ESCUELA DE EDUCACIÓN TÉCNICA Nº3141

INFORME DE
PRÁCTICA LABORAL
INFORME DE
PRÁCTICA LABORAL
Laboratorio de
Biotecnología
EEA INTA Salta.

Andrea Batallanos, Mariana Delgado

2012

CURSO3º POLIMODAL
 INDICE
PÁG.

INTRODUCCIÓN ……………………………………………………………………………………

OBJETIVOS………………………………………………………………………………………………

BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO………………………………………………….

EXTRACCIÓN DE ADN…………………………………………………………

AMPLIFICACIÓN DE ADN POR PCR…………………………………………..…

CONCLUSIÓN……………………………………………………………………………….……

ANEXOS……………………………………………………………………………………………..………..

BILBIOGRAFÍA………………………………….………………………………………………………….

1
 INTRODUCCIÓN
Biotecnología

A los seres vivos se los puede considerar como fabricas en las que, a partir de
diversas sustancias bá sicas (nutrientes), producen otras con acció n bioló gica
específica. Ademá s, los organismos son capaces de diseñ arse y rediseñ arse a sí
mismos. Todo esto gracias a su compleja y ú nica “maquinaria genética”.

Esta cualidad fundamental de los seres vivos para producir compuestos ú tiles para
el hombre, a través de modificaciones genéticas de algunos organismos es
aprovechada por la Biotecnología.

La biotecnología es la tecnología basada en la biología. Segú n el Convenio sobre

Diversidad Bioló gica de 1992, la biotecnología podría definirse como "toda
aplicació n tecnoló gica que utilice sistemas bioló gicos y organismos vivos o sus
derivados para la creació n o modificació n de productos o procesos para usos
específicos". Se desarrolla en un enfoque multidisciplinario que involucra varias
disciplinas y ciencias como biología, bioquímica, genética, virología, agronomía,
ingeniería, física, química, medicina y veterinaria entre otras. Tiene gran
repercusió n en la farmacia, la medicina, la microbiología, la ciencia de los
alimentos, la minería y la agricultura entre otros campos.

Biotecnología y agricultura

Durante el siglo XX, el desarrollo de herbicidas, plaguicidas y fertilizantes le dio un

gran impulso a la agricultura, que posibilito un importante crecimiento en la
producció n de alimentos y otras plantas ú tiles. La biotecnología hace su aporte
para aumentar los beneficios de estas sustancias, minimizar sus efectos adversos y
ademá s obtener plantas con características organolépticas, nutricionales y de
resistencia a condiciones adversas superiores a las conocidas hasta el momento.
Esto se logra mediante la obtenció n de organismos transgénicos.

2
Los organismos transgénicos son aquellos que tuvieron alguna modificació n en su
informació n genética por medio de técnicas de ingeniería genética.

La Biotecnología moderna incluye ademá s al conjunto de técnicas empleadas en

á reas tales como “biología molecular”, "ingeniería genética", "inmunología",
"bioquímica" y “genó mica”, entre otras, y que permiten el estudio de las plantas y
microorganismos a nivel de ADN, el aná lisis de las secuencias para encontrar genes
de interés y su comparació n con secuencias genó micas de otros organismos.

OBJETIVO GENERAL:

Adquirir entrenamiento en técnicas de biología molecular para el aná lisis de

plantas y microorganismos.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

1. Conocer y aplicar las normas de bioseguridad necesarias para el desarrollo

de tareas en un laboratorio de biología molecular.
2. Desarrollar un protocolo de extracció n de ADN a partir de plantas y hongos.
3. Adquirir entrenamiento en la amplificació n de ADN empleando marcadores
moleculares.

3
 BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO

¿Qué es la bioseguridad?

Es el conjunto de medidas y normas preventivas destinadas a mantener el control

de factores de riesgo laborales procedentes de agentes bioló gicos, físicos o
químicos, logrando la prevenció n de impactos nocivos frente a riesgos propio de su
actividad diaria, asegurando que el desarrollo o producto final de dichos
procedimientos no atenten contra la seguridad de los trabajadores de la salud,
visitantes y el medio ambiente.

El trabajo en el laboratorio es un trabajo en grupo. La actitud ante las prá cticas

seguras de cada uno de los integrantes del equipo determina su propia seguridad,
la de sus compañ eros de laboratorio, la del resto de los investigadores del instituto,
la comunidad en general y el medio ambiente.

Las reglas bá sicas para un manejo seguro en el laboratorio implican:

1. Conocer los agentes, sustancias y productos peligrosos que existen en el

laboratorio.
2. Conocer la metodología de trabajo en el laboratorio.
3. Conocer el equipamiento del laboratorio.
4. Conocer las medidas a tomar en caso de emergencia.
5. Respetar y hacer cumplir todo lo anterior.

MEDIDAS GENERALES

Las siguientes medidas son de cumplimiento obligatorio en cualquier á rea de

laboratorio:

 El acceso al laboratorio estará limitado al personal autorizado. No deben

entrar en el mismo, personas ajenas al lugar.
 No se puede trabajar apurado, lo má s probable es que se cometan errores y
aumente la probabilidad de accidentes.

4
 Es importante saber que el tiempo destinado a ordenar y volver a dejar el
lugar de trabajo en condiciones debe considerarse dentro del tiempo de
trabajo.
 Las personas que no está n trabajando no deben permanecer en el
laboratorio; para leer y estudiar existen aéreas determinadas.
 Está prohibido comer, beber y fumar y aplicarse cosméticos en el á rea de
trabajo del laboratorio, así como el almacenamiento de comida o bebida.
 El laboratorio debe permanecer limpio y ordenado.
 Todas las superficies de trabajo se limpiaran y desinfectaran
perió dicamente.
 En las mesadas de trabajo no deben colocarse apuntes, carpetas y libros.
 Debe usarse siempre guardapolvo en el laboratorio, nunca fuera del mismo
(por ejemplo en el comedor).
 Los investigadores deben lavarse las manos frecuentemente durante las
actividades rutinarias, tras acabar la jornada laboral y siempre antes de
abandonar el laboratorio. Se usara un jabó n líquido y el secado se realizara
con papel.
 Circular por los pasillos con cuidado, sin correr y sobre todo cuando se
transporta material.
 Debe ponerse especial cuidado al manipular sustancias peligrosas (ej.
Á cidos, bromuro de etidio, poliacrilamida, etc.). deben usarse guantes y
desecharlos antes de salir del á rea de trabajo, jamá s se saldrá de la misma
con los guantes puestos, ni con ellos se tomara el teléfono, pipetas de uso
comú n, se tocaran hojas de cuaderno o apuntes, picaportes de las puertas,
etc.
 Tras quitarse los guantes se realizará un lavado de manos.
 Se usará n gafas protectoras y barbijos si existe riesgo de salpicaduras y/o
aerosoles.
 Los derrames y accidentes deben ser informados inmediatamente.
 Esta rigurosamente prohibido pipetear con la boca. Se realizara pipeteo
automá tico con el material adecuado.
 Los accesos a las puertas deben permanecer despejados y las vías de
transito señ alizadas, libres y sin obstrucció n.

5
  Cuando se trabaje con sustancias peligrosas deberá leerse la ficha de
seguridad antes de manipularlas, si es necesario trabajar bajo campana.
 el laboratorio debe disponer de una buena ventilació n así como de sistemas
de drenaje para controlar los derrames que pueden producirse (rejillas,
canalizaciones, etc.)
 Cada reactivo debe estar identificado correctamente mediante etiquetas
normalizadas.

AUTOCLAVE

a) Se deberá respetar el lugar destinado para colocar el material a autoclavar.

b) El material se acondicionara debidamente colocando una cinta indicadora
especial para autoclave.
c) Cada nuevo integrante del laboratorio deberá solicitar que el personal
capacitado lo instruya en el uso correcto de autoclave, capacidad del llenado
del mismo, tiempo, temperatura, etc.
d) Se recomienda realizar controles rutinarios de la eficiencia de esterilizació n
de autoclaves.

FLUJO LAMINAR

 Se debe mantener siempre limpio y ordenado el cuarto de flujo laminar sin

dejar material depositado dentro de la cá mara ni sobre las mesadas.
 Debe esconderse el flujo laminar por los menos 15 min. antes de comenzar
a trabajar, desinfectar con alcohol 70% y solo utilizar el mechero cuando
sea imprescindible (preferentemente usar mechero de alcohol).
 Respetar los turnos de uso dejando siempre limpio y ordenado para ser
utilizado en el turno siguiente.

6
 EXTRACCION DE ADN

El ácido desoxirribonucleico (ADN)

Los organismos está n formados por una variedad de moléculas, dentro de ellas, el
acido desoxirribonucleico (ADN). Estas moléculas, que contienen la informació n
genética de los organismos, tienen una estructura bá sica que contiene un azú car,
un grupo fosfato y una secuencia de bases nitrogenadas (Adenina, Timina, Guanina,
Citosina) que se unen por puentes hidrogeno, para formar estructuras de doble
cadena.

El ADN es la sustancia central para

el control celular, ya que este regula
y dirige la mayor parte de las
actividades fundamentales de la
célula. Debido a la gran importancia
de esta molécula, es fundamental
contar con métodos adecuados de
aislamiento y purificació n de la
misma, que permitan en la
aplicació n de diversas técnicas de
biología molecular la obtenció n de
ADN de alto peso molecular de excelente calidad. La calidad de un material
genético obtenido va a estar influenciada por el protocolo así como el tipo de tejido
que se utilice. De ahí que se suma la importancia de la selecció n del método que
mejor ajuste a los objetivos del trabajo a realizar.

7
 Reactivos empleados en los protocolos de
extracción de ADN

Para lograr extraer el ADN de algú n organismo, tejido u ó rgano se debe emplear
un procedimiento adecuado que, a través de diversas etapas culmine con la
extracció n del material genético.

En la primera etapa del procedimiento se da una fase de rompimientos de tejidos y

lisis celular, la cual tiene el objetivo primario de solubilizar el ADN. Para lograr este
cometido se emplea el buffer de extracció n. Cada uno de los compuestos que
conforman el buffer de extracció n cumple una funció n específica. A continuació n se
detallan los compuestos que se emplean en este protocolo.

Tris-HCl (pH 8), estabiliza el pH del medio en que se encuentra el ADN para darle
una mayor estabilidad a esta molécula, lo que permite obtener ADN de buena
calidad. El tris-HCl es emulsificador de grasas y permite separar el ADN de las
proteínas por medio de su degradació n.

El EDTA, remueve los iones de magnesio requerido por las nucleasas que degradan
el ADN.

NaCl, brinda estabilidad al ADN y evita la degradació n de la molécula.

CTAB, se utiliza como detergente que elimina las grasas y destruye las membranas
celulares. Dicho compuesto se une fuertemente al ADN, formando un complejo y
precipitando e impide la degradació n por enzimas.

Β-Mercaptoetanol, es un agente oxidante que desnaturaliza proteínas, ya que

rompe los puentes disulfuro que las conforman.

Cloroformo-isoamil alcohol, se utiliza para separar los compuestos orgá nicos de

los á cidos nucleicos, se adiciona agentes que llevan a cabo una desproteinizació n
má s efectiva. El mismo tiene la propiedad de desnaturalizar proteínas y remover
lípidos. El cloroformo es má s denso que el agua, por lo que luego de una
centrifugació n se forman dos fases, la inferior en donde se encuentra el cloroformo

8
–isoamil con las proteínas y los polisacá ridos, y en la superior, en la cual se
mantiene el ADN (la fase acuosa).

Isopropanol a -20ºC: deshidrata el ADN haciendo que precipite.

Etanol 75%- Acetato de amonio: lavado.

Etanol frio al 70 %: remueve las impurezas, como restos de compuestos fenolicos

y sales.

TE: compuesto que mantiene al ADN estable y no permite que se degrade.

Protocolos de extracción de ADN

EQUIPO DE PROTECCION PERSONAL

 Delantal
 Guantes
 Mascara antigases

REACTIVOS EMPLEADOS PARA PROTOCOLO CTAB

 CTAB 10%
 Buffer CTAB (compuesto por Tris-HCl 100mM pH=8, Edta 20mM, NaCl
1,4M)
 β-Mercaptoetanol
 Cloroformo-Isoamilalcohol 12:1
 Isopropanol
 Buffer TE (Tris 10mM, EDTA 1Mm)
 Etanol 75%- Acetato de amonio 10mM
 Etanol 70%
 RNAsa

REACTIVOS EMPLEADOS PARA PROTOCOLO SDS

 SDS al 20%

9
  Buffer CTAB (compuesto por Tris-HCl 100mM pH=8, Edta 20mM, NaCl
1,4M)
 β-Mercaptoetanol
 Acetato de potasio 5 M
 Isopropanol
 Etanol 70%
 TE

MATERIALES NECESARIOS

 Micropipetas automá ticas

 Tips para micropipetas
 Frascos para preparado de solució n
 Probeta de 10ml
 Eppendorf de 2ml
 Gradilla
 Morteros y pilones
 Marcador indeleble
 Papel absorbente y alcohol

EQUIPAMIENTO NECESARIO

 Bañ o termostá tico

 Microcentrifuga refrigerada
 Agitador Vortex

TECNICA-PROTOCOLO EXTRACCIÓN ADN DE PLANTAS- CTAB

1. Moler rá pidamente en un mortero aproximadamente 300 mg de tejido

(pulverizar con nitró geno liquido).
2. Añ adir 1000 µl de Mix CTAB (800µl de Buffer, 200µl de CTAB 10% y 1µl de
B-Mercaptoetanol) y moler.
3. Pasar a un eppendorf de 2ml, agitar vigorosamente y transferir los tubos al
Bañ o Termostá tico durante 30 minutos a 60°C.
4. Añ adir aproximadamente 600µl de Cloroformo-Isoamilico y mezclar en
Vortex.

10
5. Centrifugar 15 minutos a 10.000 rpm. Transferir la fase acuosa superior a
un tubo nuevo.
6. Precipitar con 500 a 600 µl de Isopropanol a -20°C y colocar en el freezer
para que precipite (una noche).
7. Centrifugar 7 a 10 minutos a 10.000 rpm. Descartar el sobrenadante sin
perder el pellet.
8. Lavar el pellet con 400µl de Etanol 75%-Acetato de Amonio 10mM. Golpear
suave para que se desprenda el pellet.
9. Centrifugar 5 a 10 minutos a 10.000rpm. Descartar nuevamente la fase
liquida.
10. Lavar el pellet 1 o 2 veces con 300µl de Etanol 70% frio. Golpear para que
se desprenda el pellet.
11. Centrifugar 5 minutos. Descartar la fase liquida.
12. Dejar secar el pellet.
13. Resuspender el pellet en 100µl de TE (tener en cuenta el tamañ o del pellet
para graduar cantidad de TE) y 1-2 µl de RNAsa (10 µg/µl).
14. Llevar los tubos al Bañ o Termostá tico durante 20 minutos a 36°C.
15. Centrifugar 15 a 20 segundos.

TECNICA- PROTOCOLO EXTRACCIÓN ADN DE HONGOS- SDS

a) Rotular un tubo eppendorf estéril de 2 ml con el nombre del individuo.

b) Bajo mechero, raspar con espá tula estéril el micelio con la precaució n de no
arrastrar el medio de cultivo. Descargar en un mortero previamente
congelado y moler.
c) Agregar aproximadamente 700 µl de mix SDS (670 µl de buffer, 80 µl de SDS
y 0,62 µl de β-Mercaptoetanol) y continuar moliendo hasta formar una
pasta uniforme. Volcar el eppendorf previamente rotulados.
d) Incubar a bañ o maría a 65ºC durante 10 minutos.
e) Añ adir 200 µl de acetato de potasio 5 M Y agitar en el Vortex brevemente.
f) Llevar 20 minutos a la heladera.
g) Retirar de la heladera y centrifugar a 1000 rpm por 30 min a 4ºC. Transferir
la fase acuosa a un tubo nuevo.

11
 h) Añ adir 500 µl de isopropanol a – 20ºC y mezclar suavemente.
i) Centrifugar a 1000 pm durante 15 min a temperatura ambiente. Descartar
el sobrenadante sin perder el pellet.
j) Lavar el pellet con 250 µl de etano al 70%. Centrifugar a 1000 rpm durante
10 min (realizar este lavado al menos 2 veces) y eliminar la fase liquida.
k) Dejar secar el pellet.
l) Resuspender el pellet en 50 a 100 µl de TE y almacenar a – 20 ºC

RECOMENDACIONES ADICIONALES PARA LAS TECNICAS

o Antes de comenzar la extracció n se debe calentar el CTAB para que se

descristalize y poner a calentar el Bañ o Termostá tico a 60°C.
o Cerciorarse de tener los morteros y pilones autoclavados y congelados, y de
contar con todos los reactivos y demá s materiales para la extracció n
autoclavados.
o Limpiar bien la mesada de trabajo con alcohol.
o Colocarse guantes antes de comenzar a trabajar.
o Al momento de incorporar el β-Mercapto usar má scara antigases. Mantener
encendida la campana.
o El Cloroformo al ser una sustancia altamente toxica requiere de la
utilizació n de má scara antigases, antiparras, delantal y guantes.

Electroforesis para visualización de ADN

Una vez obtenido el ADN, un método para el estudio de la calidad de este es la
electroforesis en gel, el cual es un procedimiento por el que las moléculas cargadas
migran diferencialmente cuando se las somete a un campo eléctrico.

La electroforesis es una técnica que permite separar moléculas de ADN de acuerdo

a su tamañ o en una matriz determinada. Se utiliza como método analítico para la
purificació n de fragmentos de ADN específicos. El gel empleado puede ser de
poliacrilamida o agarosa dependiendo del tamañ o del segmento de material que se
desea preparar.

12
PROCEDIMIENTO PARA LA ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA 0,8%

 Agarosa: 1,44 gr
 TBE 5X: 36ml
 H2O destilada: 144 ml

PREPERACION:

1. En vaso precipitado agregar 1,44gr de Agarosa y luego 36ml de TBE 5X y

144 ml de H2O destilada.
2. Mezclar y calentar 1 minuto.

Calentar lo suficiente el GEL DE AGAROSA, de manera tal que pase de

su estado sólido a líquido.

13
 Dejar enfriar hasta obtener una
gelatina compacta de color
claro.
1. Preparar el soporte:
- secar
-colocar cinta en los extremos para sellar
2. Luego colocar un peine (este varía segú n la cantidad de individuos por
sembrar).
3. Agregar el GEL DE AGAROSA desde el final del mismo. Verificar que no
contenga burbujas, de lo contrario, con ayuda de un tip correr la burbuja
hasta el final.

4. Dejar que solidifique el gel. Luego retirar la cinta y el peine. Se observara

que al sacar el peine se formaron celdas.

5. Colocar el gel en una cuba de electroforesis. Verificar el lado en donde se

encuentran las celdas que quede para el extremo negativo (-) de la cuba. (ya
que el ADN tiene carga (-) y corre desde el polo negativo al positivo)

14
 6. Enrazar con TBE 1X la cuba.
7. Sembrar el ADN mezclando 5µl de ADN con 1,5 µl de Buffer de corrida
(Buffer de siembra 6X).
8. Al terminar de sembrar todo los individuos, en la celda posterior sembrar el
MARCADOR DE PESO MOLECULAR.

9. Colocar la tapa de la cuba haciendo coincidir el polo negativo con el

negativo, y el positivo con el positivo.
10. Conectar el cable perteneciente a la cuba y hacer correr a 85- 90 v. (aprox. 1
hora)
11. Transferir el gel a una solució n con colorante GelRed durante 15 minutos y
luego al transiluminador de luz UV para la fotodocumentació n.

AMPLIFICACIÓN DE ADN POR PCR

Replicación del ADN

15
La replicació n del ADN es el proceso por el cual se obtienen copias o réplicas
idénticas de una molécula de ADN. La replicació n es fundamental para la
transferencia de la informació n genética de una generació n a la siguiente y, por
ende, es la base de la herencia. El mecanismo consiste esencialmente en la
separació n de las dos hebras de la doble hélice, las cuales sirven de molde para la
posterior síntesis de cadenas complementarias a cada una de ellas. El resultado
final son dos moléculas idénticas a la original. Este tipo de replicació n se
denomina semiconservativa debido a que cada una de las dos moléculas resultantes
de la duplicació n presenta una cadena procedente de la molécula "madre" y otra
recién sintetizada. Un gran nú mero de enzimas y proteínas intervienen en el
mecanismo molecular de la replicació n, formando el llamado complejo de
replicació n.

Replicación de ADN

La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en

inglés (Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular
desarrollada en 1986 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran nú mero de
copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría
basta partir de una ú nica copia de ese fragmento original, o molde. Esta técnica
sirve para amplificar un fragmento de ADN in vitro; su utilidad es que tras la
amplificació n resulta mucho má s fá cil identificar con una muy alta probabilidad,
virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas o hacer

16
investigació n científica sobre el ADN amplificado. Esta técnica se fundamenta en la
propiedad natural de  la enzima ADN polimerasa para replicar hebras de ADN, para
lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las
hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicació n y, a
continuació n, dejar que vuelvan a unirse las hebras de ADN para que vuelvan a
duplicarlas.

Componentes de la PCR

Para realizar la técnica se necesita:

 Cloruro de Magnesio (MgCl2): Actú a como cofactor de la enzima

polimerasa.
 Una solució n tampón (buffer) que mantiene el pH adecuado para el
funcionamiento del ADN polimerasa.

 Primers o cebadores: son fragmentos de ADN que se unen a secuencias

específicas, se "pegan" a los extremos opuestos, uno en cada hebra de ADN.
Los primers se seleccionan en manera tal que, cuando se forman las dos
nuevas copias ellos flanquean la regió n de interés.

 Desoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs): son necesarios para que la

polimerasa los use como sustrato y pueda llevar a cabo la reacció n de
amplificació n.

 Taq-polimerasa: polimerasa resistente a las altas temperaturas a las que

vamos a someter nuestro tubo de reacció n.

 ADN muestra: ADN que queremos amplificar.

 H2O

 Termociclador: Un aparato cuya temperatura puede ser programada

precisamente para que la cambie rá pidamente y de manera cíclica. Contiene
en su interior una gradilla de metal en la cual los tubos de muestra calzan
perfectamente.
17
Ciclo de amplificación

El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios

repetidos de temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en 2-3 pasos a
diferentes temperaturas. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada
ciclo dependen de gran variedad de pará metros. Al finalizar todos los ciclos se
obtienen má s de mil millones de copias de un ú nico fragmento de ADN y se puede
visualizar mediante una electroforesis.

18
 DESNATURALIZACIÓ N: se desnaturaliza el ADN (se separan las dos cadenas
de las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de diferentes
modos, siendo el calentamiento (94-95 °C) de la muestra la forma má s
habitual.

19
  HIBRIDACIÓ N O UNIÓ N DEL CEBADOR: el cebador se unirá a su secuencia
complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la
temperatura a 40-68 °C durante 20-40 segundos (segú n el caso),
permitiendo así la hibridació n. Los puentes de hidró geno estables entre las
cadenas de ADN (unió n ADN-ADN) só lo se forman cuando la secuencia del
cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el
híbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los
cebadores actuará n como límites de la regió n de la molécula que va a ser
amplificada.
 EXTENSIÓ N O ELONGACIÓ N DE LA CADENA: Actú a la ADN polimerasa,
tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y
partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de
nuevo ADN.
 ELONGACIÓ N FINAL: Etapa que se lleva a cabo a una temperatura de 70-
74 °C durante 5-15 minutos tras el ú ltimo ciclo de PCR. Con ella se asegura
que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente amplificado.
 CONSERVACIÓ N: Este es un paso que se lleva a cabo a 4-15 °C durante un
tiempo indefinido para conservar la reacció n a corto plazo. La PCR
normalmente se realiza con un volumen de reacció n de 15-100 μL, en
pequeñ os tubos de 0.2-0.5 mL que se colocan en el termociclador.

Marcadores moleculares

Son segmentos de ADN que permiten identificar diferencias a nivel genó mico entre
individuos. Permiten detectar variació n en la totalidad del genoma (ADN
codificante y no codificante). Mediante PCR se producen patrones de bandas para
cada individuo que se visualizan mediante electroforesis. Los primers que se
utilizan en la reacció n de PCR dependen del marcador utilizado segú n la especie
analizada.

Los marcadores moleculares utilizados fueron:

 ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) para el protocolo de pantas

 ITS para el protocolo de hongos

PROTOCOLO ESTÁ NDAR DE AMPLIFICACIÓ N POR PCR

Preparar la Mix (mezcla madre) para el total de individuos.

20
MIX

 ADN………………1 µl
 MgCl2……………..2,5 µl
 Buffer…………. 2,5 µl
 Dntp…………… 1 µl
 H2O…………….. 16,75 µl
 Primer……….. 1 µl
 Taq……………..0,25 µl

 Transferir la MIX sin ADN a un tubo eppendorf.

 Colocar 1 µl de ADN en tubos eppendorf, cada individuo en diferente
tubo.
 Agregar a los tubos con ADN, 24 µl de MIX.
 Centrifugar los tubos.
 Transferir los tubos al TERMOCICLADOR GRADIENTE, durante
3horas. (PCR)
 Luego realizar la electroforesis. Sembrar en un GEL DE AGAROSA
1,5%.
 Sembrar el ADN: 7 µl de ADN con 1,5 µl de Buffer. Y en la ú ltima
celda colocar 2,5 µl de MARCADOR PESO MOLECULAR.
 Dejar correr a 90 voltios.
 Teñ ir el gel en una solució n con GelRed durante 20 min y visualizar
los fragmentos del ADN amplificado en un transiluminador de luz
UV.

21
 CONCLUSIÓN

Para finalizar con este informe queremos hacer hincapié en la experiencia en biología
molecular que realizamos en el laboratorio de biotecnología. Queremos hacer saber que
estamos totalmente agradecidas por la oportunidad que nos brindo el colegio de poder
realizar esta experiencia en la cual pudimos aplicar nuestros conocimientos y aprender otros
nuevos para experimentarlos en la práctica.

Gracias a la evolución de la tecnología, hoy en la actualidad existen nuevos sistemas de análisis

para satisfacer nuestras necesidades, en el trabajo, en la sociedad y en la economía.

En este caso pudimos contar con la tecnología necesaria, equipos, instrumentos para hacer la
extracción de ADN de las plantas y los hongos, que es posible mediante los métodos de PCR y
Electroforesis, para luego poder visualizarlo con ayuda de la fotoducumentación en la
computadora.

Una frase que nos identificó en esta práctica es:

“HAY TRES TIPOS DE PERSONAS EN EL MUNDO. LOS QUE HACEN QUE SUCEDAN LAS COSAS,
LOS QUE MIRAN COMO LAS COSAS PASAN, Y LOS QUE SIN ACERCARSE MUCHO, TRATAN DE
IMAGINARSE COMO OCURRIERON.”

22
 ANEXOS

ORGANIGRAMA DEL LABORATORIO

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA

LABORATORIO A LABORATORIO B Deposito de Materiales

Extracción de ADN Amplificación de PCR Sala de Esterilización

Tinción de geles Electroforesis Baños

Fotoducumentación

23
 MATERIALES Y EQUIPOS

MOCROPIPETAS

Tips azules (100 a 1000 µl ) 100 a 1000 µl

Tips amarillos (2 a 20µl) 2 a 20µl - 20 a 200µl

Tips blancos (0,1 a 2,5 µl) 0,1 a 2,5µl

24
 Termociclador Termociclador con gradiente

Microcentrifuga Microcentrífuga refrigerada

Baño termostático Balanza

25
Mechero Vortex

Autoclave Estufa

26
Cubas de electroforesis

Flujo laminar

27
Termómetro digital

Mortero y pilón

28
 PROTOCOLO CTAB DE EXTRACCION DE ADN DE
PLANTAS
Material bioló gico (poroto)

Molienda de hojas con buffer de extracció n

Sucesivas centrifugaciones y agregado de soluciones hasta obtener un precipitado

de ADN

29
 PROTOCOLO SDS DE EXTRACCION DE ADN EN
HONGOS
Material bioló gico (Rhizoctonia, Macrophomina y Fusarium)

Sucesivas centrifugaciones y agregado de soluciones hasta obtener un precipitado

de ADN

30
FOTODOCUMENTACION

PCR ISSR-PLANTAS

31
 GRADIENTE Y CONCENTRACION
GEL ADN F, R, M-HONGOS
HONGOS

SEÑALES DE SEGURIDAD

32
 CLASIFICACION DE RESIDUOS
SE DESCARTA EN CADA TIPO DE BOLSA SOLO LO QUE CORRESPONDE.

Los controles del contenido de todos los descartes los efectúa la policía ecológica, la secretaria
de ambiente y desarrollo sustentable de la nación y autoridades provinciales.

El generador es responsable del residuo que ha generado y esta responsabilidad persiste

hasta la destrucción y/ o disposición final del mismo (artículo 1113 del código civil – artículo
200 del código penal).

BOLSA VERDE:

RESIDUOS DOMICILIARIOS

Son aquellos residuos asimilables a los Domiciliarios generados en una unidad, provenientes
de tareas de administración o limpieza general de los mismos, depósitos, de la preparación de
alimentos, embalajes: restos de comida, alimentos, papeles.

Estos residuos podrán recibir el tratamiento similar a los de origen domiciliario, por poseer los
mismos, bajo o nulo nivel de toxicidad.

BOLSA AMARILLA

33
RESIDUOS PELIGROSOS

Las unidades podrán desechar drogas fármacos, medicamentos y sus envases como residuos
señalados en TIPO C, Peligrosos.

También se incluyen en esta categoría a los residuos provenientes de talleres, solventes, restos
de pinturas, restos de resinas y adhesivos, envases de agroquímicos, tubos fluorescentes.
Líquidos tóxicos en pequeñas cantidades, medicamentos o drogas vencidas.

Asimismo son peligrosos o especiales: Lapiceras, cartuchos de impresora, diskettes, CD`S,

botellas plásticas, bandejas plásticas, vidrio, papel de filtro usado, guantes, barbijos, aerosoles,
pilas ( 1 sola por bolsa o caja contaminan).

Los solventes y otros líquidos tóxicos se deben descartar en bidones. Respetar siempre el
listado de sustancias incompatibles.

Son residuos de riesgo químico: Los residuos radiactivos de métodos diagnósticos,

terapéuticos o de investigación, ensayos biológicos, u otros requieren, en función de la
legislación nacional vigente y por sus propiedades físico- químicas, de un manejo especial.

BOLSA ROJA

34
RESIDUOS PATOLÓGICOS

Son aquellos desechos o elementos materiales en estado sólido, semisólido, líquido o gaseosa,
que presenta características de toxicidad y/o actividad biológica, que puedan afectar
bilógicamente en forma directa o indirecta a los seres vivos y/o causar contaminación del
suelo, agua o atmosfera. Son considerados en particular residuos de este tipo, los que se
incluyen a titulo enunciativo a continuación: vendas usadas, residuos orgánicos de animales de
experimentación y sus excrementos, restos alimenticios de animales inoculados con agentes
infectocontagiosos, piezas anatómicas, materiales descartables con o sin contaminación
sanguínea, anatomía patológica, material de vidrio y descartable de laboratorio de análisis, etc.

Son residuos de riesgo bilógico: Los elementos punzo- cortantes (agujas, cubreobjetos, etc).
Siempre en descartador de paredes semi-rigidas (destino final: incineración

35
 BIBLIOGRAFÍA

 Cuellar D. 2012. Protocolos del laboratorio de Biotecnología INTA EEA Salta

 Marta Z. Galván CONICET-INTA. Seminarios del laboratorio: marcador
molecular, PCR, Electroforesis.
 Pá ginas web:

www.wikipediabiotecnologia.com

www.intabiotecnologia.com

www.wikipediaADN.com

36
 www.wikipediaanalisismolecular.com

 Libro: Santillana Tecnología industrial 1 -polimodal

37