METODOS DE ANÁLISIS

MICROBIOLÓGICOS
APLICADOS A ALIMENTOS

Lic. José W. Landa Delgado

Existen diferentes métodos para realizar
el análisis microbiológico de alimentos,
con fines didácticos los podemos clasificar
en:
❑ MÉTODOS FÍSICOS
❑ MÉTODOS QUÍMICOS
❑ MÉTODOS INMUNOENZIMÁTICOS
❑ RECUENTO DE MICROORGANISMOS
VIABLES TOTALES
 METODOS FISICOS
A) Impedancia:
Es la resistencia aparente presentada a
la corriente alterna. En un cultivo los
microorganismos alteran las substratos
cambiando su conductividad eléctrica y
esto varía la impedancia. El método se
basa en detectar estos cambios y la
cantidad de microorganismos se expresa
como función del tiempo que tarda el
cultivo en alcanzar unos valores de
impedancia correspondientes a 106 - 107
células por ml. (IDT: Imdepedance
Detection Time). Es necesario que el
medio de cultivo permita un crecimiento
homogéneo sin «escalones».
B) Microcalorimetria:
Estudio de los pequeños cambios de calor
producidos como consecuencia del
antabolismo de nutrientes. Los diferentes
tipos de microorganismos metabolizan los
substratos de forma diferente y, por ello, se
ha usado la microcalorimetría para poder
identificar las especies presentes en un
alimento: usando un medio de cultivo con
una composición definida de azúcares
pueden llegar a identificarse diferentes
tipos de bacterias lácticas mediante los
termogramas de su metabolización de los
azúcares presentes en el medio
C) Citometría de flujo:
Método basado en hacer pasar una a una
las células de una suspensión por un sistema
de detección; este sistema puede contener
un detector capaz de medir diferentes
parámetros (diferentes tipos de
fluorescencia, absorbancia, dispersión de
luz, etc.) lo que permite identificar las
bacterias durante su paso por el detector.
 METODOS QUÍMICOS
Generalmente se fundamentan en la reacción enzima - sustrato

A) Nucleasa Termoestable:
S. aureus produce una nucleasa
termoestable con mayor rapidez y
en mayor cantidad que la
enterotoxina responsable de la
intoxicación. La endonucleasa puede
detectarse experimentalmente como
un índice de la presencia de S.
aureus incluso en concentraciones
demasiado bajas para que hayan
producido unas cantidades
detectables de enterotoxina.
B) Medida de ATP-:
Se detecta la presencia de ATP
usando luciferasa, aunque hay
algunos problemas experimentales
que hacen que la técnica sea
controvertida
C) Substratos Fluoro y Cromogénicos:
Se añaden como aditivos a los medios de cultivos para facilitar y acelerar la detección de
los microorganismos. Un ejm. de estos métodos es cuando se utiliza el Agar Rambach
D) Método de la PCR:
Método para detectar número
extremadamente bajos de
microorganismos con una cierta rapidez
basado de la producción de copias de
genes específicos de un microorganismo
en cuestión. Aplicable a varios tipos de
microorganismos, incluido los virus. Ejm el
método para detectar el coronavirus
(Covid-19)
METODOS INMUNOLÓGICOS
A) Anticuerpo fluorescentes:
Se utiliza anticuerpo marcado con una
molécula fluorescente o un segundo
anticuerpo que reconozca el primero. Se
pueden usar antisueros complejos en el
primer anticuerpo y de esta forma
detectar cualquier tipo de Salmonella sin
necesidad de aislarlas. El método
también se ha usado para Clostridios
aunque su mayor aplicación ha sido en
Salmonella donde es muy conveniente
por la sensibilidad y rapidez
B) ELISA:
El método es similar al radioinmunoensayo: el
antígeno se fija en un soporte sólido, se trata
con el antisuero correspondiente y la
interacción se detecta mediante una actividad
marcadora (peroxidasa) unida al anticuerpo
en cuestión o a un segundo anticuerpo de
revelado. El método se ha usado para
detección de Salmonellas. Toxinas de S
aureus, micotoxinas, toxinas de C. botulinum,
enterotoxinas de E. coli.
METODOS PARA RECUENTO
DE MICROORGANISMO
Se trata de conocer el número total de microorganismos
presentes en el alimento. Este número no guarda relación con el
de microorganismos patógenos por lo que no puede usarse
como índice de su presencia y sólo debe considerarse un
indicador de las características higiénicas generales del
alimento.
Dependiendo de las características del medio utilizado (medio
rico, medio limitado en nutrientes para medida de la flora no
láctica de alimentos fermentados) y de las condiciones de
incubación (mesófilos, psicrófilos) los microorganismos
analizados serán miembros de poblaciones diferentes. En
general se investiga la presencia de microorganismos aerobios
o aerotolerantes (anaerobios facultativos); aunque, en ciertas
situaciones (alimentos envasados al vacío), puede ser de interés
hacer recuentos de anaerobios totales.
 METODOS PARA RECUENTO
DE MICROORGANISMO

Se han desarrollado técnicas que hacen

posible la automatización del proceso.
Hay cuatro técnicas biológicas básicas
de recuento de microorganismos
viables: Contaje en Placa Standard
(Ejm. Agar SPC), Determinación del
número más probable, Métodos
basados en la reducción de colorantes
por microorganismos viables y Contaje
microscópico directo.
a.- Contaje de Placa: Consiste en el plaqueo de una
muestra de volumen conocido del alimento que se
analiza. El resultado es función de una serie de
factores como son el método de muestreo, el tipo de
microorganismo, el tipo de alimento y las
características del medio de cultivo. Los cultivos
pueden hacerse tanto en masa como en superficie,
aunque hay que considerar que los cultivos en masa
son letales para la flora psicrotrofa. Cada bacteria
viable formará una colonia, el plaqueo puede
hacerse en una placa normal o por medio de un
plaqueador en espiral que va depositando
concentraciones progresivamente más diluidas de la
muestra.
b.- Filtros de membrana: utilizados
cuando el número de bacterias es
bajo. Son filtros con un poro de 0,45
mm que retienen las bacterias. Se
filtra un volumen dado y se coloca el
filtro sobre una placa del medio de
cultivo apropiado. La muestra puede
haber sido procesada para
epifluorescencia previamente, lo que
facilita el recuento (la
epifluorescencia se puede provocar
con naranja de acridina que tiñe
específicamente los ácidos nucleicos).
c.- Films secos (Petrifilm):
Son películas deshidratadas
de medios de cultivos
generales o selectivos en las
que se deposita 1 ml de la
muestra que rehidrata el
medio. Tras la incubación se
hace el recuento.
d.- Método del número más
probable: Basado en series de
diluciones y cálculo estadístico
del número de bacterias
presentes en las diluciones más
altas. Se puede hacer con 3 ó
5 tubos. El método es popular
aunque poco exacto.
e.- Métodos basados en la
reducción de colorantes:
Usando azul de metileno o
resazurina. Colorantes
reducidos por las bacterias; al
reducirse cambian de color y
esto es medible. Usado en
medios líquidos (lácteos)..
f.- Contaje microscópico
directo: Usando cámaras de
cuenta, se coloca un volumen
determinado y se recuentan las
bacterias.
Además de las técnicas de
recuento basadas en la
formación de colonias
observable (técnicas
biológicas) hay una serie de
procedimientos de recuento
basado en técnicas químicas,
físicas e inmunológicas.
METODO TRADICIONAL
TÉCNICA PARA LA PREPARACIÓN DE LAS
DILUCIONES:
1 mL 1 mL

10 g/ml de
muestra

....
90 mL 9 mL 9 mL
APS APS APS
10-1 10-2 10-3

1 mL 1 mL 1 mL
 SIEMBRA

EN LOS CALDO BRILA SE COLOCA 01 ML PARA MESÓFILOS LA SIEMBRA ES

DE MUESTRA EN CADA TUBO (SERIES DE POR INCORPORACIÓN
TRES TUBOS)
 NMP DE COLIFORMES TOTALES

10 g de muestra 1 mL 1 mL

90 mL
9 mL
APS
APS ....
10-1
10-2 10-3
1 mL 1 mL 1 mL
Caldo lauryl sulfato
Prueba Presuntiva 10 mL por tubo

2X X

Incubar a 35ºC por 24 - 48 horas

Los tubos positivos con gas y turbidez, se

pasan a:
 NUMERACIÓN DE MESÓFILOS AEROBIOS
VIABLES

10 g/ml de muestra 1 mL 1 mL

90 mL
AP 9 mL ....
AP
10-1
10-2 10-3
1 mL 1 mL 1 mL
Inocular 1 mL de cada
dilución en placas Petri
por duplicado ( siembra
por incorporación)
Incorporar el medio Agar Plate Count*, homogenizar y
que se solidifique.

Incubar a 35ºC por 48 h

Seleccionar para la numeración placas con un máximo de 250 colonias

•Agregar a 100 mL de medio PCA, 2 mL de TTC al 0.5% .

(TTC= 2.3.5 triphenil tetrazolium chloride)

ICMSF Vol. 1, 2da. Ed. 2000

MUCHAS GRACIAS
POR SU ATENCIÓN
QUE DIOS LOS BENDIGA GRANDEMENTE