The Plant Journal (2001) 28 (4), 465–474

 
Sitios y control homeostático de la biosíntesis de auxina en Arabidopsis durante el crecimiento
vegetativo

Karin L¡ung, Rishikesh P. Bhalerao y G o ¨ corrieron Sandber g *

Umea ˚ Planta de Ciencia centré Departamento de Bosques Genética y Plantas Fisiología La
sueca Universidad de Ciencias Agrícolas S-901 83 Umea ˚ ¸ Suecia
 
Recibido el 23 de mayo de 2001; revisado el 15 de agosto de 2001; aceptado el 20 de agosto de
2001.
* Para correspondencia (Fax: +46 90 786 5901; correo electrónico:
Goran.Sandberg@genfys.slu.se).
 

 
Resumen

La distribución y biosíntesis de ácido indol-3-acético (IAA) se investigó durante el desarrollo

temprano de la planta en Arabidopsis . Las hojas más jóvenes analizadas, de menos de 0,5 mm
de longitud, contenían 250 pg mg –1   de IAA y también exhibieron la mayor capacidad relativa
para sintetizar esta hormona. UNA
Se produjo una disminución de casi cien veces en el contenido de IAA a medida que las hojas
jóvenes se expandieron a su tamaño completo, y esto fue acompañado por un cambio claro
tanto en el tamaño del grupo como en la capacidad de síntesis de IAA. El c orrelation entre alto
contenido de IAA y división intensa celular se verificó adicionalmente en las hojas de tabaco,
donde un detallado análisis reveló que dividiendo mesófilo tejido contenía diez plegable
superiores IAA niveles
que el tejido que crece únicamente por alargamiento. Demostramos que todas las partes de la
joven planta de Arabidopsis
potencialmente puede contribuir a la auxina necesaria para el crecimiento y el desarrollo, ya que
no solo las hojas jóvenes, sino también todas las otras partes de la planta, como los cotiledones,
las hojas en expansión y los tejidos de la raíz tienen la capacidad de sintetizar IAA de novo .
También observamos que el tratamiento con ácido naftilftalámico (NPA)
inhibición inducida por retroalimentación dependiente de tejido de la biosíntesis de IAA en hojas
y cotiledones en expansión ,
pero intrigantemente no en hojas jóvenes o en el sistema de raíces. Esta observación apoya la
hipótesis de que existe un mecanismo regulador sofisticado específico de tejido para la
biosíntesis de auxina. Finalmente, se reveló un requisito estricto para mantener el tamaño de las
piscinas de IAA, ya que las reducciones en la expansión de las hojas siguieron tanto a la
disminución como al aumento de los niveles de IAA en las hojas en desarrollo. Esto indica que
las hojas no solo son fuentes importantes para la síntesis de IAA, sino que la expansión normal
de la hoja depende del control riguroso de la homeostasis de IAA.
Palabras clave: ácido indol-3-acético, auxina, distribución y biosíntesis, inhibición de la
alimentación k, ácido naftilftalámico , expansión foliar.

Introducción
Durante la inicial de crecimiento de fase, una planta de semillero claramente necesita para
rápidamente desarrollar fotosintética capacidad en las hojas y un sistema de raíces que puede
proporcionar el organismo con agua y nutrientes. Igualmente importante, también debe
desarrollar un sistema vascular para conectar el brote y los tejidos de la raíz. Tanto las señales
intrínsecas como las extrínsecas sirven como reguladores del desarrollo que permiten a la planta
coordinar esta secuencia de desarrollo . Uno de los del desarrollo intrínsecas importantes la
mayoría de las señales es la auxina, indol-3-acético ácido (IAA), que se cree que afecta a
muchos de desarrollo procesos, incluyendo la división celular, la expansión celular y el desa-
rrollo de vascular tejido y raíces. Mucho restos desconocidos acerca de los mecanismos de
auxina acción, como así como los sitios de auxinas de síntesis y su distribución dentro de la
planta.
 
Sin embargo, el progreso reciente en tecnología analítica, que permite el análisis cuantitativo de
IAA en cantidades de tejido vegetal por debajo de miligramos por espectrometría de masas
(Edlund et al., 1995; Ribnicky et al., 1998) ha abierto nuevas posibilidades para analizar en
detalle los tamaños de las piscinas y la capacidad de síntesis de IAA de tejidos específicos
( Barlier et al., 2000; Casmiro et al., 2001; Gray et al., 1998). Los contenidos de IAA se han
analizado previamente en Arabidopsis, pero rara vez de una manera verdaderamente específica
de tejido, lo cual es esencial para ampliar nuestro conocimiento sobre la función de esta
hormona.
En el estudio presentado aquí , analizamos la distribución temporal y espacial de IAA durante el
desarrollo temprano de la planta y durante el crecimiento vegetativo. También hemos investigado
los sitios de biosíntesis de IAA en plantas jóvenes de Arabidopsis,

© 2001 Bl ackwell Science Ltd 465

66 Karin Ljung y col.

y encontró evidencia de un mecanismo de inhibición de retroalimentación de biosíntesis de IAA

que se induce en tejidos específicos y etapas de desarrollo. Esto, junto con el puerto de IAA
trans-, la conjugación de un catabolismo d, es probable que sea un esencial parte de la
homeostático mecanismo que controles libres de los niveles de IAA en la planta. También hemos
realizado experimentos para dilucidar si los cambios en la concentración de IAA que ocurren
durante el desarrollo de la hoja pueden ser parte de un mecanismo que controla la transición de
la división celular a la expansión celular, y si el crecimiento de la expansión depende de que las
concentraciones de IAA se mantengan dentro de límites estrictos .
Los datos recopilados pueden ayudar a evaluar si
Las reacciones observadas in vitro entre las concentraciones de IAA y los procesos de desarrollo
específicos , como la división celular y el alargamiento celular, también son válidas para las
condiciones in vivo. Para abordar estas cuestiones nos hemos inducidas retroalimentación
inhibición de IAA biosíntesis a bajo er el IAA-contenido en la expansión de las hojas, y se utiliza
la auxina sobreproducción mutantes SUR1 y SUR2 para estudiar el efecto de aumento del
contenido de IAA en la expansión de las hojas. Los resultados obtenidos proporcionan evidencia
de que el control estricto del desarrollo de la homeostasis de las auxinas es importante para el
desarrollo normal de la hoja.
Resultados
 
 
Los altos niveles de IAA están fuertemente correlacionados con altas tasas de división celular en
las hojas de Arabidopsis
Las hojas en desarrollo proporcionan un interesante sistema in vivo para investigar la división
celular / expansión celular, el crecimiento y el papel de la auxina en estos procesos. Nosotros
hemos investigado la concentración de IAA en hojas de diferentes tamaños durante vegetativa
de crecimiento, tanto bajo corto (SD) (Figura 1a-c) y día largo (LD) condiciones (Figura 1d). Las
plantas cultivadas en condiciones SD fueron seleccionadas para análisis cuando habían
desarrollado 7, 12 o 20 hojas, y las plantas cultivadas en condiciones LD cuando desarrollaron
ocho hojas. Nosotros observamos una inversa correlación entr een hoja tamaño y la
concentración de IAA que era independiente de las condiciones de crecimiento y desarrollo
escenario. Cuando las cuantificaciones agrupadas para las plantas cultivadas en SD se
representaron gráficamente frente al peso de la hoja (Figura 1e), surgió una imagen clara de las
concentraciones de IAA que eran extremadamente altas en las hojas de menos de 1 mg de
peso, pero que cayeron dramáticamente cuando cesó la división celular y el alargamiento celular
fue único proceso que causa el crecimiento de la hoja. Nosotros también investigamos la IAA
contenido de otros tejidos de joven plántulas de Arabidopsis en desarrollo. Las plantas se div-
ided en cotiledones, el par de hojas primera desarrollo y el hipocotilo. Como se puede ver en la
Figura 2 (a), los niveles de IAA en las primeras hojas verdaderas en desarrollo son consistentes
con los encontrados en el estudio anterior: comenzando alto y cayendo en aproximadamente
90% cuando se inició la expansión de la hoja. En los cotiledones, los niveles se mantuvieron
mucho más bajo, y constante, a lo largo de la totalidad del estudio período. Los tyls hypoco-
inicialmente contenían bajas cantidades de IAA, que comenzaron a aumentar 12-13 Días
Después de la germinación (DAG), pr obably indicando que las hojas y el hipocotilo en esta
etapa están logrando la capacidad de transporte total para IAA. Este experimento se repitió en
condiciones de LD, y se encontraron exactamente las mismas correlaciones entre los niveles de
IAA, los tipos de tejido y las etapas de desarrollo, demostrando nuevamente relaciones altamente
reproducibles entre las etapas de desarrollo de los tejidos y el contenido de IAA (datos no
mostrados).

Figura 1. Niveles de IAA en hojas de Arabidopsis. La concentración de IAA se midió en (a) hojas
8–20 de seis plantas cultivadas durante seis semanas bajo SD (b) hojas 1–12 de seis plantas
cultivadas durante 4.5 semanas bajo SD (c) hojas 1–7 de tres plantas cultivadas  para   3
semanas bajo SD y (d) deja 1–8 de
10 plantas cultivadas durante 16 días bajo LD. (e) Datos agrupados de IAA para todas las hojas
cultivadas bajo SD. Los datos se presentan  como  log log –1 gráficos de la concentración de IAA
en hojas individuales versus peso de la hoja. Bar en
(e) = 1 cm.
 

La división celular es intensa en el desarrollo de los primordios foliares y en todas las partes de
una hoja muy joven de Arabidopsis . Cuando la hoja alcanza una longitud de 1–2 mm, cesa la
división celular , primero en el ápice, luego progresivamente más abajo en la hoja. Luego, la
división se restringe gradualmente a la parte basal de la lámina de la hoja, antes de cesar por
completo (Donnelly et al., 1999; Pyke et al., 1991; Van Lijsebettens y Clarke, 1998). Después de
que se termina la división celular, el crecimiento de la hoja se limita al crecimiento de expansión .
Cell división h como también ha mostrado que cese de una manera basipetal en hojas de tanto
girasol y tabaco (Granier y Tardieu, 1998; Poethig y Sussex, 1985). Para investigar si el cese
basipetal de la división celular se refleja en una reducción similar en el contenido de IAA , las
primeras cuatro hojas en desarrollo de las plantas de Arabidopsis de 10 días de edad se
dividieron en base y punta, en el centro de la lámina de la hoja. Los pecíolos se también
cosecharon, y los niveles de IAA significativamente más altos siempre se observaron en ellos
que en los de la hoja cuchillas (Figura 2b, las hojas 1 y 2), lo que indica que la acumulación y el
transporte IAA activo se produce en este tejido. No se detectaron diferencias significativas en las
concentraciones de IAA entre la base de la hoja y la punta de la hoja . Sin embargo, este
experimento era demasiado exigente técnicamente para realizarlo en hojas de Arabidopsis
menores de 1–2 mm de longitud. Las técnicas dificultades están también reflejadas en las
grandes desviaciones estándar observadas en los resultados de estos experimentos (Figura 2b,
hojas 3 y 4).
 

Figura 2. Niveles de IAA en plántulas de Arabidopsis de tipo salvaje en desarrollo y en una hoja
de tabaco en desarrollo.
(a) Concentración de IAA en las hojas 1 + 2 (las primeras hojas verdaderas, sin incluir el ápice
del brote), hipocotilo (cortado bajo la unión cotiledón / hipocotilo) y complementos cotiledones de
plántulas de Arabidopsis cultivadas bajo SD. Se agruparon tejidos de cinco a 10 plántulas para
cada muestra, y se analizaron de tres a seis muestras para cada punto de datos . 
(b) Peso de la hoja y concentración de IAA en la punta, base y pecíolo de las hojas de plántulas
de Arabidopsis de 10 días de edad cultivadas bajo LD. Se agruparon los tejidos de cinco
plántulas para cada muestra, y se analizaron cinco muestras para cada punto de datos. FW,
peso fresco; Las barras de error indican desviaciones estándar .  
(c) Concentración de IAA en discos de tejido de 2 mm cortados de una hoja de tabaco de 1,5 cm
de largo. Se tomaron muestras de tejido mesofílico a excepción de los pecíolos, donde las
muestras también contenían tejido vascular. Tinción de GUS de una hoja de tabaco que porta el
constructo CYC1–1 :: GUS .
 

Figura 3. Biosíntesis de IAA en diferentes órganos vegetales extirpados de

plántulas de Arabidopsis de tipo salvaje en desarrollo.
Las plántulas de diez días de edad cultivadas bajo LD se dividieron en hojas 3 y
más pequeñas (cuadrados negros), cotiledones (cuadrados blancos), raíces
(triángulos negros ) y hojas 1 + 2 (triángulos blancos) antes de la incubación en
medios que contienen 30% deuterados. agua. La incorporación de deuterio en 
IAA se midió por GC-HR-MS. Cada muestra contenía material vegetal agrupado
de 10 plántulas. Las muestras se midieron por triplicado y se realizaron
correcciones para el fondo y la abundancia de isótopos naturales. Las barras de
error indican desviaciones estándar .
 
 
 
Los altos niveles de IAA se correlacionan espacialmente con las áreas de hojas de
tabaco que exhiben altas tasas de división celular
Para probar si los niveles altos de IAA se correlacionan con altas tasas de división
celular en las hojas de tabaco se analizaron en vez que las hojas de Arabidopsis,
para evitar tener que diseccionar a cabo partes de hojas muy pequeñas, y que nos
permita separar áreas de la división celular y la expansión de células en las hojas
individuales. Basado en los tinción patrones de hojas que llevan células de ciclo
marcadores fusionados a GUS (CYC1-1 :: GUS y CDC2-6 :: GUS), que eran
capaces de seleccionar lea ves para IAA análisis que estaban en transición de la
división para el crecimiento de elongación, con la división celular intensa que
ocurre en el centro y la base de la hoja de cuchilla (Figura 2c). A partir de estas
hojas, tomamos muestras de discos de 2 mm de tejido mesofílico, lo que permite
un análisis de alta resolución de los niveles de IAA. Observamos que las partes
central y basal de las hojas de tabaco de 1.5 cm de largo contenían altos niveles
de IAA (Figura 2c) en comparación con la punta y los márgenes de la lámina de la
hoja. Los niveles más altos de IAA se encontraron en el pecíolo, lo que respalda
nuestras observaciones anteriores en Arabidopsis (Figura 2b). Nuestros resultados
muestran que altos niveles de IAA en el mesófilo están estrictamente
correlacionados con zonas con división celular intensa . En las hojas de tabaco de
este tamaño específico , la tasa de crecimiento relativo de las diferentes secciones
transversales de la hoja es constante (Poethig y Sussex, 1985), lo que indica que
la expansión celular es más o menos uniforme en toda la lámina de la hoja.
Durante la fase de crecimiento rápido que sigue, célula expansión progresa
basipetalmente, comenzando en t que la punta de la hoja. Más adelante en el
desarrollo, la tasa de crecimiento relativo de la base de la hoja se vuelve más alta
que cerca de la punta, por lo que la parte basal de la hoja se expande más
rápidamente, formando así la forma característica de la hoja de tabaco. Es nota-
digno de que los niveles muy altos de IAA que se observan muy temprano en el
desarrollo de hojas, tanto en Arabidopsis y tabaco están temporalmente
correlacionados con la aparición de diferenciación vascular en las hojas en
desarrollo, así como con etapas de desarrollo de la hoja en las cuales las tasas de
división celular son altas.
 
Las hojas más jóvenes tienen la mayor capacidad de biosíntesis para IAA¸, pero
todas las partes de una plántula joven de Arabidopsis pueden sintetizar IAA¸
No son varias indicaciones de que las plántulas de diferentes plantas especies
dependen en almacenados formas de IAA conjugados como las principales
fuentes de IAA libre durante los primeros días de ación germin-, y que la síntesis
de novo se inicia más tarde durante el crecimiento de plántulas (Bialek et al. ,
1992; Epstein et al., 1980; Ljung et al., 2001). Considerable progreso ha sido
realizado en los últimos años hacia el aumento de nuestra comprensión de la
biosíntesis de IAA (Bandurski et al, 1995;. Bartel, 1997; Normanly et al, 1993;.
Ouyang et al., 2000). Existe evidencia, por ejemplo, de la existencia de al menos
dos vías biosintéticas diferentes de síntesis de IAA (las vías 'dependiente de
triptófano' y 'no dependiente de triptófano'), que se cree que están reguladas por el
desarrollo (Ljung et al., 2001 ; Michalczuk et al., 1992; Normanly et al., 1993;
Sitbon et al. , 2000). Sin embargo, nuestra comprensión de las rutas específicas
todavía no es lo suficientemente precisa como para permitirnos monitorear los
flujos biosintéticos totales en todas las rutas simultáneamente. Una forma
alternativa de monitorear la biosíntesis es usar óxido de deuterio. Esto tiene varias
ventajas: se absorbe fácilmente en la planta, ingresa a todos los compartimentos
celulares y tiene poco efecto sobre el crecimiento cuando se usa en
concentraciones inferiores al 40% (Mitra et al., 1976). También es una etiqueta en
general, permitiendo que todos biosíntesis de IAA a ser monitor de ed,
independientemente de las vía (s) siendo usado por la planta durante el estudio
(Jensen y Bandurski, 1996; Pengelly y Bandurski, 1983). Al mantener los tiempos
de incubación con agua deuterada relativamente cortos y al evitar altas
temperaturas y condiciones extremas de alcalinidad o acidez durante la extracción
y purificación, el riesgo de incorporación de deuterio en la molécula IAA a través
de reacciones de intercambio no específicas se reduce considerablemente
(Cooney y Nonhebel, 1991). Alkali tratamiento para eliminar deuterio de Exch
angeable posiciones en el IAA molécula se ha utilizado para controlar
específicamente de incorporación de deuterio a través de novo síntesis de IAA,
como contraposición a incorporación de deuterio a través de cambio no específica
reacciones ciones en precursores de IAA tales como ésteres de IAA y trypto - phan
(Pengelly y Bandurski, 1983). En un estudio en el que se cultivaron plántulas de
maíz durante varios días en agua deuterada al 30% , el tratamiento con álcali de
las muestras de IAA antes del análisis no mostró incorporación de deuterio en la
molécula de IAA que pudiera ser de origen no enzimático (Jensen y Bandurski,
1996 ) Al omitir el procedimiento de tratamiento con álcali que es posible medir el
tamaño de la piscina de libre IAA en el mismo tiempo como la medición de
incorporación de deuterio i nto la molécula de IAA. Esto es importante cuando solo
pequeñas cantidades de tejido están disponibles para el análisis.

Figura 4. Biosíntesis de IAA en plántulas de Arabidopsis de tipo salvaje en

desarrollo intacto. La síntesis de novo de IAA se midió en las hojas 1 + 2 (a), las
hojas 3 y más pequeñas (b), los cotiledones (c) y las raíces (d) de plántulas de 10
días cultivadas bajo LD. Las plantas se incubaron con medios que contenían 30%
de agua deuterada con (cuadrados blancos) o sin (cuadrados negros) NPA. La
incorporación de deuterio en IAA se midió por GC-HR-MS. Cada muestra contenía
material vegetal agrupado de 10 plántulas. Las muestras se midieron por triplicado
y se realizaron correcciones para el fondo y la abundancia de isótopos naturales.
Las barras de error indican desviaciones estándar.

En esta investigación hemos demostrado que los altos niveles de IAA están
correlacionados con altas tasas de división celular en las hojas en desarrollo. Las
hojas jóvenes se creen para ser la principal fuente de IAA, pero sin investigación a
fondo aún no se ha realizado en cualquier plan de especies T hasta la fecha
dilucidado si IAA se puede sintetizar en otros órganos o otras etapas de desarrollo.
Por tanto, decidimos identificar los sitios de la biosíntesis de IAA por la
alimentación de los órganos diseccionados de plántulas de Arabidopsis con un
30% deuterado agua, y el de noviembre o síntesis de IAA fue entonces medido por
análisis de espectrometría de masas isotopomer. La incorporación de deuterio se
midió después de 12 y 24 h de incubación de plántulas de 10 días y los resultados,
que se muestran en la Figura 3, indican que todas las partes analizadas de las
plántulas son capaces de sintetizar esta hormona. Para evitar posibles
interferencias de IAA transporte entre los diferentes órganos de la planta las 
plantas  fueron disecados, antes de la alimentación de deuterio experimento, en
hojas que eran principalmente sometido expan- sión gr owth (hojas 1 + 2, las
primeras hojas verdaderas, aproximadamente 10 mm de longitud), hojas jóvenes
en desarrollo con altas tasas de división celular así como de expansión (hojas de 3
y más pequeñas, de menos de 4 mm de longitud, incluyendo todos los primordios
de las hojas y el tallo del apéndice merilo ), los cotiledones y el sistema radicular.
La mayor capacidad de síntesis relativa se observó en las hojas jóvenes en
desarrollo, pero los cotiledones también fueron capaces de sintetizar IAA a una
velocidad alta. Se detectaron tasas más bajas pero aún significativas de
biosíntesis de IAA en las hojas en expansión y en el sistema de raíces.

NPA disminuye el contenido de IAA en tejidos específicos specific probablemente

por inhibición de retroalimentación de la biosíntesis de IAA
Las plantas se diseccionaron en diferentes partes antes de la alimentación de
deuterio para evitar el transporte vascular normal de IAA, sin embargo, esto
también puede causar efectos relacionados con la herida que podrían alterar la
biosíntesis de IAA. Por lo tanto, realizamos una segunda serie de experimentos de
alimentación con plantas intactas para comparar sus respuestas con las de partes
de plantas extirpadas. En estos experimentos se incluyeron un conjunto de
ensayos en los que 40 μ M se añadió NPA para el medio, para bloquear el
transporte IAA polar y por lo tanto trampa IAA en el tejido donde se había
sintetizado (Figura 4 ). Para las hojas jóvenes, la adición de NPA no  causa
cambios significativos en las tasas de biosintéticas IAA com- recortaron a plantas
intactas (Figura 4b), pero con relación a las hojas jóvenes extirpados la cantidad
de IAA incorporación detectaron fue menor. Con base en este resultado , es
tentador especular que existe una ruta de transporte no polar que es más
importante que la ruta de transporte polar para la exportación de IAA desde estas
pequeñas hojas. La escisión reduce la cantidad de IAA recién sintetizado
detectado en la raíz en comparación con las plantas intactas, pero es importante 
tener en  cuenta que el sistema de raíz en esta etapa de desarrollo es capaz de
sintetizar su propio IAA. La disminución en   la cantidad de IAA recién sintetizado
detectado en la raíz después de la escisión puede explicarse ya sea por una
disminución general en el metabolismo debido a la falta de asimilados
transportados desde el brote al sistema radicular, o por la pérdida del transporte
polar de IAA.
 
Figura 5. Niveles de IAA en hojas en expansión de plántulas de Arabidopsis de
tipo salvaje tratadas con NPA, que muestran la inhibición de la biosíntesis de IAA
por feedba ck.
Las plántulas de Arabidopsis de tipo salvaje de diez días de edad se incubaron
durante 2–24 h en medio líquido con (cuadrados blancos) o sin (cuadrados
negros) 40 µ M de NPA. Las hojas 1 + 2 de cinco plántulas se agruparon para
cada muestra, y se analizaron tres muestras para cada punto de datos. FW, peso
fresco; Las barras de error indican desviaciones estándar.
 
 
 
 
El tratamiento con NPA causó solo una disminución menor en la biosíntesis de IAA
observada (Figura 4d), de nuevo apoyando la hipótesis de  que  podría haber un
mecanismo independiente de NPA que transporta IAA desde el derribo hasta la
raíz. Un análisis similar de las hojas expansivas y los cotiledones de plantas
intactas reveló que hubo una disminución en las tasas de biosíntesis de IAA en
estos órganos después del tratamiento con NPA (Figura 4a, c). Nuestro hallazgo
de que el tratamiento con NPA reduce la biosíntesis de IAA en estos tejidos es una
observación novedosa, ya que se espera que NPA bloquee el transporte polar de
IAA recién sintetizado fuera de estos supuestos tejidos fuente, lo que conduce a la
acumulación en lugar de agotamiento. Una posible explicación para estos
resultados es que el tratamiento con NPA crea un aumento inicial en la
concentración de IAA que induce la inhibición por retroalimentación de la
biosíntesis de IAA , y que esto conduce a  niveles más bajos de IAA en las hojas.
Con el fin de probar esta hipótesis se realizó una serie de experimentos con
plantas de semillero 10 días de edad, que fueron incubó durante 2-24 h en medios
líquidos que contienen 40 μ M NPA, y a continuación, monitorizamos el contenido
de IAA en tanto ING joven y expand- deja para la duración del experimento.
Inicialmente, después de la adición de NPA, se detectó un aumento en el
contenido de IAA en las hojas en expansión (hojas 1 + 2) que alcanzaron su punto
máximo después de 16 h (Figura 5). A partir de entonces, los niveles cayeron
dramáticamente, lo que también indica la existencia  de un mecanismo de
inhibición de retroalimentación. Este tipo de regulación no se observó en las hojas
jóvenes (hojas 3 + 4), donde los niveles fueron constantes durante la duración del
experimento (datos no mostrados), lo que indica que en las hojas jóvenes NPA no
bloquea el transporte de IAA fuera del tejido. Esto no excluye la posibilidad de que
el tratamiento con NPA también pueda activar mecanismos para la degradación y
conjugación de IAA que, junto con la inhibición por retroalimentación de la
biosíntesis de IAA, reducen el IAA nivel en estos tejidos, manteniendo la
concentración de IAA a un nivel óptimo para el crecimiento y el desarrollo.

Figura ð. Tamaños totales de agrupaciones IAA en diferentes partes de un tipo

salvaje de 10 días de antigüedad
Plántulas de Arabidopsis cultivadas bajo LD.
Los círculos muestran los tamaños absolutos de la agrupación de IAA en
diferentes órganos de la plántula. Partes negras de los círculos muestran la
cantidad de IAA que tenía ser en sintetizados de novo en diferentes tejidos
después de 24 h de incubación en 30% de agua deuterada y 40 μ M NPA.
 

 Las relaciones entre los grupos IAA en diferentes órganos de plantas.

El análisis de la capacidad de síntesis relativa no revelará por completo la

importancia de un determinado tejido como fuente de IAA sobre una base de
plántulas completas, ya que el tamaño de los diferentes órganos difiere
enormemente . En la Figura 6, los tamaños absolutos de las piscinas de IAA en
diferentes partes de una plántula de 10 días se presentan en relación con las
cantidades de IAA recién sintetizado detectadas después de un período de
incubación de 24 h con NPA y 30% de agua deuterada. El grupo más grande de
IAA se encuentra en el sistema raíz (38%) y las hojas en expansión (33%). Sin
embargo, debido a su pequeño tamaño, las hojas más pequeñas contienen solo
una parte menor del conjunto    total, a pesar de que la capacidad de síntesis y el
contenido de IAA por unidad de masa en estas hojas es muy alta. Los datos
presentados en la Figura 6 describen los tamaños absolutos de la agrupación de
IAA y el tiempo que le lleva a  la planta reemplazar toda la agrupación en los
órganos específicos con IAA recién sintetizado. Para evaluar la importancia de los
grupos individuales a nivel de toda la planta, también deben  tenerse en cuenta los
flujos de transporte hacia y desde diferentes tejidos, incluso el primer día después
de la transición a NPA (Figura 7b), y permaneció más bajo en las plantas tratadas
con NPA durante la duración del experimento. La rápida reducción de IAA piscina
tamaño observó después de apenas 24 h de NPA tratamiento fue reflejado por una
igualmente rápida decreas e en la hoja de expansión (Figura 7a).

 
Figura 7. Efectos de la inhibición por retroalimentación inducida por el tratamiento
con NPA sobre la expansión foliar y los niveles de IAA en la expansión de las
hojas de Arabidopsis.
Longitud de la hoja (a) y la concentración de IAA (b) se investigó en las plantas
cultivadas primero durante 10 días bajo LD en agar sin NPA, y luego durante 1-5
días en agar que contiene 100 μ M NPA O . Las plantas de control cultivadas sin
NPA se analizaron de la misma manera ●. FW, peso fresco; Las barras de error
indican la desviación estándar .
 
  
Las reducciones en los niveles de IAA debido a la inhibición por retroalimentación
de la biosíntesis de IAA reducen la expansión de la hoja
Nuestro siguiente conjunto de experimentos fue diseñado para evaluar si la
correlación entre el contenido de IAA y el tamaño de la hoja refleja no solo que una
hoja de cierto tamaño tiene una capacidad específica para sintetizar esta
hormona, sino también que IAA es un factor importante en el control general de
crecimiento de la hoja Para esto, nos las arreglamos utilizamos de nuestra
reciente hallazgo de que NPA tratamiento reduce los niveles de IAA en la
expansión de las hojas cuando se induce la inhibición por retroalimentación de la
biosíntesis de IAA. Hemos llevado a cabo una serie de experimentos en los que 10
días de edad, las plantas de semillero cultivadas en suave agar se transfieren a y
se incubaron hasta a 5 días en agar que contiene 100 μ M NPA. Tanto los niveles
de IAA en las hojas como el tamaño de las hojas se midieron diariamente (Figura
7). Como se esperaba de nuestros hallazgos anteriores , el contenido de IAA en
las hojas en expansión cayó significativamente

El aumento del contenido de IAA en los mutantes sur1 y sur2 también reduce la
expansión de la hoja
En un experimento complementario, investigamos si la regulación al alza del grupo
IAA en las hojas en expansión tenía el mismo efecto perjudicial sobre el
crecimiento de la expansión que la disminución del tamaño del grupo en el
experimento anterior. Para este propósito, utilizamos plántulas de los mutantes
superroot1 (sur1) y superroot2 (sur2), que ya habían  demostrado que
aumentaban los niveles de IAA. Los mutantes sur1 muestran un gran aumento en
el contenido de IAA libre y conjugado temprano en el desarrollo (Boerjan et al.,
1995), mientras que los mutantes sur2 muestran un aumento temprano similar de
IAA en todas las partes de la plántula, pero vuelven a ser silvestres. fenotipo tipo
12-15 DAG (Barlier et al., 2000). Ambos mutantes muestran rasgos fenotípicos
típicos para la sobreproducción de auxinas tales como alargadas hipocotilos,
pequeñas y epinastic Dons cotyle- y un mayor número de raíces laterales. El
fenotipo del mutante doble sur1 sur2 es adicional . Analizamos los niveles de IAA,
así como las tasas de expansión relativas de las hojas en desarrollo de las
plántulas sur1 y sur2 (Figura 8). En comparación con el tipo salvaje, las primeras
hojas en expansión de sur1 y sur2 tienen niveles significativamente más altos de
esta hormona, que se correlacionan estrechamente con las reducciones en las
tasas relativas de expansión de la hoja . Nuestro análisis muestra que el nivel
extremadamente alto de IAA en las primeras hojas de sur1 se correlaciona con
una reducción dramática en la expansión de la hoja, mientras que el aumento más
moderado en las primeras hojas de sur2 se acompaña de una reducción
intermedia de la expansión. Curiosamente, el segundo par de hojas de sur2 vuelve
a los niveles normales de IAA y también tiene una tasa de expansión foliar casi
normal. Estos resultados, en combinación con los presentados anteriormente,
demuestran que cualquier alteración en el tamaño óptimo de la piscina de IAA
durante la fase de expansión tiene efectos perjudiciales sobre la tasa de expansión
de la hoja. Por lo tanto, hay buenas razones para creer que el grupo de IAA en la
hoja está bajo un estricto control homeostático.
 
 
Discusión
Nosotros hemos utilizado avanzado masa espectrometría de analizar la
distribución de IAA en plántulas de Arabidopsis de ación germin- y durante todo el
período de crecimiento vegetativo. Hemos observado que las hojas jóvenes que se
dividen activamente contienen las concentraciones más altas de IAA, y que los
niveles hormonales caen dramáticamente a medida que las hojas se expanden.
 

Figura 8. Expansión foliar y niveles de IAA en hojas jóvenes de los mutantes

superproductores de auxina s ur1 y sur2 en comparación con el tipo salvaje.
Concentración de IAA en hojas en desarrollo de plántulas homocigotas sur1 y
sur2. La línea de regresión con intervalos de confianza del 99% se calculó a partir
de datos de tipo salvaje (ver Figura 1e). FW, peso fresco. Las tasas relativas de
extensión de la hoja se calcularon como porcentaje de la longitud final de la hoja.

Estas observaciones se aplican a plantas de diferentes edades y parecen ser

independientes del fotoperíodo.
Nos hemos también investigado la de novo síntesis de IAA en diferentes partes de
las plantas de semillero de Arabidopsis jóvenes, y aunque las hojas más jóvenes
tienen la mayor capacidad de síntesis, todas las partes de una planta de
Arabidopsis joven podemos sintetizar AIA. Hemos demostrado, por ejemplo, que
las raíces de plantas jóvenes de Arabidopsis son capaces de sintetizar su propio
IAA, y que el conjunto de IAA en el sistema de raíces comprende una gran
proporción del IAA total en la planta. Los experimentos con raíces extirpadas
demuestran que este grupo localizado en la raíz no se deriva de la auxina
transportada desde los tejidos de origen en la parte aérea de la planta. Sin
embargo, todavía no está claro cuando la síntesis IAA se inició en la raíz, y lo
específico de los tejidos de la raíz del sistema tiene la capacidad de syn thesize
IAA.
Los niveles de IAA son siempre mucho más bajos y constantes en los cotiledones
que en las hojas verdaderas . Los cotiledones se forman en el embrión, antes de
la germinación, y sirven como órganos de almacenamiento de nutrientes para las
plántulas en crecimiento. La vascular tejido es l ess altamente desarrollado en
cotiledones que en las hojas verdaderas, y son probablemente importantes para la
planta principalmente durante las primeras etapas de crecimiento de las plántulas.
Sin embargo, los cotiledones no tienen una relativamente alta capacidad de IAA
síntesis, y que es , por tanto, es posible que ellos pueden servir como un
importante IAA fuente durante las primeras etapas de desarrollo o bajo
circunstancias en las otras IAA fuentes tales como las hojas no se están
desarrollando normalmente.
Nosotros también utilizamos NPA a la trampa de IAA en las plantas órganos donde
se fue sintetizada. Esto tuvo efectos dramáticos en los niveles de IAA , así como
en la expansión de la hoja. Cuando las plantas de 10 días de edad se incubaron
con NPA durante 2–24 h, observamos por primera vez un aumento de más del
doble en el contenido de IAA en las hojas en expansión, seguido de una fuerte
disminución, lo que demuestra la existencia de inhibición por retroalimentación de
la biosíntesis de IAA. Este mecanismo de regulación no se observó en las hojas
más jóvenes, lo que indica que las hojas deben llegar a una etapa específica del
desarrollo antes de que el mecanismo de retroalimentación se convirtió en. El gen
eral opinión en la literatura es que el tratamiento NPA provoca una acumulación de
IAA en todos los tejidos de origen (Berleth y Mattsson 2000). Nosotros hemos
demostrado que este no es el caso, al menos no en la expansión de las hojas y
cotiledones. Esto hace que no excluye la posibilidad de que no puede haber
acumulación local de IAA en partes específicas de los órganos que poseen un
mecanismo de retroalimentación inhibición. Se está bien documentado que las
plantas cultivadas en las concentraciones altas de NPA por períodos largos
muestran grandes cambios en VAS de modelado cular, con cerca de formación de
tejido vascular a la hoja de margen (Mattsson et al., 1999). Esta observación es
consistente con nuestros hallazgos, ya que las alteraciones vasculares
observadas por Mattsson et al. fueron inducidos en hojas de un tamaño que no
mostró inhibición de retroalimentación en nuestros experimentos.
El tratamiento con NPA durante 1 a 7 días causó que los niveles de IAA en las
hojas cayeran y la expansión de la hoja cesara. Curiosamente, los mutantes sur1 y
sur2 que sobreproducen las auxinas, que contienen cantidades más altas de IAA
libre que los de tipo salvaje en las primeras etapas del desarrollo, también tuvieron
tasas reducidas de expansión de la hoja. Estos experimentos muestran
claramente que la expansión normal de la hoja depende de las concentraciones
óptimas de IAA. Nuestros experimentos también muestran claramente que las
necesidades de las plantas para mantener un control estricto sobre la piscina IAA
en las hojas no sólo para el crecimiento óptimo de expansión, sino también para
asegurar que puedan cumplir su papel como fuentes IAA importantes para el resto
de la planta.
En este estudio nos hemos mostrado que todas las partes de la planta de
semillero pueden sintetizar AIA, y aun si las hojas , probablemente, son las fuentes
importantes, la mayoría de la naturaleza dinámica de la auxina

La biosíntesis y los mecanismos reguladores específicos del tejido indican que el

suministro de IAA a las diferentes zonas de crecimiento de las plántulas es mucho
más complejo de lo que se pensaba anteriormente. La existencia de mecanismos t
control de sombrero de la piscina tamaño de IAA en una específica de tejido
manera también medios que los marcadores moleculares para los contenidos de
auxina deben utilizarse con precaución, ya que tales marcadores sólo pueden
detectar grandes diferencias en la concentración, y en muchos casos muestran
tejido- sensibilidad específica para auxina.
 
 
Procedimientos experimentales
 
Productos químicos y sustratos marcados isotópicamente
[ 13 C 6 ] IAA y óxido de deuterio al 70% fueron de Cambridge Isotope Laboratories
(Andover, MA, EE. UU.). El medio Murashige-Skoog (medio MS) y la sal de
clohexilamonio X-GlcA-cy (X-Gluc) eran de Duchefa (Haarlem, Países Bajos), y
todos los demás productos químicos eran de Sigma (St Louis, MO, EE. UU.) Si no
se indica de otra manera.
 
 
Material vegetal y condiciones de crecimiento.

Las semillas de Arabidopsis thaliana de tipo salvaje ecotipo Columbia, y los

mutantes sur1-3 y sur2-1 se trataron en frío (4 ° C) durante 3-4 días antes de
sembrar en el suelo (Simontorp Blomjord, Svalo¨ f Weibull Torv AB, Suecia ) o en
placas de agar, para romper la latencia y sincronizar la germinación. Las semillas
cultivadas en placas de agar se esterilizaron primero. Las plantas se colocaron en
cámaras de crecimiento bajo luces fluorescentes blancas frías a una temperatura
de 22 ± 2 ° C y una humedad relativa del aire de aproximadamente 50%. La
intensidad de la luz fue de 70-120 µ mol m –2 s –1   y los ciclos de luz  fueron de 9 h
de luz: 15 h de oscuridad (día corto, SD) y 18 h de luz: 6 h de oscuridad (día largo,
LD). Las plántulas germinadas en el suelo se replantaron después de 1–2
semanas en bandejas de plástico de 7 cm × 7 cm utilizando el mismo suelo, donde
podrían continuar creciendo hasta la cosecha. Las semillas de Nicotiana tabacum
de tipo salvaje (SR1) y las líneas CYC1–1 :: GUS y CDC2–6 :: GUS se cultivaron
en condiciones estándar de invernadero.
 
 
Recolección de material vegetal.

Se seleccionaron plántulas homocigóticas para sur1-3 para IAA y medidas de

expansión foliar. Las plantas se diseccionaron bajo un estereomicroscopio Stemi
SV 11 equipado con una cámara MC 80 DX (Carl Zeiss Jena GmbH, Jena,
Alemania) usando un par de pinzas suaves y un bisturí. El tejido de la planta se
transfirió inmediatamente a tubos Eppendorf previamente pesados, los tubos se
volvieron a pesar, se sumergieron en nitrógeno líquido y se almacenaron a –80 °
C. La balanza utilizada fue un modelo analítico AT 20 de 6 dígitos (Mettler-Toledo
GmbH , Greifensee, Suiza) y se tomaron precauciones para evitar errores en el
pesaje causados por la evaporación del material vegetal o por la electricidad
estática . Para partes de plantas muy pequeñas , se reunió material de varias
plantas para que el peso de la muestra final nunca fuera inferior a 0.1 mg. Esto se
hizo para minimizar el efecto del error de pesaje en la estimación del peso de la
muestra y para obtener suficiente material vegetal para las mediciones de IAA. La
longitud y el ancho de las hojas de las plántulas de Arabidopsis cultivadas en el
suelo y en placas de agar también se midieron bajo la capa de estereomicros . A
las hojas diseccionadas y / o medidas se les asignó un número comenzando con
las primeras hojas verdaderas (hojas 1 y 2) y las hojas más jóvenes recibieron
entonces el número 3 y más alto, siguiendo la filotaxis de la planta. Las hojas de
plantas de tabaco de 8 a 10 semanas de edad en la fase de crecimiento vegetativo
se recogieron para análisis de IAA y se tiñeron con X-Gluc (Van Lijsebettens y
Clarke, 1998). Se cortaron discos de hojas, de 2 mm de diámetro, de puntos que
representaban el área completa de hojas de 1,5 cm de largo, pesadas y
congeladas en nitrógeno líquido.
 
 
Análisis de contenido endógeno de IAA

Para las mediciones de IAA, las muestras se extrajeron, purificaron y analizaron

por cromatografía de gases, monitoreo de reacción seleccionado, espectrometría
de masas (GC-SRM-MS) como se describió previamente (Edlund et al., 1995). El
cálculo de los factores de dilución isotópica se basó en la adición de 50 pg [ 13 C 6 ]
IAA / mg de tejido.
 
 
Experimentos de alimentación de deuterio

Las plántulas de Arabidopsis se cultivaron en placas de Petri que contenían agar

blando (1 × medio MS, 1% de sacarosa, 0,5% agar, pH 5,7) en LD durante 10
días, y luego se transfirieron a medio de cultivo líquido (1 × medio MS, 1 % de
sacarosa, pH 5.7) con o sin 40 µ M de NPA e incubado durante 4 h. A
continuación, se transfirieron a medio con o sin 30% de agua deuterada y 40 μ M
NPA, y se incubaron con agitación suave bajo luz constante de 12 y 24 h.
Después de la incubación, las plantas se diseccionaron en las primeras hojas
verdaderas en expansión (hojas 1 + 2, de aproximadamente 10 mm de longitud),
hojas jóvenes (hojas 3 y más pequeñas, de menos de 4 mm de longitud, incluidos
todos los primordios de las hojas y el meristemo apical del brote ), cotiledones y el
sistema radicular. También se realizaron experimentos en plántulas que se habían
diseccionado de la misma manera antes de la incubación en medios de cultivo
líquidos (1 x medio MS, 1% de sacarosa , pH 5,7) con o sin agua deuterada al
30% durante 12 y 24 h. Las diferentes partes de la planta se pesaron y congelaron
en nitrógeno líquido. La extracción y purificación se llevaron a cabo como se
describe en otro lugar (Edlund et al., 1995) con la adición de un paso de
purificación adicional antes del análisis por GC-High Resolution (HR) -MS; a saber,
después de la purificación en XAD-7, las muestras se metilaron y purificaron en
columnas C18 SPE de 50 mg (Bond Elut, Varian, Harbor City, CA, EE. UU.). El
cálculo de la dilución isotópica se basó en la adición de 50 pg [ 13 C 6 ] IAA / mg de
tejido. El análisis por GC-HR-MS se realizó a una resolución de al menos 10 000,
y los isotopómeros del pico base de IAA metilado y trimetilsililado se midieron con
relaciones m / z de 202.105, 203.112, 204.118, 205.124 y
208.125. Se incorporaron correcciones por la contribución de
abundancias isotópicas naturales hasta m / z 203–205. La incorporación a
continuación se calculó de deuterio en la molécula de IAA, y correcciones de fondo
se realizaron mediante el análisis de muestras de plantas de control cultivadas sin
deuterado agua.
 
 
Tratamiento NPA
Experimentos de incubación de veinticuatro horas. Las semillas de Arabidopsis de
tipo salvaje se colocaron en placas de agar blando (1 x medio MS, sacarosa al 1%
, agar al 0,5% , pH 5,7) y las plántulas se cultivaron en condiciones LD como se
describió previamente durante 10 días. Plantas de semillero intactas se
transfirieron entonces a medios de comunicación de líquido (1 × medio MS,
sacarosa al 1%, pH 5,7) con o sin 40 μ M NPA. Las hojas 1 + 2 (las primeras hojas
verdaderas) y las hojas 3 + 4 fueron cosechadas para mediciones IAA después de
2–24 h de incubación en condiciones de luz constante .

Experimentos de incubación de cinco días. De tipo salvaje plántulas fueron

cultivadas bajo LD en placas de agar blando (1 × medio MS, 2% de sacarosa,
0,5% de agar, pH 5,7), cubierto con una red para evitar la antena partes que viene
en c ontacto con el agar. Cuando las plántulas tenían 10 días de edad se
transfirieron, junto con la red, a nuevas placas con o sin 100 μ M NPA, y se
mantuvieron en crecimiento en este medio para 1-5 días. Hojas 3 + 4 y hojas 5 + 6
fueron cosechadas para IAA mediciones cada día, y en el mismo momento en que
se las longitudes y anchuras de las hojas miden.
 
 
Agradecimientos
Nos damos gracias pistola L o ¨ fdahl un n d Roger Gr un nbom de un crack
tecnología n ica asistencia. Nosotros también gracias Dr. Dirk Inze' de los
transgénicos líneas de tabaco que albergan la CYC1 :: GUS y CDC2 :: GUS
construcciones. Los SUR1 y SUR2 semillas fueron amables dones de Dr. Catalina
Bellini, y también gracias a ella por valiosos comentarios sobre el manuscrito. Este
trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación de Suecia y la Fundación
para la Investigación Estratégica.