4.

MATERIALES Y METODOS
 
4.1. POBLACIÓN MUESTRAL:

En la experiencia se utilizaron ratas (Rattus norvegicus) juveniles hembras. Se utilizaron 78 ratas

(Rattus norvegicus) de 238 ± 50 gr, de peso. Los animales fueron obtenidos en el biotério de la
Universidad del Norte (Barranquilla - Atlántico); pesadas en una balanza de tres brazos con canasta.
Los animales fueron divididos en 12 cajas plásticas de 3 individuos cada una para no causar estrés
debido al cautiverio, y se les acondicionó con cascarilla de arroz, una malla de asbesto y agua potable
con una temperatura de 24ºC, esto con el fin de que el factor ambiental no interfiriera con los
resultados. (Ver anexo 1). Cada lote corresponde a los diferentes tiempos de exposición al veneno (1
hora, 48 horas, 96 horas, 144 horas y 12 días, respectivamente) y un lote adicional al grupo control. Las
ratas restantes se utilizaron en un preensayo para la determinación de la dosis toxica.

4.2. VENENO Y DOSIS UTILIZADA:

Para el presente estudio se trabajó con veneno liofilizado, obtenido de ejemplares adultos de Bothrops
asper originaria de la Costa Atlántica provenientes de un zoocriadero comercial. De este veneno se
realizó una solución madre de 0.25g en 100ml de solución salina comercial. Para la determinación de la
dosis utilizada, se tomo un grupo de ratas de laboratorio de aproximadamente 23 individuos, a los
cuales se le aplico el procedimiento de Screening de Smith. Esta consistía en la administración en
grupos de 3 animales de varias dosis que partió de la menor concentración del rango de una DL50,
reportada por De Roodt et al. (2004), en veneno de Bothrops asper originaria del Serpentario Nauyaca
de Cuernavaca (México), de 2,5 ± 0.4 µg/g de peso del animal. La aplicación del veneno fue vía i.m. en
el gastronemio y las dosis tratadas fueron 2,1; 1,9; 1,7; 1,5 y 1,3 µg/g de peso del animal.

Todos los lotes sobrevivieron a las dosis aplicadas sin presentar anomalías físicas observables al ojo
desnudo en las ratas, escogiéndose la dosis de 2,1 µg/g de peso del animal, para la realización del
trabajo.

4.3 DISEÑO EXPERIMENTAL:

La dosis baja fue inyectada por vía i.m. en la extremidad posterior a cinco grupos de 6 animales (ratas)
cada uno, al grupo control no se le aplicó veneno. La inoculación del veneno se hizo en horas
sucesivas el mismo día (10 minutos por lote). Cada uno de los grupos se marcó asignándole un número
para su reconocimiento y observó durante 1, 48, 96, 144 horas y 12 días de exposición al veneno. A
cada uno de los lotes se les fue suministrando alimento regularmente (nutrecam y conejina), cambio de
cascarilla y agua potable. Se sacrificó cada lote después de las observaciones hechas en las
respectivas horas mencionadas, seguido de esto se procedió a la extracción de los corazones
respectivos.

4.3.1. SACRIFICIOS:

Las ratas (Rattus norvegicus) fueron sacrificadas por dislocación cervical a diferentes tiempos después
de la inoculación del veneno de Bothrops asper.

El primer sacrificio se realizo al Lote numero 1, transcurrida una hora, luego el Lote numero 2 a las 48
horas, el Lote numero 3 a las 96 horas, el Lote numero 4 a las 144 horas y el Lote numero 5 a los 12
días. Después de la dislocación cervical se realizó una disección ventral; localizando el corazón para
ser fijado en formalina tamponada a pH 7.2.

4.4. HISTOPATOLOGIA:

Después de la extracción de los corazones por lote se realizó el proceso de fijación en formalina
tamponada a pH 7 por 24 – 48 horas y con formalina alcohólica en igual tiempo, luego las muestras se
deshidrataron con alcohol Isopropílico (85%, 90%, 95%, 100%) por 45 minutos. Se impregnaron en
parafina (58-60 ºC) por tres horas. Se hizo la inclusión en parafina y una vez que solidificó se realizó los
cortes en un micrótomo marca Leitz de 4-8 µ (micras).

Los cortes realizados se recogieron en un baño de flotación con gelatina a menos de 60ºC y se fijaron a
portaobjetos. Luego los tejidos fueron coloreados con hematoxilina – eosina evidenciando las fibras de
color rosado a rojo y los núcleos centrales morados. Además de las estructuras del tejido a estudiar se
realizó la tinción tricrómica de Mallory como complemento para la observación de tejido conjuntivo en
las fibras cardiacas, apareciendo las fibras de colágeno en azul, fibras musculares aparecen en rojo y
las fibrillas de elastina en naranja.

Las alteraciones histológicas de los cortes se observaron por medio de microscopios ópticos Leika
Galen III y microscopio Olympus con cámara digital incorporada, con aumentos de 4 a 40x.
4.5. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS:

Por ser el trabajo de tipo descriptivo y no cuantitativo, se aplicó una estadística básica, además, que no
se acomodan a ninguna prueba estadística ya que el diseño del experimento no planteó más de un
tratamiento ni tampoco posee parámetros que se puedan acomodar a este tipo de estadística.

5. RESULTADOS

5.1. CARACTERISTICAS GENERALES DE LAS RATAS EN EXPERIMENTACIÓN:

Las ratas utilizadas en este trabajo fueron hembras adultas con un peso de 238 ± 50 g de la especie
Rattus norvegicus y todas al momento de su colecta en el biotério tenían buenas condiciones físicas,
muy activas, alta actividad exploratoria, de apariencia saludables y su alimentación normal. Las
excreciones de orina eran constantes y de un olor poco concentrado. En cuanto a las heces eran
compactas y de coloración marrón oscuro. Luego de la aplicación de la dosis del veneno de la Bothrops
asper (2.1μg/g de peso de animal), dejaron de moverse y se aislaron en un rincón de las cajas, pero
sólo en los primeros 20 minutos.

En las próximas horas (24 y 48 horas después de la inoculación), los animales presentaron un
comportamiento diferente en comparación a lo que registraron antes del veneno, ya que en los
individuos tratados con el veneno se observo pequeñas molestias en la extremidad donde se inyectaron
y percibiéndose la presencia de olores más fuertes en la orina de las ratas y la excreción de sus heces
disminuyo.

Pasadas 96 horas, los animales al parecer se encontraban normales y activos, la extremidad donde fue
inoculada no presentaba molestias para apoyarla. La excreción de la orina se percibió más concentrada
y las heces presentaban consistencia pastosa y de color amarillento.
En el periodo de las 144 horas, las ratas se mostraban activas. La orina era aún más concentrada con
olores fuertes y penetrantes. Su actividad exploratoria era más dinámica y comenzaron a alimentarse y
beber agua con más frecuencia.

A medida que transcurría el tiempo hasta llegar a los 12 días los animales inoculados con el veneno
Bothrópico, se observaron con un comportamiento similar al de las ratas del lote control, pero con la
presencia de olores más fuertes en la orina y las heces pastosas todavía se presentaban.

5.2. OBSERVACIONES HISTOPATOLOGICO DEL CORAZÓN CON HEMATOXILINA – EOSINA Y

TINCIÓN TRICROMICO DE MALLORY.

5.2.1. Hematoxilina – Eosina:

La figura 4 corresponde a un corte histológico de corazón de la rata perteneciente al lote numero 1, en

ella se puede observar claramente que hubo en la primera hora después de la inoculación de la dosis
del veneno empleado, una congestión severa en los vasos sanguíneos, pues se evidencia la retención
de sangre taponando en su totalidad al vaso, posiblemente debido al aglutinamiento de eritrocitos. En la
figura numero 5 y 6 que corresponde a la hora de exposición descrita anteriormente se puede
evidenciar focos de congestión con fragmentación de la fibra muscular (figura 5) y procesos de necrosis
de coagulación (figura 6).

1
Figura 4. Corte Histológico de corazón de rata (Rattus norvegicus) después de una hora de la inoculación con 2.1 µg de
veneno de B. asper en el cual se evidencia vasos sanguíneos congestionados (1) HE 4x.

Figura 5. Corte Histológico de corazón de rata (Rattus norvegicus) después de una hora de la inoculación con 2.1 µg de
veneno de B. asper en el cual se evidencia focos de congestión (1) y fragmentación fibrilar (2) HE 4x.

Figura 6. Corte Histológico de corazón de rata (Rattus norvegicus) después de una hora de la inoculación con 2.1 µg de
veneno de B. asper en el cual se evidencia necrosis de coagulación (1) HE 10x.
A las 48 horas de exposición al veneno, la lámina con corte histológico de corazón de la rata del lote
numero 2, podemos observar en la figura 7, que se presento una extensa hemorragia en el endocardio.
La hemorragia aguda se hizo evidente por la forma irregular en que se encuentra las células
sanguíneas en el endocardio, estando éstas fuera del vaso sanguíneo. En las figuras 8 y 9 se muestra
la zona Auricular del corazón en el mismo tiempo de exposición (objetivos con 10 y 20x
respectivamente), observándose las fibras cardiacas de forma irregular y presencia de tejido adiposo,
además de congestión y hemorragias leves.

Figura 7. Corte Histológico de corazón de rata (Rattus norvegicus) después de 48 horas de la inoculación con 2.1 µg de
veneno de B. asper en el cual se evidencia hemorragia en el endocardio (1) HE 4x.
 2

Figura 8. Corte Histológico de corazón de rata (Rattus norvegicus) después de 48 horas de la inoculación con 2.1 µg de
veneno de B. asper en el cual se evidencia mayor presencia de congestión (1) y hemorragia leve (2) HE 10x.

Figura 9. Corte Histológico de corazón de rata (Rattus norvegicus) después de 48 horas de la inoculación con 2.1 µg de
veneno de B. asper en el cual se evidencia necrosis leve (1), congestión (2) y hemorragia leve (3) HE 20x.

La figura 10, corresponde a una lámina de un corte histológico de corazón de una rata perteneciente al
lote número 3, es decir animales que fueron sacrificados 96 horas después de la inoculación de la
respectiva dosis de veneno. Podemos observar frecuentes áreas de congestión y hemorragias aisladas
así como necrosis de coagulación. En la figura 11 se muestra alteraciones del mismo lote pero con un
objetivo de mayor aumento donde se visualizan espacios entre las fibras cardiacas o fragmentación y
zonas de tejido conectivo entre fibras musculares pero en menor grado.

1
4
3 4

Figura 10. Corte Histológico de corazón de rata (Rattus norvegicus) después de 96 horas de la inoculación con 2.1 µg de
veneno de B. asper en el cual se evidencia congestión (1), hemorragia (2), picnosis (3) y necrosis de coagulación (4) HE
20x.

1
3 4
Figura 11. Corte Histológico de corazón de rata (Rattus norvegicus) después de 96 horas de la inoculación con 2.1 µg de
veneno de B. asper en el cual se evidencia congestión (1), hemorragia (2), picnosis nuclear (3) y necrosis de coagulación (4)
HE 20x.

Las figuras 12, 13 y 14, corresponden a laminas de un corte histológico de corazón de ratas
pertenecientes al lote numero 4. En ella podemos observar que la inoculación del veneno después de
144 horas de exposición, las lesiones son más pronunciadas ya que se observa una amplia zona
congestionada, acompañada de necrosis de coagulación en una zona considerable del corazón
perteneciente al miocardio.

2
1

Figura 12. Corte Histológico de corazón de rata (Rattus norvegicus) después de 144 horas de la inoculación con 2.1 µg de
veneno de B. asper en el cual se evidencia congestión (1), hemorragia (2) HE 4x.
 1
2

Figura 13. Corte Histológico de corazón de rata (Rattus norvegicus) después de 144 horas de la inoculación con 2.1 µg de
veneno de B. asper en el cual se evidencia congestión (1), hemorragia (2) y necrosis de coagulación (3) HE 10x.

Figura 14. Corte Histológico de corazón de rata (Rattus norvegicus) después de 144 horas de la inoculación con 2.1 µg de
veneno de B. asper en el cual se evidencia congestión (1), picnosis nuclear (2) y necrosis de coagulación (3) HE 20x.
Los cortes histológicos de corazón pertenecientes a las ratas del lote numero 5, es decir, ejemplares
que fueron sacrificados a los 12 días después de la inoculación de la dosis del veneno mostraron
lesiones más agudas comparados con los otros lotes.

En la figura 15 se observa congestión, picnosis nuclear y necrosis de coagulación.

3 1

Figura 15. Corte Histológico de corazón de rata (Rattus norvegicus) después de 12 días de la inoculación con 2.1 µg de
veneno de B. asper en el cual se evidencia congestión (1), picnosis nuclear (2) y necrosis de coagulación (3) HE 10x.

En la figura 16 y 17 (objetivos 10 y 20x respectivamente) se evidenció con la coloración histológica en

corazón de la rata inflamación del miocardio conocida como miocarditis la cual se evidencia por el
intersticio del miocardio con abundante edema e infiltrado inflamatorio, rico en linfocitos y macrófagos.
Además de las patologías mencionadas en la figura 15 con un mejor registro fotográfico.
 1

Figura 16. Corte Histológico de corazón de rata (Rattus norvegicus) después de 12 días de la inoculación con 2.1 µg de
veneno de B. asper en el cual se evidencia congestión, picnosis nuclear, necrosis de coagulación y miocarditis (1) HE 10x.

Figura 17. Corte Histológico de corazón de rata (Rattus norvegicus) después de 12 días de la inoculación con 2.1 µg de
veneno de B. asper en el cual se evidencia congestión, picnosis nuclear , necrosis de coagulación(1) y miocarditis (2) HE
20x.
5.2.2. TINCIÓN TRICROMICO DE MALLORY

Las observaciones realizadas con hematoxilina – eosina fueron complementadas a través de cortes
histológicos del corazón de ratas en los lotes 2 y 5 con la tinción tricrómico de Mallory, la cual es una
técnica empleada para visualizar presencia de tejido conectivo (colágeno) en el corazón, ya que según
lo observado en las laminas de los lotes mencionados con HE fueron éstos los que presentaron mayor
presencia del tejido en cuestión y patologías cardiacas.

Para el lote numero 2 se observa a través de la lamina de la figura 18, la exposición del veneno
después de 48 horas de la inoculación, se visualiza amplias áreas de color azul que indica la presencia
de colágeno entre las fibras cardiacas y hemorragias leves.

Figura 18. Corte Histológico de corazón de rata (Rattus norvegicus) después de 48 horas de la inoculación con 2.1 µg de
veneno de B. asper en el cual se evidencia presencia de fibras colágenos entre las fibras cardiacas (área azulada) y
hemorragias (1) Mallory 20x.

La técnica de tinción de tricrómico de Mallory evidenció en los cortes histológicos de corazón de rata del
lote número 5, animales que se sacrificaron a los 12 días después de la inoculación del veneno (figura
19), presencia de colágeno entre las fibras cardiacas, con congestión y hemorragia en una amplia zona
del miocardio. La presencia de fibras colágeno entre gran parte de las fibras cardiacas no son
detectadas en los cortes coloreados con Hematoxilina – Eosina, y la evidencia de la misma se debe a la
necrosis de coagulación presentada en los lotes 2, 3, 4 y 5.
 2

Figura 19. Corte Histológico de corazón de rata (Rattus norvegicus) después de 12 días de la inoculación con 2.1 µg de
veneno de B. asper en el cual se evidencia presencia de fibras colágenos entre las fibras cardiacas (área azulada),
congestión (1) y hemorragias (2) Mallory 20x.

5.3 OBSERVACION HISTOLÓGICO DEL CORAZON DE LAS RATAS UTILIZADAS COMO GRUPO
CONTROL:

Para este trabajo se le inyectaron a un grupo de ratas (6) suero fisiológico sin veneno de mapaná,
utilizadas como grupo control, las cuales también fueron sacrificadas y extraído el corazón
correspondiente. Los cortes histológicos y mediante coloración de Hematoxilina – Eosina evidenciaron
que todas las estructuras se encuentran en forma normal, tal como se observa en la lámina
correspondiente a la figura 20, presentando sus fibras cardiacas bien ubicadas con sus estriaciones
bien marcadas (discos intercalares) y sus núcleos centrales bien coloreados.
Figura 20. Corte Histológico de corazón de rata (Rattus norvegicus) sin veneno de Bothrops asper presentando fibras
cardiacas longitudinales con sus núcleos centrales y discos intercalares HE 40x.

5.4 ALTERACIONES HISTOLOGICAS GENERALES OBSERVADAS EN EL CORAZON DE LAS

RATAS EN EXPERIMENTACION:

En la tabla numero 1 se encuentra la matriz general de las alteraciones observadas en el corazón de las
ratas inoculadas con 2.1 µg de veneno de la serpiente B. asper de la Costa Atlántica en los distintos
tiempos de exposición al veneno a través de la técnica de coloración con Hematoxilina – Eosina y
Tinción Tricrómico de Mallory (Ver tabla 1).

En la tabla podemos observar las múltiples alteraciones que se presentaron en los diferentes tiempos
de exposición al veneno y la Tinción de Mallory detecta la presencia de fibras de colágeno por la
necrosis de coagulación que presentó el tejido. También se observa que las alteraciones se fueron
agudizando con el paso del tiempo de haberse inoculado las ratas, hasta observarse Miocarditis en el
corazón de la ratas del lote numero 5, es decir, expuestas por 12 días al veneno Bothrópico.
TABLA 1. MATRIZ GENERAL DE LAS OBSERVACIONES HISTOPATOLOGICAS EN EL CORAZON
DE LAS RATAS EN EXPERIMENTACION:

ALTERACIONES COLORACIÓN HEMATOXILINA- TINCIÓN

CARDIACAS EOSINA TRICRÓMICO DE
MALLORY
LOTES* LOTES*
1 2 3 4 5 2 5
Congestión X X X X X
Hemorragia X X X X X
Picnosis Nuclear X X X
Fragmentación X X
fibrilar
Necrosis X X X X X
Coagulativa
Miocarditis X
Fibrosis X X
miocárdica
*Lote: tiempo de exposición al veneno 1(1 hora), 2(48 horas), 3(96 horas), 4(144 horas) y 5(12 días).