturforschung 59c:48-54.
Schmeda, G., Jordan, M., Gerth, A. y Wilken,
D. 2005. Secondary metabolite content in
rhizomes, callus cultures and in vitro
regenerated plantlets of Solidago chilensis.
Z. Naturforschung 60c, 5-10.
Seemann, P. 1983. Propagacion in vitro del
copihue (Lapageria rosea Ruiz et Pav). Agro
Sur 11:130-134.
Sheppard, J., Bidney, D. y Shahin, E. 1980.
Potato protoplasts in crop improvement.
Science 208:17-24.
Shivanna K. 1982. Pollen-pistil interaction and
control of fertilization. pp. 131-174. In:
Johri, B. (ed.). Experimental embryology of
vascular plants. Springer-Verlag, Berlin-
Heidelberg, Germany.
Smith, D. 1997. The role of in vitro methods in
pine plantation establishment: the lesson
from New Zealand. Plant Tissue Culture and
Biotechnology 3:63-73.
Staba, E. 1980. Secondary metabolism and
biotransformation. pp.59-97. In: Staba, E.
(ed.). Plant Tissue Culture as a Source of
Biochemicals. CRC Press, Boca Raton, USA.
Tapia, M. 1996. Inducción de callo, organogé-
nesis y regeneración in vitro de plantas de
ajo (Allium sativum L.). Agro-Ciencia
12:149-154.
Tapia, M., Wilckens, R. y Campos, L. 1997.
Regeneración y organogénesis in vitro de
plantas de camote (Ipomoea batatas L.
(Lam)) presentes en Chile. Agro-Ciencia
13:143-148.
Van Huylenbroeck, J. y Debergh, P. 1996.
Physiological aspects in acclimatization of
micropropagated plantlets. Plant Tissue
Culture and Biotechnology 2:136-141.
97

Wang, Q., Mawassi, M., Sahar,N., Li, P., Colova-
Tsolova, V., Gafny, R., Sela, I., Tanne, E. y
Perl, A. 2004. Cryopreservation of grapevine
(Vitis spp.) embryogenic cell suspensions by
encapsulation-vitrification. Plant Cell Tissue
and Organ Culture 77:267-275.
Whitehouse, A., Marks, T. y Edwards, G. 2002.
Control of hyperhydricity in Eucalyptus
axillary shoot cultures grown in liquid
medium. Plant Cell Tissue and Organ
Culture 71:245-252.
Withers, L. 1985. Cryopreservation and storage
of germplasm. pp.169-191. In: Dixon, A.
(ed.). Plant Cell Culture - A Practical
Approach. IRL Press, Oxford, England.
Wood, K. 1985. Tissue culture methods in
phytopathology I – Viruses. pp. 193-214. In:
Dixon, A. (ed.). Plant Cell Culture a Practical
Approach. IRL Press, Oxford, England.
Yang, H. y Zhou, C. 1990. In vitro gynogenesis.
In: Bhojani, S. (ed.). Plant Tissue Culture,
Applications and Limitations. Elsevier
Science Publishers, New York, USA.
98
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
Zhang, Y. y Lespinasse, Y. 1992. Haploidy. pp.
57-75. In: Hammerschlag, F. y Litz, R. (eds.).
Biotechnology of Perennial Fruit Crops,
Biotechnology of Agriculture Series Nº 8.
CAB International, Wallingford, U.K.
Ziauddin, A. y Kasha, K. 1990. Genetic stability
in haploid cell cultures. pp. 83-98. In: Bajaj,
Y. (ed.). Biotechnology in Agriculture and
Forestry 12. Haploids in crop improvement
I. Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg,
Germany.
Zimmerman, T. y Cobb, B. 1989. Vitrification
and soluble carbohydrate levels in Petunia
leaves as influenced by media, Gelrite and
glucose concentrations. Plant. Cell Rep.
8:358-360.
Ziv, M. y Ariel, T. 1992. On the relation between
vitrification and stomatal cell wall deformity
in carnation. Acta Horticulturae 314:121-
129.
TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE

CAPÍTULO 5

TECNOLOGÍA DEL DNA

RECOMBINANTE Humberto Prieto E.

INTRODUCCIÓN EL FUNCIONAMIENTO
BÁSICO DE UN GEN.

L a década de los setenta representó

una revolución en todos los labora-
torios del mundo. Fue durante esta épo-
Estructura del material genético.
En 1953, James Watson y Francis Crick
ca, en la que todos los conocimientos
publican un detallado modelo de la es-
de la biología molecular surgieron rápi-
tructura del DNA, la molécula heredita-
damente a su aplicación masiva. Todo
ria de la vida. Se sabía, por trabajos ya
esto, debido al inmenso fondo de cono-
realizados por Phobeus Levene, que el
cimientos que se venía generando des-
DNA estaba compuesto por grupos fosfa-
de los años de la post-Segunda Guerra
to unidos a grupos de azúcar del tipo de-
mundial. El avance científico en áreas
soxirribosa, los que a su vez estaban uni-
como la genética, bioquímica, biología
dos a una base nitrogenada. Esta base
celular y la físico-química, convergieron
puede ser de un grupo de cuatro posi-
en la aparición de la tecnología del DNA
bles: dos del tipo purina (adenina (A) y
recombinante. Esta tecnología, se esta-
guanina (G)) y dos del tipo pirimidina (ti-
bleció cooperativamente en los laborato-
mina (T) y citocina (C)). El conjunto cons-
rios de Stanley Cohen, Paul Berg y Her-
tituido por un grupo tri-fosfato, un azú-
bert Boyer. De esta forma, genes especí-
car y una base nitrogenada, se denomi-
ficos comenzaron a ser aislados (lo que
na nucleósido. Para formar una cadena
se conoce como clonamiento) y manipu-
de DNA, los nucleósidos son unidos en-
lados (proceso de sub-clonamiento), de
tre sí, en serie. Esto quiere decir, desde
forma tal de hacerlos funcionales fuera
un fosfato hacia un azúcar y luego al
de su fuente de origen, lo que se logra-
fosfato siguiente, enlace repetido a tra-
ba generalmente en esa época, en bac-
vés de toda la cadena y denominado
terias.
fosfodiéster, formando una hebra simple
del DNA. Una vez insertados y forman-
Para entender cómo se llegó a esta re-
do esta cadena simple, los nucleósidos
volución, revisaremos algunos elemen-
tri-fosfato se denominan nucleótidos, o
tos que serán clave para entender la tec-
simplemente bases nucleotídicas (Figura
nología del mejoramiento genético por
5.1). Comúnmente, el tamaño o largo del
transgenia en plantas.
DNA es referido en términos de bases de
nucleótidos o simplemente bases. De esta
forma, el DNA puede variar su tamaño
desde unas pocas bases, algunos miles de
nucleótidos (kilobases) o megas de
nucleótidos (megabases).

99

O O
H3C
O P O CH2
O TIMINA
H H
FOSFATO
H H
OH H
AZÚCAR
Figura 5.1. Nucleósidos tri-fosfato: Adenina, Timina, Guanina y Citosina
se unen al grupo azúcar en la estructura básica del DNA. A su vez, estos
se unen con unidades similares mediante el grupo fosfato.
Inicialmente, Levene predijo que el DNA
tenía una secuencia repetitiva de nu-
cleótidos, por ejemplo AGTCAGTC. Sin
embargo, se intuía que el DNA debía ser
inteligente y este ordenamiento repeti-
tivo no cumpliría con la misión de lle-
var toda la información que necesita la
célula y los organismos vivos. Además,
ya se había demostrado por Erwin Char-
gaff, que las abundancias relativas de los
cuatro nucleótidos en distintas células,
tanto eucariontes como procariontes, no
estaban en una razón estequiométrica
(1:1:1:1). Más bien, estos resultados in-
dicaban que, sorprendentemente, el
contenido de G era similar al de C y,
correspondientemente, el contenido de
A era muy próximo al contenido de T.
En forma casi simultánea, Linus Pauling,
trabajando en el Cal Tech, desarrolla una
poderosa herramienta: la cristalografía
de rayos X. Watson y Crick tomaron los
procedimientos que Pauling utilizaba en
sus estudios de estructura de las proteí-
nas cristalizadas y los aplicaron al DNA.
Cuando un grupo de rayos X son dirigi-
dos hacia un conjunto de átomos crista-
lizados y chocan con ellos, estos son
desviados de forma tal que colisionan
entre sí, generando puntos de diferentes
intensidades al ser colectados en una
100
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
NH 2
N
N
N N O
NH
ADENINA N
NH
O
N
N NH 2
NH2 GUANINA
N
N O
CITOSINA
película fotográfica. Maurice Wilkins y
Rosalind Franklin realizaron este tipo de
experimentos con preparaciones de
DNA semi-cristalino, obteniendo imáge-
nes claves para que Watson y Crick in-
terpretaran los patrones de difracción de
estas moléculas. Ellos realizaron medi-
ciones y cálculos desde estas fotografías
(autorradiografías), fascinados por la si-
metría que ellas mostraban. Así final-
mente, se aventuraron a postular que el
DNA tenía una estructura de doble héli-
ce (dos hebras de DNA), con los grupos
fosfato orientados hacia fuera de esta
hélice. También, determinaron las di-
mensiones básicas de esta estructura,
como ancho y ángulo de alguno de los
enlaces entre los grupos que componían
los nucleótidos.
Pese a estos resultados, estos estudios no
podían informar cómo ambas hebras de
DNA estaban unidas. Pauling, con gran
conocimiento de química orgánica y de
estructura de proteínas, había propuesto
el modelo de una triple-hélice. Sin em-
bargo, este modelo no era compatible
con los resultados inferidos de los estu-
dios de difracción de rayos X. Fue enton-
ces cuando Watson ligó los anteceden-
tes de la existencia de los puentes de hi-
drógeno, un tipo de enlace en el que se
TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE

“comparte” un átomo de hidrógeno en- De esta forma, la estructura del DNA

tre dos átomos con cierta densidad de
electrones, como lo son el nitrógeno (N)
y el oxígeno. Él analizó cada posibilidad
de unión entre los nucleótidos mediante
estos enlaces. Además, ya conocía las
medidas básicas del DNA y, apoyado en
estos antecedentes, concluyó que existía
una interacción de este tipo entre las ba-
ses G (una base físicamente grande) y C
(una base pequeña), mediante tres puen-
tes de hidrógeno entre átomos de los ani-
llos de las bases nitrogenadas, y entre A
(base grande) y T (base pequeña), me-
diante dos puentes de hidrógeno entre los
átomos del anillo de las bases. Este mode-
lo se llamó de apareamiento de bases y
estaba en completo acuerdo con las pro-
porciones estequiométricas obtenidas por
Chargaff y con las medidas deducidas de
la difracción de rayos X (Figura 5.2).
basa su estabilidad en dos tipos de en-
laces básicos: a) el enlace fosfodiéster
del grupo azúcar con el grupo fosfato en
la cadena lineal de una hebra del DNA
y b) la interacción mediante puentes de
hidrógeno entre las bases nitrogenadas
de cada nucleótido de dos hebras de
DNA. El número de puentes de hidróge-
no es proporcional a la fuerza con que
ambas bases interactúan, por lo que la
interacción GC es más fuerte que la
interacción AT. Crick postuló que, según
la estructura observada, habían ciertos
ángulos y distancias entre los grupos
químicos, que sugerían que en la doble
hélice ambas hebras debían orientarse
en forma antiparalela. Es decir, la orien-
tación química entre los enlaces forma-
dos por los grupos fosfato y los grupos
OH del azúcar del esqueleto lineal de

N
-H
O H-N
PUENTES DE
HIDRÓGENO
N N
N-H CITOSINA
N N
C

N O
-H N
3
H

H-
H N-
GUANINA H ○
O

N N TIMINA
N

○
N
H

ADENINA N
O

Figura 5.2. Enlaces de hidrógeno formados por los grupos N, H y O. En estas

interacciones, el hidrógeno está en realidad siendo "compartido" por los otros
dos átomos. Las dimensiones obtenidas en la difracción de Rayos X fueron
coincidentes con las distancias que teóricamente ofrecen los puentes de
hidrógenos entre G (una base grande) y C (una base pequeña). De la misma
forma, estas medidas coincidían para enlaces entre A (base grande) y
T (base pequeña). De esta forma, entre G y C existen tres nubes
electrónicas tipo puente de hidrógeno y entre A y T, dos.

101

una hebra, debía ser inversa a la que tie-
nen las bases en la hebra complementa-
ria. Así, el DNA es un riel de trenes que
se ha torcido, con los grupos azúcar y
fosfato formado los rieles y con las ba-
ses nitrogenadas y sus puentes de hidró-
geno formando los durmientes. Ambos
rieles son opuestos en dirección y los
durmientes siempre son complementa-
rios: A aparea con T y G aparea con C.
Flujo de la información biológica.
Una vez conocida su estructura, la
replicación del DNA pasó a ser la siguien-
te pregunta. Ya Watson y Crick habían
adelantado la idea de que cuando una
célula se divide, su material genético es
replicado y para esto, la doble hebra de
DNA debía separarse. Este modelo se lla-
mó de replicación semiconservativa.
Meselson y Stahl, en 1958, realizaron im-
portantes experimentos para demostrar la
forma en la que el DNA se replica. Ellos
hicieron crecer en un tubo, bacterias
Escherichia coli (E. coli) en presencia de
15
N, un isótopo pesado del N, para que
incorporaran este elemento en sus bases
A, T, G y C; a este llamaron tubo de expe-
rimentación #1 (tubo #1). Posteriormen-
te, trasladaron una fracción de bacterias
a un nuevo medio (tubo #2), el cual sólo
contenía N y no el isótopo pesado. Espe-
raron el crecimiento de las bacterias y re-
pitieron la operación anterior dos veces
más, generando un tubo #3 y un tubo #4,
siempre utilizando N (Figura 5.3). Extra-
jeron muestras de DNA de las cuatro pre-
paraciones bacterianas y evaluaron el con-
tenido de nitrógeno en el DNA de éstas.
Este análisis se realizó mediante la forma-
ción de gradientes de sedimentación en
soluciones salinas, las que se generaron
por centrifugación a alta velocidad. La
102
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
idea fue separar este DNA según su “peso”
o densidad, debido a la incorporación de
15
N y su reemplazo con N. El DNA extraí-
do del tubo #1, mostró que todo este ma-
terial era más pesado que aquel DNA ais-
lado de las bacterias crecidas en el tubo
#4. Aquellas bacterias que crecieron ini-
cialmente en 15N y que luego se cambia-
ron a un medio sin isótopo (tubo #2),
mostraron tener una banda intermedia a
las dos primeras preparaciones (tutbo #1y
tubo #4). El tubo #3, mostró poseer tanto
bandas livianas (al igual que el tubo #4) y
bandas intermedias (similar al tubo #2) (Fi-
gura 5.4). Estos resultados engranaron per-
fectamente con el modelo semicon-
servativo propuesto por Watson y Crick
para la replicación del DNA, en donde
ambas hebras son separadas y cada una
sirve de molde para su hebra complemen-
taria, generando dos dobles hebras, don-
de una hebra de cada par es sintetizada
de novo y la otra es mantenida. Fue Arthur
Kornberg quien encontró, en forma casi
simultánea a los experimentos de
Meselson y Stahl, la enzima (una proteína
con actividad biológica) encargada de
hacer este trabajo dentro de la célula, a la
que llamó DNA polimerasa (DNApol).
Kornberg desarrolló sistemas in vitro de
replicación del DNA, con extractos de E.
coli y los cuatro nucleótidos; eso sí, utili-
zando uno de ellos, T, “marcado” con tritio
(3H, un isótopo radiactivo del hidrógeno).
De este modo, él pudo medir la radiacti-
vidad incorporada en forma de 3H, al DNA
que se iba sintetizando por acción espe-
cífica de la DNApol. Posteriormente, este
mismo investigador descubrió que en es-
tas bacterias, la DNApol no era una sino
tres, siendo la DNApol III la encargada
preferentemente de la replicación
semiconservativa del genoma de la bac-
teria.
TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE

Figura 5.3. La replicación del DNA es semiconservativa. Primero se hizo

crecer bacterias en nitrógeno 15 (tubo # 1), desde donde se tomó una alí-
cuota y se sembró en el tubo #2 que tenía nitrógeno 14. Este se dejó crecer
nuevamente y de él se sacó una nueva alícuota para sembrar en el tubo #3.
Finalmente, se hizo lo mismo para terminar con el tubo #4, también en
nitrógeno 14.

Figura 5.4. Gradientes de sedimentación de DNA . Las bacterias que crecieron

en los tubos con nitrógeno 15 y 14 se lisaron y su DNA se depositó en una
gradiente de cloruro de cesio. Se centrifugó y así el DNA llegó a su punto de
equilibrio de densidad. El DNA extraído de las bacterias del tubo#1 se ubicó
en un punto más abajo que en el resto de los DNAs de los otros tubos. En el
tubo#4, el DNA se ubicó por encima de las otras preparaciones. El DNA del
tubo#2, se ubicó exactamente en la mitad de #1 y #4. Y el DNA del tubo#3,
presentó dos bandas, la media y la superior. Con esto, se demostró que el
nitrógeno 15 en el DNA bacteriano se fue "diluyendo" a través de las
generaciones. Las ubicaciones equidistantes, permitieron inferir
que el modelo de replicación era semiconservativo.

La transmisión de la información desde surgió de inmediato debido a su abun-

la molécula de DNA hacia moléculas
efectoras como las proteínas, fue tam-
bién establecida por Francis Crick, bajo
la idea de un Dogma Central para el flu-
jo de la información a través de una
molécula transportadora. Tal mediador
dancia en el citoplasma celular, el áci-
do ribonucleico (RNA). Al igual que el
DNA, el RNA posee un esqueleto otor-
gado esencialmente por enlaces entre un
grupo azúcar y un grupo fosfato, pero
esta vez las azúcares provienen de un

103

grupo llamado de las ribosas, en vez de
las desoxirribosas, como en el DNA. El
RNA utiliza las mismas bases nitroge-
nadas, excepto que T es reemplazada
por uracilo (U). Como se mencionó, el
DNA es una macromolécula doble he-
bra, en contraste, el RNA es usualmente
hebra simple. La existencia del RNA
como molécula transportadora de la in-
formación planteaba la existencia de
otras moléculas accesorias, que realiza-
ran funciones de adaptadores molecu-
lares. En efecto, para cada aminoácido,
debería existir un adaptador específico.
Esta idea, se desarrolló en forma parale-
la e independiente de Crick por Paul
Zamecnik, quien en 1953 desarrolló un
sistema in vitro para sintetizar proteínas
a partir de extractos de hígado de rata.
En estos sistemas, Zamecnik fue capaz
de distinguir cuerpos voluminosos
adosados a las cadenas peptídicas (se
llama péptido a una cadena de hasta 20
aminoácidos) que se estaban sintetizan-
do. Estos cuerpos se llamaron posterior-
mente ribosomas. Con la ayuda de
Mahlon Hoagland, este mismo grupo
encontró enzimas asociados a los
ribosomas y en 1955, se pudo definir
que los aminoácidos eran unidos prime-
ro a otro RNA antes de ir a formar una
proteína. Estos RNAs solubles se llama-
ron RNA de transferencia (tRNA).
Inicialmente se pensó que el RNA aso-
ciado a los ribosomas era la molécula
utilizada como molde para la síntesis de
proteínas. Pero el grupo formado por
S y d n e y B r e n n e r, F r a n c o i s J a c o b y
Mathews Meselson, descartaron pronto
al tRNA como molécula de la informa-
ción y demostraron la existencia de un
tercer tipo de RNA, altamente inestable,
que llevaría esta información desde el
104
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
DNA. Ellos evaluaron la replicación de
un bacteriófago (virus que infecta bac-
terias) en bacterias, utilizando la idea de
poder distinguir entre los ribosomas y
tRNA aportados por las bacterias y el
nuevo material generado por el fago para
su replicación (aquí es necesario recal-
car que la replicación de los fagos im-
plica la síntesis de sus proteínas utilizan-
do la maquinaria de la misma bacteria).
Los experimentos de este grupo consis-
tieron en hacer crecer bacterias en un
medio con isótopos pesados de C y N
( 13C y 15N). Luego, estas bacterias se sa-
caron de estos medios y se infectaron
con fagos en presencia de un tercer
nucleótido, 32 P. Una vez producida la
infección y un tiempo antes de la lisis
de las bacterias por parte del fago, se
procedió a la extracción de RNAs y
ribosomas y su separación por gradientes
de densidad. Las fracciones correspon-
dientes a ribosomas completos y a
ribosomas desmantelados en sus sub-
unidades (producto de la separación),
mostraron todas poseer los isótopos 13C
y 15N pero no 32P (Figura 5.5). Esto im-
plicaba que los ribosomas habían sido
sintetizados antes de la infección con el
fago. Al analizar la existencia de 32P en
las fracciones observadas, éste se detec-
tó en la zona donde se encontraban los
ribosomas completos y también en el
fondo del tubo (Figura 5.7, derecha); este
último material, al ser estudiado, se des-
cribió como un RNA distinto a los co-
nocidos, el que se llamó RNA mensaje-
ro (mRNA). El mRNA vino a ser la pieza
faltante del rompecabezas que era el
Dogma propuesto por Francis Crick y se
reconoció como la molécula molde para
la síntesis de proteínas, la que además,
estaba de alguna forma interactuando
con ribosomas completos (Figura 5.6).
TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE

Figura 5.5. Descubrimiento del RNA mensajero. Se hizo crecer bacterias

en un medio con isótopos pesados de C y N (13C y 15N). Luego, éstas se
sacaron de estos medios y se infectaron con fagos en presencia de un ter-
cer nucleótido, 32P. Luego se procedió a la extracción de RNAs y ribosomas
y su separación por gradientes de densidad. Las fracciones
correspondientes a ribosomas completos y a sub-unidades ribosomales
(artefacto técnico de la separación), mostraron poseer 13C y 15N pero
no 32P. Así, los ribosomas habían sido sintetizados antes de la infección
con el fago. El 32P se encontró en la zona correspondiente a los
ribosomas completos y también en el fondo del tubo (tubo a la
derecha). Al ser estudiado, éste se describió como RNA mensajero.

Figura 5.6. Dogma Central. El RNA es transcrito a RNA, del cual existen tres
tipos: rRNA, RNA ribosomal que participa en la estructura de los ribosomas y
también tiene funciones en la traducción; tRNA, RNA de transferencia, que
posibilita la traducción a proteínas mediante el acoplamiento de
aminoácidos; y mRNA, RNA que contiene el mensaje para la
síntesis de la proteína en el proceso de traducción.

105

Así, el Dogma Central estableció que la
información para generar una proteína
estaba codificada en el DNA, el cual
utilizaba como molécula mediadora al
mRNA, la que con ayuda del tRNA y
ribosomas, generaría finalmente las pro-
teínas. La codificación utilizada por el
DNA para informar de la formación de
una proteína específica vendría a ser
dilucidada en 1961, cuando Marshall
Niremberg y Johann Matthaei, demues-
tran que un aminoácido es codificado
por tres nucleótidos “leídos” en el mRNA
por las moléculas de traducción. Al or-
denamiento y uso de esos grupos de tres
nucleótidos del mRNA para ubicar un
aminoácido específico se llamó codón,
generándose de este modo el código
genético, en donde grupos de codones
servirían para posicionar determinados
aminoácidos. Finalmente, fue Phil Leder,
quien demostró que cada codón es re-
conocido en el mRNA utilizando para
ello el tRNA, el cual proporciona a tra-
vés de su estructura, tres bases comple-
mentarias a dicho codón. Entonces en
el tRNA existen los anticodones, que
reconocen específicamente un codón en
el mRNA, existiendo un tRNA específi-
co para cada uno de los 20 aminoácidos.
Partes de un gen.
En 1950 Fred Sanger fue el primero en
determinar la secuencia de aminoácidos
de una proteína, demostrando que los
51 aminoácidos de la insulina, siguen un
orden específico. Sin embargo, para po-
der entender cómo esta secuencia orde-
nada de aminoácidos derivaba de su
molde, el DNA, se requirió de 27 años
más. En la década de 1970, el grupo de
Rich Roberts en el Cold Spring Harbor
Laboratory, se dedicó a trabajar activa-
106
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
mente en el desarrollo de nuevas herra-
mientas para la tecnología del DNA
recombinante. Ellos realizaron importan-
tes experiencias basados en la capaci-
dad de separación y re-asociación de las
hebras de DNA, debido a la ruptura y
generación de los puentes de hidrógeno
entre las bases complementarias. Las
cadenas simples de DNA son posibles de
separar y unir nuevamente en virtud de
la temperatura. Según esto, si se tuviera
hebras simples de DNA, mediante la
manipulación de la temperatura, se pue-
de hacer que hebras complementarias se
unan nuevamente. El grupo de Roberts
desarrolló importantes experimentos de
hibridación entre mRNA y DNA
bacterianos. Estos experimentos, permi-
tieron establecer que para un gen
bacteriano, el mRNA y el DNA que lo
sintetizan son colineales, es decir, se
aparean o hibridan completamente,
siendo la secuencia del DNA exacta-
mente complementaria a la del mRNA
generado por ésta. Sin embargo, al rea-
lizar los mismos estudios de re-
asociatividad en eucariontes, observaron
la formación de estructuras de lazo en-
tre un mRNA y su correspondiente pre-
paración de DNA. Estos lazos mostraron
corresponder a zonas en el DNA que ya
no existían en el mRNA. En 1977, se
determinó que en eucariontes no todas
las secuencias del DNA son transcritas
a mRNA para que este genere una pro-
teína. De este modo, los genes en
eucariontes están compuestos por dos
tipos de secuencias: a) secuencias que
codifican efectivamente para la proteí-
na que se expresa, llamadas exones y b)
secuencias que son procesadas y
escindidas en el mRNA, llamadas
intrones. Los exones corresponden a se-
cuencias que generarán directamente la
TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE

cadena de aminoácidos correspondien- cleo de la célula, para formar un mRNA

tes a la proteína o péptido y los intrones que generará finalmente la proteína. Un
son secuencias que se presentan en el gen original, es decir, con intrones y
gen originalmente, intercaladas entre los exones, se denomina gen genómico (Fi-
exones y que son procesadas en el nú- gura 5.7).

Promotor Exón 1 Intrón 1 Exón 2 Intrón 2 Exón 3 Terminador

Figura 5.7. Un gen eucarionte está constituido tanto por secuencias que no
codifican finalmente para una proteína (intrones), como para aquellas que
lo hacen (exones). Además, existen secuencias que ordenan que un gen
active su transcripción (producción de RNA), denominadas secuencias
promotoras y, por contrapartida, secuencias que ordenan que se
termine esta expresión, denominadas secuencias terminadoras.

TECNOLOGÍA DEL DNA

RECOMBINANTE.

Herramientas para manipular genes:

Los plasmidios.

La posibilidad de aislar un determinado

fragmento de DNA y manipularlo, es el
final de décadas de estudio en distintas
áreas de la ciencia. El conjunto de estos
aportes es conocido hoy como biología
molecular. Una herramienta importantí-
sima en biología molecular la constitu-
yen DNAs circulares extracromosomales
(no genómicos) bacterianos, denomina-
dos plasmidios (Figura 5.8). Los plasmi-
dios poseen un sistema de replicación
de su DNA que es autónomo, por lo que
se pueden multiplicar independiente-
Figura 5.8. Un plasmidio. DNA circular
mente de cómo lo hace el genoma de la extracromosomal que se utiliza en biología
misma bacteria en que se encuentran. A molecular como herramienta de multiplicación
diferencia de los experimentos de Mesel- de genes. En determinadas secuencias de estos
son y Stahl, quienes aislaron y evalua- plasmidios (denominados sitios múltiples de
ron la integración de 15N a purificaciones clonamiento), se pueden introducir secuencias
o genes de interés, los que serán multiplicados
de DNA total de bacterias, los plasmidios por las bacterias que lo posean, de forma
presentan una ventaja técnica en extre- independiente de su genoma, por poseer
mo importante para su trabajo en labo- un origen de replicación autónomo.

107

ratorio, como lo es la posibilidad de
purificarlos para trabajarlos de una for-
ma independiente del DNA genómico.
En general, los plasmidios son entidades
genéticas con un tamaño molecular re-
lativamente pequeño, alcanzando sólo
unos pocos miles de nucleótidos de DNA
(alrededor de 3.000 bases), en compa-
ración con los cientos de miles de bases
que pueden alcanzar los cromosomas o
genomas bacterianos. Esta posibilidad
de purificación y su tamaño reducido,
los hacen excelentes herramientas para
introducir, en determinadas regiones de
ellos, fragmentos específicos de DNA
que sean de interés. De esta forma, los
plasmidios son estructuras circulares dis-
cretas de DNA, que se multiplican den-
tro de las bacterias y que pueden servir
como un sistema de amplificación de
genes que son introducidos dentro de
ellos, debido a su tamaño apropiado.
Clonamiento.
En la década de 1970, Rich Roberts y
Phil Sharp, del Cold Spring Harbor
Laboratory, desarrollaron las primeras
herramientas de la biología molecular
moderna, las endonucleasas de restric-
ción o enzimas de restricción. En líneas
generales, el aislamiento de un gen o un
segmento específico de DNA se realiza
mediante proteínas que son capaces de
cortar específicamente el DNA. Estas
proteínas se conocen con el nombre de
enzimas de restricción, las que recono-
cen secuencias blanco que se denomi-
nan secuencias palindrómicas o
palíndromes (Figura 5.9).Éstas, en líneas
generales, corresponden a secuencias de
4 ó 6 nucleótidos que son reconocidas
y cortadas en el enlace fosfodiéster. De
esta forma, la doble hebra de DNA pue-
108
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
de ser cortada por estas enzimas, pro-
duciendo dos tipos de productos: a) frag-
mentos cuyos extremos generados en el
sitio de corte son adhesivos ("sticky") (Fi-
gura 5.9a) y b) fragmentos cuyos extre-
mos generados en el sitio de corte pue-
den ser romos o planos ("blunt") (Figura
5.9b). El corte de un fragmento de DNA
con una enzima de restricción específi-
ca, generará siempre los mismos frag-
mentos tras su digestión, con el mismo
tipo de extremo en la zona de corte y
siempre en la misma secuencia
palindrómica. Por ejemplo, una enzima
de restricción llamada EcoRI, cortará
siempre cualquier fragmento de DNA
que tenga la secuencia GAATTC, rom-
piendo el enlace entre los nucleótidos
G-A y generando fragmentos adhesivos.
XXXX G A T A T C XXXX
XXXX C T A T A G XXXX
a
XXXX G A T A T C XXXX
XXXX C T A T A G XXXX
b
XXXX G A T A T C XXXX
XXXX C T A T A G XXXX
Figura 5.9. Secuencia palindrómica.
Secuencia de reconocimiento para enzimas
de restricción. Éstas, luego de detectar
secuencias específicas de este tipo, cortan
el DNA con dos posibilidades: a) generando
dos fragmentos escalonados con extremos
cohesivos o b) generando dos fragmentos
con extremos lisos o romos. Cada enzima
de restricción reconoce solo un sitio
palindrómico específico.
TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE

Estos fragmentos de DNA que son “di-
geridos”, pueden volver a ser pegados
por otra enzima, que se llama DNA
ligasa. Esta ligasa de DNA unirá frag-
mentos correspondientes a DNAs dige-
ridos que sean adhesivos complementa-
rios, vale decir, cortados con una mis-
ma enzima de restricción. En el caso de
fragmentos romos, la ligasa los pegará
también, pero en esta operación no se
requiere que los fragmentos hayan sido
producidos por la misma enzima de res-
tricción, sino sólo que sean romos o pla-
nos. En la práctica, la ligación mediada
por la DNA ligasa es más eficiente para
DNAs con extremos adhesivos que la de
DNAs con fragmentos romos.
Si en dos reacciones por separado se
digieren, con una misma enzima de res-
tricción, un DNA genómico y un DNA
plasmidial (de forma tal que el plasmidio
es cortado sólo en un sitio), se puede
mezclar estos DNAs digeridos y la mez-
cla someterse a una reacción de ligación
con la enzima DNA ligasa. Producto de
esto, se tendrá múltiples posibilidades de
la reacción de ligación, siendo la de in-
terés aquella en donde el plasmidio ha
insertado un fragmento genómico, gene-
rando así lo que se llama plasmidio re-
combinante y que se refiere a un plasmi-
dio en el que se insertó efectivamente
el fragmento de DNA de interés (Figura
5.10)(Buchanan et al., 2001).
Genes quiméricos y “cassettes” de
expresión.
Discutamos ahora el uso de los genes en
biotecnología. El aislamiento o clona-
miento de un gen y su uso, necesitan no
sólo tener un plasmidio recombinante
con un gen genómico, o un gen com-
plementario al mRNA (llamado gen
cDNA, el que considera sólo la informa-
ción lineal de todos los exones). Cada
plasmidio posee elementos adicionales
que permiten la multiplicación del gen
de interés y su expresión, ya sea en bac-

Figura 5.10. Plasmidio recombinante.

Plasmidio en el que se ha insertado una o varias secuencias (mostradas en
rojo) de interés para multiplicar. Las flechas indican el sentido en el que
el gen se lee (o transcribe) por la RNA polimerasa.

109

terias, animales o plantas, según sea el
objetivo final de uso del gen. La secuen-
cia que contiene los codones necesarios
para que un gen origine una proteína,
necesita ser activada transcripcional-
mente, para que ese DNA se transcriba
a mRNA y luego se traduzca a proteína.
Para esto, el extremo 5´ del gen debe
tener, a una distancia adecuada (entre
20 a 100 nucleótidos), una secuencia
que informe a la RNA polimerasa que
debe transcribir ese gen. Esa secuencia
se denomina promotor y posee toda la
información para este proceso y también
para la traducción del mRNA (Goodrich
et al., 1996; Sambrook et al., 1989) (Fi-
gura 5.7). Existen promotores que son es-
pecíficos para bacterias, para animales
y para plantas (Busbry y Ebright, 1994;
Odel et al., 1985; Buchanan et al.,
2001), por lo que un aspecto importan-
te para expresar un gen en una célula
específica, es insertar un promotor ade-
cuado según el sistema. Además, de es-
tas secuencias promotoras, un gen debe
poseer en su otro extremo, el 3´, nucleó-
tidos que informan a las enzimas celu-
lares del término de la transcripción de
un gen, estas se denominan terminado-
res (Goodrich et al., 1996) (Figura 5.7).
También se debe considerar que el co-
rrecto funcionamiento de los termina-
dores dependerá del sistema en donde
se quiera expresar el gen. Cuando se
transforma plantas, las secuencias acce-
sorias (intrones, promotores y termina-
dores) tienen por función asegurar una
correcta expresión del gen (Goodrich et
al., 1996; Buchanan et al., 2001). Los
intrones son secuencias propias de los
organismos eucariontes, cuya utilización
en genes quiméricos para transforma-
110
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
ción de plantas, ha demostrado aumen-
tar la estabilidad y expresión del trans-
gén. De este modo, un gen mínimo debe
tener, además de sus exones, un promo-
tor y un terminador transcripcional apro-
piado según el sistema. El conjunto de
estos elementos que permiten la correc-
ta expresión de un gen, se denomina
“cassette” de expresión. Usualmente, los
plasmidios comercialmente disponibles
están desarrollados de forma tal que el
gen a clonar es directamente insertado
entre un promotor y un terminador. Esto
quiere decir que el sitio de inserción está
generalmente predefinido y correspon-
de a una serie de sitios palindrómicos,
denominándose sitio múltiple de
clonamiento (Sambrook et al., 1989).
Dentro de los promotores más utilizados
hasta hoy en la transformación genética
de plantas, está aquel que proviene del
RNA 35S del virus del mosaico de la
coliflor (“cauliflower mosaic virus”,
CaMV). Este promotor, llamado simple-
mente 35S ó 35S CaMV, ha mostrado ser
especialmente fuerte en casi todos los
tejidos de las plantas transgénicas que
se han generado a la fecha. Del mismo
modo, una de las secuencias terminado-
ras más utilizadas en el desarrollo de
plantas transgénicas, aunque no con la
omnipresencia del 35S CaMV, es el ter-
minador del gen de la enzima nopalina
sintetasa (nos-ter) de Agrobacterium
tumefaciens. Sin embargo, la gran mayo-
ría de los clonamientos de genes, inde-
pendiente de su uso final, requiere su
paso por un sistema bacteriano, por lo
que el manejo de plasmidios de clona-
miento en bacterias, es un requisito bá-
sico de laboratorio.
TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE
Transformación bacteriana.
Una vez ligados los fragmentos de DNA,
dentro de los que se encuentra nuestro
plasmidio recombinante con el gen de
interés, estos son introducidos nueva-
mente a las bacterias mediante un pro-
ceso denominado transformación bacte-
riana. La transformación bacteriana es
un método de fácil desarrollo en el la-
boratorio, existiendo múltiples procedi-
mientos para hacerlo. Dos de los más
utilizados son:
a) Transformación mediante CaCl 2 : en
el que bacterias tipo E. coli son lava-
das exhaustivamente primero con
H 2 O estéril y finalmente con una so-
lución de CaCl 2. Este tratamiento se
conoce como “elaboración de bacte-
rias competentes” y son bacterias que
están en una curva ascendente de
crecimiento. De esta forma, las bac-
terias competentes son puestas en
contacto con el DNA ligado (la mez-
cla de ligación anterior en donde in-
teresa sólo el plasmidio con el DNA
foráneo insertado) y mediante un gol-
pe térmico, generalmente de 42ºC por
un tiempo breve (por ejemplo 90 seg),
éstas incorporan este DNA mezclado.
Si el plasmidio es funcional, es de-
cir, está cerrado, permitirá que las
bacterias que lo incorporaron puedan
seguir creciendo en medios selecti-
vos. Para esto, un nuevo factor entra
aquí en juego, los genes de resisten-
cia para la selección de las bacterias
efectivamente transformadas. Los
genes de resistencia vienen incorpo-
rados en los plasmidios comercial-
mente disponibles para clonamiento
y sirven como indicador de la incor-
poración del plasmidio por parte de
la bacteria, pues sólo aquellas que in-
corporan el plasmidio funcional pro-
liferarán en medios selectivos con
antibióticos (Figura 5.5).
b) Electroporación: en este sistema tam-
bién se preparan células competen-
tes (se les llama en este caso electro-
competentes). Esta vez se utiliza una
solución de glicerol en lugar de
CaCl 2. Así, las bacterias electrocom-
petentes son una solución de bacte-
rias resuspendidas en glicerol, un
agente que se intercalará en las mem-
branas facilitando la penetración de
macromoléculas, como lo es el DNA
ligado. Una preparación de bacterias
electrocompetentes es mezclada con
la ligación de DNA y entonces se
aplica sobre esta mezcla una caída
de tensión, durante un tiempo del or-
den de los milisegundos. El resulta-
do son bacterias que incorporaron el
plasmidio recombinante, las que tam-
bién son llevadas a selección como
sucede con la transformación por
CaCl 2 .
Detección de clones recombinantes.
Como se mencionó, las bacterias incor-
porarán distintos DNAs foráneos ligados,
generando diversos clones bacterianos.
Solamente proliferarán aquellos clones
que hayan incorporado plasmidios con
genes de resistencia a antibióticos, lo
que implica que se tendrán poblaciones
de bacterias tanto con el plasmidio origi-
nal como con el plasmidio recombi-
nante. Para buscar qué clones bacteria-
nos poseen plasmidios recombinantes,
existen varias técnicas, dentro de las que
111
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

destaca la detección por hibridación de REFERENCIAS.

ácidos nucleicos. Al tener una colonia
de bacterias que poseen un plasmidio Buchanan, B., Gruissem, W. y Jones, R. 2001.
Biochemistry & Molecular Biology of Plants.
con el inserto, ésta puede adherirse a un
John Wiley & Sons, Somerset, New Jersey,
filtro y una vez allí, ser lisada para así USA.
dejar el plasmidio expuesto. Si se apli-
ca temperatura y/o agentes desnaturali- Busbry, S. y Ebright, R. 1994. Promoter
zantes sobre este filtro (por ejemplo structure, promoter recognition, and
transcription activation in prokaryotes. Cell
NaOH), se inducirá a que el plasmidio 79:743-746.
recombinante se separe en cada una de
sus hebras complementarias. Si enton- Goodrich, J., Cutler, G. y Tjian, R. 1996.
ces este filtro se incuba con una solu- Contacts in context: promoter specificity
ción en donde se encuentre el mismo and macromolecular interactions in
transcription. Cell 84:825-830.
gen de interés (o una parte de él) tam-
bién desnaturalizado, pero que ha sido Odell, J., Nagy, F. y Chua, N. 1985. Identi-
marcado con algún isótopo (como por fication of DNA sequences required for
ejemplo 32P), al volver a bajar la tempe- activity of the cauliflower mosaic virus 35S
ratura se re-asociarán las dobles hebras promoter. Nature 313:810-812.
de DNA, pero esta vez se verá favoreci- Sambrook, J., Fritsch, E. y Maniatis, T. 1989.
da la unión entre el gen marcado o son- Molecular cloning: a laboratory manual.
da (agregado en exceso para producir Nolan, C. (ed). 2a edición. Cold Spring
esta condición) y la hebra complemen- Harbor Lab. Press., New York, USA.
taria fijada al filtro, proveniente de la
bacteria. Luego este filtro hibridado se
expone a una película sensible a la ra-
diactividad, generándose las manchas
tal como se obtiene en el proceso de
difracción de rayos X, pero esta vez in-
dicando zonas en donde ha ocurrido la
hibridación entre el gen marcado y DNA
plasmidial adherido al filtro.

112
TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE PLANTAS
TRANSFORMACIÓN
GENÉTICA DE PLANTAS
INTRODUCCIÓN
H ace aproximadamente 150 años
que Gregor Mendel realizó sus tra-
bajos destinados a establecer cómo de-
terminados caracteres eran traspasados
entre distintas generaciones de plantas
de arvejas. Sin embargo, pasaron más de
50 años para que los resultados de
Mendel fueran redescubiertos y explica-
dos de forma tal que así permitieran for-
mular las que hoy se conocen como Le-
yes de Mendel. Sus experimentos se ba-
saron en la emasculación de flores de
arveja, lo que consiste en eliminar es-
tambres de éstas para poder polinizarlas
manualmente. Esta técnica es exacta-
mente la misma que desde comienzos
del siglo XX viene siendo utilizada, en
lo que es conocido como mejoramiento
convencional de plantas.
El mejoramiento convencional de plan-
tas utiliza varias metodologías para la
generación de mejores individuos apro-
vechables para el ser humano. Estas
metodologías pueden clasificarse en dos
grupos, según su grado de profundidad
en cuanto a la manipulación del mate-
rial genético. El primer grupo se refiere
a técnicas en las que no hay un intento
de modificación de los cromosomas de
los individuos que son utilizados, salvo
la utilización sexual de sus gametos. Pa-
ra que esto sea posible, las especies a
“mezclar” en busca de mejores indivi-
duos, deben ser sexualmente compati-
CAPÍTULO 6
Humberto Prieto E.
bles. El segundo grupo de técnicas,
involucra métodos que inducen modifi-
caciones del material genético propia-
mente tal, ya sea generando algún tipo
de mutaciones en los nucleótidos del
genoma de una especie parental, o cam-
biando en la cantidad original de DNA
de éste.
Cada vez que se aplica la manipulación
sexual a los cromosomas mediante el uso
de los gametos en cruzamientos sexual-
mente compatibles, estos aportan el 50
por ciento de material genético. Esto
genera líneas de plantas “hijas”, que a
su vez pueden ser retrocruzadas varias
veces más, para enriquecer en un fondo
genético deseable (por ejemplo el del
parental A), pero además de mantener
el carácter de interés (por ejemplo el
parental B). De hecho, los experimen-
tos de Mendel jamás hubieran tenido los
resultados obtenidos si él no hubiera de-
sarrollado un gran trabajo previo a tra-
vés de la generación de parentales con
un genoma “estable” y bien conocido en
cuanto al fenotipo que genera (lo que
se denomina línea pura). Dentro de esta
categoría de técnicas de mejoramiento
tenemos:
a) La selección de líneas puras: que con-
siste en la selección de determinados
caracteres que serán retenidos en una
planta individual, procurando un es-
tado homocigoto (presente en ambos
cromosomas) tras varias retrocruzas.
113

b) La hibridación: en donde diferentes cro-
mosomas son combinados para gene-
rar un individuo en un estado heteroci-
goto. Ésta es, por lejos, la técnica de más
amplio uso en mejoramiento conven-
cional de plantas, pero requiere tener
líneas puras como punto de partida.
Por contrapartida, el otro grupo de téc-
nicas involucra la modificación directa
del genoma de una especie de interés,
implica generalmente un proceso al azar.
Así, los nuevos individuos son general-
mente utilizados, por ejemplo, como da-
dores de gametos sexuales o, simplemen-
te, son propagados clonalmente a través
de las técnicas de cultivo de tejidos (re-
pique simple), vista en los capítulos an-
teriores. Para este segundo tipo de
metodologías, tenemos como ejemplos:
c) La mutagénesis: en donde mediante
la aplicación de agentes exógenos
(los que pueden ser químicos o físi-
cos), se procura el cambio en la in-
formación genética del cromosoma.
d) La poliploidía: en donde la aplicación
de agentes químicos lleva a un cam-
bio en el juego de cromosomas de una
célula, generalmente aumentándolo.
Lejos es la hibridación de variedades, la
técnica de mayor utilización en mejora-
miento convencional de plantas y por
ejemplo, ha impulsado el crecimiento en
la producción de maíz entre 1930 a la
actualidad, en más de un 600%. La ins-
tauración de líneas parentales puras es
de tal importancia que, notablemente y
como se mencionó, Mendel debió gene-
rar líneas puras de arvejas con caracte-
rísticas bien definidas, tales como color
de flor, forma de semilla, aspecto de se-
114
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
milla, etc., para luego hibridarlas. De
otra forma, sus resultados jamás hubie-
ran sido tales y por ende, nunca expli-
cados.
La aparición de la tecnología del DNA
recombinante, presentada en el capítu-
lo anterior, permitió ya en 1980, descri-
bir y clonar los primeros genes de plan-
tas. Poco después, se comenzaron a en-
tender las bases moleculares de la inte-
racción entre bacterias como Agrobac-
terium tumefaciens y algunos de sus
huéspedes vegetales (plantas que lo alo-
jan), interacciones antes hasta entonces
ignoradas. La disposición de genes ais-
lados, su manipulación y el entendi-
miento del sistema de infección por A.
tumefaciens, permitieron que en 1983,
se generara la primera planta transfor-
mada genéticamente, la que expresó un
gen de resistencia a un antibiótico.
Si bien es cierto que la transformación
utilizando A. tumefaciens ofrecía una
gran herramienta para la introducción de
genes en plantas, su espectro de acción
se limitaba, en esa época, al rango de
plantas huéspedes al que la bacteria na-
turalmente podía transferir su DNA a la
planta, es decir, infectar. Debido a esto,
diversas técnicas se desarrollaron desde
mediados de la década de 1980. Entre
ellas, la que más destacó fue una en que
los genes a introducir son depositados
sobre partículas metálicas microscópicas,
las que son dirigidas a una alta veloci-
dad para impactar las células “blanco”
(objetivo). Este sistema de transformación
se llamó “gene-gun”, pistola génica o sis-
tema de biobalística. En las células que
sobreviven al impacto, el DNA puesto en
la superficie de las partículas llega al nú-
cleo celular y se incorpora a su genoma.
TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE PLANTAS

De esta forma, a comienzos de la déca-

da de 1990, ya se podía postular que se
contaba con sistemas de transformación
genética de potencialmente todas las
plantas de interés agronómico y de for-
ma cotidiana, de plantas consideradas
como modelo para la expresión y estu-
dios de las secuencias externas introdu-
cidas, como lo son tabaco y Arabidopsis
thaliana.

Agrobacterium tumefaciens.

A. tumefaciens es una bacteria del suelo

causante de la enfermedad de la agalla de
la corona (o cuello) (“crown gall disease”)
(Figura 6.1). El estudio a un nivel molecu-
lar de la interacción planta-Agrobacte-
rium, permitió determinar que entre los
numerosos eventos que ocurren en esta
interacción, uno de los pasos más impor-
tantes es la transferencia de un trozo de
DNA desde la bacteria hacia el núcleo de
las células vegetales que son infectadas.
Para entender cómo es este paso de un
trozo de DNA hacia la planta, empeza-
remos por describir que A. tumefaciens
posee un plasmidio gigante, si se com-
para con el de bacterias utilizadas en la
tecnología del DNA recombinante (E.
coli). Este DNA plasmidial se denomina
plasmidio Ti (Figura 6.2), por inductor
de tumores (“tumor inducing”) y contie-
ne todos los genes responsables de la
enfermedad de la corona de agallas, de
su fenotipo y de este proceso de transfe-
rencia de un trozo de DNA a la planta.
Sin embargo, vale la pena señalar que
sólo una pequeña porción de DNA del
plasmidio Ti es transferido a la planta,
éste es llamado DNA de transferencia o
simplemente T-DNA.
Figura 6.1. Aspecto de la enfermedad
de la agalla de la corona.
Manifestación fenotípica de la interacción
entre A. tumefaciens y una planta
dicotiledonea, ésta se debe a la síntesis de
opinas (que proveen una ventaja competitiva
para la bacteria) y fitohormonas (auxinas y
citoquininas, que inducen la proliferación
celular aumentando el número de células
que sintetizan opinas).
Genes vir
Borde
derecho
Plasmidio Ti T-DNA
Borde
izquierdo
Figura 6.2. Plasmidio inductor de tumores o
Ti. Se muestran los cuatro elementos
fundmentales de este DNA circular:
Los genes vir, que aportan toda la maquinaria
de transporte del DNA de transferencia o T-
DNA. El T-DNA es transportado en forma de
DNA hebra simple, para esto es reconocido
en dos zonas claves, que son repetidas
imperfectas, llamadas bordes
(derecho e izquierdo).

115

Gracias al plasmidio Ti, la bacteria pue-
de sintetizar compuestos aminoacídicos
derivados de arginina, que le permiten
una mejor interacción con la planta. Es-
tos compuestos se llaman genéricamen-
te opinas, las que se pueden clasificar
en: nopalina, octopina y agropina. Cada
plasmidio Ti contiene los genes de sín-
tesis para una clase de opina. Por lo tan-
to, existen plasmidios Ti con los genes
para la síntesis de nopalinas, otros para
la síntesis de octopinas y otros para la
síntesis de agropinas. De este modo, la
idea de Agrobacterium en su proceso de
infección natural de plantas, es sinteti-
zar las opinas que le son útiles para su
desarrollo y esto ocurre en convivencia
plena con la planta infectada. De ello,
se deduce que los genes de síntesis de
opinas están ubicados en el T-DNA y son
naturalmente transferidos a la planta, de
forma de asegurar la convivencia de esta
interacción planta-patógeno.
Otra región de gran importancia dentro
del plasmidio Ti, es la que contiene los
g e n e s q u e o t o rg a n l a v i r u l e n c i a o
infectividad de la bacteria, esta se deno-
mina región vir (con los genes virA, virB,
virG, virC, virD y virE). Estos genes están
involucrados específicamente en el me-
canismo de activación de la infección
bacteriana y de la transferencia del T-
DNA a la célula huésped (o infectada).
Los genes vir representan la base de la
maquinaria de infección de la bacteria,
siendo fundamentales en gatillar la trans-
ferencia del T-DNA hacia la planta.
Existe una variante de la enfermedad de
la corona de agalla: la generación de
pelos radiculares; que es causada por
otra clase de Agrobacterium, el A. rhizo-
genes. A. rhizogenes posee un plasmidio
116
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
denominado plasmidio Ri (por “root in-
ducing”), cuyos genes también producen
opinas (preferentemente del tipo agro-
pinas) y también posee un sistema de
transferencia de DNA a la célula hués-
ped, generando pelillos en la mayoría de
las infecciones resultantes, aunque tam-
bién se han visto ejemplos en que este
tipo de Agrobacterium causa agallas del
cuello.
Mecanismos biológicos involucrados
en la transformación por
A. tumefaciens.
a) El proceso de activación y transferen-
cia del T-DNA.
Tal vez uno de los aspectos más intere-
santes de la transformación genética se
relaciona con los procesos biológicos
involucrados en la transferencia e incor-
poración del DNA exógeno a la célula
vegetal. Como se mencionó anterior-
mente, Agrobacterium tumefaciens po-
see en su plasmidio Ti un operón (con-
junto de genes) denominado vir. Este es
un conjunto de seis grupos de genes que
codifican para todos los productos re-
queridos en las distintas etapas de la in-
fección: a) activación de la bacteria, b)
generación del T-DNA apropiado para
ser transferido (formación del “comple-
jo T“), c) traspaso del “complejo T“, d)
ingreso a la célula huésped y finalmen-
te su integración al genoma de ella.
El proceso comienza cuando la bacteria
detecta ciertas señales en su medioam-
biente y transmite esta información ha-
cia su interior. Este paso de información
se conoce como “transducción de seña-
les“ y en general, utiliza dos componen-
te moleculares, una proteína sensora en
TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE PLANTAS

la superficie de la bacteria y una proteí-

na que “modula” o traduce de la res-
puesta hacia adentro. En Agrobacterium,
Vir A y Vir G, respectivamente, son las
proteínas sensora y moduladora (Figura
6.3). De esta forma, cuando se produce
una herida o daño mecánico en la pa-
red celular vegetal (requisito mínimo pa-
ra la inducción), se liberan compuestos
fenólicos con un esqueleto carbonado
de un tamaño específico, siendo uno de
ellos el clave: la acetosiringona. Esta
molécula es detectada y sensada en la
bacteria, lo que hace que ella se ligue
férreamente a la célula vegetal utilizan-
do proteínas ubicadas en su membrana
(como las proteínas ChvA, ChvB, PscA y
Att entre otras propuestas) y por contra-
parte, reconociendo ligandos de la cé-
lula vegetal, los que quedan expuestos
por la herida producida. Los ligandos de
la célula vegetal se denominan com-
puestos “símiles de la vitronectina”, por
su estructura similar a este compuesto Figura 6.3. Mecanismo de activación del
conocido en mamíferos. La acetosiringo- Agrobacterium tumefaciens.
Fragmentos de la pared celular de la
na generada por el vegetal induce en el
célula vegetal, son reconocidos por la
receptor VirA una reacción denominada proteína VirA. Esta activación, causa la
de autofosforilación (reacción típica de fosforilación de otra proteína ubicada en
sistemas de la transducción de señales la parte interior de la membrana de la
biológicas), la que hace que un grupo bacteria, VirG. VirG activa la transcripción
del operón vir, el que permite la síntesis
fosfato se “transfiera“ luego a la proteí-
de varias proteínas, como VirD2, la que
na VirG (Figura 6.3, paso 1). VirG es un reconoce el borde derecho del T-DNA y lo
factor transcripcional, es decir, que es- corta en esa zona. En seguida se produce
timula la transcripción de un gen a tra- la separación de la hebra cortada (a la vez
vés de su unión a una zona promotora. se va volviendo a sintetizar la hebra
desplazada), la que es protegida por VirE2
Así, los promotores del operón vir en el
para evitar su degradación. Este complejo
plasmidio Ti son activados, generando T es transportado finalmente a la célula
la transcripción del resto de los genes vegetal, a través de un canal constituido
vir (Figura 6.3, pasos 2 y 3). Al sinteti- por otras proteínas Vir, como son las del
zarse (transcribirse y traducirse) las pro- grupo VirB. En la célula vegetal, VirD2 y
VirE2 serán reconocidas por proteínas
teínas VirD2 y VirD1 (productos de la
receptoras y así, el complejo T llegará
familia de genes virD), más VirC1 (pro- al núcleo y se integrará al genoma.
ducto de la familia virC), cortan una sola
hebra del T-DNA y comienzan a sepa-

117

rarla de su hebra complementaria,
uniéndose covalentemente a sus extre-
mos (Figura 6.3, paso 4). Al mismo tiem-
po que se produce la separación y des-
plazamiento de la hebra simple de T-
DNA, se replica y reemplaza una nueva
hebra en el plasmidio Ti, quedando éste
intacto hacia el final del proceso de for-
mación del T-DNA hebra simple (T-
DNAss). El T-DNAss que se va generan-
do, es rápidamente cubierto y protegido
por múltiples unidades de la proteína
VirE2 (Figura 6.3, paso 5), de manera de
evitar su degradación ocasional (Figura
6 . 3 , p a s o 6 ) . E s t a h e b r a d e T- D N A
recubierta con VirE2, se conoce como
“complejo T”. Durante todo el proceso,
VirD2 permanece unida covalentemente
al extremo 5´ del T-DNA, sirviendo de
máquina de conducción, ayudada ade-
más por VirE1, para el paso del comple-
jo a través de un canal intercelular que
une a Agrobacterium con la célula ve-
getal que va a ser transformada. Este
canal está conformado por principal-
mente por proteínas de la familia VirB
(VirB4 y VirB11) y VirD4.
Figura 6.4. Bordes derecho e izquierdo del T-DNA. Secuencia de estas zonas repetidas
imperfectas. El borde derecho es reconocido por VirD2, activando todo el proceso de
transferencia e integración al genoma vegetal.
118
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
Una de las características más importan-
tes del T-DNA es que está flanqueado por
dos zonas nucleotídicas específicas, que
son secuencias repetidas y directas (Fi-
gura 6.4). Es precisamente gracias a es-
tas zonas, comúnmente denominadas
brazo izquierdo (ubicado en el extremo
3´) y brazo derecho (ubicado en el extre-
mo 5´) (Figura 6.2), que las proteínas
VirD2 y VirD1 reconocen dónde “cortar”
el T-DNA para comenzar a formar el com-
plejo T. Uno de los aspectos más intere-
santes en la transferencia del T-DNA, es en
la transferencia del T-DNA, donde VirD2
permanece siempre ligada al extremo 5´ del
complejo T, haciendo entonces que el bra-
zo derecho del T-DNA sea la zona que se
ve integrada en un cien por cien de las
plantas transformadas. Por el contrario,
existe variada evidencia de que el brazo
izquierdo del T-DNA no es tan perfecta-
mente integrado en el genoma de las
plantas infectadas. Pese a esta falta de
perfección en la integración del extremo
izquierdo, la correcta expresión de los
genes que se desea introducir a una plan-
ta específica no se ha visto alterada.
TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE PLANTAS
b) El paso del T-DNA hacia la célula
vegetal.
No está claro qué proteínas acompañan
al T-DNA en su viaje a la célula vegetal
y finalmente al núcleo. Como se advir-
tió más arriba, un modelo aún válido es
que el complejo T (compuesto por T-
DNA, VirD2 y VirE2) viaja por el canal,
guiado por VirD2 (Ward y Barnes, 1988).
El rol de VirE2 es menos claro, aunque
es claro que puede unirse a T-DNA he-
bra simple y protegerlo (Sen et al., 1989).
Existen numerosos experimentos que
han demostrado que el T-DNA sólo ne-
cesitaría ir unido a VirD2 y que podría
pasar en forma separada de VirE2 hacia
la célula vegetal (Gelvin, 2000). En este
sentido, la transferencia del T-DNA ha-
cia la célula vegetal, sería un proceso
bastante parecido a lo que es la conju-
gación bacteriana, donde la transferen-
cia de DNA desnudo entre bacterias a
través de un pili, permite al mismo tiem-
po la regeneración del material genético
en la bacteria de origen, (lo que ocurri-
ría físicamente cerca del pili (Stachel y
Zambryski, 1986)). Existe una tercera
proteína que también pasaría hacia la
célula vegetal que está siendo infecta-
da: VirF. Su función especulativa sería
interactuar con otras proteínas de la cé-
lula vegetal, para inducir la división ce-
lular de ésta, en conjunto con las fito-
hormonas producidas por los genes
”acarreados” en el mismo T-DNA. Este
es un evento sumamente necesario en
los primeros estados de desarrollo de la
infección, generando así el fenotipo de
la corona de la agalla. Como puede infe-
rirse, esto es también fundamental para
la transformación con fines biotecnoló-
gicos (Regensberg -Tuink y Hooyas,
1993).
c) Integración al genoma vegetal.
El proceso de integración del T-DNA al
genoma vegetal es un ejemplo específi-
co de un proceso biológico en el cual
las hebras de DNA dentro de un núcleo,
son intercambiadas o recombinadas; de-
bido a esto, el proceso se llama recombi-
nación del DNA. La recombinación for-
ma parte de procesos tan importantes
como la mantención y división celular
(Nam et al., 1998)
- Recombinación del DNA. Sin duda,
que la supervivencia de las especies está
influenciada por factores tales como una
cuidadosa replicación del DNA, la re-
paración del mismo y su variabilidad. La
recombinación genética tiene un rol
muy importante en la evolución de las
especies, debido al proceso de reordena-
miento en las secuencias del DNA para
generar nuevas combinaciones de genes
(Puchta y Hohn, 1996). Estos ”nuevos”
genes permitirían generar nuevos
mRNAs y proteínas, y por lo tanto, nue-
vos y mejores fenotipos. Una etapa muy
activa en cuanto a recombinaciones,
ocurre en la meiosis (etapa del “crossing
over”), donde la recombinación del DNA
puede resultar en gametos genética-
mente distintos, que permitan la produc-
ción de genotipos variados que pueden
ser más adecuados a un medioambiente
cambiante. Un aspecto esencialmente,
relevante es el rol inmediato que signi-
fica la recombinación del DNA en las
células: la reparación de segmentos da-
ñados. Gracias a la recombinación, una
hebra de DNA (o las dos) que ha sido
dañada (en algún segmento del genoma
de cualquier organismo), por ejemplo
por radiación UV, será rápidamente de-
tectada y reemplazada por una hebra
119
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

completamente nueva. Este sistema es tion”), donde RecA es la más conocida

conocido como de recombinación-repa-
ración del DNA (Britt, 1996).
Existen tres tipos de recombinación:
a) Homóloga.
b) Sitio específica.
c) Ilegítima.
- Recombinación homóloga: es aquel
proceso en el que se intercambian do-
bles hebras de DNA en zonas donde
existe una similitud substancial de las
secuencias (es decir, homología). Mien-
tras más largo sea el segmento homólo-
go, más posibilidad de recombinación
habrá (Puchta y Hohn, 1996) (Figura
6.5). La recombinación homóloga ha si-
do explotada ampliamente por el hom-
bre en sus programas de mejoramiento
genético tradicional de los cultivos (por
ejemplo, en la hibridación de líneas pu-
ras). La recombinación tanto en células
meióticas como mitóticas, requiere de
sistemas de proteínas que aún no son del
todo aclarados. En bacterias, este con-
junto de proteínas se agrupa con el nom-
bre de proteínas Rec (de “recombina-
(Buchanan et al., 2001). En plantas, ya
se han descrito genes homólogos al que
codifica para RecA (o sea, gen recA),
éstas se han llamado proteínas RAD. En
Arabidopsis thaliana, mutantes que no
reproducen RAD (o rad si se habla del
gen) funcional, no pueden reparar su
DNA cuando se someten a radiaciones
UV (Buchanan et al., 2001, Nam et al.,
1998) (ver más abajo).
- Recombinación sitio específica: este
mecanismo se ha identificado especial-
mente en E. coli. El DNA de E. coli po-
see zonas con secuencias que son homó-
logas al bacteriófago λ. Tras la infección,
el fago logra insertarse en el genoma
bacteriano mediante el reconocimiento
de estos sitios homólogos. Las secuen-
cias específicas de reconocimiento y re-
combinación se denominan zonas att
(por “attachment”). Si se habla de las se-
cuencias att del fago λ, se denominan
zonas attP y si éstas son de la bacteria,
se denominan zonas attB. Para la inser-
ción, el fago codifica una proteína lla-
mada integrasa (Int), que interactúa en

GACTTTAGCACC
CTGAAATCGTGG

GACTTTAGCACC
CTGAAATCGTGG

GACTTTAGCACC
CTGAAATCGTGG
Figura 6.5. Recombinación homóloga. Es el intercambio de dobles hebras
de DNA en zonas donde existe una similitud substancial de las secuencias
(es decir, una homología). Mientras más largo sea el segmento homólogo
(mostrado aquí por las secuencias), mayor es la posibilidad de
recombinación.

120
TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE PLANTAS

forma conjunta con un factor bacteriano
de integración (IHF, “integration host
factor”). Así, todo el DNA comprendido
entre las zonas attP del fago, se integran
entre las zonas attB de la bacteria
(Gardner y Nash, 1986) (Figura 6.6).
- Recombinación ilegítima: donde se in-
cluyen todos los eventos de recombina-
ción que no caen en las categorías an-
teriores. En esencia, este tipo de recam-
bio o integración entre hebras de DNA
no requiere homología de secuencias, o
si lo hace, estas son zonas de unos po-
cos nucleótidos de largo. Se postula que
en plantas, existe una importante pro-
porción de re-ordenamientos del DNA,
que no pueden ser explicados por homo-
logías entre secuencias, asumiéndose
que la recombinación ilegítima en plan-
tas en bastante alta (Buchanan et al.,
2001). Un gran ejemplo de recombina-
ción ilegítima en plantas el la integra-
ción del T-DNA en el genoma de las
plantas transformadas. El proceso de in-
tegración del T-DNA al genoma vegetal
tiene sus bases en nuestras ya conoci-
das proteínas de Agrobacterium VirD2 y
VirE2, las que en algunos sectores de su
secuencias, poseen sitios que sirven co-
mo señales para que se dirijan hacia el
núcleo (Gelvin, 2000), y con ello aca-
rrear al T-DNA unido. Se postula que el
mecanismo de tráfico al núcleo vegetal
estaría mediado por la interacción de es-
tas dos proteínas bacterianas, proceso
que sería apoyado por proteínas de la
planta. Se sabe que VirD2 es fosforilado
en un residuo de serina cercano a su do-
mino de señalización nuclear, teniendo
esta fosforilación un gran efecto en la
eficiencia de transporte al núcleo de la
planta (Gelvin, 2000). VirD2 desfos-
forilada prácticamente no tendría capa-
cidad de conducir al T-DNA al núcleo.

DNA fago λ
Secuencia attP Secuencia attP

DNA E. coli
Secuencia attP Secuencia attP

Factor de
integración Integrasa del fago
bacteriano

DNA E. coli
Secuencia attP Secuencia attP
Figura 6.6. Recombinación sitio específica. El DNA de E. coli posee se-
cuencias que son homólogas al DNA del bacteriófago λ. Tras la infección
por parte de este último, las secuencias específicas de reconocimiento y
recombinación (secuencias attP del fago λ y attB de la bacteria), son reco-
nocidas por una proteína integrasa (Int) del fago, la que interactúa con un
factor bacteriano de integración (IHF) para que todo el DNA comprendido
entre las zonas attP, se integre entre las zonas attB de la bacteria.

121

Se asume que VirD2 juega algún rol en
el proceso de integración al genoma,
debido a que mutaciones en su estruc-
tura alteran la eficiencia de este proce-
so (Gelvin, 1998; Mysore et al., 2000).
En el caso de VirE2, su rol sería menor,
dado que se ha demostrado que cepas
de A. tumefaciens mutantes que no sin-
tetizan esta proteína, muestran una dis-
minución en su tumorigenicidad (Gel-
vin, 2000; Yusirov et al., 1994), lo que
sin embargo, no descarta del todo la exis-
tencia de problemas en etapas anteriores
a la integración.
d) Proteínas de la planta involucradas en
la integración.
Debido a que la integración del T-DNA
involucra un proceso de recombinación
ilegítima, es esperable encontrar que
enzimas vegetales involucradas en el
proceso normal de recombinación/repa-
ración del DNA puedan tener participa-
ción en la integración. Este pensamien-
to ha llevado a utilizar plantas mutantes
de Arabidopsis thaliana que muestren
una deficiencia en sus sistemas de repa-
ración de DNA frente a radiaciones. Es-
tas plantas se denominan mutantes rad
(Nam et al., 1998). Se ha descubierto
que histonas (proteínas que intervienen
activamente en la formación de los
cromosomas), específicamente la H2A,
tienen una directa influencia en el pro-
ceso de integración de fragmentos linea-
les de DNA hacia los cromosomas
(Mysore et al., 2000). Mutantes rad, de-
ficientes en H2A, muestran una eficien-
cia reducida en la integración del T-
DNA, pero no así en la expresión transi-
toria de genes del “cassette” contenido
en el vector de transformación que po-
see un gen reportero. Como se sabe, la
122
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
expresión transitoria de estos “cassettes”,
no requiere la integración al genoma,
sino sólo su presencia dentro del núcleo,
de forma de tener acceso a la maquina-
ria de expresión de dicho “cassette”
(proteínas nucleares de transcripción).
Recientemente, algunos experimentos
estudiando la interacción proteína-pro-
teína, denominados sistemas de doble
híbridos en levadura, han demostrado
una interacción física entre H2A y VirD2
(Gelvin, 2000, Mysore et al., 1998).
Plasmidios binarios.
Debido a su gran tamaño, el plasmidio
Ti es en sí inmanejable en el laboratorio
y difícilmente podría utilizarse para
clonar directamente genes en él. Así,
para transformar una planta mediante A.
tumefaciens, se utilizan plasmidios de-
sarmados tipo Ti. Esto da origen, gene-
ralmente, a un sistema en el que dos
plasmidios complementan sus funcio-
nes, uno aportando con el operón vir y
el otro aportando el “cassette” con el gen
de interés. De esta forma, ambos plas-
midios en conjunto, complementan las
funciones de un plasmidio Ti normal (Fi-
gura 6.7). Estos plasmidios con funcio-
nes complementarias se llaman plasmi-
dios binarios. El plasmidio que lleva los
elementos relacionados con el T-DNA,
no posee los grupos de genes encarga-
dos de la síntesis de opinas ni los de la
síntesis de fitohormonas (citoquininas y
auxinas). En él se han reemplazado es-
tos, por "cassettes" de expresión de los
genes de interés. Como se ve, existe un
proceso de complementación de funcio-
nes entre ambos plasmidios binarios, los
que en su conjunto, equivalen a tener
un plasmidio Ti funcional, (sin formar el
tumor) y con la ventaja de hacerlos más
TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE PLANTAS
Figura 6.7. Racional del uso de A.
tumefaciens en el laboratorio.
Sistema de plasmidios binarios.
Para evitar la manifestación de la
enfermedad de la agalla de la corona
(producida por la síntesis de opinas),
en el laboratorio se usan plasmidios Ti
desarmados. Esto quiere decir que, se
han desarrollado cepas de
Agrobacterium que tienen un plasmidio
que aporta sólo las funciones vir. El
plasmidio con la región de T-DNA
es manipulado separadamente en el
laboratorio, utilizando todas las técnicas
del DNA recombinante para introducir
entre ambos brazos, los genes de interés
a expresar en la planta. Así, en la zona
del T-DNA, se ponen los “cassettes” de
expresión de proteínas externas y se han
abolido los genes de opinas y
fitohormonas, que propician la
formación del tumor observado
en la Figura 6.1.
pequeños en tamaño, de forma de po-
der manipularlos adecuadamente en el
laboratorio. Esta estrategia ha permitido
diseñar cepas comerciales de A. tume-
faciens que traen incorporadas el plas-
midio que contiene las funciones de vi-
rulencia (vir), como ocurre con la cepa
LBA4404, la más conocida y utilizada
hasta hoy para transformación de plan-
tas. Esta bacteria posee el plasmidio de-
nominado pAL4404 (al que se llama,
plasmidio Ti residente), con todos los ge-
nes vir necesarios para activar un even-
tual T-DNA que pudiera ser incorpora-
do a la bacteria. El T-DNA es aportado
entonces por otro plasmidio, el que ade-
más posee elementos que le permiten
funcionar como plasmidio lanzadera, es
decir, que funciona tanto en A. tumefa-
ciens como en E. coli. Esta característi-
ca, permite que todas las operaciones de
clonamiento de un gen de interés y su
manipulación para que se exprese co-
rrectamente en la planta, son posibles
de realizar en este plasmidio utilizando
bacterias tipo E. coli, tal como si fuera
un plasmidio pequeño y con todas las
herramientas que se pueden aplicar con
la tecnología del DNA recombinante.
Dentro de las señales necesarias para
este vector binario lanzadera, se encuen-
tran los “cassettes” de selección para
antibióticos y secuencias que permiten
que dicho plasmidio se pueda replicar,
tanto en bacterias tipo E. coli como en
bacterias tipo A. tumefaciens. También
en este plasmidio, se suele incluir el
“cassette” de selección para el proceso
de transformación propiamente tal, es
decir, la selección de las células que
efectivamente se han transformado.
Un sistema similar, pero menos usado en
la actualidad, es el denominado de plas-
123

midios integrativos. Este sistema explota
también un sistema dual de plasmidios,
con las funciones separadas de la misma
forma anterior. La diferencia con el siste-
ma binario radica en que esta vez se bus-
ca reconstituir un plasmidio Ti dentro de
Agrobacterium, a través de la recomb-
inación de secuencias homólogas entre
el plasmidio que porta la zona T-DNA y
el plasmidio que tiene la zona vir.
1. Genes reporteros y marcadores.
Cuando se realizan experimentos de trans-
formación, los explantes (o tejido que se
transforma) que son sujetos al evento, se
conforman por células que han sido efec-
tivamente transformadas (las menos) y cé-
lulas que no se transformaron eficien-
temente. Esto último puede deberse a
muchas razones, tales como que en efec-
to no son células transformadas o como
células que a pesar de ser transformadas,
es decir que el DNA entró a su interior,
nunca ingresará a su núcleo ni será incor-
porado definitivamente a su genoma.
Existen eventos de transformación en los
que los genes son ingresados al núcleo,
pero estos nunca serán integrados en el
genoma. En este tipo de ensayos, los genes
incluidos en los “cassettes” de transforma-
ción, son expresados de manera tempo-
ral, denominándose eventos de expresión
transitoria y que generalmente duran sólo
unos pocos días (por ejemplo, hasta 9
días) para ser finalmente eliminados de la
célula, generalmente por maquinarias de
degradación ácidos de nucleicos que le
resulten “extraños”.
Cuando se busca generar una nueva va-
riedad de plantas a través de transgenia,
se busca un evento de transformación
124
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
permanente, es decir, la transformación
estable del tejido blanco. Una forma de
aumentar la certeza de que se ha obte-
nido células establemente transforma-
das, es el crecimiento selectivo de las
células sometidas a transformación. Este
proceso de selección obliga a la utiliza-
ción de “cassettes” adicionales al de in-
terés, que expresan genes que confieren
alguna característica metabólica a la
planta, lo que hace que ella pueda cre-
cer en medios selectivos. Estos “casset-
tes” para los genes de selección, sólo
deben permitir la expresión de dichos
genes en la célula blanco (eucarionte) y
no en microorganismos contaminantes,
como el mismo A. tumefaciens, u otros
que pudieran estar presentes en la trans-
formación (ex profeso o casualmente).
Los marcadores de selección, son genes
que confieren un fenotipo dominante a
las células transformadas en comparación
a aquellas que no lo poseen. Los marca-
dores de selección pueden agruparse en
dos grandes tipos: a) aquellos que con-
fieren ya sea viabilidad o letalidad en
presencia de un agente selectivo en el
medio de cultivo (medio de selección) y
b) aquellos que no tienen un efecto evi-
dente en la supervivencia celular, pero
confieren alguna característica física
distinguible a las células transformadas.
a) Marcadores que confieren viabilidad
o letalidad a las células transformadas.
i. Genes de resistencia a antibióticos o
herbicidas: Una de las características
más empleadas es la resistencia a anti-
bióticos (por ejemplo kanamicina e hi-
gromicina), herbicidas (por ejemplo
Basta) u otras fitotoxinas. En general,
la resistencia conferida a la célula por
TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE PLANTAS
este tipo de genes de selección, se de-
be a la codificación de una enzima
que permite la destoxificación por
modificación química del tóxico, a la
síntesis de un agente blanco del tóxi-
co que sea menos sensible que el sil-
vestre o; a la sobre-expresión de la
proteína blanco, haciendo poco sig-
nificativo el efecto del tóxico en el me-
dio. El proceso de selección de las
plantas efectivamente transformadas,
consiste simplemente en hacer crecer
los explantes transformados en medios
conteniendo estos agentes selectivos
(tóxicos para células normales) en
concentraciones adecuadas. En la ac-
tualidad, la utilización de genes de re-
sistencia a antibióticos es muy discu-
tida, debido a los posibles efectos se-
cundarios que estos genes pueden
producir al ser ingeridos en alimentos
que utilizan como materia prima a cul-
tivos transgénicos. Esto ha llevado a
la búsqueda y utilización de nuevos
genes y estrategias.
ii. Marcadores de letalidad: Más que en
aplicaciones biotecnológicas, el uso
de este tipo de marcadores correspon-
de a ciencia básica. Un ejemplo de
esto puede ser utilizar un gen que co-
difique para una proteína tóxica bajo
las órdenes de un promotor que sea
activado sólo bajo ciertas condicio-
nes. De esta forma, al darse dicha
condición fisiológica o estímulo ex-
terno, se producirá la muerte celular.
Este tipo de marcadores ha permitido
establecer la tecnología “terminator”,
en la que expresando el gen de la bar-
nasa (una ribonucleasa inductora de
macho-esterilidad, originalmente exis-
tente en Bacillus amyloliquefaciens;
Denis et al., 1993) en células trans-
formadas, la planta transgénica gene-
re una progenie infértil, eliminando la
posibilidad de escapes, flujo génico e
incluso de la formación de progenie.
b) Marcadores visibles.
i. Marcadores histológicos: Ellos confie-
ren un fenotipo visible en presencia de
un sustrato aplicado exógenamente.
Esto ha dado origen a la utilización de
los llamados genes reporteros, los cua-
les al expresarse dentro de la planta
transgénica, expresan una actividad
biológica que es fácilmente evaluable
e incluso cuantificable. Dos son las
principales proteínas utilizadas; la pri-
mera de ellas es la enzima β-glucuro-
nidasa (GUS), que utiliza un sustrato
llamado β-glucurónido que es incolo-
ro y lo trasforma a un producto colo-
reado azul, que precipita sobre la mis-
ma enzima (Figura 6.8). La desventaja
de utilizar este gen reportero, es que
para realizar la detección de GUS, se
debe destruir el tejido transformado,
perdiendo el evento transgénico. En los
últimos doce a quince años, ha apare-
cido un segundo gen, cuya más impor-
tante característica es no requerir esta
destrucción del tejido transformado.
Éste codifica para la denominada pro-
teína verde fluorescente (“green
fluorescent protein”, GFP), que se ais-
ló de Aquorea victoria y que tiene la
particularidad de emitir una luz verde
neón cuando es excitada con luz
ultravioleta (Figura 6.9). La utilización
de GFP ha permitido generar incluso
procedimientos de obtención de plan-
tas transgénicas sin la utilización de ge-
nes de selección metabólica o resisten-
cia a antibióticos, como los anterior-
mente mencionados.
125
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

Figura 6.8.
Genes reporteros.
Expresión de
ß- glucuronidasa.
La enzima ß-glucu-
ronidasa (GUS) uti-
liza un sustrato lla-
mado ß-glucuróni-
do, que es incolo-
ro y lo trasforma a
un producto colo-
reado azul que pre-
cipita sobre la misma enzima. Cuando una planta es transformada con este gen, el
tejido al ser incubado con el sustrato en las condiciones adecuadas, se tornará azul en
el lugar donde se expresa. En la fotografía izquierda, se muestran embriones de poroto
disparados con partículas de oro recubiertas con DNA que codifica para la enzima
reportera (izquierda misma fotografía) y sin DNA (derecha misma fotografía). La barra
corresponde a 1 milímetro. A la derecha, vista de una semilla de pepino (Solanum
muricatum) después de ser disparada, observándose los “pellets” de partículas (ver
biobalística).

Figura 6.9.
Genes reporteros. Expresión
de proteína verde fluorescente.
El gen de la "green fluorescent protein" o
GFP, que se aisló de la medusa Aquorea
victoria y que tiene la particularidad de
emitir una luz verde neón cuando es
excitada con luz ultravioleta. GFP ha
permitido generar incluso procedimientos
de obtención de plantas transgénicas sin la
utilización de genes de selección
metabólica o resistencia a antibióticos,
como los mencionados en el texto. En las
fotografías se muestra una hoja de pepino
que ha sido infectada con A. tumefaciens
(arriba, la expresión de GFP (emisión en
verde neón) en las zonas cercanas al daño
mecánico generado y el color rojo causado
por la excitación de la clorofila por luz UV).
Al medio, se ve un acercamiento a esta
situación, definiéndose claramente los
bordes de las células transformadas.
Abajo, expresión estable de GFP en hojas
de plantas de vid obtenidas en INIA - La
Platina. Al ser iluminadas con luz UV,
la clorofila emite color rojo (izquierda).
Sin embargo, en células transformadas,
la emisión de GFP logra sobreponerse con
su típico color verde neón (derecha).

126
TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE PLANTAS
ii. Marcadores morfológicos: Corres-
ponden a genes que codifican para
proteínas que generan, en las células
transformadas, un cambio fenotípico
fácilmente evaluable. Si estos marca-
dores se ubican bajo las órdenes de
un promotor que responde a un estí-
mulo químico del medio (un agente
inductor), la aplicación de este agen-
te permitirá la selección de las célu-
las transformadas. Este inductor pue-
de ser luego quitado y así las células
seleccionadas pueden recobrar su
morfología normal. Actualmente, es-
tos sistemas son de amplio uso bio-
tecnológico y se conocen con el nom-
bre de MAT (del inglés “multi-auto-
transformation”). Son sistemas que
utilizan genes metabólicos que per-
miten seleccionar positivamente las
células o el tejido transformado. Los
sistemas MAT de uso cada vez más
popular (Ebinuma et al., 2001; Endo
et al., 2002), se pueden agrupar se-
gún el tipo de enzima o elemento
metabólico de selección: a) aquellos
que usan el gen de la enzima isopen-
tenil transferasa (ipt) (Kunkel et al.,
1999; Wabico et al., 1989) y b) aque-
llos que usan los genes rol A, B y C
de A. rhizogenes (Kiyokawa et al.,
1994). Al ser transformadas con ipt,
las células que incorporan el gen en-
tran en una activa proliferación, debi-
do a que la enzima cataliza la sínte-
sis de citoquininas. Por otro lado, las
Figura 6.10. Principio de la biobalística. Consiste en precipitar DNA sobre la superficie de par-
tículas, las que serán lanzadas luego a alta presión sobre tejidos o explantes, de forma que el
DNA llegue al núcleo de las células que los constituyen.
células transformadas con los genes
rol, son capaces de inducir la forma-
ción de pelillos radicales aéreos, de-
bido a un aumento en la sensibilidad
a auxinas. De esta forma, ambas plan-
tas o células transformadas, podrán
ser distinguidas fenotípicamente de
sus contrapartes no transformadas.
Los sistemas MAT poseen además,
elementos que permiten su escisión
del genoma de las células o plantas
transformadas (ver más abajo).
BIOBALÍSTICA
La interacción natural entre Agrobacte-
rium y las plantas, inicialmente se creyó
limitada al espectro de las dicotiledó-
neas. Debido a esto, en 1991, John San-
ford y su grupo, en el Campus Geneva
de la U. de Cornell, crearon un sistema
de alta presión que fuera capaz de impul-
sar pequeñas partículas de metales consi-
derados inertes para la célula, como oro
o tungsteno. Estas partículas se recubren
con genes quiméricos, de forma que ellos
lleguen al núcleo y se incorporen al geno-
ma de la célula (Figura 6.10). Se asume
que las partículas, una vez ingresadas a
la célula, desprenden el DNA que se ha
depositado sobre su superficie, debido a
la acción de los líquidos intracelulares.
Este proceso esencialmente físico, permi-
tió superar el inicial impedimento prác-
tico de transformar especies monocotile-
dóneas en un laboratorio.
127

Una de las ventajas del sistema de
biobalística, es que prácticamente se
puede utilizar en cualquier sistema ve-
getal, quedando así abierta la posibili-
dad de transformación in situ de células
diferenciadas, sin necesidad de un culti-
vo in vitro previo o de regeneración pos-
terior, como lo requiere la metodología
a través de A. tumefaciens. Esto ha per-
mitido, por ejemplo, la transformación
de células meristemáticas apicales con
una eficiencia aceptable (0,007 a 0,003
%). Sin embargo, esta eficiencia se pue-
de aumentar (por ejemplo hasta 1%) a
través de la inducción de procesos de
organogénesis en la región transforma-
da, mediante la utilización de citoquini-
nas (por ejemplo bencilaminopurina)
para generar multibrotación (Ver Capí-
tulos 2-4).
METODOLOGÍAS
DE TRANSFORMACIÓN
1. Transformación mediada por
Agrobacterium tumefaciens.
Como se mencionó anteriormente, la
factibilidad de instaurar sistemas de trans-
formación utilizando A. tumefaciens ge-
neralmente involucran un gran esfuerzo
en desarrollar líneas celulares con alta
capacidad de regeneración. Una vez ob-
tenida una línea celular específica, se
desarrollan los experimentos de transfor-
mación, los que en términos generales
constan de tres etapas básicas (Figuras
6.11a y 6.11b):
a) Infección: en la que se ponen en con-
tacto los explantes celulares con la so-
lución de bacteria. Esta etapa es de
una duración variable en la que se
128
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
procura el reconocimiento entre las
proteínas receptoras de la bacteria y
los ligandos de la pared celular vege-
tal. Para la infección se pueden reque-
rir tiempos breves de sólo algunos se-
gundos (como por ejemplo para taba-
co), tiempos intermedios de un par de
minutos (como por ejemplo para vi-
des) o, tiempos bastante prolongados
(como por ejemplo para durazno). De
la misma forma, la concentración óp-
tima de bacteria (medida como OD600)
varía entre 0,1 y 1,0. Una vez realiza-
da la infección, los explantes son ex-
traídos de las solución bacteriana y el
exceso de bacterias es eliminado cui-
dadosamente mediante un papel fil-
tro. Entonces ya se puede dar paso a
la segunda etapa.
b) Co-cultivo: se denomina así a la eta-
pa que implica todos los eventos de
generación del complejo-T y trasla-
do a la célula vegetal. El tiempo sufi-
ciente para el co-cultivo es depen-
diente del modelo de trabajo, encon-
trándose generalmente suficiente
unas 48 horas, en medios propicios
para que ambos componentes, bac-
teria y explante, interactúen efectiva-
mente generando la transformación.
c) Selección y regeneración del explan-
te transformado: esta es la etapa más
larga de todo el proceso de transfor-
mación, pudiendo durar tantos me-
ses como el sistema de regeneración
de la célula vegetal disponga. Una
vez pasado el tiempo de co-cultivo,
ya no interesa más la presencia de
Agrobacterium en el mismo medio en
que están las células transformadas.
Para eliminarlo, se utilizan antibióti-
cos (usualmente cefotaxime), aplicán-
TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE PLANTAS

dolos por un determinado tiempo
hasta que ya no existen evidencias de
la bacteria en el medio de selección
y regeneración. Como este nombre lo
indica, también es un medio de se-
lección, por ello, junto con eliminar
al Agrobacterium, se pretende no es-
timular la multiplicación y regenera-
ción de células no transformadas.
Hasta la fecha, los agentes de selec-
ción más utilizados los constituyen
antibióticos como la kanamicina,
cuyo efecto final es precisamente eli-
minar todas las células vegetales que
no hayan incorporado los genes de-
seados desde el plasmidio. Sin embar-
go, la aparición de nuevos agentes de
selección, como la misma GFP (Figu-
ra 6.11b) o genes que confieren ca-
racterísticas metabólicas específicas
a la planta, han permitido la genera-
ción de nuevos vectores de transfor-
mación en los que se excluyen genes
de resistencia a antibióticos, cuya uti-
lización se ha cuestionado debido a
sus posibles efectos en el humano.

Figura 6.11a. Transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens.

En la etapa de infección, se ponen en contacto los explantes celulares con la
solución de bacterias, para dejarse en este estado por un período de tiempo
denominado co-cultivo (usualmente entre 48 y 72 horas). Esto da tiempo para
la infección y transformación propiamente tal. Luego viene una etapa de se-
lección y regeneración del explante transformado, en donde se permitirá el
desarrollo sólo de las células efectivamente transformadas, lo que se evalúa
utilizando diversos genes marcadores, ya sea de resistencia a antibióticos,
metabólicos o reporteros (ver texto). Luego de la selección, las plántulas
promisorias son traspasadas a tierra y finalmente recuperadas.

Figura 6.11b. Sistema de regeneración de Nicotiana benthamiana. Utilizando GFP (proteína

fluorescente verde) es posible hacer el seguimiento de la transformación por visualización del
verde neón en los callos transformados (1). Luego, estos son rescatados (2) y llevados a re-dife-
renciar nuevamente, hasta la obtención de plántulas (3), que son finalmente enraizadas (4).

129
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

2. Transformación mediada por a) Preparación de las partículas: donde

biobalística.
El sistema de biobalística consta esen-
cialmente de una cámara de vacío y un
sistema de acumulación de presión, para
el que se utiliza un gas inerte para las
células (por ejemplo helio) (Figura 6.12).
Esta presión será la que impulsará las
partículas que han sido recubiertas con
el plasmidio o “cassette” de interés (Fi-
gura 6.10). Las etapas más importantes
en el proceso de biobalística son:
se precipita el DNA de interés en in-
troducir a la planta, utilizando para
ello CaCl 2 , espermidina y etanol. To-
dos estos elementos corresponden, en
esencia, a elementos que desplazan
agua desde las hebras de DNA pro-
duciendo así la precipitación sobre la
superficie de las partículas.
b) Preparación de las membranas por-
tadoras: éstas son membranas circu-
lares de aproximadamente 1,5 cm de
diámetro sobre las que se deposita

Figura 6.12. Principio del sistema de biobalística.

Las partículas con DNA precipitado en su superficie, son depositadas sobre una membrana
transportadora (1). Esta membrana es invertida, de modo que las partículas quedan mirando
hacia abajo (2). De esta forma, son posicionadas en la pistola (4). Para hacer el disparo,
se acumula presión en el cilindro del sistema (3). Esta presión es rota mediante la ruptura
de membranas que específicamente retienen el gas dentro del cilindro (barra negra en (3)).
Así, cuando se decide, éstas se rompen, generando la onda expansiva que acelera la
membrana portadora de las partículas. Este viaje dura hasta que la membrana es detenida
por una rejilla de detención, pero que permite el paso de las partículas con el DNA,
de modo que éstas llegan a impactar al tejido blanco (5).

130
TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE PLANTAS

una cantidad adecuada de partículas por la rejilla de parada y las partículas

preparadas (con DNA en su superfi-
cie) (Figura 6.12, paso 1). El material
de estas membranas es extremada-
mente resistente, comercialmente
conocido como Kapton (de Dupont).
c) Preparación del dispositivo porta
membrana: que corresponde a un
anillo que tiene como objetivo rete-
ner a la membrana portadora, de
manera invertida (exponiendo las
partículas hacia abajo (Figura 6.12,
paso 2) y adaptarla al sistema de in-
yección de gas (Figura 6.12, paso 4).
d) Armado del sistema de retensión: tras
ubicar las membranas portadoras del
DNA, a una distancia que puede va-
riar entre 0,5 a 1,5 cm, se ubica una
rejilla de parada para la membrana
portadora. La idea es que, tras el im-
pulso dado por la presión de gas, la
membrana portadora acelere esta dis-
tancia y se detenga súbitamente. De
este modo, la membrana será retenida
seguirán su viaje hasta impactar con el
tejido blanco (Figura 6.12, paso 5).
e) Producción de la onda de impulso:
Como se mencionó, se utiliza un gas
considerado inerte para la célula, el
helio. Para generar la presión de gas,
éste se acumula en un cilindro en el
que uno de sus extremos está abierto y
habilitado para poner membranas de
ruptura. La función de estas membra-
nas de ruptura es retener la presión de-
seada de trabajo y luego, al inducir su
ruptura por acción mecánica (por
ejemplo con una aguja), liberarla ge-
nerando la onda expansiva necesaria
para impulsar las membranas portado-
ras (Figura 6.12, paso 3).
Existen numerosos sistemas y variantes
comercialmente disponibles en cuanto a
biobalística. El costo aproximado de este
tipo de equipos puede ascender a US$
5.000 ó US$ 10.000, dependiendo de su
automatización y origen (Figura 6.13).

Figura 6.13. Vista externa de sistemas comerciales de biobalística.

Vista exterior del aspecto que tienen dos aparatos de biobalística. Izquierda,
“pistola” desarrollada por DuPont semiautomatizada. Derecha, sistema
desarrollado por EMBRAPA-CENARGEN, Brasil. Ambos sistemas se encuentran
en distintos laboratorios de nuestro país, como son INIA, PUC y Bioforest.

131

ELIMINANDO
LOS GENES INDESEADOS
La mayoría de las técnicas de transfor-
mación introducen un gen de selección
que confiere resistencia a antibióticos,
junto con el gen de interés. Una de las
metas más deseadas en el camino del
mejoramiento de plantas mediado por
transgenia, es la obtención de nuevos
cultivos con un mínimo de modificación
de su fondo genético, siendo en efecto
ésta una de las grandes ventajas de la
transgenia en comparación con los cul-
tivos mejorados sexualmente (mejora-
miento convencional).
En casi todos los casos, el gen de resis-
tencia incorporado en forma accesoria
ya no es útil una vez que se ha supera-
do la etapa de selección de los clones
transformados, siendo deseable eliminar-
lo desde las plantas transformadas y se-
leccionadas. En el caso de los genes in-
sertados en el genoma nuclear de las
plantas, se han ideado varias aproxima-
ciones para retirar estos genes de resis-
tencia al antibiótico.
1. Sistemas de remoción de los genes
de resistencia.
i. Co-transformación: consiste en la
transformación en paralelo de dos loci
distintos y lejanos, uno conteniendo el
“cassette” para el gen de interés y el
otro, conteniendo el “cassette” con el
gen de resistencia a antibiótico. Ambos
“cassettes” se insertan en estos sitios dis-
tantes, pudiendo ser separados posterior-
mente por segregación de las progenies
de las transformantes, mediante mejora-
miento convencional (retrocruzas).
132
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
Existen tres formas de generar la co-
transformación:
• Utilizando dos plasmidios binarios,
cada uno en una cepa de A. tumefa-
ciens distinta (De Neve et al., 1997).
• Utilizando dos plasmidios binarios,
ambos presentes en una sola célula de
A. tumefaciens (Daley et al., 1998).
• Utilizando un plasmidio binario, con
dos T-DNAs distintos, uno para cada
“cassette” (Komari et al., 1996).
Aunque la eficiencia de estos sistemas
está dada por muchas variables, se ha
observado un amplio rango de variación
entre la frecuencia de transformación
con uno y otro “cassette”. Existen nu-
merosos factores que pudieran explicar
esta diferencia de efectividad, como el
estado de los explantes vegetales y su
efecto sobre la adhesión de la bacteria
a su superficie, en el caso de dos bacte-
rias y dos “cassettes”. Sin embargo, la
utilización de dos T-DNAs o dos plasmi-
dios binarios dentro de una misma cé-
lula de A. tumefaciens, ha rendido bue-
nos resultados.
Por otra parte, se ha observado que exis-
ten diferencias entre los niveles de se-
gregación que se obtienen en las plan-
tas transgénicas al utilizar cepas de A.
tumefaciens sintetizadoras de nopalinas
o de octopinas. Las primeras, son bac-
terias que propician la inserción de T-
DNAs más ligados genéticamente o, lo
q u e e s l o m i s m o , e n l o c i c e rc a n o s
(Ebinuma et al., 2001).
ii. Recombinación sitio-específica: este
proceso explota un fenómeno descrito
TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE PLANTAS

en el bacteriófago llamado P1, que fun- cruzamiento de la línea de plantas

ciona de un modo bastante similar a lo
descrito para la recombinación de se-
cuencias att del bacteriófago λ y E. coli.
En el caso de P1, tenemos la existencia
de sitios específicos en un DNA, deno-
minadas secuencias loxP, los que son re-
conocidos por una enzima que los corta
y promueve su escisión, la recombinasa
Cre. Por lo tanto, cualquier secuencia
que esté rodeada de dos sitios loxP, será
escindida si existe en forma paralela la
expresión de Cre (Odell et al., 1990). Si
un “cassette” de expresión de resisten-
cia a antibióticos es flanqueado por dos
sitios loxP, bastará la expresión de la
proteína Cre en la misma planta para
producir la salida de dicho “cassette”
(Figura 6.14). En mejoramiento vegetal,
esto se realiza mediante dos formas: a)
la re-transformación con un “cassette”
de expresión de Cre de una planta ya
transgénica (Dale y Ow, 1991), ó b) por
transgénicas con una línea que previa-
mente ha sido transformada con el “cas-
sette” Cre (Ebinuma et al., 2001). La efi-
ciencia de este sistema es relativa, ob-
servándose que es la línea portadora de
Cre el factor que otorga esta variabili-
dad de resultados (Russel et al., 1992).
En similitud al sistema Cre/lox, el ya des-
crito sistema de recombinación basado
en zonas attP de fago λ y attB de E. coli,
también tiene su aplicación en plantas
transgénicas. Recientemente se ha gene-
rado un sistema de plasmidios binarios
que explotan la recombinación homóloga
entre dos sitios attP, prescindiendo abso-
lutamente de los elementos Int e IHF, pero
incluyendo en forma adicional en dicho
plasmidio, una secuencia de nucleótidos
estimuladora de eventos de recombina-
ción (Zubko et al. 2000).

Secuencia Secuencia
lox lox
T-DNA insertado
al genoma vegetal
Promotor Resistencia a Terminador Cassette de interés
antibiótico
(ej. Kanamicina)
Cre

Secuencia
lox
T-DNA insertado
al genoma vegetal
Cassette de interés

Figura 6.14. Sistemas de eliminación de genes marcadores o de resistencia a

antibióticos. Sistema Cre/lox. Es un sistema descrito en el bacteriófago P1. Éste
tiene sitios específicos en su DNA, denominadas secuencias loxP, que son recono-
cidas por una enzima (codificada por el mismo fago) que las corta y promueve su
escisión, la recombinasa Cre. Al insertar un “cassette“ de resistencia a antibiótico
flanqueado por estas secuencias, una planta que tenga la capacidad de producir la
recombinasa Cre, escindirá dicho “cassette” del genoma de la planta transgénica.

133
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

iii. Sistema de elementos transposables: denominan transposasas. De esta forma,

que utiliza elementos genéticos salta-
rines que explotan la recombinación ile-
gítima. Estos elementos específicos se
llaman secuencias móviles o transposo-
nes, descritos por primera vez en euca-
riontes por Barbara McClintock a través
de sus trabajos en maíz. Ella identificó
este tipo de secuencias y las denominó
Ds (del inglés “dissociation”)(Rhoades,
1984). Los elementos Ds, son secuencias
repetitivas invertidas y se pueden escin-
dir de un sitio genómico y ubicarse en
otro espontáneamente. Eso sí, bajo la
presencia de otro elemento, denomina-
do Ac (del inglés “activator”). Ac pro-
porciona las actividades enzimáticas
necesarias para este salto de un lugar a
otro (Fedorof, 1989). Estas enzimas se
“cassettes” flanqueados por secuencias
Ds, en presencia de los genes de trans-
posasa ubicados en Ac, generarán el
“salto” de dicho “cassette” hacia un
locus distante del originalmente utiliza-
do para la transformación (Figura 6.15).
Así, se permite realizar la segregación
de ambos “cassettes” mediante retrocru-
zas posteriores (Goldsbrough et al.,
1993), de la misma forma como se haría
en un sistema de co-transformación.
Todos estos sistemas tratan de remover
los genes de selección utilizados. Sin
embargo, como contrapartida, se han ge-
nerado también sistemas que utilizan la
incorporación de un marcador metabóli-
co positivo.

Secuencia Secuencia
Ds Ds
T-DNA insertado
Promotor Resistencia Terminador Cassette de interés al genoma vegetal
a antibiótico
(ej. Kanamicina)
Ac

Cassette de interés
T-DNA insertado

Resistencia
Secuencia a antibiótico Secuencia
Ds (ej. Kanamicina) Ds
Transposón que
Promotor Terminador salió a otro locus

Figura 6.15. Sistemas de eliminación de genes marcadores o de resistencia

a antibióticos. Sistema con elementos transposables de maíz Ac/Ds. Los
transposones Ds son secuencias repetitivas invertidas y se pueden escindir
de un sitio genómico y ubicarse en otro espontáneamente. Esto requiere
la presencia de otros elementos proteicos, que se encuentran en genes
denominados Ac. De esta forma, un ”casete” de resistencia a antibióticos
flanqueado por secuencias Ds, en presencia de los genes de transposasa
ubicados en Ac, harán que dicho “cassette” salte hacia un locus distante
del originalmente utilizado para la transformación, y que permitirá
entonces realizar la segregación de los “cassettes” de interés
y de resistencia mediante retrocruzas.

134
TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE PLANTAS
2. Sistemas que incorporan un
marcador positivo.
Como se mencionó anteriormente, el uso
de marcadores de selección positiva (sis-
temas MAT) ha despertado gran interés,
considerando su potencialidad con res-
pecto a la obtención de plantas trans-
génicas libres de "cassettes" de selec-
ción. Todos los MAT utilizan, en adición
a los genes o grupo de genes de selec-
ción, los elementos transposables de
maíz Ac/Ds o bien secuencias de recom-
binación sitio específicas denominadas
R/RS (que provienen de un plasmidio lla-
mado pRS1 de Zygosaccharomyces rouxi
(Ebinuma et al., 2001)). En ambos casos,
los elementos Ac y R/RS se usan para
flanquear el "cassette" de expresión del
gen marcador metabólico, el que es es-
cindido luego de la selección primaria,
al expresar la recombinasa respectiva.
El elemento transposable Ac ha mostra-
do poseer la capacidad de re-ubicarse
en el genoma en el 90% de los eventos
de transformación, mientras que en el
10% de los eventos restantes, no se re-
inserta, generando la eliminación per-
manente del “cassette” de selección. En
el caso del sistema de recombinación R/
RS, la recombinasa R reconoce dos se-
cuencias específicas contiguas RS, ha-
ciendo posible la eliminación de un
“cassette” de selección flanqueado por
estos elementos.
PLANTAS TRANSGÉNICAS
DE PRIMERA GENERACIÓN.
Las pasadas décadas han marcado un
hito en la aplicación de la ingeniería
genética de plantas y por ende en la agri-
cultura. La primera generación de plan-
tas obtenidas por biotecnología, por le-
jos, se concentró en la incorporación de
genes de resistencia a insectos y genes
de tolerancia a herbicidas (Chua y Sun-
daresan, 2000). Estos rasgos incorpora-
dos, han permitido la reducción de pér-
didas por aparición de malezas y de pes-
tes, así como una disminución en la can-
tidad de químicos utilizados en su pre-
vención. Se estima que el primer país en
comercializar cultivos GM fue China, a
principios de la década de 1990. En
1994, la empresa Calgene comercializó
el tomate Flavr-Savr, con maduración
retardada debido a la introducción, en
forma antisentido, del gen de la poliga-
lacturonasa, enzima encargada del me-
tabolismo de la pared celular. Ya en
1995, se habían otorgado nueve conce-
siones para la comercialización de es-
tos cultivos, siendo Canadá y Estados
Unidos los principales países en apro-
barlas. El éxito de estos cultivos GM ha
sido tal, que ya en el año 2000 se supe-
ró los 40 millones de hectáreas, tenien-
do como países más importantes, por su
área total sembrada, a Argentina y Esta-
dos Unidos (James, 2000).
En el caso de las plantas con tolerancia
al herbicida glufosinato de amonio (Bas-
ta), destaca como cultivo la soya, repre-
sentando más de la mitad del total de
cultivos GM sembrados en el mundo
hacia fines de la década pasada (James,
1998). Con este mismo carácter, le si-
guieron canola y maíz en este mismo pe-
ríodo de tiempo. Casi todos los eventos
disponibles o comercializados con este
rasgo en la actualidad, utilizan como
fuente de resistencia el gen pat, de la
bacteria Streptomyces viridochromoge-
nes cepa Tu494, que codifica para la
enzima fosfinotricin-acetil transferasa
135

(proteína PAT). Al estar presente en las
plantas, PAT permite que éstas desacti-
ven a la fosfinotricina, principio activo
de los herbicidas de este tipo.
Hacia fines de la década de 1990 desta-
có el conocido maíz Bt (James, 1998),
que utiliza diferentes genes de la fami-
lia cry de Bacillus thuringiensis subsp.
kurstaki cepa HD-1, para expresar la
proteína CRY que confiere resistencia
aumentada a insectos (Prieto-Samsonov
et al., 1997). El mecanismo de acción
de esta proteína es formar agrupaciones
cristalinas en los aparatos digestivos de
lepidópteros, es decir, verdaderos cana-
les o perforaciones el tracto digestivo de
los insectos, generando su muerte. Este
tipo de cultivo llegó a ser un 25 por cien-
to del total de los transgénicos sembra-
dos en el mundo en ese período.
Un tercer cultivo de importancia por su
volumen de área sembrada para comer-
cialización, ha sido la producción ma-
siva de algodón GM (James, 1998), el
que se ha modificado con ambas carac-
terísticas, es decir, resistencia a insec-
tos y a herbicidas. A fines de la década
pasada, su siembra ocupaba el 10 por
ciento del total de cultivos GM sembra-
dos en el mundo.
PLANTAS TRANSGÉNICAS
DE SEGUNDA GENERACIÓN
Y POSTERIORES.
a) Plantas con contenido nutricio
mejorado.
Uno de los hitos en el desarrollo de las
plantas genéticamente modificadas lo
constituyó el denominado “arroz dora-
136
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
do”. En 1990, un grupo de investigado-
res, liderados por Ingo Potrykus (ETH-
Zurich, Suiza), propuso a la Fundación
Rockefeller y a su Programa de Biotec-
nología en Nueva York, desarrollar un
proyecto para introducir una vía meta-
bólica que permitiera la producción de
provitamina-A en el endosperma del gra-
no de arroz. Se sabe que la deficiencia
de vitamina A en dietas de países de es-
casos recursos, incide en enfermedades
como la ceguera nocturna, xeroftalmia
y keratomalacia, pudiendo generar final-
mente ceguera total (Sommer, 1989). Fue
así como este proyecto, a pesar de ser
concebido como de difícil viabilidad
técnica, comenzó su ejecución median-
te la fusión de núcleos de científicos con
variadas habilidades. Un grupo que es-
taba trabajando en la vía del metabolis-
mo de los terpenos en endosperma de
arroz (grupo de Peter Beyer, University
of Freiburg, Alemania), se unió con otro
grupo de gran dominio en la ingeniería
genética (grupo de Ingo Potrikus, ETH-
Zurich, Suiza). Estudios preliminares
permitieron a este núcleo de investiga-
dores determinar que, gracias a la fun-
ción de cuatro enzimas: fitoeno sin-
tetasa, fitoeno desaturasa, ξ-caroteno
desaturasa y licopeno β-ciclasa; se po-
dría en teoría, producir β-caroteno, o
provitamina-A (Burkhardt et al., 1997;
Ward y Barnes, 1988). La metodología
de obtención de esta nueva variedad de
arroz, consistió en la co-transformación
con dos cepas de A. tumefaciens portan-
do todos los genes necesarios para la
ruta metabólica más el “cassette” con el
gen de selección. Un plasmidio binario
contenía los genes necesarios para la
producción de licopeno en los plastidios
del endosperma de arroz: el gen de la
TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE PLANTAS
fitoeno sintetasa de narciso (Narcissus
pseudonarcissus) y el gen de la fitoeno
desaturasa de una bacteria (Erwinia
uredovora). El otro plasmidio contenía
otros dos genes: el de la licopeno β-
ciclasa de narciso y el “cassette” para
resistencia a higromicina. De esta for-
ma, el segundo plasmidio permitiría la
síntesis completa hasta β-caroteno.
Como se habrá notado, se utilizaron sólo
tres de los cuatro genes anteriormente
mencionados como necesarios en la ruta
sintética completa. Esto debido a que el
uso de una caroteno desaturasa de ori-
gen bacteriano, permitió prescindir del
uso de las desaturasas vegetales, las que
en su conjunto tienen el mismo rol que
la enzima bacteriana (introducir dos
dobles enlaces en la estructura del
fitoeno). Así, tras ocho años de trabajo,
se obtuvo una planta de arroz, fenotí-
picamente normal, fértil y con buen con-
tenido de β-caroteno en su endosperma
(1,6 mg/g) (Ye et al., 2000). Desafortu-
nadamente, no se han podido llevar a
cabo los ensayos a nivel de campo, de-
bido a la moratoria de 10 años que exis-
te en Suiza para las pruebas de campo
con cultivos GM.
Debido a esto, la actual estrategia de los
generadores del “arroz dorado” es inte-
grarse activamente con sus líneas trans-
génicas, a programas de mejoramiento y
evaluación locales, para la introducción
de este rasgo a especies localmente adap-
tadas y ecotipos propios de los países
productores de arroz. Todo esto bajo las
premisas y regulaciones que existen en
los diversos países para el empleo de cul-
tivos GM. Un claro ejemplo de esto, re-
presenta la decisión del Consejo Indio
para la Investigación Agrícola, quienes
han decidido evaluar detalladamente es-
tas variedades, tanto desde el punto de
vista biológico como su impacto econó-
mico-social (Potrykus, 2001).
b) Plantas como agentes productoras
de vacunas.
Durante la década de 1980, el avance en
el conocimiento de aspectos moleculares
genéticos del sistema inmune y su apli-
cación a la patología humana, permitie-
ron sentar las bases para nuevos sistemas
de elaboración de anticuerpos (como lo
es la producción de anticuerpos mono-
clonales) o generación de vacunas. De
esta forma, la posibilidad de expresar en
plantas, determinadas secuencias nucleo-
tídicas con capacidad de expresar pép-
tidos claves que son capaces de inducir
una respuesta inmune, ha sido de gran
interés. Estos péptidos reciben el nombre
de epítopes o determinantes antigénicos,
siendo una cadena lineal de entre 7 y 15
aminoácidos específica del agente infec-
cioso (Arakawa et al., 1998; Haq et al.,
1995; Thanavala et al., 1995).
Uno de los aspectos más atractivos del
uso de plantas tansgénicas que expre-
san epítopes específicos (o plantas pro-
ductoras de vacunas), es que, a diferen-
cia de los sistemas animales utilizados
para este mismo fin, las plantas sólo re-
quieren agua, luz solar y sales minera-
les para su mantención, siendo un siste-
ma mucho más barato. Además, la pro-
ducción de este tipo de péptidos en
plantas, se ofrece como un sistema mu-
cho más limpio que el animal, si se pien-
sa en los diversos contaminantes bioló-
gicos que acompañan a estos últimos
(especialmente otros patógenos asocia-
137

dos al animal productor). También resal-
ta que, por sus características de produc-
ción, las plantas proveen anticuerpos
estables a temperatura ambiente y, final-
mente, la producción de vacunas en
plantas, facilita la obtención de produc-
tos administrables por vía oral (Walmsley
y Arntzen, 2000).
El éxito de la producción de vacunas en
plantas implica desarrollar un producto
que sea capaz de inducir una respuesta
inmune a nivel de la mucosa gástrica.
Una vez en el tracto digestivo, el antígeno
suministrado por vía oral será reconoci-
do las células M de la mucosa linfática
del tracto. Estas células dirigirán el
antígeno hacia otro tipo de células, de-
nominadas células presentadoras del
antígeno (del inglés “antigen presenting
cell”, APS). Éstas internalizarán, proce-
sarán y finalmente mostrarán en su mem-
brana plasmática, los epítopes específi-
cos asociados a dicho patógeno para que
los linfocitos T de ayuda (linfocitos T
“helper” del sistema inmune celular) ac-
tiven a los linfocitos B (del sistema in-
mune humoral, productor de anticuer-
p o s ). A s í , e s t o s m i g ra r á n h a c i a l o s
nódulos linfáticos mesentéricos, donde
madurarán a células plasmáticas que
migrarán a la mucosa gástrica para pro-
ducir anticuerpos del tipo inmunoglobu-
lina A (IgA), específicos contra el
antígeno.
Uno de los primeros ejemplos de vacu-
nas en plantas los constituyó, en 1990,
la expresión de una proteína de superfi-
cie de Streptococcus mutans en tabaco
(Curtiss y Cardineau, 1990). La inclusión
de estas plantas de tabaco en la dieta de
ratones, demostró que efectivamente
138
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
estos produjeron IgA anti-S. mutans,
aunque los animales “vacunados” no se
sometieron a experimentos de desafío
con la bacteria. Posteriormente, han
existido algunos ejemplos, siendo la ex-
presión de moléculas llamadas antígenos
de superficie correspondientes al virus
de la hepatitis B, uno de los más recu-
rrentes (Richter et al., 2000). Los prime-
ros experimentos con este patógeno ex-
presando estos antígenos en papas, mos-
traron una débil respuesta inmune en ra-
tones alimentados con tubérculos crudos
de papas transgénicas. Sin embargo, es-
tos resultados han mejorado reciente-
mente, cuando en el año 2001, se trans-
formó papas con un plasmidio binario
multicomponente, es decir, que conte-
nía los “cassettes” de expresión para dos
antígenos de la toxina del cólera
(antígenos de las toxinas B y A2), un
antígeno de la enterotoxina fimbrial de
E. coli enterotoxigénico y un antígeno
de la enterotoxina de rotavirus (Yu y
Langridge, 2001). Los ratones alimenta-
dos con los tubérculos de estas papas,
mostraron inducir no sólo buenos nive-
les de IgA y recuperarse más rápido de
los efectos de la exposición a rotavirus,
sino también, ser capaces de presentar
una respuesta inmune más generalizada
mediante la síntesis de interleuquinas,
(moléculas potenciadoras de la respues-
ta inmune celular). Interesantemente,
cuando una camada de ratones que se
alimentó de leche de madres que fue-
ron alimentadas con estas papas, esta
progenie también mostró recuperarse
más rápido de los efectos del rotavirus.
Hasta la fecha, los datos obtenidos en es-
te ámbito no permiten observar un buen
grado de protección inmune, debido a
TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE PLANTAS
que muchas veces el animal utilizado
como modelo no es susceptible al pató-
geno o porque las normativas de mani-
pulación de estos patógenos en el labo-
ratorio son tan estrictas, que no hacen fá-
cil la instauración en experimentos de
prueba.
Una de las principales preocupaciones
de los investigadores es cómo aumentar
la expresión de los genes utilizados
como determinantes antigénicos en este
tipo de alimentos-vacuna. Esto ha dado
paso a la idea de modificar los genes o
secuencias nativas de los péptidos anti-
génicos, generando genes sintéticos más
potentes en su expresión, debido a que
las modificaciones introducidas han au-
mentado su estabilidad, tanto en la plan-
ta como tras ser ingeridos por los ani-
males modelo (Richter et al., 2000). En
1997, se aprobó la primera prueba bio-
lógica en humanos de una vacuna de
planta transgénica (Tacket y Mason,
1999). Esto consistió en utilizar como
alimento en un grupo de voluntarios,
papas que constitutivamente expresaban
una sub-unidad sintética (modificada) de
la toxina B del E. coli enteropatógeno.
Cada uno de los 11 voluntarios recibió
como alimento, una mezcla de cubos de
papas transgénicas y no transformadas,
en una cantidad de entre 50 y 100 gra-
mos de papa cruda. En 10 de los 11 parti-
cipantes hubo un aumento en anticuer-
pos anti-toxina B. Esta respuesta inmu-
ne fue similar a la observada cuando a
una persona se le desafía con un millón
de bacterias E. coli enterotoxigénicos. A
la fecha, se están desarrollando ensayos
similares de evaluación en humanos,
para vacunas orales contra la hepatitis
B (Walmsley y Arntzen, 2000).
c) Plantas como productoras de pro-
ductos biofarmacéuticos.
Los productos biofarmacéuticos (insulina,
eritropoyetina, hormona de crecimiento,
etc.), históricamente se han obtenido a
través de organismos genéticamente mo-
dificados, utilizando para ello bacterias,
levaduras y células mamíferas en cultivo
(Ganz, 1996; Pen, 1996; Ma y Vine,
1999). Sin duda que la demanda crecien-
te de este tipo de compuestos genera un
punto de colapso en términos de suplir
la necesidad por ellos, repercutiendo esto
en el costo que los pacientes deben so-
portar por sus tratamientos. La produc-
ción de proteínas con capacidad terapéu-
tica en plantas, se vislumbra como una
posibilidad real, de costos realmente in-
feriores a los de los actuales sistemas de
producción y generadora de productos
libres de contaminantes patógenos
(Kusnadi et al., 1997).
Dos aproximaciones de transformación
de plantas se utilizan comúnmente en
los sistemas de producción de biofarma-
céuticos en plantas: a) la ya conocida y
detallada transformación por A. tumefa-
ciens o biobalística y b) la utilización
de virus vegetales recombinantes (Della-
Cioppa y Grill, 1999). En el último caso,
la estrategia consiste en utilizar virus que
infectan plantas y de los que se conoce
completamente su genoma y funciona-
miento molecular in vivo. Así, se pue-
den reemplazar partes prescindibles del
genoma de estos virus por los “casset-
tes” de expresión del péptido con activi-
dad farmacéutica. Con esto, sólo basta-
rá la infección con este virus recombi-
nante para que dicho péptido sea pro-
ducido in planta. Desafortunadamente,
139

el uso de virus recombinantes se limita
al conocimiento biológico del virus uti-
lizado y a su rango de hospederos, lo
que ha limitado mucho su utilización
masiva. De esta forma, los virus más co-
rrientemente utilizados son el virus del
mosaico del tabaco (Kumagai et al.,
1993) y el virus del mosaico de la haba
(Brennan, 1999). Ejemplos en donde se
han utilizado plantas infectadas con vi-
rus recombinantes son tabaco y tomates
que expresan el péptido inhibidor de la
enzima convertidora de angiotensina-1
(Hamamoto et al., 1993) y el péptido
inhibidor de la replicación viral del vi-
rus de la inmunodeficiencia humana (a-
tricosantina) en la hierba Nicotiana
benthamiana (Kumagai et al., 1993).
Ejemplo de sistemas de investigación en
donde se ha aplicado transformación
genética son la expresión de encefalinas
en canola (Brassica napus)(Godgjin y
Pen, 1995), interferón α en arroz (God-
gjin y Pen, 1995), seroalbúmina huma-
na en papa y tabaco (Godgjin y Pen,
1995), glucocerebrosidasa en tabaco
(Cramer et al., 1999) y factor estimulador
de colonias de granulocitos y macrófa-
gos en tabaco (Godgjin y Pen, 1995). En
1998 se comenzaron pruebas en huma-
nos para la utilización de arroz transgé-
nico que expresa la proteína α-1-anti-
tripsina (Giddings et al., 2000); de gran
potencial terapéutico en el tratamiento
de enfermedades hepáticas, de hemorra-
gias y de fibrosis quística. Otro ejemplo
de la utilización a una escala más avan-
zada de esta estrategia proviene de la
expresión de hirudina, un compuesto na-
tural con actividad antitrombosis. Cano-
la y tabaco han sido los cultivos transgé-
nicos utilizados para la expresión de este
140
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
péptido que, en sus fases iniciales mos-
tró problemas para su purificación des-
de la planta (Chaudray et al., 1998). Sin
embargo, trabajos fusionando el gen de
hirudina a genes de oleosinas, compo-
nentes que habitualmente se encuentran
en los aceites de canola (Boothe et al.,
1997), han permitido soslayar estos pro-
blemas y ha permitido la siembra en
campos comerciales en Canadá de es-
tos cultivos, para la producción masiva
del compuesto antitrombótico (Boothe et
al., 1997).
TRANSFORMACIÓN
DE ORGANELOS
Una de las técnicas de mayor proyec-
ción en la transformación genética ve-
getal es la transformación específica de
organelos, con especial relevancia la
ingeniería genética de cloroplastos. Las
plantas transgénicas que poseen el
transgén insertado en el genoma cloro-
plástico se denominan plantas transplas-
tómicas (Bogorad, 2000). La ventaja de
este tipo de alternativas en la transfor-
mación de plantas reside en que ésta es
precisamente una de las formas de eli-
minar el fenómeno denominado flujo
génico entre cultivos genéticamente
modificados y parientes silvestres o cul-
tivados. Así, la producción de plantas
transplastómicas es de gran interés en es-
pecies con alto potencial de cruzamien-
to con- e inter-específico. Del mismo
modo, el flujo de polen y su efecto no
deseado frente a insectos no blanco, por
ejemplo en el caso de los cultivos Bt, es
también eliminado utilizando este tipo
de estrategia (Daniell, 2002). Estas ven-
tajas provienen del hecho de que, aun-
que el polen de algunas pocas plantas
TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE PLANTAS
pueda contener plastidios metabóli-
camente activos, el DNA de estos es
perdido durante su proceso de madura-
ción, impidiendo su transmisión a la
próxima generación de plantas. A ma-
nera de ejemplo, se ha visto que aún
cuando plantas transplastómicas para el
gen cry llegaron a poseer un 47% de
proteína CRY del total de proteínas so-
lubles, ésta no se encontró en el polen
de estas plantas (De Cosa, 2001).
La transformación de cloroplastos tiene
su base en un proceso totalmente dis-
tinto a la recombinación ilícita que ex-
plotan los plasmidios binarios: la recom-
binación homóloga (ver Figura 6.5).
Como se mencionó, la recombinación
homóloga es un sistema normal de las
plantas, mediante el cual secuencias que
son idénticas entre sí son recombinadas,
generando el reemplazo de una hebra
de DNA por otra idéntica, con el fin de
reparar hebras dañadas de DNA o de
generar simplemente variabilidad
genética. Para procurar recombinación
homóloga en el cloroplasto, entonces,
se debe tener conocimiento del genoma
en dónde se desea insertar el o los “cas-
settes” de expresión de los genes de in-
terés. De esta forma, los plasmidios uti-
lizados en la transformación de cloro-
plastos no tienen los elementos descri-
tos anteriormente para los plasmidios
binarios desde el punto de vista de los
bordes T, sino que, en adición a los “cas-
settes” normales de expresión, poseen
segmentos bastante significativos (des-
de 400 pares de bases a varios kilobases)
de genes plastidiales, los que al ser ho-
mólogos al genoma cloroplástico, son
reconocidos por las maquinarias inter-
nas de recombinación y reparación del
DNA en la célula de la planta, llevando
a la inserción de los “cassettes” de inte-
rés entre dichas secuencias, pero en el
genoma plastidial (Lamtham y Day,
2000).
El tamaño de los genomas plastidiales
varía entre 120 y 160 kilobases y codifi-
ca para los genes involucrados en la man-
tención del propio plástido y en la foto-
síntesis. Además de su rol en la fotosín-
tesis, los plastidios sirven como compar-
timentos para la biosíntesis de aminoá-
cidos y lípidos, siendo la mayoría o to-
dos los genes involucrados, sintetizados
en el núcleo (Gray et al., 2003).
Como en una célula vegetal existen mu-
chos cloroplastos, los sistemas de selec-
ción deben propiciar la obtención de
células con todos sus plastidios transfor-
mados. Para esto, los sistemas de selec-
ción deben también estar dirigidos al
cloroplasto. Inicialmente, la selección
de plantas transplastómicas utilizó una
mutante en el RNA ribosomal 16S, que
no unía el antibiótico espectinomicina
y así confería resistencia a éste (Daniell
et al., 1998). Posteriormente, se ha uti-
lizado el gen de la aminoglicósido 3´-
adenil transferasa (aad), enzima que in-
activa este mismo antibiótico mediante
la transferencia de la porción adenil del
trifosfato de adenosina (ATP), hacia la
espectinomicina o su símil estreptomi-
cina (Daniell et al., 1998). Desafortuna-
damente, estos antibióticos también
controlan las infecciones bacterianas en
humanos y animales, por lo que la posi-
bilidad teórica de transferencia de este
gen de resistencia hacia bacterias en los
tractos digestivos, aunque remota, está
abierta a discusión (Chambers et al.,
141

2002). Recientemente, se han desarro-
llado sistemas metabólicos de selección,
como los descritos anteriormente para
eliminar el uso de genes reporteros que
confieren resistencia a antibióticos. En el
caso de la transformación de plastidios,
se ha utilizado el gen de la enzima
betaína-aldehído deshidrogenasa (BADH)
de espinaca (Ratinasabapathi, 1994). Esta
enzima está presente sólo en los
cloroplastos de un número muy reduci-
do de especies con alta resistencia a se-
quedad y salinidad, por lo que al intro-
ducirla en plantas transplastómicas, per-
mite la selección de plantas en medios
con el agente tóxico betaína-aldehído
(BA), las que gracias a la BADH, lo trans-
forman en glicina-betaína, compuesto
que es además, un reconocido metabolito
osmoprotector (Daniell et al., 1998;
Daniell et al., 2001).
Una característica adicional observada
tras el uso de BADH-BA como sistema de
selección de plantas transplastómicas, es
la rápida regeneración de los explantes
que lo utilizan. En líneas generales, se ha
visto que este sistema permite una rege-
neración casi tres veces más veloz que
el uso del sistema de antibióticos
espectinomicina-estreptomicina (Daniell
et al., 2001).
En teoría, la selección utilizando BA se
muestra como una herramienta muy po-
derosa y de amplio espectro de aplica-
ción, siempre que los cultivos o espe-
cies a transformar no posean este siste-
ma expresado en muy altos niveles,
como por ejemplo la familia de las
Chenopodiaceae y Poaceae.
142
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
PERCEPCIÓN PÚBLICA
Sin duda que el avance de las nuevas
tecnologías es hoy en día de muy difícil
asimilación para cualquier persona, aun-
que esté ésta vinculada a la ciencia. Esto
ha contribuido a ahondar la brecha en-
tre los científicos y la persona común
(Daniell, 1999). Sin embargo, no ha sido
difícil advertir que el debate sobre la
incorporación y uso masivo de los cul-
tivos GM en el mundo, ha sido prefe-
rentemente controversial y manejado de
una forma visceral más que técnica y
con distintos intereses.
El mal manejo informativo causado por
la ausencia de una prensa especializa-
da, ha llevado a generar una gran canti-
dad de movimientos públicos con cierta
orgánica, conocidos como “grupos ver-
des o ecologistas”. Aquí, podemos dis-
tinguir varios estratos o tendencias, bá-
sicamente agrupables en dos: a) aque-
llos que buscan alcanzar una moratoria
el desarrollo de cultivos GM hasta que
los hechos técnicos demuestren una to-
tal certeza de su seguridad y b) aquellos
grupos que quieren incluso detener su
desarrollo, bajo este mismo argumento
de riesgo cero.
Dentro del grupo reivindicativo de un
mayor análisis de los cultivos GM y sus
productos alimenticios derivados de
ellos, encontramos el uso de argumen-
taciones como que la tecnología es
mala, ejemplificándose con accidentes
tecnológicos históricos como el efecto
del uso del DDT y otros químicos de la
“revolución verde”, de la talidomida, del
asbesto o de las dioxinas. Yendo más
allá, se incluyen ejemplos como los ac-
TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE PLANTAS
cidentes nucleares de Chernobyl y Three
Miles Island. En una forma aún más re-
currente y preocupante, se ha utilizado
el desconocimiento de una sociedad
sobre sistemas o procesos biológicos que
efectivamente pueden deber su origen a
deficiencias en el marco regulatorio de
las nuevas tecnologías, como lo son la
encefalopatía espongiforme bovina (co-
múnmente llamado mal de las vacas lo-
cas) y la enfermedad de Kreutzfel-Jacobs
(enfermedad neurodegenerativa debida
a priones) o las dioxinas en el ambiente
y los alimentos. Sin duda, en ninguno
de estos ejemplos citados, existió un cul-
tivo GM involucrado, ni tampoco un ali-
mento derivado de ellos.
La misma falta de prensa científica, ha
contribuido enormemente a la agrupa-
ción de este tipo de organismos gené-
ticamente modificados (conocidos aho-
ra como OGMs) y alimentos derivados
de ellos, bajo nombres o denominacio-
nes que muchas veces pueden dar paso
a la discriminación comercial, siendo
ésta la verdadera razón por la que se
debe estudiar en detalle una política de
rotulado que incluya un análisis deteni-
do en los requisitos de dicha etiqueta.
Por ejemplo, además de llamárseles “ali-
mentos transgénicos”, muchas publica-
ciones se refieren a “alimentos biotec-
nológicos”, aunque vale la pena recal-
car que los OGMs no han cambiado (sal-
vo casos ex profeso, como la producción
de una vitamina C por microorganismos
modificados o la misma insulina, sin ser
este un alimento) las tecnologías de pro-
ducción de alimentos. Otras denomina-
ciones son las de “alimentos genéti-
camente modificados”, “bioproductos”,
“alimentos modificados mediante inge-
niería genética”, “alimentos recombi-
nantes” y “alimentos obtenidos mediante
la biotecnología” (este último emplea-
do en el Codex Alimentarius). Aquí, es
necesario decir que la ingeniería gené-
tica, la tecnología del DNA recombi-
nante y sus distintas etapas, no consti-
tuyen por sí solas, metodologías para el
desarrollo de alimentos y por lo tanto,
mal pueden producirlos. Como se men-
cionó, este punto es de vital importan-
cia a la hora de la presentación de los
diferentes productos al consumidor final,
sea este un mercado de un país determi-
nado o una persona enfrentada a los
anaqueles de un supermercado nacional.
Es además y sin ninguna duda, un punto
neurálgico del etiquetado que se les dará
a estos nuevos productos, donde se de-
bería compatibilizar el nivel de conoci-
miento real del consumidor y el tipo de
información que se le entrega. Ante esto,
surge el cuestionamiento sobre qué tan
urgente debe ser una política de rotula-
do en nuestro país, si no existe una so-
ciedad con un conocimiento adecuado
del tema.
1. Factores a tener en cuenta
en el Marco Regulatorio Nacional
aplicable a los OGMs.
En virtud de la complejidad del tema,
de los ámbitos involucrados y de los sec-
tores afectados (positiva y negativamen-
te), un marco regulatorio nacional para
los OGMs debe armonizar los requeri-
mientos y normas impuestos por los tres
componentes involucrados en su gene-
ración: a) Ministerio de Agricultura, b)
Ministerio de Salud y c) Ministerio de
Economía. No parece razonable la ge-
neración de un marco regulatorio eficaz
y contingente excluyendo a alguno de
estos tres actores.
143

En términos generales, la normativa de-
biera considerar aspectos intrínsecos del
alimento u OGM (según corresponda)
tales como: el tipo de alimento, modifi-
cación genética del OGM y tecnologías
de procesamiento de las materias primas
utilizadas. También debieran tenerse en
cuenta aspectos técnicos contingentes;
vale decir, debe ser un reglamento pro-
activo que considere los cambios en los
conocimientos sobre la ciencia y tecno-
logía de los alimentos, tipo de informa-
ción al consumidor, percepción públi-
ca, posible manejo con identidad pre-
servada y reales objetivos mayores de la
salud pública. El tipo de información al
consumidor debería generar la posibili-
dad de evaluar correctamente, compa-
rar y decidir sobre su opción por un ali-
mento transgénico.
En la actualidad, los principios genera-
les se basan esencialmente en la aplica-
ción del Enfoque Precautorio y en la
Evaluación de Riesgo Previa del OGM.
El Enfoque Precautorio se basa en un
marco regulatorio que necesariamente
va acompañado de la generación de
nuevo conocimiento, siendo proactivo,
aplicando dudas razonables y significa
que ante la ausencia de fundamentos
científicos completos, no se acepta el
riesgo o no se puede evaluar. Esto im-
plica una búsqueda de información
faltante en plazos de tiempo razonables.
Aquí resulta de gran importancia el he-
cho de que argumentos técnicos débiles
no sean utilizados como barreras al co-
mercio. Esto último ha representado la
constitución de ejes de opinión diver-
gentes incluso entre distintas agrupacio-
nes de países.
144
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
La Evaluación de Riesgo Previa del OGM,
implica un análisis del impacto ambien-
tal, un análisis de seguridad para los
operadores, un planteamiento ante el
consumo furtivo y el escalamiento en
etapas de flexibilización (cadena labo-
ratorio-invernadero-campo de bioseguri-
dad, etc.). Un componente estratégico
de esta evaluación, es la comprendida
por el análisis cuantitativo y cualitativo
de Equivalencia Substancial del nuevo
alimento, en función de su similitud con
plantas no modificadas. El análisis de
todos los aspectos en que el nuevo ali-
mento puede diferir del tradicional in-
cluye, por ejemplo: modificaciones en
el contenido de tóxicos y alergenos, toxi-
cidad y alergenicidad, estructura de los
componentes macromoleculares, diges-
tibilidad y metabolismo, biodisponibili-
dad de nutrientes y micronutrientes,
toxicidad aguda y crónica, formulación
y ensayo de alimentos para animales y
necesidad de información para el con-
sumidor.
Al respecto, es necesario decir que un
aná-lisis de equivalencia substancial no
es un parámetro de evaluación masiva
aplicable por ejemplo, a embarques de
semillas rutinarios. Así, el hecho de la
aprobación de comercialización para un
evento transgénico, presupone que ha
existido ya una rigurosa evaluación de
riesgo previa, con su correspondiente y
detallado análisis de equivalencia subs-
tancial, entre muchos otros.
2. Marco Regulatorio Internacional.
Desde 1970 muchos países han instau-
rado marcos regulatorios oficiales para
el control de las diversas aplicaciones
TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE PLANTAS
de la biotecnología. De manera particu-
lar, los esfuerzos se han concentrado en
aspectos de seguridad de la aplicación
de la tecnología teniendo como sujetos
de impacto al hombre, los animales y el
medioambiente. Las Directrices de la
Unión Europea 219/90 y 220/90, cons-
tituyen un conjunto de normas para la
liberación al medioambiente de OGMs.
Por el contrario, las agencias regulato-
rias de Estados Unidos (el más grande
exportador de cultivos genéticamente
modificados), consideran a estas nuevas
técnicas de modificación genética como
una extensión de otros procesos biotec-
nológicos. Esto es, que los nuevos pro-
ductos (plantas transgénicas) obtenidos
a través de esta tecnología, son evalua-
dos según los mismos marcos regula-
torios de evaluación de riesgos diseña-
dos previamente. Así, en Estados Unidos
existen tres agencias gubernamentales:
agricultura, salud y medioambiente, en-
cargadas conjuntamente de la regula-
ción, pruebas de campo y control del
uso de la “tecnología del DNA recombi-
nante“. Los criterios utilizados por la Di-
rectriz Europea 220/90 y por la Agencia
de Agricultura y Salud Estadounidense,
en cuanto a salud humana y medioam-
biente, son básicamente los mismos. Es-
tos difieren sólo en que la agencia euro-
pea establece los requisitos a cumplir
por el aplicante para una liberación a
campo; mientras que en EE.UU. los cri-
terios son básicamente formulados por
el mismo generador del OGM, en acuer-
do con la agencia del estado.
De forma similar, en Sudamérica, países
como Brasil y Argentina han implemen-
tado sistemas de tránsito, siembra y vi-
gilancia de material transgénico. En Ene-
ro de 1995, Brasil publicó la Ley 8.974
y el Decreto 1725/95, estableciendo el
Comité Técnico Nacional de Bioseguri-
dad (CTNBio), agencia gubernamental
responsable de las regulaciones a cam-
po de plantas transgénicas y de la ela-
boración de normas para el uso conte-
nido y la liberación al medioambiente
de OGMs. El esqueleto normativo y fun-
cional brasileño es muy parecido al es-
quema europeo, pues considera el con-
trol de la tecnología del DNA recombi-
nante en forma distinta de otros proce-
sos biológicos. Sin embargo, desde el
punto de vista de los procedimientos de
inspección y evaluación, Brasil sigue el
modelo implementado por EE.UU., en el
cual cada autorización es seguida por
una examinación local crítica, para ase-
gurar que las principales medidas de
evaluación de riesgo que presenta el
aplicante, sean llevadas a cabo correc-
tamente. Argentina define las condicio-
nes que deben reunir los OGMs para ser
liberados al medio en las Resoluciones
Nº 656 (de la SAGyP del 30 de Julio de
1992) y Nº 837 (de la SAGyP del 9 de
Septiembre de 1993). Estas Resoluciones
se suman a las normativas existentes en
materia de protección vegetal (Decreto
Ley de Defensa Sanitaria de la Produc-
ción Agrícola 6704/66), de semillas y
creaciones fitogenéticas (Ley de Semi-
llas y Creaciones Fitogenéticas 20247/
73) y de sanidad animal (Ley de Produc-
tos Veterinarios). De manera similar a
Brasil, la estrategia de Argentina se basa
en la aprobación para liberación a cam-
po, esencialmente de los mismos even-
tos transgénicos que están siendo apro-
bados en Europa, de manera de no afec-
tar su fuerte posición exportadora.
145

3. Situación de Chile.
La legislación sobre protección agrícola
se encuentra contenida en el Decreto
Ley Nº 3557 de 1980, en donde hay dis-
posiciones genéricas que facultan al Ser-
vicio Agrícola y Ganadero (SAG), enti-
dad dependiente del Ministerio de Agri-
cultura, para dictar resoluciones espe-
cíficas que establezcan requisitos, pro-
cedimientos y normas particulares para
la internación y manejo del material
transgénico. La Resolución Exenta 1927
de 1993, establece normas para la in-
ternación de material vegetal transgéni-
co de reproducción a Chile, creando en
Octubre de 1993 el Comité Asesor para
la Liberación de Organismos Transgéni-
cos (CALT). Este comité está constituido
por representantes del Ministerio de
Agricultura y de Salud, de institutos de
investigación agrícola y de varias uni-
versidades; tiene el carácter de comité
permanente y está facultado para incor-
porar, cuando las circunstancias así lo
aconsejen, a otros especialistas. La Pre-
sidencia y la Secretaría Técnica del CALT
son ejercidas por el Departamento de
Protección Agrícola del SAG.
En la actualidad, la Evaluación de Ries-
go Previa es aplicada en Chile por el
CALT, la que se basa en un formulario
tipo Declaración Jurada, completado por
el solicitante, sea este un importador o
el obtentor de un cultivo GM. En este
formulario se vierte una completa des-
cripción a nivel botánico, agronómico
y molecular de los diversos componen-
tes del nuevo cultivo. También se inclu-
yen todos los ensayos y evaluaciones
técnicas realizadas al cultivo en el país
de origen. De esta forma, todo el mate-
146
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
rial GM ingresado al país debe hacerlo
bajo las premisas de: a) cada internación
de material transgénico debe ser previa-
mente autorizada por el Departamento
de Protección Agrícola del SAG, b) sólo
se autorizará la internación del material
vegetal transgénico cuyo objetivo sea la
multiplicación para ser reexportado (es
decir, sólo semillas para multiplicación),
c) el material de internación debe cum-
plir cuarentena, d) debe contar con in-
formes que acrediten que en liberacio-
nes a campo, en el país de origen, el
material mostró ser inocuo al medio
ambiente y a la agricultura, e) se debe
presentar la solicitud de internación en
la forma de la Declaración Jurada ya
descrita, y e) la internación sólo podrá
hacerse por el aeropuerto Comodoro
Arturo Merino Benítez, con el objeto de
facilitar el seguimiento del material.
Como se mencionó, el CALT basa sus de-
cisiones en esta información, pero no
posee una capacidad de evaluación in
situ del efecto o nivel de interacción con
el medioambiente, la salud animal o la
salud humana. Sin embargo, podemos
decir que en Chile ya se está comenzan-
do la formación de núcleos técnicos para
el análisis de la incorporación e interac-
ción de cultivos GM con la flora nativa,
es decir, la formación de centros de es-
tudios de bioseguridad y de personal con
conocimiento en el área, con participa-
ción de personal del Instituto de Inves-
tigaciones Agropecuarias y del SAG.
Desde la década de 1990, Chile comen-
zó su incursión técnica en el desarrollo
de plantas GM, debido a esto, el CALT
dictó una nueva resolución, la Resolu-
ción 1523 de 2001, en donde los culti-
TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE PLANTAS
vos GM desarrollados en el país se so-
meten a las mismas normas que rigen
para los cultivos GM desarrollados fue-
ra del país e importados. Esto obliga a
todo nuevo material transgénico gene-
rado en el país a someterse a las evalua-
ciones y regulaciones del CALT. Antes
de la publicación de esta Resolución,
sólo se hacía sometimiento voluntario de
los cultivos GM producidos en Chile,
como efectivamente sucedió con los
únicos dos trabajos realizados en esa
época: papas resistentes a Erwinia
carotovora y melones resistentes al vi-
rus del mosaico de la sandía tipo II, el
primero desarrollado por investigadores
de la Pontificia Universidad Católica de
Chile e INIA - La Platina y el segundo,
desarrollado íntegramente en INIA - La
Platina.
El 30 de Noviembre de 2000, se publi-
có en el Diario Oficial la creación de
los Comités Asesores en Materias Am-
bientales Internacionales. Esto incluyó el
Comité Asesor en Materias de Biosegu-
ridad. Este organismo, básicamente con
centro de coordinación en la Comisión
Nacional del Medio Ambiente (CONA-
MA), ejercerá la articulación de las dis-
tintas organizaciones nacionales ligadas
a la bioseguridad, incluyendo al CALT,
Ministerio de Relaciones Exteriores y a
la CONAMA misma. Bajo este marco, el
comité se plantea con una composición
multisectorial de las instancias ya men-
cionadas, más Aduanas y Ministerios de
Economía, Agricultura, Salud y Sub-Pes-
ca. La idea de esta instancia es, en base
a la pronta entrada en vigencia de acuer-
dos internacionales como el Protocolo de
Cartagena sobre Bioseguridad en Biotec-
nología, generar en el país todas las ca-
pacidades necesarias para el análisis po-
lítico en base a información técnica, pro-
cedente desde un Comité Asesor Técni-
co, sobre el movimiento de material
genéticamente modificado tanto en el
país como a través de sus fronteras.
4. Protocolo de Cartagena sobre
Bioseguridad en Biotecnología.
El Protocolo de Cartagena sobre Biose-
guridad en Biotecnología tiene sus raí-
ces en la Conferencia de las Naciones
Unidas de Medio Ambiente y Desarro-
llo, celebrada en 1992 en Río de Janeiro.
Este Convenio acordó tres áreas primor-
diales: la conservación de la biodiversi-
dad, el uso sustentable de sus compo-
nentes (plantas, microorganismos, ani-
males, cromosomas, genes, etc.) y el
equilibrio en la repartición de los bene-
ficios de la utilización de los recursos
genéticos.
El Protocolo representa un acuerdo le-
galmente vinculante, para proteger el
medioambiente de los eventuales ries-
gos que podría ocasional el movimiento
transfronterizo de organismos vivos mo-
dificados (OVMs). El objetivo es que los
países tengan la oportunidad de realizar
el análisis de riesgo que involucra la in-
ternación de los productos obtenidos
mediante la biotecnología moderna. De
esta forma, se persigue que cada país
pueda tomar decisiones de manera in-
formada, con respecto a estos organis-
mos y sus contenedores (alimentos, gra-
nos, materias primas, etc.)
Este sistema de análisis de riesgo nacio-
nal o local, fuerza a cada país a generar
una capacidad técnica especializada.
147

Así, los gobiernos podrán indicar a la co-
munidad internacional si aceptan o re-
chazan las importaciones de commodi-
ties agropecuarios que incluyan OVMs,
mediante un conjunto de instancias co-
nocidas como Clearing House de Biose-
guridad. Esto es, la instauración de una
red o sistema de información del cono-
cimiento científico, técnico, medioam-
biental y legal, sobre los eventos de
OVMs en cuestión e implica también un
derecho a asistencia técnica si hubiera
necesidad. Finalmente, con todos estos
antecedentes, los estados deberán tomar
una decisión.
Para esto, los embarques con commodi-
ties con contenido de OVMs deberán ser
identificados como tales y para otros ti-
pos de OVMs, como semillas y peces
que vayan a ser introducidos intencio-
nalmente al medioambiente, se aplica-
rá un conjunto de etapas técnicas deno-
minadas Acuerdo Fundamentado Previo
(AFP). El AFP prevé la provisión de in-
formación en forma detallada al Estado
del país en donde se interna el OVM, en
una forma anterior al primer embarque.
Así, con todos los antecedentes en
mano, el Estado importador deberá res-
ponder a dicha aplicación.
En todo caso, el Protocolo contiene en
su referencia básica, el establecimiento
de un Enfoque Precautorio para el ma-
nejo de este tipo de importaciones. Esto
es, ante dudas razonables, lo aconseja-
ble es la abstención.
• Un poco de historia.
En conformidad con los artículos del
Convenio sobre la Biodiversidad Bioló-
148
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
gica, se estableció un grupo de trabajo
ad hoc para el tema de bioseguridad.
Este grupo, con carácter de ampliable,
mantuvo seis reuniones entre Julio de
1996 y Febrero de 1999, producto de las
cuales se desarrolló un borrador en el
que se incluyó las mayores preocupacio-
nes de las partes participantes. Este tex-
to se discutió en lo que se llamó la Pri-
mera Reunión Extraordinaria, desarrolla-
da a fines de Enero de 2000 en Montreal
(Canadá). Allí se convino la adopción de
un Protocolo de Bioseguridad dentro del
marco de la Convención, que ya se ha-
bía escrito en Cartagena (Colombia), en
Febrero de 1999, pero que no se pudo
acordar su entrada en vigencia en esa
misma oportunidad.
La aprobación del documento en Mon-
treal implicó, dejar abierta la posibili-
dad de realizar modificaciones hasta su
entrada en vigor y a una ratificación de
su firma por parte de los países repre-
sentados. Para esto, existiría una instan-
cia denominada Comité Interguberna-
mental para el Protocolo de Cartagena
sobre Bioseguridad (Intergovernmental
Comitee for the Cartagena Protocol,
ICCP), que ya se ha reunido en Montpe-
llier (Francia) en Diciembre de 2000, en
Nairobi (Kenia), en Octubre de 2001 y
en La Haya (Holanda), en Abril de 2002.
Las posturas de los distintos países tras
estas reuniones, en forma muy sintéti-
ca, es que existen dos agrupaciones:
Unión Europea más África y Países
Exportadores (ex Grupo de Miami, del
cual Chile formaba parte). Una gran di-
ferencia entre estas dos posturas es que,
con respecto a los embarques de com-
modities, sean indiscutiblemente iden-
TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE PLANTAS
tificables y trazables, en lo posible me-
diante una metodología técnica en co-
mún, siendo la postura más estricta la
europea. Para los exportadores, el sello
de “puede contener OVM” sería sufi-
ciente. También existen notorias diferen-
cias, aún menos trabajadas que el pun-
to anterior, sobre los procesos adminis-
trativos o legales a seguir en cuanto al
cumplimiento de responsabilidades co-
munes, a la responsabilidad y formas de
compensación que existiría entre los
países miembros, debido al movimiento
transfronterizo de estos productos.
En forma adicional, el Protocolo estable-
ce la generación de redes de intercam-
bio de información y la generación de
capacidad técnica en cada uno de los
países. Puntos que están en distinto es-
tado de avance.
Finalmente, podemos decir que la posi-
ción chilena tras esta última ronda de
discusiones es mantener una equidistan-
cia de los dos bloques, en espera de defi-
nir internamente una política nacional
en materia de OVMs.
Así, es necesario recalcar que el estado
de negociaciones internacionales, la po-
lítica interna y la percepción pública aquí
expuesta, representan sólo una fotogra-
fía de un sinnúmero de eventos que aún
están sucediendo, por lo que es proba-
ble que esta situación ya sea obsoleta en
el momento de su lectura. Sin embargo,
pensamos que representa una buena for-
ma de informar el cuán complejo y cómo
se han sucedido los hechos con respecto
a los OGMs (u OVMs), tanto en los paí-
ses más directamente involucrados (paí-
ses desarrollados), como en Chile.
REFERENCIAS
Arakawa, T., Chong, D. y Langridge, W. 1998.
Efficacy of a food plant-based oral cholera
toxin B subunit vaccine. Nat. Biotechnol.
16:292-297.
Bogorad, L. 2000. Engineering chloroplasts: an
alternative site for foreign genes, proteins,
reactions, and products. Trends Biotechnol.
18:257-263.
Boothe, J., Parmenter, D. y Saponja, J. 1997.
Molecular farming in plants: oilseeds as
vehicles for the production of phar-
maceutical proteins. Drug Develop. Res.
42:172-181.
Brennan, F. 1999. Chimeric plant virus particles
administered nasally or orally induce
systemic and mucosal immune responses in
mice. J. Virol. 73:930-938.
Britt, A. 1996. DNA damage and repair in
plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol.
Biol. 47:75-100.
Buchanan, B., Gruissem, W. y Jones, R. 2001.
Biochemistry & Molecular Biology of Plants.
John Wiley & Sons, Somerset, New Jersey,
USA.
Burkhardt, P., Beyer, P., Wünn, J., Klöti, A.,
Armstrong, G., Schledz, M., von Lintig, J. y
Potrykus, I. 1997. Transgenic rice (Oriza
sativa) endosperm expressing daffodil
(Narcisus pseudonarcisus) phytoeno
synthase accumulates phytoene, a key
intermediate of provitamin A biosynthesis.
Plant J. 11:1071-1078.
Chambers, P., Duggan, P., Heritage, J. y Forbes,
J. 2002. The fate of antibiotic resistance
marker genes in transgenic plant feed ma-
terial fed to chickens. J. Antimicrob.
Chemother. 49:161-4.
Chua, N. y Sundaresan, V. 2000. Plant Bio-
technology. The ins and outs of a new green
revolution. Curr. Op. Biotech. 11:117-119.
149

Cramer, C., Boothe, J. y Oishi, K. 1999. Trans-
genic plants for therapeutic proteins: linking
upstream and downstream strategies. Curr.
Topics Microbiol. Immunol. 240:95-118.
Curtiss, R. y Cardineau, C. 1990. Oral immuni-
sation by transgenic plants. World Patent
Application WO 90/02484.
Dale, E., y Ow, D. 1991. Gene transfer with
subsequent removal of the selection gene
from the host genome. Proc. Natl. Acad. Sci.
(USA) 88:10558-10562.
Daley, M., Knauf, V., Summerfely, K. y Turner, J.
1998. Co-transformation with one Agrobac-
terium tumefaciens strain containing two
binary plasmids as a method for producing
marker-free transgenic plants. Plant Cell Rep.
17:489-496.
Daniell, H. 1999. GM crops: public perception
and scientific solutions. Trends Plant Sci.
4:467-469.
Daniell, H. 2002. Molecular strategies for gene
containment in transgenic crops. Nat.
Biotechnol. 20:581-586.
Daniell, H., Datta, R., Varma, S., Gray, S. y Lee,
S. 1998. Containment of herbicide resistance
through genetic engineering of the chloro-
plast genome. Nat Biotechnol. 16:345-348.
Daniell, H., Wiebe, P. y Fernández-San Millán,
A. 2001. Antibiotic-free chloroplast genetic
engineering – an environmentally friendly
approach. Trends Plant Sci. 6:237-239.
De Cosa, B. 2001. Overexpression of Bt
Cry2Aa2 operon in chloroplast leads to
formation of insecticidal crystals. Nat.
Biotechnol. 19:71-74.
Della-Cioppa, G. y Grill, L. 1999. Production
of novel compounds in higher plants by
transfection with RNA viral vectors. pp.
777-783. In: Collins, G. y Sheperd, R. (eds.).
Engineering plants for commercial products
and applications. New York Academy
Sciences, New York, USA.
150
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
De Neve, M., De Buck, S., Jacobs, A., Van Monta-
gu, M. y Depicker, A. 1997. T-DNA integration
pattenrs in co-transformed plant cells suggest
that T-DNA repeats originate from co-inte-
gration of separate T-DNA. Plant J. 11:15-29.
Denis, M., Delourme, R., Gourret, J., Mariani,
C. y Renard, M. 1993. Expression of enginee-
red nuclear male sterility in Brassica napus.
Genetics, morphology, cytology, and sensiti-
vity to temperature. Plant Physiol. 10:1295-
1304.
Ebinuma, H., Sugita, K., Matsunaga, E., Endo,
S., Yamada, K. y Komanine, A. 2001. Systems
for the removal of a selection marker and
their combination with a positive marker.
Plant Cell Rep. 20:383-392.
Endo, S., Sugita, K., Sakai, M., Tanaka, H. y
Ebinuma, H. 2002. Single-step transformation
for generating marker-free transgenic rice
using the ipt-type MAT vector system. Plant J.
30:115-122.
Fedorof, N. 1989. Maize transposable elements.
pp 375-411. In: Berg, D. y Howe, M. (eds.).
Mobile DNA. Am. Soc. Microbiol., Washing-
ton, D.C., USA.
Ganz, P. 1996. Expression of human blood
proteins in transgenic plants: the citokine
GM-CSF as a model protein. pp. 149-167.
In: Owen, R. y Pen, J. (eds.). Transgenic
plants: a production system for industrial
and pharmaceutical proteins. John Wiley &
Sons, London, England.
Gardner, J. y Nash, A. 1986. Role of Escherichia
coli IHF protein in lambda site specific
recombination. J. Mol. Biol. 191:181-189.
Gelvin, S. 1998. Agrobacterium VirE2 proteins
can form a complex with T strands in the
plant citoplasm. J. Bacteriol. 180:4300-4302.
Gelvin, S. 2000. Agrobacterium and plant
genes involved in T-DNA transfer and
integration. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant
Mol. Biol. 51:223-256.
Giddings, G., Allison, G., Brooks, D. y Carter, A. 2000.
Transgenic plants as factories for biopharma-
ceuticals. Nature Biotechnol. 18:1151-1155.
TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE PLANTAS
Goddjin, O. y Pen, J. 1995. Plants as bioreactor.
Trends Biotechnol. 13:379-387.
Goldsbrough, A., Lasterella, C. y Yoder, J. 1993.
Transposition mediated re-positioning and
subsequent elimination of marker genes
from transgenic tomato. Biotechnology
11:1286-1292.
Gray, J., Sullivan, J., Wang, J., Jerome, C. y
MacLean, D. 2003. Coordination of plastid
and nuclear gene expression. Philos. Trans.
R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358:135-44.
Hamamoto, H., Sugiyama, Y., Nakagawa, N.,
Hashida, E., Matsunaga, Y., Takemoto, S.,
Watanabe, Y. y Okada, Y. 1993. A new tobacco
mosaic virus vector and its use for the systemic
production of angiotensin-I-converting
enzyme inhibitor in transgenic tobacco and
tomato. Biotechnology 11:930-932.
Haq, T., Mason, H., Clements, J. y Arntzen, C.
1995. Oral immunization with a recom-
binant bacterial antigen produced in
transgenic plants. Science 268:714-716.
Lamtham, S. y Day, A. 2000. Removal of anti-
biotic resistance genes from transgenic toba-
cco plastids. Nat. Biotechnol. 18:1172-1176.
James, C. 1998. Global Status of commercialized
transgenic crops: 1998. International Service
for the Acquisition of Agribiotech Appli-
cations, Ithaca N.Y., USA ISAAA Briefs No.
8. http://www.biotech-info.net/global_re-
view.html
James, C. (2000). Global Status of commercia-
lized transgenic crops: 2000. International
Service for the Acquisition of Agribiotech
Applications, Ithaca, N.Y., USA ISAAA Briefs
N o . 21. http://www.biotech-info.net/glo-
bal_status_2000.html
Kiyokawa, S., Kobayashi, K., Kikuchi, Y., Kamada,
H. y Harada, H. 1994. Root-inducing region
of mikimopine type Ri plasmid pRi724. Plant
Physiol. 104:801.802.
Komari, T., Hiei, Y., Saito, Y., Murai, N. y Kuma-
shiro, T. 1996. Vectors carring two separate
T-DNAs for co-transformation of higher plants
mediated by Agrobacterium tumefaciens and
segregation of transformants free from
selection markers. The Plant J. 10:165-174.
Kumagai, M., Turpen, T., Weinzettl, N., Della-
Cioppa, G., Turpen, A., Donson, J., Hilf, M.,
Grantham, G., Dawson, W., Chow, T.,
Piatak, M. y Grill, L. 1993. Rapid, high-level
expression of biologically active alpha-
trichosanthin in transfected plants by an
RNA viral vector. Proc. Natl. Acad. Sci.
(USA) 90:427-30.
Kunkel, T., Niu, Q. Can, Y. y Chua, N. 1999.
Inducible isopentenil transferase as high-
eficiency marker for plant transformation.
Nat. Biotechnol. 17:916-919.
Kusnadi, A., Nikolov, Z. y Howard, J. 1997.
Production of recombinant proteins in
transgenic plants: pracical considerations.
Biotechnol. Bioeng. 56:473-484.
Ma, J. y Vine, N. 1999. Plant expression systems
for the production of vaccines. Curr. Opin.
Topics Microbiol. Immunol. 236:275-292.
Mysore, K., Bassumer, B., Deng, X., Darbinian, N.,
Motchoulski, A., Ream, W. y Gelvin, S., 1998.
Role of Agrobacterium tumefaciens VirD2
protein in T-DNA transfer and integration. Mol.
Plant-Microbe Interact. 11:668-683.
Mysore, K., Nam, J. y Gelvin, S. 2000. An Arabi-
dopsis histone H2A mutant is deficient in
Agrobacterium T-DNA integration. Proc.
Natl. Acad. Sci. (USA) 97:948–953.
Nam, J., Mysore, K. y Gelvin, S. 1998. Agrobac-
terium tumefaciens transformation of the
radiation hypersensitive Arabidopsis thaliana
mutants uvh1 and rad5. Mol. Plant Microbe
Interact. 11:1136-1141.
Odell, J., Caimi, P., Sauer, B. y Russel, S. 1990.
Site-directed recombination in the genome
of transgenic tobacco. Mol. Gen. Genet.
223:369-378.
Pen, J. 1996. Comparison of host systems for
the production of recombinant proteins. pp.
149-167. In: Owen, R. y Pen, J. (eds.).
Transgenic plants: a production system for
industrial and pharmaceutical proteins.
John Wiley & Sons, London, England.
151

Potrykus, I. 2001. Golden rice and beyond.
Plant Physiol. 125:1157-1161.
Prieto-Samsonov, D., Vazquez-Padron, R.,
Ayra-Pardo, C., Gonzalez-Cabrera, J. y Riva,
G. 1997. Bacillus thuringiensis: from
biodiversity to biotechnology. J. Ind.
Microbiol. Biotech. 19:202-219.
Rhoades, M. 1984. The early years of maize
genetics. Annu. Rev. Genet. 18:1-30.
Puchta, H. y Hohn, B. 1996. From centimorgan
to base pairs: homologous recombination
in plants. Trends Plant Sci. 1:340-348.
Ratinasabapathi, B. 1994. Metabolic engineering
of glycine betaine snythesis: plant betaine
aldehyde dehydrogenase lacking typical
transit peptides are targeted to tobacco
chloroplasts where they confer aldehyde
resistance. Planta 193:155-162.
Regensberg-Tuink, A. y Hooykaas, P. 1993.
Transgenic N. glauca plants expressing
bacterial virulence gene virF are converted
into hosts for nopaline strains of A.
tumefaciens. Nature 363:69-71.
Richter, L., Thanavala, Y., Arntzen, C. y Mason,
H. 2000. Production of hepatitis B surface
antigen in transgenic plants for oral
immunization. Nat. Biotech. 18:1167-1171.
Russel, S., Hoopes, J. y Odell, J. 1992. Directed
excision of a transgene from the plant
genome. Mol. Gen. Genet. 234:49-59.
Sen, P., Pazour, G., Anderson, D. y Das, A. 1989.
Cooperative binding of Agrobacterium
tumefaciens VirE2 protein to single-stranded
DNA. J. Bacteriol. 171:2573-2580.
Sommer, A. 1989. New imperatives for an old
vitamin (A). J. Nutr. 119:96-100.
Stachel, S. y Zambryski, P. 1986. virA and virG
control of the plant-induced activation of the
T-DNA transfer process of A. tumefaciens.
Cell 46:325-333.
152
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
Tacket, C. y Mason, H. 1999. A review of oral
vaccination with transgenic vegetables. Mi-
crobes and Infection 1:777-783.
Thanavala, Y., Yang, Y., Lyons, P., Malson, H. y
Arntzen, C. 1995. Immunogenicity of
transgenic plant-derived hepatitis B surface
antigen. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)
92:3358-3361.
Wabico, H., Kagaya, M., Kodama, I., Masuda,
K., Kodama, Y., Yamamoto, H., Shibano, Y.
y Sano, H. 1989. Isolation and characte-
rization of diverse nopaline type Ti plasmids
of Agrobacterium tumefaciens from Japan.
Arch. Microbiol. 152:119-124.
Walmsley, A. y Arntzen, C. 2000. Plants for
delivery of edible vaccines. Curr. Opinion
Biotechnol. 11:126-129.
Ward, E. y Barnes, W. 1988. VirD2 protein of
Agrobacterium tumefaciens very tightly
linked to the 5´ end of T-strand DNA.
Science 242:927-930.
Ye, X., Al-Babili, S., Klöti, A., Zhang, J., Lucca,
P., Beyer, P. y Potrykus, I. 2000. Engineering
the provitamin A (b-carotene) biosynthetic
pathway into (carotenoid-free) rice
endosperm. Science 287:303-305.
Yu, J. y Langridge, H. 2001. A plant-based
multicomponent vaccine protects mice
from enteric diseases. Nat. Biotechnol.
19:548-552.
Yusirov, V., Steck, T., Grupta, V. y Gelvin, S.
1994. Association of single-stranded
transferred DNA from Agrobacterium
tumefaciens with tobacco cells. Proc. Natl.
Acad. Sci. (USA) 91:2994-2998.
Zubko, E., Scutt, C. y Meyer, P. 2000.
Intrachromosomal recombiantion between
attP regions as a tool to remove slectable
marker genes from tobacco transgenes. Nat.
Biotech. 18:442-445.
MARCADORES MOLECULARES
MARCADORES
MOLECULARES
INTRODUCCIÓN
L os marcadores moleculares son pro-
teínas o fragmentos del DNA que di-
ferencian a un ser de otro; a una especie
de otra. Estas diferencias eran tomadas
en otros tiempos, simplemente como las
encontradas en el ámbito morfológico (en
plantas: presencia de flores, tipo de ho-
jas, raíces, frutos, etc; en animales: pre-
sencia de antenas, pelos, color de los
ojos, etc.). Pero, ¿Cómo eran distingui-
das dos especies con una similitud muy
grande? No se podía diferenciar. Esto es
ahora posible, gracias al uso de los mar-
cadores moleculares y al desarrollo de
técnicas que permiten su análisis.
Tipos de Marcadores Moleculares
Los primeros marcadores moleculares
conocidos y utilizados fueron las isoen-
zimas; por eso, son también conocidas
como marcadores bioquímicos. Estas
enzimas pueden presentar más de una
forma pues, son constituidas por más de
un tipo de cadena de polipéptidos (pro-
teínas multiméricas) o también se pue-
de decir, que corresponden a polpépti-
dos diferentes con la misma funcionali-
dad. Estos marcadores pueden represen-
tar los dos alelos de los genes que cons-
tituyen las enzimas, llamándose por ello,
marcadores co-dominantes, al poder dis-
tinguir genéticamente una especie con
expresión génica en homocigosis o en
CAPÍTULO 7
M. Cristina Rocha C.
heterocigosis de estos genes. Como
ejemplos de este tipo de marcadores po-
dríamos mencionar a las siguientes en-
zimas: aconitasa, adenilato quinasa, al-
cohol deshidrogenasa, glutamatoxalo-
acetato transaminasa, fosfoglucomutasa,
triosafofato isomerasa, leucina amino-
peptidasa, isocitrato deshidrogenasa,
shikimato deshidrogenasa y otras
(Ellstrand y Lee, 1987).
Así, ahora pueden ser distinguidas espe-
cies que no podrían diferenciarse por as-
pectos morfológicos, pero que tenían di-
ferencias al nivel de las isoenzimas. Para
efectuar un ensayo con isoenzimas (Fi-
gura 7.1), es necesario extraer la proteí-
na (enzima) del tejido que la contiene,
separarla en un gel a través de una
electroforesis y finalmente, hacer una
reacción enzimática para distinguirla
por medio de la formación de un produc-
to coloreado, en condiciones apropia-
das de pH y temperatura, pues como
buena enzima, esta molécula presenta-
rá dichos requisitos para revelar su fun-
ción. En la Figura 7.2 se puede observar
que dos especies de Penaeus (conocidas
como gambas); se distinguien por un en-
sayo de actividad de la isoenzima
adenilato quinasa. Esto se realiza deter-
minando en un gel al que se ha adicio-
nado almidón. Este ensayo es relativa-
mente sencillo y de bajo costo, siendo
por ello empleado en diversos sistemas
animales y vegetales.
153

Extracción de la enzima
del tejido apropiado
Análisis de electroforesis
en gel de almidón
Figura 7.2. Análisis de polimorfismo de la isoenzima
A B
1 Penaeus subtilis M I; 2 P. subtilis M II.
(fotografía gentilmente cedida por Dr J.Gusmão, UFRJ)
Reacción de la enzima con un sustrato
apropiado y revelado de actividad por
formación de un producto coloreado
Figura 7.1 Esquema demostrativo de
las principales etapas para análisis de
polimorfismos utilizando isoenzimas.
De esta forma, muchos estudios vincu-
lados con caracterización de plantas
anuales o perennes y también de anima-
les, se han basado en la utilización de
este tipo de marcadores, los que incluso
se utilizan hasta hoy (Ellstrand y Lee,
1987; Degani et al., 1990; Gusmão,
2000; Huamán et al.,2000; Gusmão,
2001;). Otra aplicación del estudio con
isoenzimas, es identificar cambios
genéticos producidos en plantas propa-
gadas in vitro (nuestro ya conocido tér-
mino variación somaclonal). Ese ensa-
yo fue utilizado con este objetivo en
papas propagadas a través de cultivo de
tejidos.
El principal problema con los marcado-
res bioquímicos es que representan so-
lamente unos pocos genes de todo el
genoma, existiendo casos en que no se
puede distinguir bien algunas especies
que son muy semejantes. Otro proble-
ma frecuente es que, en la preparación
154
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
adenilato quinasa entre:
(Gusmão, 2001).
de las muestras proteicas, se tiene que
partir de material vegetal exactamente
en el mismo estado de desarrollo fisio-
lógico, pues pueden haber diferencias
de expresión de las isoenzimas durante
distintas etapas. Así, para que los ensa-
yos sean reproducibles, es necesario ob-
tener tejidos en la misma etapa del de-
sarrollo. Sin embargo, los marcadores
bioquímicos siguen siendo útiles, pues
algunas veces son marcadores próximos
a genes importantes en programas de
mejoramiento. Por ejemplo, el gen de re-
sistencia del tomate al nemátodo Meloi-
dogyne incognita, se encuentra próximo
a un gen de una isoenzima de fosfatasa
ácida y eso ayudó en la selección de
plantas resistentes a ese nemátodo
(Medina-Filho, 1980).
Con el desarrollo de diversas herramien-
tas modernas de la biología molecular
(Tecnología del DNA recombinante, ca-
pítulo 5), aparecieron otras estrategias
para analizar marcadores moleculares.
Todas esas técnicas permiten establecer
diferencias evaluando directamente el
material genético contenido en la mo-
lecula del DNA. Una de esas técnicas,
se basa en el corte del DNA genómico
MARCADORES MOLECULARES
con enzimas de restricción seguida de
electroforesis en gel de agarosa, transfe-
rencia hacia un filtro de “nylon“, hibri-
dación con fragmentos de genes cono-
cidos o no, marcados con radioactividad
seguida de autorradiografía (Figura 7.3)
(ver también “Detección de clones re-
combinantes”, capitulo 5). Esta técnica
se llama Polimorfismo del Largo de Frag-
mentos de Restricción (Restriction
Fragment Length Polymorphism - RFLP).
Además de RFLP, también existen otras
metodologías que utilizan como base la
Reacción en Cadena de la Polimerasa
(Polymerase Chain Reaction - PCR). Esas
otras técnicas son conocidas como la del
DNA Polimórfico Amplificado al Azar
(Random Amplified Polymorphic DNA -
RAPD), Repeticiones de Secuencia Sim-
Corte del DNA
genómico
con enzima
de restricción
Electroforesis en gel de agarosa
seguido de transferencia para
filtros de Nylon, hibridación
con secuencias radioactivas y
autorradiografía (Southern blot)
A B C
Figura 7.3. Esquema demostrativo de las
principales etapas para análisis de
polimorfismos por RFLP.
ple (Simple Sequence Repeats, SSR; tam-
bién conocida como microsatélites),
Repeticiones Inter Secuencia Simple
(Intersequence Simple Repeats, ISSR),
Secuencia Sitio Marcada (Site Tagged
Sequence, STS), Regiones Amplificadas
de Secuencias Caracterizadas (Sequence
Characterized Amplified Regions, SCAR)
y Polimorfismo del Largo de Fragmen-
tos Amplificados (Amplified Fragment
Length Polymorphism, AFLP). Además
de éstas, también tenemos las VNTR o
Repeticiones Adjacentes de Número Va-
riable (Variable Number of Tandem Re-
peats, también llamada de minisatélites).
Todas estas metodologías serán más de-
talladas a continuación.
El marcador RFLP, como se indicó, tiene
como base el corte del DNA genómico
con una enzima de restricción. En las di-
ferentes especies pueden ocurrir varia-
ciones genéticas puntuales que hacen
variar el sitio de restricción de una en-
zima. Así, se pueden detectar diferen-
cias de tamaño en fragmentos de restric-
ción relacionados a un gen o alelo. Esa
técnica es empleada en pruebas diagnós-
tico de enfermedades genéticas (Griffiths
et al., 2001) o también en análisis de di-
versidad genética entre organismos (Liu
y Musial, 1995; Pruvost et al., 1998). Co-
mo los marcadores bioquímicos (isoenzi-
mas), el RFLP también es co-dominante,
pues distingue caracteres genéticos en
homocigosis y heterocigosis. El costo de
un ensayo RFLP es superior al de las
isoenzimas, siendo también más lento,
además de demandar entrenamiento es-
pecializado. Como las isoenzimas, tie-
ne la desvantaja de solamente distinguir
variaciones específicas con relación a
pocas secuencias génicas. Además, para
155

realizar el ensayo, es necesario conocer
la secuencia del gen para el análisis u
obtener secuencias de DNA en una li-
brería genómica o de DNA complemen-
tario (cDNA) (Liu y Musial, 1995) (ver
también capítulo 8). Una variación de
esta técnica utilizada hoy en día, es am-
plificar una secuencia de un gen y en-
seguida hacer digestión con enzima de
restricción. Esa variación del RFLP, lla-
mada RFLP/PCR, disminuye el costo del
análisis, además del tiempo para la ob-
tención de los resultados (Gusmão,
2001).
La VNTR es una técnica donde se hace
hibridación del DNA genómico con se-
cuencias que son repetidas en el DNA.
La variabilidad encontrada en ese tipo
de marcador, ocurre probablemente por
errores de lectura de la DNA polimerasa
en la célula que no son corregidos (repli-
cation slippage). También es llamada
técnica de minisatélite y es utilizada
para elaborar fingerprints, que son va-
riables de especie en especie. Los finger-
prints son muy interesantes en el senti-
Desnaturalización de la cadena del DNA
Duplicación
de la cadena
Figura 7.4. Diseño demostrativo de las principales
etapas de la reacción en cadena de la polimerasa.
156
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
do de distinguir variedades para prote-
gerlas, como ocurre a través de las pa-
tentes o registros de obtentor, según sea
el país (Sharon et al., 1995).
Marcadores Moleculares
con base en PCR
Antes de comentar las técnicas de mar-
cadores moleculares que tienen como
base la PCR, es necesario explicar ésta.
El PCR es una reacción in vitro que imi-
ta la replicación del DNA dentro de las
células. Para que ocurra la reacción de
PCR son necesarias tres etapas funda-
mentales: desnaturalización del DNA,
hibridación de un partidor y extensión
de la nueva cadena del DNA producien-
do dos moléculas a partir de una (Figu-
ra 7.4). Esas etapas son repetidas en ci-
clos de 30 o 40 veces. En consecuen-
cia, se produce amplificación de una se-
cuencia de DNA en progresión geométri-
ca, que puede ser analizada en un gel
de agarosa teñido con bromuro de etidio
(Figura 7.4). La etapa de desnaturaliza-
Hibridación
del partidor
o «primer»
Extensión de la
nueva cadena por
la DNA polimerasa
(Taq polimerasa)
MARCADORES MOLECULARES
ción ocurre, en general, a la temperatura
de 92 o C o 95 o C; la etapa de hibridación
del partidor es variable y depende de la
secuencia a amplificar. Los partidores (se
usan dos por reacción) son oligonucleó-
tidos de secuencia directa (uno) y com-
plementaria (el otro), a aquellas que
flanquean la zona que se quiere ampli-
ficar. El partidor o “primer“ es muy im-
portante, pues es él quien ofrece una
conformación en la cadena del DNA
desnaturalizada tal que la enzima DNA
polimerasa se acopla y empieza la ex-
tensión de la nueva cadena complemen-
taria.
Esa temperatura (de apareamiento) es
calculada a partir de la cantidad de ade-
nina, timina, guanina y citosina en la se-
cuencia del partidor. Recordemos que
los puentes de hidrógeno entre adenina
y timina y entre guanina y ciotosina, ge-
nerarán fuerzas distintas en la unión de
las cadenas complementarias, haciendo
importante la proporción de las bases en
el partidor. Cuanto mayor es la tempe-
ratura para la hibridación del partidor,
más específica es su asociación al DNA
genómico, pudiendo variar entre 35 y
65-68 o C. Cuanto mayor la especificidad
del partidor, mayor es la reproducibili-
dad del ensayo. Y finalmente, la etapa
de extensión de la nueva cadena se da,
en general, a la temperatura de 72 oC.
Esa es la temperatura óptima de la DNA
polimerasa. Todo ese proceso es posible
in vitro gracias a la automatización y,
porque la DNA polimerasa utilizada en
él, es resistente a temperaturas altas, ta-
les como aquella de la etapa de
desnaturalización. Esta polimerasa fue
encontrada por primera vez en la bacte-
ria Thermus aquaticus y es conocida
como Taq polimerasa (también existen
variaciones como la Pfu y el fragmento
de Klenow). La PCR se realiza en equi-
pos que producen un cambio rápido de
temperatura, llamados termocicladores
(Rojo, 1999). Las técnicas de marcado-
res moleculares que tienen como base
la PCR son: RAPD, Microsatélites, ISSR,
SCAR, STS y AFLP.
RAPD (Figura 7.5) utiliza como partidor
un único oligonucleótido de 10 bases ni-
trogenadas y de secuencia al azar (ines-
pecífica). Ese partidor hará asociación en
cualquier sitio de toda la cadena del DNA
genómico. Por no ser específico, en el
RAPD suelen ocurrir problemas con la
repetitividad de los ensayos (reproduci-
bilidad). Así, es necesario fijar muy bien
los parámetros del trabajo. La verdad, es
que pequeñas diferencias de concentra-
ción de los reactivos en la reacción, pue-
den alterar el resultado; incluso, pueden
ocurrir varaciones por la utilización de
diferentes termocicladores. Es la técnica
más difícil de reproducir entre los labo-
ratorios y por eso no es recomendada pa-
ra ensayos con objetivo de caracteriza-
ción molecular. Pese a esto, RAPD es la
técnica de menor costo que tiene como
base la PCR. Además de un fácil manejo,
detecta polimorfismos dominantes; esto
es, sólo detecta estados orgánicos en
homocigosis. En la Figura 7.5 se puede
observar un análisis en RAPD, donde se
encontró un fragmento marcador relacio-
nado a un gen de resistencia del Phase-
olus vulgaris al hongo Uromyces phaseoli
(Faleiro et al.,2000).
RAPD ya ha permitido muchísimos es-
tudios que van desde identificación ge-
nética, análisis de diversidad, mapeo ge-
nético en plantas anuales como arroz,
maíz, soja (Ferreira y Grattapaglia,
157
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

Figura 7.5. Productos de amplificación en RAPD del DNA genómico de Phaseolus vulgaris
con el partidor OPF10 en gel de agarosa 1,2% teñido con bromuro de etidio.
P1 y P2 corresponden a los parentales resistente y susceptible al hongo Uromyces phaseoli
respectivamente y F2 es una población segregante de 27 plantas. M corresponde al
marcador de peso molecular (fago λ digerido com EcoRI, BamHI y HindIII.
La flecha indica el fragmento marcador relacionado al gen de resistencia.
Fotografía gentilmente cedida por el Dr. Fábio G. Faleiro, EMBRAPA Cerrados.

1998), forrajeras (Kazan et al., 1992) e
incluso en plantas forestales, como el
eucalipto (Grattapaglia y Sederoff, 1994,
Grattapaglia et al., 1995), frutales como
el mango, naranjo, chirimoya (Fang et
al., 1997; Ravishankar et al., 2000;
Ronning y Schnell, 1995; Schnell, 1993)
y nemátodos o microrganismos (Hahn et
al., 1994; Hayden et al., 1994). Otra
aplicación para RAPD también es la de-
tección de variaciones somaclonales en
plantas micropropagadas en cultivo de
tejidos, pues puede analizar posibles di-
ferencias inducidas genéticamente que
pueden ocurrir durante la regeneración
de las plantas en medio nutritivo (ver
también capítulo 4).
Aunque RAPD no pueda detectar esta-
dos génicos en heterocigosis, se puede
añadir información por medio del clo-
naje de una banda representativa en el
análisis que, en seguida, es sometida al
corte con una enzima de restricción. Si
esta banda contiene una secuencia de
nucleótidos distinta entre dos o más es-
pecies, se observará un patrón diferente
de fragmentos producidos por la acción
de la enzima. De esa manera entonces,
se consigue distinguir las diferentes es-
pecies. Otra alternativa es clonar el frag-
mento polimórfico y transformarlo en un
SCAR. Así, el fragmento polimórfico se
estabiliza y se puede añadir información
al estudio, como por ejemplo su propie-
dad como carácter genético en homo-
cigosis o heterocigosis, utilizándosele en
ensayos de RFLP (Fang et al., 1997). Es-
tas estrategias utilizan herramientas de
la técnica del DNA recombinante, como
el clonamiento y la detección de clones
(ver también capítulo 5).
Los microsatélites son secuencias repe-
tidas en el DNA genómico. Estos marca-
dores son muy polimórficos y pueden

158
MARCADORES MOLECULARES
ocurrir como secuencias perfectas, por
ejemplo (GA) 8 , (TTA) 9 o imperfectas,
como por ejemplo (TC) 4GAATGA(TC) 7 .
Esos marcadores son específicos para
cada especie, por lo cual se hace nece-
sario caracterizar esas secuencias para
cada caso específico a estudiar. Lo an-
terior implica un costo muy alto. Para
caracterizar las secuencias microsaté-
lites, es necesaria la construcción de una
librería genómica (ver capítulo 8) y la
selección de colonias que contengan se-
cuencias homólogas a las posibles se-
cuencias de microsatélites ya caracteri-
zados (patrón semejante) (Figura 7.6). El
fragmento de DNA de las colonias se-
leccionadas debe ser secuenciado, la
secuencia evaluada y a partir de ellas,
son diseñados partidores homólogos a
las zonas flanqueadoras de las posibles
secuencias repetitivas, que corresponde-
rían a los microsatélites encontrados.
Esos partidores deben ser probados en
una PCR. Para cada reacción son utili-
zados dos partidores. El análisis del PCR
se hace en geles de poliacrilamida teñi-
dos con nitrato de plata o también se les
puede hacer en geles de agarosa teñi-
dos con bromuro de etidio. El primer tipo
de análisis también eleva mucho el cos-
to de la técnica. Los microsatélites pro-
ducen polimorfismos del tipo co-domi-
nante, por lo tanto, reconocen expresión
génica en homocigosis y heterocigosis.
Actualmente, esos marcadores son reco-
mendados principalmente para los en-
sayos de caracterización, pues son ellos
los que mejor reproducen resultados
entre los laboratorios de Europa (Jones
et al., 1997). Esos marcadores también
sirven para fingerprints y análisis de di-
versidad genética (Eiadthong et al.,
1999).
Construcción de
librería genómica
Selección de
colonias positivas
para secuencias
relacionadas con
microsatélites
(Hibridación
en colonia)
Purificación y secuenciación
de las colonias
Análisis de las secuencias y diseño
de partidores de las secuencias
flanqueadoras de microsatélites
Pruebas para seleccionar los mejores
partidores en PCR (polimórficos y
marcadores de carácter genético)
Figura 7.6. Esquema demostrativo de las
principales etapas para obtención de
microsatélites específicos.
El ISSR es semejante al microsatélite,
pero lo que se hace es producir un parti-
dor que amplifica la secuencia entre las
secuencias microsatélites. Esa técnica es
patentada cuando se utiliza el extremo
5 ’ (Deshpande et al., 2001).
La técnica de STS es aquella que desde
el RFLP, permite clonar el fragmento
marcador (cuando no se conoce) y, a par-
tir de su secuencia, hacer diseños de par-
tidores específicos, para amplificar sólo
esa secuencia. De la misma manera,
cuando es clonado un fragmento poli-
mórfico desde RAPD, y es secuenciado
para utilización en amplificación PCR,
se produce un SCAR. Como se comen-
159
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

tó, el SCAR estabiliza el fragmento mar- Ambas metodologías utilizan las técni-
cador de RAPD y esa es una posibilidad cas del DNA recombiante ya menciona-
que puede disminuir la desventaja que das en el capitulo 5.
tiene RAPD con respecto a la repetitivi-
dad. SCAR permite también la utiliza- AFLP (Figura 7.7) es una herramienta
ción del fragmento clonado en análisis donde también se emplea el corte del
RFLP y así, ese marcador puede ser eva- DNA genómico con enzimas de restric-
luado en expresión en homocigosis y ción. Pero, en este caso, se hace con dos
heterocigosis. STS y SCAR son herra- tipos de enzimas, una de corte infre-
mientas muy útiles en programas de me- cuente (por ejemplo EcoRI)y otra de cor-
joramiento (Deng et al., 1997; Fang et te frecuente (Msel). Después de la diges-
al., 1997; Barbosa, 1998; Milach, 1998). tión, se hace ligación de adaptadores pa-
5’ GAATTC TTAA 3’
3’ CTTAAG AATT 5’
Restricción con EcoRI y Msel
AATTC T
G AAT
C TAC
GTTAA + G
Adaptador EcoRI Adaptador Adaptador Msel
CAATTC TTAC
GTTAAG AATG

Amplificación con primers

selectivos
3’ GTTAAG AATG 5’

Con. 1 5’ CAATTCC 1/4 de los fragmentos

2 5’ CAATTCCG 1/16 de los fragmentos

3 5’ CAATTCCGA 1/64 de los fragmentos

Nucleótidos selectivos

3’ GTTAAGGCT AATG 6’
Primers 5’ CAATTCCGA
con 3 Amplificación
nucleótidos
selectivos 3’ GTTAAGGCT AATG 6’
5’ CAATTC G
G NO Amplificación
A

Electroforesis desnaturalizante en acrilamida y

tinción con nitrato de plata

Figura 7.7. Esquema demostrativo de las principales etapas para análisis AFLP.
El DNA genómico es digerido con las enzimas de restricción EcoRI y MseI, reacción a la que
se ligan los adaptadores - EcoRI y - MseI (azul y verde respectivamente). Luego de ligados, estos
mismos sitios sirven como zonas de anclaje para una serie de primers que amplificarán
selectivamente, según el nucleótido adicional a la secuencia del adaptador. Estos pueden ser
con +1 nucleótido selectivo, +2 nucleótidos o +3 nucleótidos (bases en rojo), amplificándose
1/4, 1/16 ó 1/64 de los fragmentos totales. Usualmente, se utiliza una reacción de pre-amplifi-
cación con primers +1 nucleótido selectivo y luego, desde esta reacción de PCR,
se reamplifica con primers +3 nucleótidos selectivos. Finalmente, los productos
de PCR se resuelven en electroforesis en acrilamida y tinción con plata.

160
MARCADORES MOLECULARES

ra los dos tipos de enzima. Luego, la PCR
se hace en dos etapas que son selecti-
vas. La primera se hace utilizando parti-
dores de secuencia complementaria a
los adaptadores, pero con un nucleótido
al azar. En la segunda etapa, se utilizan
partidores complementarios a los
adaptadores pero con dos nucleótidos al
azar. Esas distintas etapas de amplifica-
ción son utilizadas para disminuir el
número de fragmentos amplificados y
poder resolverlos bien en un gel de
poliacrilamida. Asimismo, en el análisis
AFLP se produce amplificación de un
gran número de fragmentos. El análisis
de los fragmentos amplificados se hace
en gel de poliacrilamida teñido con plata
o también, se suele utilizar fluorescen-
cia y radioactividad (Figura 7.8). Igual-
mente tiene un costo alto, pero es la es-
trategia que produce más polimorfismos.
Tiene gran potencial para ser utilizada
para producir fingerprints (Figura 7.8)
(Eiadthong et al., 2000; Faleiro et al., en
prensa). De la misma forma que algunas
anteriores, el polimorfismo producido
por AFLP sólo analiza estados génicos
en homocigosis (como RAPD) y tiene
como desventaja, ser una técnica
patentada.
CARACTERÍSTICAS
DE LOS MARCADORES
MOLECULARES
Un marcador es evaluado por su capaci-
dad de producir polimorfismos (Conte-
nido de Información Polimórfica o PIC)
y Multiplex (número de bandas), que co-

Figura 7.8. Patrón de amplificación AFLP separados

en gel de poliacrilamida y revelado con fluorescencia
obtenidos desde 23 plantas distintas de Theobroma cacao.
(Fotografía gentilmente cedida por el Dr. Fábio G. Faleiro, EMBRAPA Cerrados).

161

rresponde a la cantidad de loci analiza-
dos simultáneamente. Esos dos paráme-
tros deben ser los más altos posibles y
representan el índice del marcador. En
la Tabla 7.1 pueden ser observadas las
diferencias de PIC y Multiplex para los
principales marcadores.
Tabla 7.1.
Comparación entre Diferentes Marcadores
Moleculares con respecto a la producción de
información polimórfica y loci analizados*
Marcador/Tipo Multiplex PIC
RAPD ↓ ↓
RFLP ↓↓↓
SSR ↓ ↑↑
AFLP y ISSR ↑↑↑
*
Informaciones obtenidas en el Curso “Aplicação de
marcadores Moleculares em Programas de
Melhoramento Genético Vegetal”, Programa CABBIO /
CNPq, UFRGS, 2000.
En RAPD, se puede aumentar multiplex
utilizando geles de poliacrilamida y en
microsatélites, con muestras hechas en
geles de manera escalonada (utilización
de dos secuencias microsatélites que
producen fragmentos de distintos tama-
ños). Además de esas diferencias, hay
otras con respecto al tipo de ensayo,
detección, tiempo, etc., que están resu-
midas en la Tabla 7.2.
Aspectos importantes al momento de
elegir un marcador son: objetivo del es-
tudio y disponibilidad técnica y finan-
ciera del laboratorio. Es necesario saber
muy bien el objetivo que se quiere al-
canzar y el período de tiempo disponi-
ble para lograrlo, ya sea corto, mediano
o largo.
162
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
APLICACIONES DE LOS
MARCADORES MOLECULARES
En general, los marcadores moleculares son
utilizados en estudios de enfermedades
genéticas, pruebas de paternidad/parentes-
co, también como herramientas en la se-
lección de plantas o animales, en progra-
mas de mejoramiento (Barbosa, 1998;
Milach, 1998; Coutinho y Reginato, 2001;
Griffiths et al., 2001) y finalmente, en es-
tudios cuya finalidad es la caracterización
(taxonomía, evolución, conservación).
Aplicación para estudios
↓ de caracterización
↓↓ Los parámetros más importantes para uti-
lizar marcadores moleculares en la ca-
racterización son: novedad, distiguibili-
dad, homogeneidad y estabilidad. Así, de-
ben ser capaces de demostrar públicamen-
te un alto poder de discriminación, no
deben presentar interacción con el am-
biente, deben ser capaces de producir re-
sultados equivalentes entre distintos labo-
ratorios, deben permitir el cálculo de dis-
tancias entre genotipos en forma consis-
tente con otros caracteres, como informa-
ción de pedigree. Preferentemente, debe
conocerse el control genético de los
descriptos, y ser posible su localización
cromosómica. Además, la metodología de
análisis de los perfiles generados, debe
ser capaz de traducirlos e interpretarlos.
Entre las principales técnicas de marca-
dores moleculares, la más adecuada a esos
parámetros es la de microsatélites. Actual-
mente, este tipo de estudio tiene un gran
impacto, pues son apuntadas como las he-
rramientas más poderosas para identifica-
ción/caracterización de variedades, dan-
do soporte a la propiedad intelectual de
las mismas (Eiadthong et al., 1999).
MARCADORES MOLECULARES

Tabla 7.2. Comparación entre los principales

marcadores (distintos aspectos)*

Marcador/ RAPD/ISSR RFLP SSR AFLP

Parámetro

Evaluación Dominante Co-dominante Co-dominante Dominante

expresión
génica

Ensayo PCR Southern blot PCR Digestión,

e hibridación ligación, PCR
Detección Gel agarosa o Hibridación Gel de poliac Gel de
poliacrilamida (quimio- y nitrato de poliacrilamida y
teñido con luminescencia, plata o nitrato de plata
bromuro de fluorescencia fluorescencia o fluorescencia
etidio o o radiactividad)
fluorescencia
Cantidad de 20-25 ng 2-20 mg 20-30 ng 0,5 ng
DNA utilizado
Tiempo 1 ó 2 días 4 a 12 días 1 ó 2 días 2 días
Relación entre Bandas Homología Se amplifica = RAPD
los genotipos homólogas = X sondas y detecta locus
movilidad
Especificidad No Si Si No
Nivel de Medio Medio Alto Medio
polimorfismo
Costo Bajo Alto Menor que Menor que
RFLP y mayor RFLP y mayor
que RAPD que RAPD y SSR
Patente No No No/ Si para Si
ISSR para el
extremo 5’
*
Informaciones obtenidas en el Curso “Aplicação de marcadores Moleculares em Programas de Melhoramento
Genético Vegetal”, Programa CABBIO / CNPq, UFRGS, 2000.

Aplicaciones de los marcadores redadas, mapeo comparativo entre dis-

moleculares en programas de
mejoramiento
En programas de mejoramiento, los mar-
cadores moleculares pueden ser utiliza-
dos con finalidad de identificación de
individuos, análisis de diversidad gé-
nica, mapeo genético, mapeo de carac-
terísticas cualitativas y cuantitativas he-
tintas especies, estudios de evolución,
caracterización genética de especies,
genética de poblaciones y clonaje de
genes (Lee, 1995; Ferreira y Grattapa-
glia, 1998).
La identificación de plantas puede ser
hecha por medio de VNTR, RAPD, SSR,
ISSR o AFLP. La aplicación de marcado-

163

res moleculares para identificación ge-
nética, permite optimización de bancos
de germoplasma y colecciones nuclea-
res para programas de mejoramiento. Ese
tipo de análisis asociado a evaluación
en software adecuados, conduce a los
estudios de diversidad genética que per-
miten al fitomejorador, una base para su
elección de individuos como progenito-
res, pues analiza la proximidad o diver-
gencia genética de los progenitores top
cross del programa. De esa manera, el
fitomejorador puede optimizar los cru-
zamientos y alcanzar individuos híbri-
dos con características mejoradas en
tiempo más corto.
El mapeo genético es un estudio impor-
tante en programas de mejoramiento,
pues es necesario, en un momento dado,
saber en cual cromosoma está la carac-
terística de interés y cómo ésta segrega
en la población (Ferreira y Grattapaglia,
1998). El mapeo genético que se consi-
gue por medio de trabajos con marca-
dores moleculares (como veremos en el
capítulo 8), también puede ser utilizado
para ubicar en el genoma de una planta
transgénica, el gen que otorgó la carac-
terística introducida a través de la trans-
formación.
La utilización de los marcadores mo-
leculares para mapeo de características
cuantitativas (Quantitative Trait Loci,
QTL), es extremadamente útil. Rasgos
tales como resistencia a enfermedades
o producción, son características que
dependen de más de un gen y así son de
difícil evaluación. Por eso, hacer selec-
ción asistida con marcadores molecula-
res para fragmentos relacionados con
QTL, tiene un gran impacto (Barbosa,
164
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
1998). Además de eso, también se pue-
de hacer el mapeo de características
heredadas que sean cualitativas. En esos
casos, la técnica de SCAR es muy útil
para hacer selección asistida. La selec-
ción asistida fue señalada como una téc-
nica que disminuye el costo de un pro-
grama de mejoramiento (Deng et al.,
1997, Schneider et al., 1997, Yu et al.,
2000). La selección asistida puede tam-
bién ser utilizada para reconocimento de
individuos en una progenie que contie-
ne un gen introducido por transforma-
ción genética de plantas.
Una técnica asociada a los marcadores
moleculares que también es muy utili-
zada en programas de mejoramiento, es
el análisis en grupos segregantes (Bulked
Segregant Analysis) (Michelmore et al.,
1991). Esa herramienta, ya permitió la
identificación de genes o fragmentos
asociados a una característica (Gusmão,
1997), como también fue utilizada en
estudios para encontrar fragmentos es-
pecíficos entre diferentes especies, uti-
lizándose como técnica de marcadores
moleculares, el RAPD (Grattapaglia et
al., 1992).
Los marcadores moleculares ya permitie-
ron el clonaje de un gran número de ge-
nes (Map-based cloning) (Wing et al.,
1994; Wang et al., 1999). Así, la técni-
ca de los marcadores moleculares pue-
de también relacionarse con las del DNA
recombinante y transformación genética
de plantas.
Es conveniente indicar que, el estudio
utilizando marcadores moleculares en
programas de mejoramiento con objeti-
vo de análisis de diversidad genética,
MARCADORES MOLECULARES
mapeo de características cualitativas o
cuantitativas o aún mapeo genético, ne-
cesita no sólo conocimiento técnico de
esas metodologías, sino que también co-
nocimiento para análisis estadísticos en
las progenies analizada (métodos biomé-
tricos de evaluación) y también de soft-
wares tales como SAS, NTSYS, Mapma-
ker, Mapmaker-QTL o Linkage.
Actualmente, en la era de la genómica,
los estudios de secuenciación conducen
al conocimiento de diversas secuencias
génicas nuevas. La caracterización de
nuevos genes, asociados a alguna carac-
terística de interés, puede ser una herra-
mienta muy poderosa para dar soporte
a los programas de mejoramiento y es-
tán asociadas al análisis con marcado-
res moleculares (ver Capítulo 8). Por me-
dio del conocimiento de sus secuencias,
se pueden hacer diseños con partidores
específicos y así hacer amplificación es-
pecífica de los genes más importantes
que se quieren fijar en una población y
analizar su segregación en ésta. Aún
más. se puede estudiar su presencia ge-
nética (homocigosis o heterocigosis). El
mapeo genético de organismos utilizan-
do los marcadores moleculares, también
da soporte a los trabajos de secuen-
ciación completa de genomas (Ferreira
y Grattapaglia, 1998).
REFERENCIAS.
Barbosa Neto, J. 1998. Seleção assistida por
marcadores moleculares. pp. 75–85. In:
Marcadores moleculares em plantas. Ed.
Sandra Milach, Porto Alegre, RS, Brasil.
Coutinho, L. y Regitano, L. 2001. Uso de mar-
cadores moleculares na indústria animal.
biologia molecular aplicada à produção
animal. pp. 12 – 24. In: Correia de Almeida
Regitano, L. y Lehmanm Coutinho, L. Min.
da Agricultura Pecuária e Abastecimento.
EMBRAPA Informação Tecnológica.
Degani, C., El-Batsri, R. y Gazit, S. 1990.
Enzyme polymorphism in mango. J. Am.
Soc. Hort. Sci. 115:844-847.
Deng, Z., Huang, S., Xiao, S. y Gmitter, F. 1997.
Development and characterization of SCAR
markers linked to the citrus tristeza virus
resistance gene from Poncirus trifoliate.
Genome 40:697-704.
Deshpande, A., Apte, G., Bahulikar, R., Lagu,
M., Kulkarni, B., Suresh, H., Singh, N., Rao,
M., Gupta, V., Pant, A. y Ranjekar, P. 2001.
Genetic diversity across natural populations
of three montane plant species from the
Western Ghats, India revealed by intersimple
sequence repeats. Mol. Ecol. 10:2397-2408.
Eiadthong, W., Yonemori, K., Sugiura, A.,
Utsunomiya, N. y Subhadrabandhu, S.
1999. Identification of mango cultivars of
Thailand and evaluation of their genetic
variation using the amplified fragments by
simple sequence repeat-(SSR-) anchored
primers. Scientia Horticulturae 82:47-56.
Eiadthong, W., Yonemori, K., Kanzaki, S. y
Sugiura, A. 2000. Amplified Fragment
Length Polymorphisms analysis for studying
genectic relationships among Mangifera
species in Thailand. J. Am. Soc. Hort. Sci.
125:160-164.
Ellstrand, N. y Lee, J. 1987. Cultivar
identification of cherimoya (Annona
cherimola Mill.) using isozyme markers.
Scientia Horticulturae 32:25-31.
165

Faleiro, F., Lopes, U., Yamada, M., Pires, J.,
Bahia, R., Santos, R., Gomes, L., Araújo, I.,
Faleiro, A., Gramacho, K., Melo, G., Mon-
teiro, W., Valle, R. Caracterização molecular
de variedades clonais de Theobroma cacao
L. recomendadas pelo CEPEC/CEPLAC com
base em marcadores RAPD, AFLP e
microsatélites. Agrotópica (en prensa).
Faleiro, F., Vinhadelli, W., Ragagnin, V., Corrêa,
R., Moreira, M. y Barros, E. 2000. RAPD mar-
kers linked to a block of genes conferring
rust resistance to the common bean. Gene-
tics and Molecular Biology 23:399-402.
Fang, D., Federici, C. y Roose, M. 1997. De-
velopment of molecular markers linked to
a gene controlling fruit acidity in citrus.
Genome 40: 841-849.
Ferreira, M. y Grattapaglia, D. 1998. Introduc-
ción al uso de marcadores moleculares en
el análisis genético. EMBRAPA-CENARGEN,
Brasília, D.F., Brasil. 220 p.
Gusmão, J. 1997. Determinção de marcadores
moleculares de AFLP estreitamente asso-
ciados ao loco MER que confere a resistên-
cia ãs raças E1, E2 e E3 do fungo Melamp-
sora larici – populina em Populus. Tesis de
Maestría, Inst. Biof. Carlos Chagas Filho, CCS,
UFRJ, Rio de Janeiro, Brasil. 143 p.
Gusmão, J., Lazoski, C. y Solé-Cava, A. 2000.
A new species of Penaeus (Crustacea:
Penaeidae) revealed by allozyme and
cytochrome oxidase I analyses. Marine
Biology 137:435-446.
Gusmão, J. 2001. Sistemática molecular e
genética populacional de espécies
brasileiras de camarão (Penaeus: Decapoda:
Penaei-dae). Tesis de Doctorado, Inst. De
Biologia, Depto de Genética, UFRJ, Rio de
Janeiro. 120 p.
Grattapaglia, D., O’Malley, D. y Sederoff, R.
1992. Multiple applications of RAPD mar-
kers to genetic analysis of Eucalyptus sp.
pp. 436-450. In: Proceedings of IUFRO
International Conference “Breeding Tropi-
cal Trees” Section 2.02-08. Cali, Colombia.
166
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
Grattapaglia, D. y Sederoff, R. 1994. Genetic
linkage maps of Eucalyptus grandis and
E.urophylla using a pseudo-testcross
strategy and RAPD markers. Genetics
137:1121-1137.
Grattapaglia, D., Bertolucci, F. y Sederoff, R.
1995. Genetic mapping of quantitative trait
loci controlling vegetative propagation in
Eucalyptus grandis and E.urophylla using a
pseudo-testcross mapping strategy and
RAPD markers. Theor. App. Genetics
90:933-947.
Griffiths, A., Gelbart, W., Miller, J. y Lewontin,
R. 2001. Aplicações da tecnologia do DNA
recombinante – Genética Moderna. p. 309.
Guanabara Koogan S.A., Río de Janeiro,
Brasil.
Hahn, M., Burrows, P., Gnanapragasam, N.,
Bridge, J., Vines, N. y Wright, D. 1994.
Molecular diversity among Radopholus
similis populations from Sri Lanka detected
by RAPD analysis. Fundamental Applied
Nematology 17:275-281.
Hayden, H., Pegg, K., Aitken, E. e Irwin, J.
1994. Genetic relationships as assessed by
molecular markers and cross-infection
among Strains of Collectotrichum
gloeosporioides. Australian Journal of
Botany 42:9-18.
Huamán, Z., Ortiz, R., Zhang, D. y Rodríguez,
F. 2000. Isozyme analysis of entire and core
collections of Solanum tuberosum subsp.
Andigena potato cultivars. Crop Science
40:273-276.
Jones, C., Edwards, K., Castaglione, S.,
Winfield, M., Sala, F., van de Wiel, C.,
Bredemeijer, G., Vosman, B., Matthes, M.,
Daly, A., Brettschneider, R., Bettini, P.,
Buiatti, M., Maestri, E., Malcevschi, A.,
Marmiroli, N., Aert, R., Volckaert, G., Rue-
da, J., Linacero, R., Vazquez, A. y Karp, A.
1997. Reproducibility testing of RAPD,
AFLP and SSR markers in plants by a
network of European laboratories.
Molecular Breeding 3:381-390.
MARCADORES MOLECULARES
Kazan, K., Manners, J. y Cameron, D. 1992.
Genetic relationships and variation in the
Stylosanthes guianensis species complex
assessed by random amplified polymorphic
DNA. Genome 36:43-50.
Lee, M. 1995. DNA Markers and Plant Breeding
Programs. Advances in Agronomy 55:265-
344.
Liu, C. y Musial, J. 1995. Restriction fragment
length polymorphism detected by cDNA and
genomic DNA clones in Stylosanthes.
Theoretical Applied Genetics 91:1210-1213.
Medina-Filho, H. 1980. Linkage of Aps-1, Mi
and other markers on chromosome 6,
Report. Tomato Genetics Cooperative
30:26-28.
Michelmore, R., Paran, I. y Kesseli, R. 1991.
Identification of markers linked to disease-
resistance genes by bulked segregant
analysis : a rapid method to detect markers
in specific genomic regions by using
segregating populations. Proc. Natl. Acad.
Sci. (U.S.A.) 88:9828-9832.
Milach, S. 1998. Principais tipos de marcado-
res moleculares e suas características – Mar-
cadores moleculares em plantas. pp. 17-29.
Ed. Sandra Milach, Porto Alegre, RS, Brasil.
Pruvost, O., Couteau, A., Perrier, X. y Luisetti, J.
1998. Phenotypic diversity of Xanthomonas
sp. mangiferaeindicae. Journal of Applied
Microbiology 84:115-124.
Rojo, M. 1999. La reacción en cadena de la
polimerasa – Ingenería genética y transfe-
rencia génica. pp.85-99. Ediciones Pirámi-
de, S.A., Madrid, España.
Ravishankar, K., Anand, L. y Dinesh, M. 2000.
Assessment of genetic relatedness among
mango cultivars of India using RAPD
markers. Journal of Horticultural Science
& Biotechnology 75:198-201.
Ronning, C. y Schnell, R. 1995. Using randomly
amplified polymorphic DNA (RAPD)
markers to identify Annona cultivars. J. Am.
Soc. Hort. Sci. 120:726-729.
Schnell, R. 1993. Genetic relationships among
Mangifera spp. Based on RAPD. Acta
Horticulturae 341:86-92.
Schneider, K., Brothers, M. y Kelly, J. 1997.
Marker-assisted selection to improve
drought resistance in common bean. Crop
Science 37:51-60.
Sharon, D., Adato, A., Mhameed, S. y Lavi, U.
1995. DNA fingerprints in plants using sim-
ple-sequence repeat and minisatellite
probes. HortScience 30:109-112.
Wang, Z., Yano, M., Yamanouchi, U., Iwamoto,
M., Monna, L., Hayasaka, H., Katayose, Y.
y Sasaki, T. 1999. The Pib gene for rice blast
resistance belongs to the nucleotide binding
and leucine-rich repeat class of plant
disease genes. Plant Journal 19:55-64.
Wing, R., Zhang, H. y Tanksley, S. 1994. Map-
based cloning in crop plants. Tomato as a
model system: I. Genetic and physical
mapping of jointless. Molecular Gene
Genetics 242:681-688.
Yu, K., Park, S. y Poysa, V. 2000. Marker-
assisted selection of common beans for
resistance to common bacterial blight:
efficacy and economics. Plant Breeding
119:411-415.
167
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

168
GENÓMICA
GENÓMICA
INTRODUCCIÓN
L a decodificación de las secuencias
en que los nucleótidos se ordenan
para dar origen a los diversos genomas,
constituye una de las contribuciones más
espectaculares de los últimos años en el
ámbito de la ciencia. Esto ha permitido
formular ya variadas teorías acerca de
las relaciones evolutivas de varias espe-
cies vivas, en las que obviamente, se in-
cluye la humana.
En 1965, trabajando con el tRNA de
alanina, Robert Holley (Holley, 1968) por
primera vez obtuvo la secuencia comple-
ta de un ácido nucleico. Él encontró que
éste estaba constituído por 76 bases, de
las cuales 10 de ellas estaban modifica-
das químicamente. Sin embargo, la pro-
puesta de código genético para la traduc-
ción de secuencias nucleotídicas de
Marshall Nirenberg y Har Khorana, esta-
blecía que esta traducción se realizaba
bajo la base de la lectura de grupos de
tres nucleótidos, llamados codones, pero
además reconocía la existencia de varios
codones para un mismo aminoácido (co-
dones redundantes). Así, el ordenamien-
to aminoacídico descubierto por Sanger
sólo dio paso a la incógnita de la real
secuencia nucleotídica que debía tener
su gen.
En los años 70, el mismo Sanger y el
equipo conformado por Alan Maxxam y
Walter Gilbert, implementaron en forma
CAPÍTULO 8
Humberto Prieto E.
paralela, distintas aproximaciones quí-
micas para acceder al conocimiento del
orden lineal de los nucleótidos que con-
forman un gen. De este modo, surge el
método de secuenciación de los ácidos
nucleicos, conocido como de la termi-
nación de la cadena, utilizando análo-
gos de los nucleótidos que conforman
el DNA (Sanger et al., 1977).
La metodología propuesta por Sanger, se
basó en trabajos preliminares propues-
tos por Kornberg en base a la replicación
del DNA a partir de un molde (capítulo
5). Así, si se utiliza una cadena de
politiminas (poliT) como molde o tem-
plado, la DNA pol irá incorporando
adeninas como complemento a este
molde. Si recordamos, la adición de re-
siduos en la hebra naciente del DNA es
mediante la generación de un enlace
entre el grupo fosfato unido al C-5´ del
grupo azúcar del nucleósido entrante y
el OH- del C-3´del grupo azúcar del
nucleótido previo (lo que se conoce
como dirección 5´-3´ de síntesis). Por lo
tanto, la existencia de este grupo OH-
en el C-3´ de la nueva cadena de DNA
(cadena naciente), es fundamental para
la reacción de polimerización. Precisa-
mente, Sanger predijo que si este grupo
OH- no existiera, la polimerización no
proseguiría. De esta forma, si en vez de
situarse un nucleótido con sus grupos
OH- en el C-3´ en la cadena que se está
elongando, se situara un nucleótido sin
este grupo OH, es decir un análogo
169

didesoxinucleósido trifosfato (ddNTP), la
polimerización o elongación de la ca-
dena de DNA, se detendrá.
En otras palabras, si un DNA molde es
distribuido entre cuatro tubos distintos
y a cada de ellos les adiciona una mez-
cla de los cuatro desoxinucleósidos tri-
fosfato (dATP, dTTP, dGTP y dCTP) con
uno de ellos marcado radiactivamente,
más la DNA pol y un partidor, la elonga-
ción ocurrirá sin ningún problema en
ninguno de estos tubos. Pero Sanger adi-
cionó a cada uno de estos tubos, uno de
los ddNTPs (ddATP, ddCTP, ddGTP o
ddTTP). Así, cada tubo de Sanger conte-
nía los cuatro dNTPs más un ddNTP es-
pecífico. De esta forma y cuidando una
adecuada razón dNTPs/ddNTP, la elon-
gación se detuvo cuando ese ddNTP se
incorporó a la cadena naciente de DNA.
Como cada tubo estaba marcado según
el ddNTP que se había adicionado, San-
ger sabía en dónde estaban parando su
elongación los fragmentos nuevos de
DNA. Así, en cada uno de los tubos ha-
bía una mezcla o población de fragmen-
tos de DNA de distinto tamaño, pero que
siempre habían parado en un ddNTP es-
pecífico, el adicionado a ese tubo de-
terminado.
En seguida, Sanger separó cada uno de
los fragmentos amplificados mediante
electroforesis. Depositó el contenido de
cada tubo en un pocillo de un gel de
acrilamida y luego puso en contacto este
gel con una placa tipo fotográfica, de
manera que las bandas correspondientes
a cada fragmento se hicieron visibles al
revelar dicha placa, pues recordemos que
también había un nucleósido radioactivo
en la mezcla de reacción. Según el prin-
cipio de la separación electroforética, al
170
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
someterse a un campo eléctrico, las ban-
das más pequeñas se moverán más rápi-
do en la trama del gel, que las más gran-
des. De esta forma, la placa fotográfica
tendrá marcada una escala de tamaños co-
rrespondiente a los fragmentos generados
por la DNA pol en cada tubo, hasta que
se incorporó un ddNTP y detuvo la elon-
gación. Así, el DNA estaba siendo secuen-
ciado de manera confiable y de una ma-
nera relativamente poco laboriosa.
Con el desarrollo de esta gran herra-
mienta, también en 1977, se publicó la
primera secuencia de un gen humano
(Seeburg et al., 1977). En 1986, Hood y
su grupo (Strauss et al., 1986) publica-
ron un mejoramiento de la metodología
originalmente propuesta por Sanger. Esta
mejora consistió en no utilizar radioac-
tividad en alguno de los dNTPs que es-
taba siendo incorporado por la DNA pol,
sino emplear ddNTPs “fluorescentes co-
loreados” de manera distinta según fue-
ran ddATP, ddCTP, ddTTP o ddGTP. Así,
cada fragmento elongado en la polime-
rización incorporará un análogo ter-
minador de la cadena que será además
"coloreado", por lo que será leído de
manera automatizada por un sistema
detector, sensor de la longitud de onda
o color del respectivo ddNTP. Al mismo
tiempo, la relación entre el tamaño del
fragmento sintetizado y su color, podía
ser fácilmente relacionada por un com-
putador. De esta forma, nace el proceso
conocido como secuenciación automáti-
ca, teniéndose como el primer secuen-
ciador automático aquel desarrollado
por la empresa Applied Biosystems, en
California en el año 1987.
Se inició así, una carrera que aún esta-
mos viviendo, la genómica de los seres
GENÓMICA
vivos. Es decir, conocer exactamente el
orden que tienen los nucleótidos a tra-
vés de todo el genoma de los seres vi-
vientes. A priori, se podría pensar que es-
ta es una misión relativamente sencilla,
pero en realidad el ordenamiento simple
de los nucleótidos a través de un genoma
no se puede evaluar de manera solitaria
y, hoy en día, se sabe que a él deben adi-
cionarse estudios que relacionan este ge-
noma con su funcionalidad y productivi-
dad. Y como se supondrá, esto es una fun-
ción del contexto celular. Así, en forma
paralela, surgieron áreas como la Proteó-
mica y Metabolómica. Finalmente, a es-
tas alturas ya es evidente que sólo con la
ayuda de los computadores y programas
específicos seremos realmente capaces
de entender toda esta gran cantidad de
información que a diario se está generan-
do, surgiendo así la Bioinformática.
UBICÁNDONOS
EN UN GENOMA.
Las primeras banderillas, marcadores
moleculares.
De una forma consecuente al descubri-
miento de la nucleina, primera descrip-
ción para los ácidos nucleicos, una de
las primeras herramientas para orientar-
nos en los genomas proviene de las téc-
nicas de tinción de DNA, las que en su
mayoría lo utilizan en forma de cromo-
somas. La tinción de los cromosomas
genera patrones específicos de bandas,
los que son de gran utilidad en estudios
citogenéticos. Sin embargo, estas ban-
das corresponden a millones de nucleó-
tidos y miles de genes. Si consideramos
estos cromosomas teñidos como un mol-
de de cocina que debe ser llenado con
un delicioso pastel, uno de los primeros
objetivos será hacer el pastel que se de-
berá cocer. Así, una de las primeras
aproximaciones para la elucidación de
un genoma, es el saturar este complejo
mapa lineal de nucleótidos constituyen-
te de los tangibles cromosomas, con
cientos o miles de marcadores molecu-
lares, los que ya conocemos del capítu-
lo anterior.
Vayamos a un ejemplo simple pero a la
vez complejo, el desarrollo del Genoma
Humano, proyecto emprendido en 1989.
El primer director del Programa Genoma
Humano, James Watson, planteó la es-
trategia de utilizar a los marcadores mo-
leculares como herramientas de aproxi-
mación a los genes de un cromosoma.
Su idea fue ubicar tantos marcadores
como fuera posible, de modo que estos
estuvieran relacionados con secuencias
únicas. De esta forma, uno de los pri-
meros trabajos en el desarrollo del Pro-
yecto Genoma Humano, fue ubicar lo-
tes de marcadores sobre unidades sub-
cromosomales, por ejemplo, de 150.000
nucleótidos. Encontrar genes, los cuales
en términos muy generales tienen unos
10.000 nucleótidos en humanos, dentro
de estos segmentos de 150 mil bases es,
en la práctica, mucho más fácil que en-
contrarlos dentro de un cromosoma
completo. Watson logró ubicar 30 mil
marcadores con secuencias únicas de
entre 100-300 nucleótidos de largo, a
través del genoma humano completo.
Para realizar esto, los cromosomas se
cortaron con enzimas de restricción de
corte infrecuente, de forma de tener
como resultado estos fragmentos de
150.000 pares de bases aproximadamen-
te (Figura 8.1A). Estos se ligaron y clo-
naron en unas nuevas herramientas mo-
171
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

leculares, pero que manejan los mismos
principios teóricos descritos anterior-
mente en el capítulo 5: los cromosomas
artificiales de bacterias (BACs, Bacterial
Artificial Chromosomes). Los BACs y los
plasmidios poseen grandes similitudes,
en cuanto a que son DNAs que se utili-
zan en el mesón del laboratorio, a los
que se les puede introducir un segmen-
to de DNA de interés. Ambos son de ori-
gen bacteriano, por lo que podemos tra-
bajarlos con bacterias, pero como se po-
drá ver, un BAC admite 150 mil pares
de bases, fragmento notablemente ma-
yor al que soporta un plasmidio.
Partiendo de estos clones BAC, la estra-
tegia general consistió en cortarlos orde-
nadamente con distintas enzimas de res-
tricción (en digestiones separadas), de
forma de tener varios fragmentos que pu-
dieran se superponibles entre ellos (Fi-
gura 8.1B). Con estos mapas de diges-
tiones de cada clon BAC, se alinearon
zonas consenso de cortes entre varios
clones y se ensamblaron computacio-
nalmente (Figura 8.1C), generando mar-
cadores que en esencia, corresponden
a secuencias únicas de 100 a 300 bases
cada una (Figura 8.1D).

Figura 8.1. Clones BAC para secuenciación del genoma humano. Watson propuso generar
fragmentos de los cromosomas humanos (de alrededor de 150 mil pares de bases) a través
de cortes con enzimas de restricción de corte poco frecuente (A). Estos se clonaron en
cromosomas artificiales de bacterias (BACs) (B) donde nuevamente se cortaron con enzimas
de restricción, esta vez generando cortes más frecuentes (C). Finalmente, estos mapas se
reconstituyeron, sobreponiendo segmentos comunes, de manera de ordenarlos de la forma
como deberían estar en su respectivo cromosoma. Al mismo tiempo, se aislaron los
marcadores específicos, los que corresponderían a secuencias únicas representativas
de cada fragmento cromosómico inicial (D).

172
GENÓMICA
Nuevas marcas, etiquetas de secuen-
cias expresadas.
Considerando que aproximadamente el
3% del genoma humano corresponde
efectivamente a genes, el intentar ubi-
carlos utilizando el mapa de marcado-
res diseñado por Watson, se convertía
en una misión extremadamente laborio-
sa. De a esto, muchos de los integrantes
de este megaproyecto, sabían que sería
necesario reducir el universo sobre el
cual buscar. El DNA recombinante y la
transformación de plantas nos han mos-
trado que, una de las primeras necesi-
dades en el conocimiento de los genes,
es el poder manejarlos en el laborato-
rio. Como ya hemos visto, una de las
formas de manipular DNA en un tubo de
ensayo es la etapa de clonamiento. En
teoría, un investigador puede introducir
o clonar prácticamente cualquier seg-
mento de DNA en un plasmidio. Este
DNA insertado y su significancia biológi-
ca, es la base de dos tipos de herramien-
tas básicas de la biología actual, las
genotecas.
Las genotecas.
Éstas son colecciones de plasmidios (u
otro vector manipulable de DNAs como
por ejemplo un fago), que tienen inser-
tados fragmentos representativos de
genes de un organismo.
Existen al menos dos vías de tener re-
presentado un gen. Como se discutió en
el capítulo 5, en eucariontes un gen está
constituido por exones e intrones. Como
contrapartida, una bacteria no posee
intrones. De esta forma, si se piensa que
se puede tener el genoma de una célula
eucarionte digerido con enzimas de res-
tricción y ligado a plasmidios, estarán
clonados genes con todas sus secuen-
cias, incluyendo las secuencias re-
guladoras, los exones y los intrones. Esto
se conoce como una genoteca genómica
y representa toda la carga informática de
un individuo, independiente de su me-
dioambiente o de su estado fisiológico.
Sin embargo, si mediante herramientas
del DNA recombinante extraemos
mRNAs de una célula (eucarionte o pro-
carionte), y utilizando transcriptasas re-
versas generamos una primera hebra de
DNA exactamente complementario al
mRNA aislado, fabricamos lo que se lla-
ma un cDNA hebra simple. Si con ayu-
da de la DNA pol sintetizamos su hebra
complementaria, tendremos un cDNA
doble hebra. Vale la pena referirnos a la
cualidad de este cDNA: en él no están
representadas secuencias promotoras ni
los intrones. Si clonamos en plasmidios
cDNAs retrotranscritos de una población
representativa de mRNAs de una célula,
tendremos lo que se denomina una
genoteca cDNA (Figura 8.2). Nótese que
por lo general, nuestra población de
mRNAs aislados corresponderá a aquel de
células bajo un determinado estado fisio-
lógico o ambiental, por lo que guardará
así una relación funcional respecto de una
situación específica. De este modo, las
genotecas cDNA son en su mayoría fun-
cionales.
Una aproximación experimental, a la
vez sencilla y barata para dar con genes
que conforman nuestro genoma, es el
utilizar señales que estén ya situadas
dentro de genes que se expresan. El re-
quisito es que éstas, al igual que los
marcadores desarrollados por la estrate-
gia de Watson, deben ser únicas.
173
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

Figura 8.2. Genoteca cDNA de cerebro. En un estadio específico se extrae el mRNA

de estas células, el que sirve para ser retrotranscrito a cDNA hebra simple.
Luego, mediante la DNA pol I se sintetiza la segunda hebra de este cDNA y
posteriormente se clonan en un vector apropiado, en este caso, un fago.

Señales “etiqueta” de genes que se ran etiqueta o marcadoras de genes que

expresan.
Craig Venter, un colaborador y amigo de
Watson, quien trabajaba buscando genes
humanos en el Nacional Institute of
Health (NIH), utilizó una genoteca cDNA
de cerebro humano que estaba hecha con
anterioridad, como base de templados
para buscar secuencias únicas que fue-
estaban representados en esa genoteca de
cerebro. Estas secuencias se denominan
etiquetas de secuencias expresadas (EST,
de “Expressed Sequence Tags”). La estra-
tegia de Venter fue amplificar por PCR,
zonas de 150 a 400 nucleótidos, utilizan-
do como DNA templado esta genoteca
cDNA de cerebro humano (Figura 8.3).
Para esto, utilizó partidores aleatorios,

Figura 8.3. Desarrollo de ESTs. A partir de cDNAs de una genoteca, estos son amplificados
aleatoriamente mediante partidores, generándose amplicones de distinto tamaño, representati-
vos de los genes capturados por la genoteca. Los amplicones, representan entonces a genes
específicos, los que pueden ser secuenciados y utilizados como señales de una secuencia
de un gen que se está expresando en un momento específico de una célula.

174
GENÓMICA
que permitieron amplificar distintas ban-
das únicas en tamaño y secuencia. Estos
ESTs corresponden, entonces, a genes ex-
presados en el cerebro, puesto que ellos
provienen de una genoteca cDNA de ce-
rebro (es decir, de un mRNA de este teji-
do). El resultado final de este grupo fue
la obtención de 2375 ESTs y sus respecti-
vas secuencias. Increíblemente, sólo el
17% de éstas fue conocida, al comparar-
la con una base de datos que contenía la
secuencia de todos los genes conocidos
a la fecha. Algunos de los genes identifi-
cados resultó ser de distribución genera-
lizada en el cuerpo humano, como el de
la β-actina; pero otros mostraron ser más
específicos del cerebro, como el gen big-
brain previamente identificado en
Drosophila melanogaster (Rao et al.,
1990).
El 83% de genes deconocidos fue, sin du-
da, el resultado más excitante a estas altu-
ras. Así, pronto este grupo desarrolló
30.000 ESTs adicionales en unos pocos
años, los que estaban obviamente rela-
cionados a genes nuevos. Esto marcó el
inicio, tanto de grandes empresas biotec-
nológicas dedicadas a la genómica (como
Human Genome Sciences e Incyte Geno-
mics), como de la discusión sobre la fi-
nalidad de la carrera por conocer y ma-
nipular genes.
Desde el punto de vista técnico, uno de
los lados débiles de esta estrategia es
que, genes con baja expresión de su
mRNA, estarán pobremente o simple-
mente no representados por una colec-
ción de ESTs. Además, los bancos de
ESTs, no identificarían zonas reguladoras
de los genes que estaban siendo anota-
dos.
ROMPIENDO UN GENOMA
Y ESTUDIÁNDOLO POR PARTES
Consciente de la debilidad de los ESTs,
Watson decide extender la estrategia de
romper el DNA humano para tenerlo
prácticamente por completo, en forma
de pedazos manejables y abordables en
el laboratorio. Esta estrategia recibe el
nombre de mapeo físico completo.
Mapeo Físico por ensamblaje de
clones BAC.
Debido al trabajo previo de mapeo con
los clones BAC de 150 mil nucleótidos,
se tenía toda una librería BAC con mar-
cadores de secuencias únicas de 100-
300 nucleótidos “anclados“ o ubicados.
En adición, a aquellos clones BAC que
no se les pudo relacionar experimental-
mente con un marcador, se les sometió
a un estudio más detallado, digiriéndo-
lo con enzimas de restricción adiciona-
les. Esta vez se utilizaron enzimas con
secuencias de corte más comunes que
las inicialmente utilizadas. Estos sitios
de restricción, también se convirtieron
en señales físicas útiles como marcado-
res moleculares y permitieron dar cierto
orden a la librería de BACs ya diseñada.
Luego de este ordenamiento, se selec-
cionaron los BACs que teóricamente se-
rían suficientes para cubrir todo un
cromosoma, según la comparación con
los marcadores que originalmente se ha-
bían situado, a razón de uno por cada
150 mil bases. Como trabajar con “me-
gaplasmidios” como los BACs con inser-
tos de más o menos 150 mil nucleótidos,
es abordable pero no trivial en el labo-
ratorio, estos se digirieron nuevamente
para generar fragmentos de aproximada-
175

mente 1.500 pares de bases, los que se
subclonaron en vectores tipo fago, de
manejo experimental similar a los plas-
midios descritos anteriormente (sobre
todo en lo referente al tamaño del DNA
externo insertado). Los fagos también
pueden ser utilizados en la elaboración
de genotecas y, para ser apegados a la
verdad, fue una genoteca elaborada con
fagos, la que utilizó Venter para generar
sus ESTs de cerebro (Figura 8.2).
De este modo, y nuevamente para ase-
gurar la factibilidad de sobreposición de
fragmentos en el armado final, se digi-
rió cada clon BAC con distintas enzimas
de restricción.
Los clones de fago (con fragmentos de
DNA genómico humano de aproximada-
mente 1500 nucleótidos), se secuencia-
ron individualmente, información con la
que luego se debió emprender el cami-
no reverso. Es decir, comenzar a pegar
fragmentos, aunque en forma teórica y
con ayuda de programas computacio-
nales. Como podrá calcularse, la base
del armado reverso fue la utilización de
las secuencias de las zonas que se su-
perponían. Esto se hizo también con la
ayuda del conocimiento previo de la po-
sición relativa de los marcadores mole-
culares generados inicialmente por el
proyecto. De esta forma, se armaron las
secuencias contiguas o simplemente
“contigs“. Armar nuevamente cada uno
de los fragmentos pequeños, hasta lle-
gar al orden de los fragmentos de 150
mil nucleótidos de cada clon BAC, fue
el paso siguiente. Luego, obtenida la in-
formación para cada clon BAC deriva-
do de cada cromosoma, se armaron los
cromosomas. Al tener la información de
la secuencia de cada cromosoma, se
176
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
había terminado el secuenciamiento del
genoma humano.
Mapeo por ruptura física del DNA.
Venter, en su anhelo por desarrollar for-
mas más directas para secuenciar geno-
mas, propuso el método de la secuencia-
ción por ruptura del DNA, lo que se cono-
ce como “shotgun sequencing“. Este méto-
do se inicia con la generación de peda-
zos de DNA generados al azar, pero que
tengan secuencias que se sobrepongan.
Esto se consigue haciéndolo pasar en for-
ma de solución acuosa, por una jeringui-
lla con aguja (Figura 8.4). Según la pre-
sión o número de veces que esta solución
se haga pasar por la aguja, será el tamaño
promedio de los fragmentos que se gene-
rarán. De esta forma, Venter obtuvo solu-
ciones con fragmentos promedio de 2.000
bases y otra solución con fragmento pro-
medio de 10.000 bases. Ambas solucio-
nes de ruptura se clonaron en plasmidios,
a modo de genoteca genómica. Luego, se
secuenciaron los extremos de cada uno
de los clones bacterianos (Figura 8.5A),
puesto que él ya sabía que no necesitaba
conocer la secuencia del todo el fragmen-
to. Finalmente, utilizó esta información
para que, con ayuda de programas compu-
tacionales desarrollados ex profeso, se
hiciera automáticamente el ensamblaje de
los “contigs“ (Figura 8.5B). Así, sumando
secuencias que se sobreponían, Venter se
propuso acortar camino sobre el trabajo
que significa el uso de marcadores y
clones BAC, para obtener la secuencia del
genoma humano completo (Figura 8.5C).
Su primer gran resultado vino en 1995,
cuando reportó la secuencia de los 1,8 mi-
llones de nucleótidos de Haemophilus
influenzae (Smith et al., 1995). Un nuevo
resultado vino luego en 1999, cuando des-
GENÓMICA

de su compañía Celera, informó del geno-

ma completo de Drosophila melanogaster
(Adams et al., 2000), el cual obtuvo en
colaboración con el ya formado Droso-
phila Genome Project.

Sin duda, estos primeros resultados de

Fragmentos de 2.000 y 10.000 pares de bases.
Figura 8.4. Estrategia de ruptura del DNA
mediante su paso por el orificio de una
jeringuilla. El tamaño de los fragmentos
generados dependerá de la fuerza con que
se hagan pasar estos a través de la aguja
(mientras más fuerza, mayor ruptura).
A
AAGACTTATG GGACACAGGTTATGG
GACCTTA CGTTGGA GACACAGGTT
secuenciación de genomas ya auguraban
un pronto primer anuncio en el conoci-
miento del genoma humano. Así, en 26
de Junio del 2000, el mismo Venter y
Francis Collins, reemplazante de Watson
como jefe del Programa Genoma Huma-
no, informaron en la Casa Blanca, el tér-
mino del libro borrador para las secuen-
cias del genoma humano. Un análisis
funcional-estructural de este borrador
CGTTATAGG

GCACGTT TATGGAC TTATGGACCA GATTAGGCC

TAGGATTA GATTGGG
TAT GGTGC AACGTTATA CCGA
TATGGA GTGCACG
AAGGTGCACGTTG GTTA
TAAGGT GGACACA
GTTGGACA ACCAACGT AGGTGCA
AGGTTATGGA AGGATTAGG
ACCAACG AGGCCCGA
ACACAGGTTATGGACC GGCCCGAGATTGG
AAGGAC TTAAGGTG
B
AAGGAC TTAAGGTG
GACTTAT GGTGC
TATGGA GTGCACG
GACCTTA CGTTGGA
AAGGACTTATC C C A C A C A C C T TAT C C
TTAAGGT GGACACA
AGGTGCA CACAGGTT
GCACGTT TATGGAC
GTTGGACA ACCAACGT
AAGGTGCACGTTG G T TATA G G AT TA G G C
GACACAGGTT CGTTATAGG
AGGTTATGGA AGGATTAGG
TTATGGACCA GATTAGGCC
TGGACCAACG AGGCCCGA
A A C G T TATA CCGAGAT
TAGGATTA GATTGGG
ACACAGGTTATGGACC GGCCCGAGATTGGG
C
AAGGACTTATGGACCTTAAGGTGCACGTTGGACACAGGTTATGGACCAACGTTATAGGATTAGGCCCGAGATTGGG

Figura 8.5. A) Secuenciamiento de los extremos de los fragmentos generados por ruptura
con jeringuilla y luego clonados hacia vectores de manipulación en el laboratorio. B) Seguida
esta etapa de secuenciación de los bordes de los fragmentos, computacionalmente se
alinean las secuencias superponibles, de modo de ordenar estos fragmentos, generando
finalmente una secuencia lineal, que corresponde al DNA completo
fragmentado originalmente (C).

177

fue publicado en Febrero de 2001 (Ven-
ter et al., 2001), quedando a la vez de
manifiesto que aún quedaba mucho tra-
bajo por realizar. Ejemplo de esto, son
varias de las secuencias correspondien-
tes a las regiones centroméricas. Éstas
contienen una gran cantidad de secuen-
cias repetitivas (repeticiones de unos
pocos nucleótidos). Este tipo de secuen-
cias hace muy difícil la tarea de los com-
putadores, puesto que ellos otorgan va-
rias posibilidades de las cuales sólo una
es la acertada. Así, la tarea está aún en
marcha.
GENÓMICA FUNCIONAL
Inducción diferencial de genes. Hi-
bridación substractiva.
¿Qué genes están involucrados en una
respuesta específica?. En ciencia, la
comprensión de los eventos moleculares
involucrados en una respuesta por parte
de un organismo o un individuo ante un
estímulo específico, involucra el tener,
en la medida de lo posible, tanto la situa-
ción de reposo o control, así como la
situación específica. Como bien lo dice
nuestra pregunta, los eventos compo-
nentes de la respuesta serán entonces la
diferencia entre estas dos condiciones.
A nivel de genes, aquellos que son apa-
gados o activados durante una respues-
ta, serán evaluables sólo si podemos
compararlos con una condición en la
que no está el agente que produjo tal res-
puesta. Una de las primeras herramien-
tas para estudiar este tipo de procesos,
proviene de la técnica de hibridación
substractiva de ácidos nucleicos.
Igor David y Thomas Sargent desarrolla-
ron este procedimiento para descubrir
178
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
aquellos genes que se inducen en una
célula como respuesta a un estímulo me-
dioambiental. Para ello, utilizaron célu-
las de ranas (Xenopus laevis), las que co-
mo sabemos, tienen distintos estados de
desarrollo. Entre estos estados, también
se pueden distinguir distintas morfolo-
gías, aunque las células siempre tengan
el mismo genoma. En la blástula encon-
tramos un montón de células en estado
indiferenciado, pero ya en la gástrula,
encontramos capas celulares como ecto-
derma, endoderma y mesoderma. Así,
ellos supusieron que los genes encarga-
dos de esta diferenciación en capas, de-
bía gatillarse a tiempos terminales del
estado de blástula o muy iniciales de la
gástrula. Para realizar su estudio, extra-
jeron mRNAs desde individuos en am-
bos estados a distintos tiempos de edad
(Figura 8.6). Tal como se realiza en la
elaboración de una genoteca cDNA, uti-
lizaron transcriptasa reversa para obte-
ner los cDNAs (hebra simple) correspon-
dientes a las distintas muestras del esta-
do gástrula. Luego utilizaron estos
cDNAs para hibridarlos con los mRNAs
procedentes de las distintas muestras de
blástula. Los híbridos formados entre
cDNA-mRNA, correspondieron a genes
que se transcribieron en ambos estados,
quedando en estado de cDNA no hibri-
dados, sólo aquellos correspondientes a
transcritos que específicamente se ex-
presaban en los estadios de gástrula.
Para separar esta mezcla de híbridos
cDNA-mRNA de las hebras cDNA no co-
munes, la hicieron pasar por una colum-
na de hidroxiapatita, que une específi-
camente los ácidos hibridados, dejando
pasar los cDNAs hebra simple (no hibri-
dados), correspondientes específica-
mente a genes expresados en el estadio
gástrula.
GENÓMICA

Figura 8.6. Genoteca substractiva. . Desde los estadios de blástula y gástrula del embrión
de Xenopus laevis, se aislaron los mRNAs en tubos separados. Luego se retrotranscribieron
aquellos mRNAs correspondientes al estado de gástrula y se mezclaron, de forma de producir
la hibridación entre mRNA de blástula y cDNAs de gástrula. Los híbridos formados entre
cDNA-mRNA correspodieron a genes que se transcribieron en ambos estados, quedando en
estado de cDNA no hibridado, aquellos correspondientes a transcritos que específicamente
se expresaban en los estadios de gástrula. Para separar esta mezcla de híbridos cDNA-mRNA
de las hebras cDNA no comunes, se le hizo pasar por una columna de hidroxiapatita,
que sólo deja pasar los cDNAs hebra simple (no hibridados) que corresponden,
específicamente, a genes expresados en el estadio gástrula.

Estos fragmentos cDNA hebra simple, se El poder acceder a representaciones de

llevaron a cDNA hebra doble para final-
mente utilizarlos en la construcción de
una genoteca, correspondiente a genes
que exclusivamente se expresan duran-
te el estadio de gástrula de Xenopus
laevis. La utilidad de esta técnica es po-
der conocer y tener representada, una
población específica de genes corres-
pondientes a un evento fisiológico, co-
mo lo es un estado de desarrollo de un
individuo. Por ejemplo, David y Sargent
utilizaron estos cDNAs marcados radiac-
tivamente, para hibridarlos a una mem-
brana de nitrocelulosa que tenía adheri-
dos en puntos específicos, mRNAs pro-
cedentes de distintos tiempos de cada
uno de los estados de desarrollo de Xe-
nopus (Figura 8.7). Así, pudieron detec-
tar cuáles genes son en verdad claves en
el proceso de desarrollo.
los genes de una especie, abrió una nue-
va puerta en la posibilidad de analizar
la respuesta molecular global de un or-
ganismo ante un estímulo determinado.
Esto, a la hora de referirnos a genes, se
conoce como genómica funcional. Así,
cuando un organismo es sometido a una
situación específica, como bien podría
ser un estado específico de desarrollo en
el caso de Xenopus, su respuesta final-
mente se reflejará en una modificación
de la expresión de sus genes.
Los microarreglos.
En el desarrollo de los ESTs, Venter asu-
mió la funcionalidad de las secuencias
de un genoma en un momento determi-
nado. Para esto, él utilizó una genoteca
cDNA de cerebro humano obtenida pre-

179
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

Figura 8.7. Experimento de puntos de hibridación sobre membranas, para el estudio

de la expresión diferencial de genes del desarrollo embrional en Xenopus laevis.
Diez preparaciones de cDNAs, aislados mediante hibridación substractiva (figura anterior),
se marcaron radioactivamente y se hibridaron sobre un arreglo de mRNAs aislados a distintos
tiempos de desarrollo de cada estado embrional. La intensidad de los puntos está directamente
relacionada con la expresión, en ese tiempo y estado, del cDNA (es decir del gen) específico.

viamente. La irrupción de la tecnología herir varios DNAs ordenadamente en la

en el uso de los estudios genómicos, ha
llevado a una aceleración en la genera-
ción de resultados. Así como Venter y
su criterio práctico llevó a modificar
variadas veces la propuesta original del
Programa Gubernamental Genoma Hu-
mano, el principio de mezclar las técni-
cas de hibridación substractiva con el de
los ESTs, ha dado paso a una impresio-
nante herramienta: los microarreglos de
DNA, o chips de DNA.
Unos pocos años antes, Pat Brown ha-
bía desarrollado una técnica en la que
se pueden fijar ácidos nucleicos sobre
una superficie de vidrio. Para ello, utili-
zó placas de vidrio a las que recubrió
con polilisina, la que confiere una car-
ga positiva al vidrio. El DNA, cargado
negativamente, al ser “impreso” o pues-
to en contacto con este vidrio “activa-
do”, se une fuertemente a su superficie
y puede ser utilizado además, como son-
da de hibridación (Figura 8.8). La ven-
taja de este sistema es que se pueden ad-
superficie del vidrio. Brown, interesado
en saber qué genes eran responsables de
un linfoma (cáncer de nódulos linfáticos)
de las células B, sabía que existían dis-
tintos sub-tipos de esta enfermedad, la
que se relacionaba con distintos grados
de supervivencia del individuo. Así, él
construyó lo que se denominó el “lin-
fochip”, un vidrio con 17.856 cDNAs pe-
gados ordenadamente en su superficie
(Alizadeh et al., 2000). Estos cDNAs pro-
venían tanto de preparaciones de nódulos
linfáticos como de cDNA de genes
conocidamente involucrados en cáncer.
Luego, obtuvo mRNAs desde nódulos
linfáticos afectados por dos subtipos de
linfoma (DLBCL1 y DLBCL2) y los retro-
transcribió a cDNAs, marcándolos con un
colorante específico para cada caso. In-
cubó el linfochip con sus cDNAs dife-
rencialmente marcados para que se pro-
dujera la hibridación y vio cómo se pro-
ducían apareamientos entre el chip y los
cDNA marcados, dependiendo del sub-
tipo de linfoma (Figura 8.9).

180
GENÓMICA

Figura 8.8. Microarreglo sobre vidrio activado.

Mediante interacción electrotástica, el vidrio activado
y reforzado en su carga positiva, retiene a los cDNAs
depositados ordenadamente sobre él.

Figura 8.9. Experimentos realizados

por Pat Brown para descubrir la
expresión diferencial de genes
expresados en dos tipos de cáncer
de nódulos linfáticos de las células B
(DLBCL). Él sabía que existían distintos
sub-tipos de esta enfermedad (DLBCL1
y DCBCL2), la que se relacionaba con
distintos grados de supervivencia del
individuo. Así, construyó el "linfochip",
un vidrio con 17.856 cDNAs adheridos
ordenadamente en su superficie.
Obtuvo mRNAs desde nódulos
linfáticos afectados ambos subtipos de
linfoma y los retrotranscribió a cDNAs,
marcándolos con un colorante para
cada caso (rojo y verde). Incubó
el linfochip con sus estos cDNAs
marcados para hibridarlos y evaluó
los apareamientos entre el chip y los
cDNA marcados, dependiendo
del subtipo de linfoma.

C o m o s e p u e d e v e r, B r o w n u t i l i z ó Chip”, que es un arreglo mucho más pe-

cDNAs para pegar a los vidrios que iban
a ser hibridados. Sin embargo, poco pasó
para que este chip fuera variado por
Stephen Fodor, quien pensó que no era
necesario tener cDNAs para generar es-
tos chips de DNA. Él desarrolló la técni-
ca de los arreglos de sondas o “Gene-
queño y que utilizan un vidrio especial.
Sobre este mini-vidrio, Fodor fue sinteti-
zando los ácidos nucleicos que harían
el trabajo de sonda de hibridación. Para
ello, utilizó un sistema de síntesis quími-
ca de DNA dirigida por luz, haciendo
que se pegarán secuencialmente nucleó-

181

tidos, uno sobre el otro, en la superficie
de este vidrio especial. Para ello, se pone
primero una capa de nucleósido sobre
el vidrio (por ejemplo A), en seguida se
bloquea esta capa con un agente foto-
sensible. Luego se aplica una máscara,
que contiene orificios en las zonas que
sólo se desean desbloquear, es decir,
aquellas en donde se adicionará un nue-
vo nucleósido al anteriormente adheri-
do. Mediante la aplicación de luz (la que
penetrará por aquellos orificios defini-
dos por la máscara), el protector fotosen-
sible desbloqueará el nucleótido adhe-
rido al vidrio, dejándolo disponible para
unir otro a él. Luego, nuevamente se
aplica el agente bloqueador/fotosen-
sible, otra máscara específica (distintos
agujeros por ejemplo), se elimina especí-
ficamente el protector con luz y se adi-
ciona otro nucleósido. Y así, hasta com-
pletar un chip, con oligonucleótidos de
unos 20 residuos de largo y con ubica-
ciones específicas. En estos microchips,
se pueden ordenar hasta 65 mil oligonu-
cleótidos de secuencia conocida.
Así, la revolución de los microarreglos
de DNA ha comenzado. Estos chips tie-
nen en la actualidad innumerables usos.
Por ejemplo, pueden utilizarse para de-
tectar poblaciones de genes que se ex-
presan en un determinado momento,
para detectar mutaciones puntuales en
alguna secuencia genética, para carac-
terizar un individuo transgénico, etc.
Genómica de vegetales.
Hasta ahora hemos presentado un sin-
número de eventos clave en el desarro-
llo de la genómica como Era. Pero no
hemos dicho que, el Proyecto Genoma
182
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
Humano en realidad contempló a todos
los organismos modelos mejor conoci-
dos a la fecha, como Escherichia coli,
Drosophila e incluso ratón, pero por ra-
zones desconocidas, no incluyó a nin-
gún modelo vegetal. Es así como en
1994, la Comunidad Europea (hoy Unión
Europea), bajo la inquietud de Michael
Bevan, del John Innes Institute, inicia un
programa para secuenciar el cromosoma
4 de Arabidopsis thaliana, una pequeña
hierba prácticamente sin significado
agronómico, pero de biología relativa-
mente fácil y conocida, al grado de ser
la especie modelo en vegetales.
Se implementó un Consorcio de Labo-
ratorios Europeos (ESSA), liderados por
Bevan. Al poco andar, Satoshi Tabata del
Kazusa DNA Research Institute, de Ja-
pón, comienza la iniciativa para se-
cuenciar el cromosoma 5 de Arbidopsis.
En 1996, varios de los núcleos involu-
crados en la iniciativa del Proyecto
Genoma Humano, logran consolidar la
Iniciativa Genoma de Arabidopsis (AGI),
conformada por el núcleo europeo, el
japonés y un fuerte contingente de gru-
pos estadounidenses, provenientes prin-
cipalmente de la National Science
Foundation, Department of Energy y del
US Department of Agriculture. El objeti-
vo general, secuenciar los 125 mega-
bases de su genoma, con fecha límite en
2004.
La estrategia seguida por AGI fue la uti-
lización de las librerías BAC y el mapeo
físico, tal como Watson había empren-
dido la iniciativa humana. En esa épo-
ca, el sistema ”shotgun sequencing”,
aunque propuesto, se consideró muy
riesgoso. El camino no estuvo exento de
GENÓMICA

problemas, sobre todo si se considera El genoma posee aproximadamente

que no habían mapas físicos completos
que apoyaran los resultados que se iban
obteniendo desde los BACs. También
hubo buenas discusiones acerca del por-
centaje de error de secuenciación que
se admitiría y de cómo y cuándo liberar
esta información a la luz pública. Con
todo esto, en Diciembre de 1999 se pu-
blica la secuencia de los cromosomas 2
y 4 (Mayer et al., 1999) y un año des-
pués, se dan a conocer las secuencias de
los restantes cromosomas 1, 3 y 5, junto
con un completo análisis del genoma de
Arabidopsis.
25.500 genes, en una densidad de 1 gen
por cada 4 kilobases. El tamaño prome-
dio de estos es de 2 kilobases, con 5
exones como promedio. Uno de los as-
pectos más relevantes de los resultados
obtenidos, fue el observar que existe una
gran duplicación de las secuencias tanto
intra- como inter-cromosomales, alcan-
zando a ser un 60% del genoma total.
Luego de esta iniciativa han surgido nume-
rosos consorcios y proyectos. En la Tabla
8.1 se muestran los programas de genómi-
ca de plantas existentes en la actualidad.

Tabla 8.1. Estado en cifras de ESTs de los diferente programas de

genómica vegetal en el mundo.

Sistema Estado de avance Estado de ESTs

en estudio público al: ingresados

Arabidopsis thaliana 12 de enero de 2004 227.670

Algodón 14 de agosto de 2003 52.818
Arroz 16 de enero de 2004 254.916
Caña de azúcar 6 de enero de 2004 246.046
Cebada 9 de enero de 2004 341.924
Cebolla 4 de septiembre de 2003 19.553
Centeno 22 de diciembre de 2003 9.119
Chlamydomonas
reinhardtii 5 de enero de 2004 152.263

Ice plant 23 de abril de 2003 25.640

Lechuga 12 de enero de 2004 68.120
Lotus japonicus 21 de abril de 2003 32.881
Maíz 23 de diciembre de 2003 377.188
Maravilla 18 de agosto de 2003 59.426
Medicago truncatula 1 de mayo de 2003 189.714
Nicotiana benthamiana 6 de enero de 2004 18.832
Papa 29 de diciembre de 2003 131.750
Pinus 22 de diciembre 2003 125.061
Sorghum bicolor 22 de diciembre de 2003 158.133
Soya 21 de agosto de 2003 333.481
Tomate 17 de abril de 2003 155.317
Trigo 25 de diciembre de 2003 542.781
Vides 13 de noviembre de 2003 132.316

183

Estos proyectos están en distinto estado
de avance. La mayoría de ellos compren-
de iniciativas que no sólo involucra el
secuenciamiento e identificación de
ESTs con el fin de generar bases de da-
tos finales de genes de estas especies,
sino también, son trabajos en paralelo
al mapeo físico y ordenamiento (satura-
ción de los mapas) de marcadores mo-
leculares descritos a través de mucho
tiempo de trabajo.
Un detalle más acabado de alguno de
estos proyectos puede observarse en la
Tabla 8.2, la que resume el estado a ene-
ro de 2004 de varias de estas iniciativas.
Genómica funcional en Chile.
A fines del año 2001, se crea la Iniciati-
va Genoma Chile bajo el contexto del
Programa de Desarrollo e Innovación
Tecnológica del Gobierno de Chile 2001-
2004. Esta Iniciativa está dirigida por un
comité formado por representantes de:
Corporación de Fomento de la Produc-
ción (CORFO), dependiente del Ministe-
rio de Economía; Comisión Nacional
Científica y Tecnología (CONICYT); y
Fundación para la Innovación Agraria
(FIA), dependiente del Ministerio de Agri-
cultura. Así, en su primera instancia, se
enfatiza el desarrollo de capacidades téc-
nicas en nuestro país, en el área de la
fruticultura. Para este plan inicial, se des-
tinan 3 millones de dólares, con los que
se financian tres proyectos de genómica
funcional:
a) Genómica Funcional en Nectarines:
Plataforma para fomentar la competiti-
vidad de Chile en exportación de fru-
tas. Cuya Institución Principal es la
Universidad de Chile, teniendo como
184
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
instituciones beneficiarias y asociadas
a: INIA, Fundación Chile, Asociación
de Exportadores de Chile, Fundación
para el Desarrollo Frutícola.
• Proyecto que se centra en estudiar
por genómica funcional, desórdenes
metabólicos y fisiológicos que sufren los
duraznos y nectarines en su almacena-
miento en frío, cuando es transportado
a sus mercados de destino. Este fenóme-
no se conoce como “daño por frío”. De
este modo, la idea es ver qué genes son
alterados en su expresión durante la apli-
cación por frío. Para ello, este proyecto
plantea la ruta de elaborar genotecas
cDNA y obtener ESTs para utilizarlos en
arreglos que serán hibridados con
mRNAs de duraznos almacenados en frío
y duraznos control.
b) Plataforma científico-tecnológica
para el desarrollo de la Genómica
Vegetal en Chile. Etapa I: Genómica
funcional en vid. Cuya Institución
Principal es la Universidad Técnica
Federico Santa María, teniendo como
instituciones beneficiarias y asocia-
das a: Universidades de Chile, San-
tiago y de Talca, INIA, Asociación de
Exportadores de Chile, Fundación
para el Desarrollo Frutícola, Funda-
ción Chile.
• Proyecto de genómica funcional que
está compuesto por tres subproyectos, en
donde se investigará el fenómeno de
generación de apirenia (falta de semilla)
en el cultivar sultanina, la respuesta de-
fensiva de vid frente al hongo Botrytis
cinerea y finalmente, se caracterizarán
eventos moleculares que generan el fe-
nómeno de corrimiento de la baya en el
emblemático cultivar Carmenère (este
GENÓMICA

Tabla 8.2. Estado de algunos proyectos específicos de genómica en el mundo,

presentados en el Plant and Animal Genome 2004.

Iniciativa Contacto o lider Estado a enero 2004

“International Perry Gustafson, Programa de dos fases: desarrollo de ESTs en trigo y

Triticaceae USDA/ARS y cebada. 16.000 ESTs de trigo y 6.000 de cebada. Se
Mapping Brian Foster, espera desarrollar 300.000 secuencias para ambos
Initiative” Scottish Crop cultivos. De momento, la comparación entre los
Research Institute. genomas de trigo y arroz, con una estrictez alta han
mostrado una homología del 80% entre ambas
especies.

“Maize Genome Georgia Davis, En él se ha generado una base de datos iMap para
Initiative” University of maíz. Ésta tiene como objetivo generar datos,
Missouri validarlos y verificarlos, analizarlos y unirlos e
integrarlos. iMAP posee ya información para el
genoma de maíz de 2.025 Mbases, 4.443 contigs.
(www.maizemap.org).

“Forest Trees ”Christophe Se ha llegado al establecimiento de diversos tipos de

Genomes Plomion, National marcadores moleculares en distintas especies (Norway
Institute for spruce, Japanese black pine). También se han
Agricultural obtenido ESTs para Norway spruce (4.007) y Loblolly
Research pine (20.337). También ya se ha desarrollado un
“poplar-chip”, un arreglo tipo cDNA para 15000 ESTs
de hoja y cambium.

“International Douglas Cook, En donde destaca el proyecto de University of

Grape Genome University of Nevada-Reno, con una inversión de 3,6 millones de
Project” California, Davis. dólares para 4 años. Es un proyecto sistemático de
genómica, proteómica, metabolómica y bioinformática.
Se planifica el secuenciamiento de 350.000 ESTs y su
uso en microarreglos para genómica funcional
(especialmente de resistencia a estrés hídrico).
También en este consorcio existen grupos europeos,
australianos y chilenos, dedicados a la obtención de
marcadores moleculares con vías a generar un mapa
saturado de marcadores moleculares, entre los que
destacan los marcadores de polimorfismos basados en
mutaciones puntuales. En esta iniciativa, ya destaca el
desarrollo de Informa de la construcción de 3 librerías
BAC, de las variedades Syrah, Pinot y Cabernet. Estas
genotecas comprenden tamaños entre 100 y 200 Kbs.
En Chile también existe un grupo destinado a la
obtención de ESTs.

185
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

(Continuación Tabla 8.2).

Iniciativa Contacto o lider Estado a enero 2004

“Internacional Albert Abbott, Sus objetivos son: a) análisis del grado de macro y
Consortium of Clemson. micro sintenia en el genoma de especies de Rosaceae
Prunus persica” y b) genoma de durazno como modelo de Rosaceae.
Estos objetivos incluyen la búsqueda de genes
candidatos mediante ESTs, desarrollo de un mapa
genético general, construcción de librerías BAC
y desarrollo de mapas físicos. Hasta el momento
este equipo ha desarrollado 7 genotecas cDNA, en
función de los distintos estados de desarrollo. Han
desarrollado 149 marcadores anclados al mapa físico
y tienen una gran cantidad de ESTs (9984).

Otras iniciativas interesantes:

Papa y Tomate Esther van der Estudios en tomate, Proyecto “Genetic, molecular,
Knaap, and developmental análisis of variation in tomato
Ohio State fruti shape”.
University.

Richard Visser, Proyecto “Solanaceae for genomics”

Center
Biosystems
Genomics,
Wageningen
University.

fenómeno lleva a que en un mismo raci- Universidad de Chile, Fundación de

mo existan granos semillados y asemilla-
dos, o de calibre notoriamente distinto).
En líneas generales, este proyecto gene-
rará distintas genotecas cDNA para culti-
vares de vid sultanina y carmenère, desa-
rrollará ESTs y los utilizará en el formato
de microarreglos, los que serán hibrida-
dos con mRNAs de distintas muestras pro-
venientes de los tres sub-proyectos.
c) Estudios Genómicos y de expresión
genética en vides: respuesta a la in-
fección viral y desarrollo de sistemas
de diagnóstico. Su Institución Princi-
pal es la Pontificia Universidad Ca-
tólica de Chile, teniendo como insti-
tuciones beneficiarias y asociadas a:
Ciencia para la Vida, Bios-Chile In-
geniería Genética S.A.
• Este proyecto plantea el estudio de la
respuesta de vides, frente a virus de im-
pacto sobre su productividad. Para ello,
se plantea un estudio comparativo a tra-
vés del uso de microarreglos de cDNAs
de Arabidopsis thaliana, los que serán
utilizados como fuente de hibridación
con mRNAs de vides infectadas con vi-
rus como el Grape leaf roll virus. De la
misma forma, plantea conocer variantes
poblacionales locales de virus que in-
fectan vides y también el desarrollo de
sistemas de detección de estos.

186
GENÓMICA
REFERENCIAS
Adams M. et al. 2000. The genome sequence
of Drosophila melanogaster. Science
287:2185-2195.
Alizadeh, A., Eisen, M., Davis, R., Ma, C.,
Lossos, I., Rosenwald A., Boldrick, J., Sabet
H., Tran, T., Yu, X., Powell, J., Yang, L.,
Marti, G., Moore, T., Hudson, J., Lu, L.,
Lewis, D., Tibshirani, R., Sherlock, G.,
Chan, W., Greiner, T., Weisenburger, D.,
Armitage, J., Warnke, R., Levy, R., Wilson,
W., Grever, M., Byrd, J., Botstein, D.,
Brown, P. y Staudt, L. 2000. Distinct types
of diffuse large B-cell lymphoma identified
by gene expression profiling. Nature
403:503-511.
Holley, R. 1968. Experimental approaches to
the determination of the nucleotide
sequences of large oligonucleotides and
small nucleic acids. Prog. Nucleic Acid Res.
Mol. Biol. 8:37-47.
Mayer, K., Schuller, C., Wambutt, R., Murphy,
G., Volckaert, G., Pohl, T., Dusterhoft, A.,
Stiekema, W., Entian, K., Terryn, N., Harris,
B., Ansorge, W., Brandt, P., Grivell, L.,
Rieger, M., Weichselgartner, M., de Simone,
V., Obermaier, B., Mache, R., Muller, M.,
Kreis, M., Delseny, M., Puigdomenech, P.,
Watson, M. y McCombie, W. 1999.
Sequence and analysis of chromosome 4 of
the plant Arabidopsis thaliana. Nature
402:769-777.
Rao, Y., Jan, L. y Jan Y. 1990. Similarity of the
product of the Drosophila neurogenic gene
big brain to transmembrane channel
proteins. Nature 345:163-167.
Sanger, F., Nicklen, S. y Coulson, A. 1977. DNA
sequencing with chain-terminating
inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)
74:5463-5467.
Seeburg, P., Shine, J., Martial, J., Ullrich, A.,
Goodman, H. y Baxter, J. 1977. Nucleotide
sequence of a human gene coding for a
polypeptide hormone. Trans. Assoc. Am.
Physicians. 90:109-116.
Smith, H., Tomb, J., Dougherty, B., Fleischmann,
R. y Venter, J. 1995. Frequency and
distribution of DNA uptake signal sequences
in the Haemophilus influenzae Rd genome.
Science 269:538-540.
Strauss, C., Kobori, J., Siu, G. y Hood, L. 1986.
Specific-primer-directed DNA sequencing.
Anal Biochem. 154:353-360.
Venter, J. et al. 2001. The sequence of the
human genome. Science 291:1304-1351.
187
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

188
GLOSARIO

GLOSARIO

Acetosiringona. Molécula carbonada derivada de fenol y

producida por daño mecánico en las paredes celula-
res de las plantas dicotiledóneas. Activador de las se-
ñales de infección para Agrobacterium tumefaciens.

Ácido ribonucleico. Molécula lineal constituida por una ca-

dena única de ribonucleótidos, conteniendo cuatro
monómeros de nucleótidos, los monofosfatados de
adenosina (AMP), guanosina (GMP), citosina (CMP) y
uridina (UMP). Estructuralmente, la molécula de RNA
es similar a la de DNA, con la excepción que en el
RNA el azúcar presente es una ribosa. Existen tres ti-
pos de RNAs: ribosomales (rRNA), mensajero (mRNA)
y transferencia (tRNA). El RNA es sintetizado a partir
del DNA mediante la transcripción.

ADN (o DNA). Ácido desoxirribonucleico; corresponde a

una macromolécula polimérica formada por los cua-
tro desoxinucleótidos monofosfato en una doble he-
bra ligada por enlaces de hidrógeno entre las bases.
Ésta es portadora de la información genética.

Agrobacterium. a) tumefaciens: bacteria del suelo tipo ba-

cilo, Gram negativo. Sus cepas virulentas poseen, en
adición al DNA genómico, un plasmidio gigante lla-
mado Ti. Cuando infecta a una célula vegetal, una por-
ción del Ti (el T-DNA) pasa a la célula que es infecta-
da, causando un tumor conocido como la enfermedad
de la agalla de la corona; b) rhizogenes: bacteria del
suelo tipo bacilo, Gram negativo. De igual forma que
A. tumefaciens, las cepas virulentas poseen un plas-
midio Ri el que también posee T-DNA que actúa de la
misma forma que su congénere. El fenotipo de esta
interacción es la proliferación de raíces; c) cepa des-
armada (comercial): cepa de tumefaciens o rhizogenes
en el que su plasmidio (Ti o Ri) ha sido desarmado,
dejándosele los genes vir y escindiéndosele los genes
para síntesis de opinas y otros elementos innecesarios

189
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

para la transferencia de T-DNA. Son complementados

con plasmidios binarios, que se trabajan en el mesón
del laboratorio, los que llevan los brazos izquierdo y
derecho, flanqueando el “cassette” del gen de interés.

Albino. Planta con marcada deficiencia de pigmentación,

generalmente referida a la falta de color verde por de-
ficiencias de clorofila en cloroplastos .

Alimento transgénico. Alimento de consumo directo, deri-

vado de una planta u otro organismo genéticamente
modificado.

Análogo. Molécula ligeramente diferente de otra y que pue-

de entrar en la composición de otra, a causa de su pa-
recido. Esto puede acontecer en proteínas y ácidos
nucleicos.

Antera. Porción apical de un estambre que produce las mi-

crosporas o polen en una flor.

Antibiótico. Moléculas orgánicas de origen microbiológico,

que en términos generales, inhiben selectivamente el
crecimiento de células. Actúan a través de la altera-
ción de algún evento relacionado con la replicación
del DNA o con la síntesis de proteínas. Estos agentes
son tóxicos para células que no poseen sistemas espe-
cíficos para eliminarlos, por lo que son utilizados en
la selección de células que ha sido transformadas. Exis-
ten antibióticos que afectan la vida de células proca-
riontes y, otros, que afectan a las células eucariontes.

Anticodón. Secuencia trinucleotídica ubicada en el aminoa-

cil-tRNA, encargada de reconocer el codón respecti-
vo en el momento de la traducción del mRNA.

Anticuerpo. Molécula proteica de las clases de las inmuno-

globulinas, producida por células linfocitarias B, en-
cargada de reconocer específicamente secuencias
polipeptídicas en los antígenos. Los anticuerpos se
unen específicamente a los antígenos que inducen su
síntesis, neutralizando toxinas, aglutinando bacterias
o células, precipitando antígenos solubles. Un antígeno

190
GLOSARIO

es cualquier molécula que estimula una respuesta in-

mune en la forma de un anticuerpo. Polen y vacunas
son ejemplos de antígenos.

Antígeno. Compuesto extraño que ingresado (inyectado) en

cualquier animal vertebrado, genera una respuesta in-
mune contra él. Los antígenos son reconocidos por los
anticuerpos para su destrucción.

Apareamiento de bases. Tipo de interacción entre las bases

nucleotídicas descrita por Watson y Crick.

Autotróficos. Organismos que son capaces de producir su

propio alimento. Un ejemplo son las plantas. En opo-
sición, los heterótroficos no producen su propio ali-
mento, ejemplos: hongos, hombre, etc.

Autorradiografía. Metodología en la cual se observa en una

película, la radioactividad o marca luminiscente in-
corporada en macromoléculas (DNA, RNA, proteína).

Auxina. Regulador de crecimiento vegetal que promueve la

elongación de brotes y formación de raíces entre va-
rios otros efectos, en bajas concentraciones. La auxina
natural producida por todas las especies de plantas es
el ácido indolacético (AIA o IAA).

Bacteria competente. Célula bacteriana sensibilizada artifi-

cialmente para que sea capaz de captar DNA del me-
dio.

Bacteriófago. Virus que infecta bacterias.

Base nitrogenada. Molécula química que posee un anillo

heterocíclico con átomos de carbono y nitrógeno. En
la constitución de ácidos nucleicos, existen aquellas
del tipo purinas (adenina y guanina) y del tipo pirimi-
dinas (citosina, timina y uracilo).

Biobalística. Sistema de transformación genética (de plan-

tas) alternativo a A. tumefaciens. Surgió como necesi-
dad de sistemas capaces de transformar plantas mono-
cotiledóneas.

191
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

Bioinformática. Se refiere al campo de estudio que extrae

información biológica de un gran número de bases
tales como secuencias, interacciones entre proteínas,
microarreglos, etc. Este campo también incluye el área
de visualización de datos.

Biomímica. Se refiere a lo que es el área de simulación del

diseño biológico en procesos manufacturados.

Brazos izquierdo y derecho del plasmidio Ti. Secuencias

repetidas directas de 25 nucleótidos que bordean el
DNA de transferencia en el plasmidio Ti.

Bromuro de Etidio. Químico utilizado para observar molé-

culas de ácidos nucleicos (DNA y RNA) por su capa-
cidad de intercalarse en las bases nitrogenadas y
fluorescer bajo luz ultravioleta.

Cadena peptídica. Secuencia de aminoácidos de no más de

20 unidades.

CALT. Comité Asesor para la Liberación de Transgénicos,

creado en 1991. Organismo multidisciplinario depen-
diente del SAG, encargado de la aprobación o recha-
zo de nuevos eventos transgénicos en nuestro país.

Caracteres cuantitativos de locus (QTL). Genes que codifi-

can fenotipos que pueden ser medidos en una escala
cuantitativa. Cada gen tiene un pequeño efecto sobre
el fenotipo, siendo atribuible al ambiente un gran efec-
to. Muchos caracteres de interés económicos son in-
fluenciados por muchos genes.

“Cassette” de expresión. Conjunto de señales necesarias en

una hebra de DNA sea capaz de expresar correctamen-
te una enzima o proteína específica. Contiene todos
los elementos promotores y terminadores de la trans-
cripción para que esto ocurra.

cDNA. Secuencia de DNA que corresponde, complementa-

riamente según reglas de Watson y Crick, al mRNA de
una proteína.

192
GLOSARIO

Ciclo de Krebs. También llamado ciclo de los ácidos tricar-

boxilicos, es un conjunto de reacciones enzimáticas
que comienzan con la condensación de la Acetil CoA
con el oxalato, liberando CO 2 e H + en la medida que
el ciclo va girando. En los eucariontes, estas reaccio-
nes acontecen en el interior de la mitocondria.

Clivaje poliembriogénico. Cuando más de un embrión es

formado por división del cigoto, en dos o más unida-
des, cada una desarrollándose en un embrión. Los em-
briones resultantes son monocigóticos en cuanto a su
origen e idénticos genéticamente.

Clon bacteriano. Conjunto de bacterias que poseen un fon-

do genético común. En términos prácticos, en el labo-
ratorio, un clon corresponde por ejemplo, a una colo-
nia de bacterias creciendo en placas nutritivas sóli-
das, o a un cultivo líquido sembrado con un solo tipo
de bacterias; todo esto tras haber sido transformadas
con un plasmidio de interés.

Clonamiento. Conjunto de pasos que involucran la manipu-

lación de un gen o un segmento de DNA y su intro-
ducción a bacterias competentes para su multiplica-
ción o mantención.

Co-cultivo. Etapa de la transformación de plantas mediada

por A. tumefaciens en la que, luego de la infección
propiamente tal, los explantes son incubados en con-
junto con las bacterias que han quedado adheridas a
su superficie. En general, esta etapa suele durar un par
de días.

Código genético. Todo el conjunto de informaciones ge-

néticas de un ser dado. Sistema en que los nucleótidos
permiten indicar la correspondencia de aminoácidos.
Cada tres nucleótidos, se señala un aminoácido espe-
cífico, existiendo en todo caso, para casi todos los
aminoácidos, más de un triplete (codón) posible. Tam-
bién existen tripletes que indican el comienzo y el tér-
mino de una proteína. Puede definirse por un conjun-
to de 64 codones y se dice que es degenerado, debido
a que la mayor parte de los aminoácidos es codificada
por más de un codón.

193
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

Co-dominante. Un marcador molecular que expresa los dos

alelos del gen.

Codón. Ordenamiento de tres nucleótidos de DNA que indi-

can correspondencia con un aminoácido específico.

Colchicina. Alcaloide usado en la duplicación artificial del

número de cromosomas, pues impide la separación de
los cromosomas después de la mitosis.

“Commoditie”. En el caso de las plantas transgénicas, térmi-

no referido a granos y otros elementos producidos por
ellas y que posee una comercialización interfronteriza
muy común.

Complejo T. Conjunto molecular consistente de T-DNA he-

bra simple, una proteína VirD2 unida a su extremo 5´
como conductora y varias proteínas VirE2 con función
protectora, conocida como actividad de proteínas de
unión a hebra simple. Este complejo viaja desde A.
tumefaciens hasta la célula vegetal blanco que se quie-
re transformar.

Co-transformación. Acción de co-cultivar, seleccionar y re-

generar un explante que ha sido infectado con dos
clones de A. tumefaciens. Frecuentemente cada uno
de los clones lleva “cassettes” de expresión distintos.

DNA ligasa. Enzima que se encarga de unir dos fragmentos

de DNA hebra doble (DNA normal) a través del grupo
fosfato 5´ de un extremo y del grupo OH-3´ del otro.
Esta enzima puede o no requerir adenosina trifosfato
(ATP) para esta actividad, dependiendo de su origen
(por ejemplo de un fago o de una bacteria, respectiva-
mente).

DNA polimerasa. Enzima encargada de la síntesis de cade-

nas nucleotídicas, utilizando un DNA como molde y
un RNA como partidor o “primer”. Las más utilizadas
en biología molecular son la DNA pol I de Escherichia
coli y el fragmento Klenow.

194
GLOSARIO

DNA polimerasa I. Primera DNA polimerasa aislada de E.

coli, que posee actividad exonucleasa (degradadota
de nucleótidos) 5´-3´ y 3´-5´. Su principal función bio-
lógica es durante la reparación del DNA.

DNA polimerasa III. Polimerasa de DNA encargada de la

síntesis de fragmentos largos de DNA de una célula,
es decir, la primera responsable de la copia del genoma
de una célula (es de E. coli). Esta actividad es comple-
mentada por la DNA polimerasa I, quien rellena los
sitios vacíos dejados por la degradación de los
“primers”.

Dogma Central de la biología molecular. Principio ordena-

do de eventos postulado por Watson y Crick, de forma
de predecir que el DNA se replica, transcribe a RNA y
que este últimose traduce a proteínas.

Dominante. Marcador molecular que expresa sólo un alelo

del gen.

Dormancia. Fase de inactividad común en semillas, esporas

y yemas en los cuales el crecimiento y desarrollo es
retardado o frenado.

Electroforesis. Metodología de separación de macromolécu-

las en un soporte sólido (también se puede hacer en
papel, acetato de celulosa) que es sometido a un cam-
po eléctrico.

Electroporación. Técnica de transformación de bacterias me-

diante la cual, a través de un pulso eléctrico de mili-
segundos de duración, se fomenta la captura de DNA
por parte de una célula. Esto sucede debido a la gene-
ración momentánea de heridas o poros en la membra-
na de dichas células.

Embriogénesis. El desarrollo de un embrión normalmente

cigótico a partir de un tejido cualquiera. Cuando exis-
te desarrollo embrionario de otra forma, se obtiene
“embrioides”.

Embrión cigótico. Es el embrión resultante de la fecunda-

ción sexual.

195
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

Embrión somático. No es resultante de la fecundación sexual,

sino de la manipulación de condiciones in vitro. Se
puede originar a partir de un callo o directamente del
explante. Ejemplo: hoja. Es generado a partir de una
célula somática, generalmente bajo condiciones in vitro.

Endosperma. Tejido nutritivo triploide que se encuentra en

el saco embrionario de las plantas con semilla.

Enfermedad de la agalla de la corona. Fenotipo producido en

el cuello de plantas dicotiledóneas tras la infección por
A. tumefaciens. Esto se debe a que, en forma original, el
T-DNA posee genes que codifican enzimas para la sínte-
sis de opinas y fitohormonas que, entre otros procesos,
promueven la división de las células huésped.

Enfoque precautorio. Sistema de operación entre los distin-

tos gobiernos que se han acogido al Protocolo de Car-
tagena, en el que ante dudas razonables de la interna-
ción de un evento transgénico (alimento o commoditie,
ver arriba), éste no ingresa a las fronteras de dicho país.

Enlace fosfodiéster. Enlace O-P-O esqueleto del DNA. Este

se realiza entre el grupo OH 3´ de la base nucleotídica
previamente adicionada en la hebra y el grupo PO 4 5´
del nucleótido entrante.

Enzima. Proteína con alguna función biológica de catálisis

de una reacción específica. También se ha descubier-
to últimamente, que existen algunos RNAs (en algu-
nos organismos inferiores) que tienen actividad catalí-
tica, como Tetrahymena.

Enzimas de restricción. Proteinas capaces de romper los

enlaces fosfodiéster entre diferentes nucleótidos en una
misma cadena de ADN doble hebra en sitios específi-
cos.

Epistasis. Representa una forma de interacción génica, don-

de un gen interfiere con la expresión fenotípica de otro
gen o genes no-alélico (s).

196
GLOSARIO

Epítopes. Secuencia lineal de 7 a 9 aminoácidos en el antíge-

no, que son los responsables del reconocimiento por
parte del anticuerpo.

Etiolacion. Características que evidencian las plantas cuan-

do crecen en condiciones deficitarias de luz, elongán-
dose excesivamente y mostrando desarrollo anormal
de cloroplastos, que no serán funcionales.

Evaluación de riesgo previa del OGM. Conjunto de opera-

ciones tanto prácticas como teóricas, tendientes a eva-
luar la factibilidad de internar o no un evento trans-
génico al país. Este análisis es fundamental para una
aprobación en este sentido y requiere que el importa-
dor entregue gran cantidad de información científica,
esencialmente basada en los ensayos técnicos reali-
zados en otros países.

Exones. Nucleótidos encargados de informar la secuencia

primaria de aminoácidos de una proteína. Los exones
están separados por los intrones y después del proce-
samiento del RNA, quedan ubicados linealmente para
que los ribosomas puedan comenzar la lectura del
mensaje que generará la proteína.

Expresión transitoria. Expresión eventual de un gen que está

en el núcleo, a través de la generación efectiva de su
proteína, sin la necesidad de que esté incorporado es-
tablemente al DNA de la célula que ha sido transfor-
mada.

Explante. Término referido a una célula, tejido u órgano se-

parado de la planta madre y que se cultiva aislada-
mente bajo condiciones in vitro.

Factor transcripcional. Proteína con capacidad de unión a

zonas específicas del DNA (promotores transcripcio-
nales), que fomentan la transcripción de ciertos genes.
Los factores transcripcionales, en términos prácticos,
corresponden al último paso de una información del
mensaje que una célula recibe de su entorno y que
permiten a ésta responder apropiadamente a dicho
mensaje.

197
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

Fenogenética. Rama de la genética que estudia las relacio-

nes entre el genotipo y fenotipo (sus manifestaciones).

Filotaxis. Forma de arreglo o disposición de las hojas alre-

dedor del tallo.

Fitocromo. Pigmento proteico que media respuestas fotope-

riódicas y algunas otras reacciones gatilladas por pre-
sencia de la luz.

Fotosíntesis. Proceso por el cual las plantas captan la ener-

gía solar para producir poder reductor (ATP, NADPH),
fijar CO 2 y sintetizar carbohidratos.

Gen cDNA. Gen cuya secuencia nucleotídica proviene de

la secuencia del mRNA, por lo tanto es equivalente a
la información aportada sólo por los exones del gen.

Gen de resistencia a antibiótico. Gen utilizado como marca-

dor o informador de la transformación genética, apor-
tando la propiedad de resistencia a un antibiótico es-
pecífico a la célula que lo contiene y expresa correcta-
mente.

Gen genómico. Secuencia nucleotídica que codifica una

proteína, que contiene tanto exones como intrones.

Gen marcado o sonda. Copia complementaria de la secuen-

cia templado, en que a través de su síntesis con una
DNA polimerasa in vitro (generalmente la polimerasa
Klenow), se ha incorporado un nucleótido marcado (ya
sea con radioactividad u otro compuesto químico) que
servirá para detectarlo mediante películas fotográficas
o procesos de tinciones. También se puede incorporar
marca a un DNA a través de fosforilaciones específi-
cas en sus extremos mediante kinasas terminales.

Gen reportero y marcador. Gen utilizado para evidenciar el

hecho que una célula lo ha incorporado correctamente.
Esto se utiliza normalmente en experimentos de transfor-
mación de células, ya sean procariotes o eucariotes.

198
GLOSARIO

Genes de resistencia. Gen reportero que específicamente

permite a las células transformadas crecer en medios
suplementados con antibióticos. Estos genes son es-
pecíficos para cada antibiótico o familias de ellos y
permiten resistir a las células sobrellevar dosis que en
circunstancias de no transformación, serían letales.

Genes vir. Conjunto de genes de Agrobacterium encargados

de la virulencia de cepas específicas. Sus productos
génicos se encargan de activar y transferir el comple-
jo T desde la bacteria hacia la planta.

Genoma. Conjunto de todos los genes de un ser vivo. Juego

completo de cromosomas que se hereda en forma de
unidad proveniente de un solo progenitor diploide.

G e n ó m i c a . Término vago relacionado con el estudio

referencial de secuencias genómicas, variaciones den-
tro de un genoma específico, microarreglos de DNA,
circuitos y sistemas biológicos. Se considera también
el transcriptoma, la proteómica y la metabolómica,
etc., bajo el concepto de genómica.

Glucolisis. Vía metabólica en que la glucosa es degradada

hasta dos moléculas de piruvato en el citosol.

Grupo azúcar. Grupo ribosa o desoxirribosa presente en los

nucleósidos.

Grupo fosfato. Grupo encargado de enlazar, a través de

interacción con oxígeno 3´ de la base siguiente, a los
nucleótidos en los ácidos nucleicos.

Haploide. Número reducido de cromosomas que se presen-

tan en las células germinales maduras de organismos
sexuales. Individuo conteniendo solo un representan-
te de cada par de cromosomas.

Hebra complementaria. Hebra correspondiente al molde,

según la complementariedad propuesta por Watson y
Crick (A-T y G-C) .

199
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

Heterocigosis. Carácter genético que presenta los dos alelos

del gen diferentes.

Hidrólisis. Ruptura de una molécula en dos mediante la adi-

ción del agua.

Histonas. Proteínas de carácter básico (H1, H2A, H2B, H3 y

H4), ricas en arginina y lisina, que se unen al DNA
aportando a su estructura a través de la formación de
los nucleosomas y posteriormente, cromosomas.

Homocigosis. Carácter genético que presenta los dos alelos

del gen iguales (puede ser dominante o recesivo).

Huésped. Célula u organismo que hace la función de alojar

a otro organismo o molécula.

Infección. Interacción entre Agrobacterium y el explante ve-

getal sometido a la transformación. Requiere una eta-
pa de reconocimiento y unión, para luego gatillar even-
tos específicos de cada interacción.

Integración del T-DNA. Proceso por el cual el T-DNA se in-

tegra al genoma de una célula vegetal. El mecanismo
propuesto para este evento es el denominado como
recombinación ilegítima.

Introgresión. Incorporación gradual de genes de una espe-

cie a otra, mediante el cruzamiento entre dos progeni-
tores, generando un híbrido que es retrocruzado, suce-
sivamente, con una de las especies parentales.

Intrones. Secuencias nucleotídicas espaciadoras entre

exones, que son transcritas hacia el transcrito prima-
rio y que son escindidas por el proceso de madura-
ción del RNA, para generar el mRNA.

In vitro. Literalmente en el tubo de ensayo.

In vivo. Literalmente en la célula o en un organismo.

Isopreno. Es una unidad de 5 carbonos producidos por las

plantas. Una de las características de ellos es su gran
capacidad de polimerización, pudiendo formar com-

200
GLOSARIO

puestos químicos como C 10 y C 15 llamados terpenos,

los cuales, explican la fragancia de muchas plantas.
Entre ellos pueden citarse: limoneno, mentol, etc. Los
isoprenos también se encuentran en la vía metabólica
de síntesis de las citoquininas.

Juvenilidad vs Madurez: En las plantas corresponden a teji-

dos y órganos que evidencian hábitos, formas y zonas
asociadas a tal carácter en la planta. La condición ju-
venil se da en la zona más basal e incide notablemen-
te en la capacidad reproductiva del material bajo con-
diciones in vivo e in vitro. La madurez es la condición
alternativa que expresa otra característica funcional
de parte de la planta.

Lincaje genético. Situación en que dos genes están locali-

zados cerca en el mismo cromosoma.

Línea híbrida. Línea vegetal producida por la cruza sexual

entre dos líneas puras (u homocigotos para algún ras-
go determinado).

Línea pura. Línea vegetal producida por continuas

retrocruzas de filiales sucesivas procurando el enri-
quecimiento de un rasgo.

Marcador histológico. Marcador que confiere un fenotipo

visible en presencia de un substrato aplicado
exógenamente.

Marcador morfológico. Gen que codifica para una proteína

que genera, en las células transformadas con él, un
cambio fenotípico fácilmente evaluable.

Marcador de letalidad. Gen que al ser activado mediante la

inducción de su promotor, induce la muerte de la cé-
lula que lo ha incorporado.

Marcador de selección. Gen marcador que, en forma simi-

lar a la resistencia a antibióticos, al ser expresado en
una célula que lo posee, permite ser detectado fácil-
mente en dicha célula, ya sea a través de tinciones
específicas o por alguna característica de la proteína
que produce.

201
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

Medio Selectivo. Medio que permite el desarrollo selectivo

de ciertas células, inhibiendo el de otras. Estos pueden
ser por ejemplo, medios suplementados con antibióti-
cos, químicos tóxicos, suplementos metabólicos, etc.

Membrana de parada. Rejilla utilizada en los equipos de bio-

balística. Detiene a la membrana portadora de las par-
tículas, sin afectar el paso de las partículas propiamen-
te tal.

Membrana portadora. Membrana del equipo de biobalística

que permite ubicar las partículas recubiertas con el
DNA a ser proyectado en su superficie.

Microarreglos de DNA o “chips” de genes. Ordenamientos

de secuencias definidas de genes u óligos en soportes
sólidos de vidrio o nylon, en microespacios y debido a
la acción de robots especialmente diseñados. Estos mi-
croordenamientos son utilizados en distintos experimen-
tos de hibridaión masiva con cDNAs de forma de eva-
luar simultáneamente el nivel de expresión de varios
genes.

Mixotrófico. Poblaciones de células con diferente autono-

mía y capacidad de síntesis de compuestos orgánicos

Moratoria. Esquema administrativo que han implementado

ciertas naciones frente a la internación para comercia-
lización o evaluación de ciertos eventos transgénicos,
en espera de más antecedentes técnicos y/o políticos.

Morfogénesis. Los cambios en el desarrollo que dan forma a

un individuo adulto a partir de un cigoto.

Morfológico. Relativo a las características físicas de un ser

(fenotipo).

mRNA y DNA colineales. Se refiere a que la secuencia de

DNA que origina el mRNA son correspondientes, salvo
en los “loops” o zonas que corresponden a los intrones.

Mutagénesis. Métodos para introducir variaciones en la se-

cuencia original del DNA. Estos pueden ser físicos, quí-
micos o biológicos.

202
GLOSARIO

Núcleos generativos. En angiospermas, corresponden a los

dos gametos masculinos que se forman por división
de la célula generativa. Ambos migran por el tubo polí-
nico participando en el proceso de fertilización. Uno
se fusiona con la célula huevo para formar el cigoto;
el otro, normalmente se fusiona con los núcleos pola-
res para formar el núcleo primario del endosperma.

Núcleo vegetativo. En el polen de angiospermas; correspon-

de a un núcleo de mayor tamaño que los núcleos gene-
rativos. Su función, durante la germinación del polen,
es controlar el desarrollo del tubo polínico, desinte-
grándose cuando éste penetra al nucelo.

Nucleósido. Molécula que posee un anillo heterocíclico con

átomo de carbono y nitrógeno (bases nitrogenadas) y
un grupo azúcar con cinco carbonos dispuestos en
forma de anillo pentosa. Las bases nitrogenadas pue-
den ser purinas (adenina y guanina) y pirimidinas (cito-
sina, timina y uracilo).

Nucleótido. Unidad química que compone el DNA. En esen-

cia, corresponden a nucleósidos que han sido incorpo-
rados a un ácido nucleico a través de uniones fosfo-
diéster (utilizando un grupo fosfato).

Ontogenia. Todos los cambios que ocurren en la historia de

vida de un organismo.

Operón. Unidad de expresión y de regulación génica en

bacterias, en que un conjunto de genes es transcrito
bajo el control de un promotor único, originando un
mRNA policistrónico.

Opinas. Compuestos aminoacídicos derivados de arginina

que permiten a Agrobacterium, una mejor interacción
con la planta.

Organogénesis. Los cambios en el desarrollo que ocurren

durante la formación de un órgano determinado.

Organelo. Parte especializada de una célula eucariótica de-

limitada por una membrana, con funciones específicas.
Cloroplastos y mitocondrias son ejemplos de organelos.

203
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

Origen de replicación autónomo. Secuencia de nucleótidos

en la que se inicia la duplicación (replicación) del
DNA, de una forma autónoma de otras secuencias si-
milares o con la misma función en una célula.

Partenogénesis. Producción de un embrión del gameto fe-

menino sin la participación del gameto masculino.

Patrones de difracción. Conjunto de desviaciones en un haz

de rayos X al atravesar el DNA en estructura semicris-
talina. Estas se registran en películas fotográficas.

pH. Abreviatura que expresa el logaritmo negativo de la con-

centración de iones de hidrógeno de una solución
acuosa.

Pili bacteriano. Filamento proteico que se forma en la su-

perficie de algunas células bacterianas que permite su
ligación a otras células bacterianas. Por ejemplo, el
pili F (canal sexual) está involucrado en la conjuga-
ción bacteriana.

Planta transgénica. Planta modificada genéticamente a tra-

vés de técnicas biológicas específicas que involucran
la inserción en su genoma, de un segmento de DNA
distinto al de su genoma original.

Planta transplastómica. Planta transgénica, modificada

específicamente en el genoma de sus organelos y no
en el nuclear.

Plasmidio. DNA circular extracromosomal con origen de re-

plicación autónomo, presente en el citoplasma bac-
teriano.

Plasmidio binario. Plasmidio que se utiliza para transforma-

ción de plantas y cuyas funciones son cooperativas
con otro, para generar un complejo T funcional y trans-
ferible.

Plasmidio integrativo. Plasmidio con secuencias homólogas

al plasmidio residente de las cepas comerciales de
Agrobacterium. Al incorporarse a la bacteria, estas

204
GLOSARIO

zonas permiten la recombinación homóloga entre el

plasmidio residente y el integrativo, formado un
plasmidio Ti (o Ri) “íntegro”, formando así el comple-
jo T y transformando las células blanco.

Plasmidio lanzadera. Plasmidio que funciona tanto en A.

tumefaciens como en E. coli y que posee los brazos
izquierdo y derecho de Agrobacterium. Esta caracte-
rística, permite que todas las operaciones de clo-
namiento de un gen de interés (en su sitio múltiple de
clonamiento) y su manipulación para que se exprese
correctamente en la planta, son posibles de realizar
en este plasmidio utilizando bacterias tipo E. coli, tal
como si fuera un plasmidio pequeño y con todas las
herramientas que se pueden aplicar con la tecnología
del DNA recombinante.

Plasmidio recombinante. Plasmidio que posee en su sitio

múltiple de clonamiento, un fragmento de DNA exter-
no de interés e insertado mediante técnicas de DNA
recombinante.

Plasmidio Ti. Plasmidio encontrado en cepas patogénicas

de Agrobacterium tumefaciens. La bacteria transfiere
parte de su DNA (T-DNA) a la célula vegetal, generan-
do la enfermedad de la agalla de la corona.

Plasmidio Ti residente. Plasmidio Ti desarmado, habitante

de A. tumefaciens y que sólo posee las funciones vir.

Poliembriogénesis. Producción de más de un embrión de

células gametofíticas o esporofíticas.

Poliembriogénesis esporofítica. Cuando un embrión se ge-

nera por yemación esporofítica del nucelo o del
integumento en plantas con flores. Los embriones son
normalmente idénticos entre sí y la planta madre.

Poliembriogénesis simple. Cuando varias células huevo se

desarrollan de una megaspora, siendo cada una ferti-
lizada por esperma o una espora distinta, o su desa-
rrollo puede ocurrir en forma partenogénica.

205
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

Poliploidía: 1) Célula u organismo con un número múltiplo

de cromosomas mayor que el normal (diploide). 2) Cé-
lula u organismo con un número múltiplo de cromoso-
mas de un conjunto haploide, causado por la replica-
ción cromosomal sin división celular.

Presión osmótica. Presión inducida por el flujo osmótico

(energía libre) del agua a través de una membrana para
una solución en la cual el soluto está en mayor con-
centración. (Sinónimo = Potencial Osmótico).

Polimorfismo genético. Más de una forma genética.

Primordio. Cualquier parte inmadura de una planta destinada

a diferenciar en una cierta célula, tejido u órgano; ejem-
plo, un primordio foliar se diferenciará luego en una hoja.

Producto biofarmacéutico. Producto de utilidad farmacéu-

tica, producido por herramientas biotecnológicas en
organismos (plantas, células, animales) modificados
genéticamente con el gen que fomenta (o produce di-
rectamente) una alta cantidad de él (ejemplo, insulina
o interferón producido en bacterias).

Promotor. Secuencia nucleotídica o región de un gen, en

que una RNA polimerasa se une para dar inicio a la
transcripción de dicho gen. Además de la RNA poli-
merasa, son requeridas una serie de proteínas que se
unen a DNA, a otras proteínas, o a ambos.

Promotor 35S ó 35S-CaMV. Una de las secuencias promotoras

de la transcripción en plantas más fuerte conocidas has-
ta el momento. Se aisló del virus del mosaico de la coli-
flor (CaMV), en donde activa la transcripción del RNA35S
del virus.

Proteínas multiméricas. Proteínas que presentan más de una

cadena de polipéptidos en múltiples combinaciones.

Protocolo de Cartagena. Acuerdo legalmente vinculante para

proteger el ambiente de los eventuales riesgos que po-
dría ocasional el movimiento transfronterizo de orga-
nismos vivos modificados (OVMs). El objetivo es que

206
GLOSARIO

los países tengan la oportunidad de realizar el análisis

de riesgo que involucra la internación de los produc-
tos obtenidos mediante la biotecnología moderna. De
esta forma, se persigue que cada país pueda tomar de-
cisiones de una forma lo más informada posible con
respecto a estos organismos y sus contenedores (ali-
mentos, granos, materias primas, etc.).

Puentes de hidrógeno. Atracción electrostática débil entre

un átomo electronegativo (Oxígeno, Nitrógeno, etc.)
y un átomo de hidrógeno. Enlace que permite el apa-
reamiento complementario de bases según el modelo
de Watson y Crick.

Quelato (de “chelos“= tenazas). Compuesto químico capaz

de capturar temporalmente un ión en una solución,
evitando su precipitación y haciéndolo de esta mane-
ra, soluble y disponible para su absorción por las plan-
tas.

Radiación ionizante. Radiación beta y o gamma, incluyen-

do rayos X, que provocan la ruptura de la hebra cro-
mosomal y con ello, graves mutaciones en la célula y
organismo.

Razón estequiométrica. Proporción de masas entre distintos

átomos. A nivel de DNA, se refiere a que la constitu-
ción de una célula entre adeninas y timidinas es 1:1,
de forma similar a lo que acontece con la proporción
entre guaninas y citocinas.

Reacción de ligación. Reacción in vitro en la que se intenta

ligar dos fragmentos de DNA de interés, mediante la
enzima DNA ligasa.

Recombinación del DNA. Evento molecular en el que he-

bras de DNA son intercambiadas.

Recombinación homóloga. Proceso en el que se intercam-

bian dobles hebras de DNA en zonas donde existe una
similitud substancial de las secuencias (es decir,
homología).

207
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

Recombinación ilegítima. Recombinación de DNA en el que

se incluyen todos los eventos de recombinación que
no caen en recombinación homóloga o sitio específi-
ca. En esencia, este tipo de recambio o integración
entre hebras de DNA no requiere homología de se-
cuencias, o si lo hace, estas son zonas de unos pocos
nucleótidos de largo.

Recombinación sitio específica. Recombinación del DNA

que involucra el reconocimiento entre secuencias que
son homólogas e involucran la participación de pro-
teínas de recombinación. Este mecanismo se ha identi-
ficado especialmente en E. coli, que posee secuencias
que son homólogas al bacteriófago λ y que requieren
la participación de una proteína llamada integrasa.

Regeneración. Estadio clave en el cultivo in vitro y transfor-

mación de plantas, en donde, las células de un ex-
plante eventualmente sometido a transformación
genética, son inducidas a re-diferenciar hasta una plan-
ta nueva. Esto se procura mediante la manipulación
hormonal específica.

Replicación semiconservativa. Modelo propuesto por Watson

y Crick para la replicación (duplicación) del DNA, en
donde cada una de las hebras molde se separan, para
dar origen a su complementaria respectiva.

Ribosoma. Complejo ribonucleoproteico encontrado en el

citoplasma de las células, en forma libre o unido a
membranas del retículo endoplasmático. Poseen dos
subunidades, mayor y menor, siendo la menor la en-
cargada de unirse al RNA y la mayor, de aportar a la
maquinaria necesaria para ingresar los aminoacil-
tRNAs, descargarlos y cargar otros nuevos.

RNA de transferencia (tRNA). RNA que media la traducción

de ácidos nucleicos en secuencias de aminoácidos.
Sirven de moléculas adaptadoras, uniendo cada amino-
ácido específicamente (por lo que existen por lo me-
nos 20 tRNAs distintos) y lo ubican según la lectura
del codón respectivo, el que también es “leído” por
otro segmento del tRNA (el anticodón).

208
GLOSARIO

RNA mensajero (mRNA). RNA que lleva la información que

va a ser traducida a proteínas. Representa una peque-
ña fracción del RNA total.

Secuencias flanqueadoras (en el DNA). Secuencias de DNA

encontradas junto a la de interés.

Secuencia palindrómica. Secuencia del DNA que es reco-

nocida por las enzimas de restricción y que varían en
su largo (4, 6 ó más nucleótidos) según dicha enzima.
Estas secuencias son repetidas invertidas, vale decir,
que son idénticas cuando ambas hebras son leídas en
la dirección opuesta (desde una hebra y su comple-
mentaria).

Selección. Estadio en la transformación de plantas, en don-

de, las células regeneradas son sometidas a una com-
probación masiva de su estado efectivo de transfor-
mación, a través del uso de marcadores de resistencia
a antibiótico, morfológico u otro.

Semillas recalcitrantes. Son semillas que pierden rápidamen-

te su poder germinativo durante el almacenamiento y
son posteriormente difíciles de germinar. En semillas
de frutos tropicales esta característica es común. Ejem-
plo: café, cacao, caucho, etc.

Simplástico (relativo a “simplasto”). Todo lo que implica

transporte de agua y iones por estructuras celulares
tales como membranas, citosol, plasmodesmos, exclu-
yendo transporte por la pared celular y espacios inter-
celulares.

Sitio múltiple de clonamiento. Sitio específico de un plasmi-

dio, en donde se han posicionado sucesivamente, dis-
tintos sitios de restricción para poder insertar allí, en
varias posibilidades, un segmento externo de DNA de
interés.

Solución hidropónica. Solución nutritiva con aireación para

hacer crecer plantas con interés científico o económico.

209
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

Solución hipotónica. Es una solución en que el soluto está

en baja concentración molar. Ejemplo: 0,01 molar de
NaCl. Contrariamente en la solución hipertónica el
soluto está en mayor concentración. Ejemplo: 2 molar
NaCl.

Suspensión celular. Conjunto de células aisladas creciendo

en un medio de cultivo bajo condiciones in vitro.

T-DNA o DNA de transferencia. Fragmento del plasmidio Ti

que va a ser transferido a una planta. En forma origi-
nal, el T-DNA está constituido por los genes que per-
miten la síntesis de opinas y fitohormonas, flanqueados
por los brazos izquierdo y derecho. En los plasmidios
lanzadera o de tipo binario, estos genes se han remo-
vido y reemplazado por sitios múltiples de clonamiento
y "cassettes" de expresión para genes reportero.

Técnica del DNA recombinante. Conjunto de técnicas que

permitió la manipulación y el clonamiento de fragmen-
tos de DNA de interés.

Terminador. Secuencia de DNA localizada en el extremo 3´

de la región codificante de un gen y que obliga a la
RNA polimerasa a interrumpir la transcripción y diso-
ciarse del DNA.

Tonoplasto. Membrana unitaria de la vacuola de una célula

vegetal.

Totipotencia celular. Capacidad que pueden expresar algu-

nas células diferenciadas para regenerar plantas ente-
ras células vegetales y células tronco-embrionarias en
animales.

Transformación bacteriana. Evento de captación de DNA

desde el medio externo por parte de una bacteria. En
el laboratorio, es la transferencia controlada de una
secuencia o porción de DNA hacia una bacteria, ge-
neralmente utilizando plasmidios.

210
GLOSARIO

Transformación estable. Transferencia controlada de una

secuencia o zona de DNA hacia un genoma receptor,
generalmente aportando nuevas características a este
genoma, que son establemente adquiridas.

Transposasa. Enzima clave involucrada en las actividades

de “salto” de elementos de DNA específicos llamados
transposones, hacia un nuevo sitio del genoma.

Transposón. Elemento genético capaz de translocarse (escin-

dirse e insertarse) a una nueva posición.

Tubo polínico. Estructura originaria de la intina del grano

de polen que, durante su germinación, emerge a tra-
vés de una apertura existente en la exina, creciendo
hacia la célula huevo y portando el núcleo vegetativo
y núcleos generativos.

Vacuola. En la célula vegetal, cavidad celular llena de flui-

do, separada del citosol, provista de una membrana
unitaria (tonoplasto). Células jóvenes pueden tener
varias vacuolas pequeñas respecto de células adultas
que generalmente poseen una sola. Su tamaño puede
implicar el 90% del volumen celular.

Zigoto (cigoto). Producto de la fusión de dos gametos antes

que se inicie la mitosis o meiosis.

211
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

212
AUTORES

HUMBERTO PRIETO E.
Chileno, Bioquímico, Doctor en Bioquímica e
investigador jornada completa en INIA – La Platina
desde 1998. Su principal área de trabajo ha sido
participar e impulsar diversos proyectos de
transformación genética de plantas dentro del
grupo de investigación del Laboratorio de
Biotecnología de INIA-La Platina. Uno de los
primeros trabajos en este tema en INIA – LaPlatina,
fue la generación de melones resistentes a aislados
chilenos del Watermelon Mosaic Virus Type II,
trabajo iniciado en 1994 y culminado en 1999,
siendo a la vez su tesis doctoral. Luego, se
ha vinculado activamente al desarrollo de la
plataforma de transformación genética de cultivos
económicamente importantes, como vides y
últimamente, frutales de carozo (iniciativas
FONDEF, FDI; en conjunto con Fundación Chile,
Agrícola Brown y ANA). En forma adicional,
desde el año 2000, el Dr. Prieto también se ha
relacionado con las iniciativas de genómica
funcional de vides (en el sub-proyecto del estudio
de la respuesta vegetal frente al hongo Botrytis
cinerea) y en el desarrollo de un proyecto FIA,
que evalúa el flujo génico entre cultivos
genéticamente modificados y sus parientes
silvestres.

213
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

AUTORES

MIGUEL JORDAN
Nacido en Alemania y nacionalizado chileno.
Desde 1967, es profesor e investigador a tiempo
completo en la Pontificia Universidad Católica de
Chile. Doctorado en 1975, Justus Liebig- Universität,
Giessen, Alemania. Profesor Encargado del curso
de Fisiología Vegetal. Su investigación está referida
a aspectos de Morfogénesis y Regeneración de
Plantas, en particular al potencial de manipulación
y regeneración de plantas a partir de sistemas
celulares (protoplastos y suspensiones), tejidos y
órganos bajo condiciones in vitro, como igualmente
aspectos de transformación en plantas referidos a
papa, pepino dulce y tomate de árbol (tamarillo)
(Proyectos PNUD, CONICYT, AID).
Otras actividades de investigación corresponden a
estudios sobre germinación, viabilidad, multiplicación
y conservación in vivo e in vitro a bajas temperaturas
de clones élite de diferentes especies forestales
introducidas y nativas (pino, eucalipto, raulí)
(Proyectos con BIOFOREST); producción in vitro
de diversos compuestos metabólicos y regeneración
de plantas medicinales (BMBF). Estos aspectos están
igualmente vinculados con otras temáticas, en especial
aspectos de Fitorremediación de diversos residuos,
acumulación de metales pesados con uso de plantas
tolerantes y sobre colonización de especies vegetales
en depósitos de acopio de residuos (FONDEF/DIPUC).

214
AUTORES

L. PEDRO BARRUETO CID

Nacido en Chile, investigador en el área de cultivo
de tejidos de plantas en el Centro Nacional de
Recursos Genéticos y Biotecnología (CENARGEN)
ubicado en Brasilia-DF y dependiente de la
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria
(EMBRAPA), empresa dependiente del Ministerio
de Agricultura del Gobierno Brasileño. Profesor
de Biología y Ciencias de la Universidad de Chile.
Magister Scientiae en Fisiología Vegetal,
Universidad Federal de Viscosa, MG Brasil;
Doctor Scientiae en Fisiología Vegetal, Universidad
de Campinas, Sao Paulo, Brasil. Post-doctorado en
el tema de Hiperhidricidad en UC-Davis (USA).
Como investigador, es coordinador en la actualidad
de dos proyectos de investigación en el área del
cultivo de tejidos. Uno sobre micropropagación
de café (Coffea arabica) y otro sobre piña (Ananas
comosus), a través del uso de biorreactores de
inmersión permanente. Además, como investigador,
es consultor de varios proyectos de investigación
de otras unidades de EMBRAPA, entre ellos
mandioca, mango y eucalypto. En CENARGEN,
es responsable del curso sobre “Introducción al
Método Científico”, para alumnos de pre y
post-grado del área de biología de plantas.

215
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

M. CRISTINA R. CORDEIRO
Brasileña nacida en Rio de Janeiro,
Biomédica, M.Sc. en Biofísica y Ph.D.
en Biología Molecular. Ex profesora de
la Universidad Gama Filho en Rio de Janeiro.
Actualmente se desempeña como investigadora
en el área de biotecnología (biología molecular)
en el Centro de Pesquisa de Cerrados de EMBRAPA,
en Brasília-DF, dependiente del Ministerio de
Agricultura del Brasil. Investigadora especializada
en biología molecular del Centro de Pesquisa
Agropecuária do Cerrado (CPAC), Brasilia, Brasil.
Sus líneas actuales de investigación son:
Mejoramiento Genético de Frutas con énfasis en
mango, específicamente en EMBRAPA Cerrados
(Subproyecto “Uso de Marcadores Moleculares no
Melhoramento Genético da Mangueira (Mangifera
indica, L.)) y mejoramiento en leguminosas
(Subproyecto “Banco de Germoplasma de
Leguminosas com Potencial Forrageiro
para a Região dos Cerrados”).

216
AUTORES

DON DURZAN
Nacido en EE.UU., profesor del Environmental
Horticulture de la University of California en Davis.
Entre 1981 a 1986 fue Chairman del Department
of Pomology. En conjunto con Calgene, logró la
primera evidencia de introducción de genes estables
en coníferas. Gestó ocho patentes en USA vinculadas
con poliembriogénesis somática, partenogénesis,
drogas anticáncer, métodos de detección, y usos de
ciclodextrinas en formulaciones nutritivas. Junto
con “NASA microgravity support” ha inducido la
sobreproducción de TaxolTM, droga anti-cancerígena
generada en células rediseñadas. Ha sido consultor
de US Agency for International Development, the
Center for Application of Biotechnology in
Agriculture, the United Nations Development
Program para Indonesia, y para gobiernos e
industrias de biotecnología y de azúcar de diferentes
países. Cuenta con artículos en variados temas tales
como Bioquímica Analítica, Bioquímica, Botánica,
Fisiología Vegetal, Fisiología de Insectos y Forestal.
Co-editor de cinco volúmenes de libro referidos a
cultivo de células y tejidos de especies forestales y
causas de envejecimiento a nivel molecular.
Editor asociado y referee en varias revistas científicas.

217
 BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

218

View publication stats