Se ha demostrado que las señales nanotopográficas en Ti provocan diferentes respuestas celulares,

como la diferenciación celular y el crecimiento selectivo. La remodelación ósea es un proceso

constante que requiere señales específicas para un crecimiento óseo óptimo y la fijación del implante.
Además, la formación de biopelículas y la infección resultante en los implantes quirúrgicos es un
problema importante. Nuestro objetivo es identificar nanopatrones en superficies de Ti que serían
óptimos tanto para la remodelación ósea como para reducir el riesgo de infección bacteriana. Se
sembraron cocultivos primarios de osteoblastos / osteoclastos humanos sobre sustratos de Ti con
nanocables de TiO2 cultivados en condiciones alcalinas a 240 ° C durante diferentes tiempos (2, 2,5 o 3
h). El crecimiento y el comportamiento celular se evaluaron mediante microscopía electrónica de
barrido (SEM), microscopía de inmunofluorescencia, histoquímica y métodos cuantitativos de RT-PCR.
La colonización bacteriana de las superficies de nanocables también se evaluó mediante microscopía
confocal y SEM

. De las tres superficies probadas, la superficie de nanocables de 2 horas soportó osteoblastos y, en

menor medida, crecimiento y diferenciación de osteoclastos. Al mismo tiempo, se redujo la viabilidad
bacteriana. Por lo tanto, la superficie de 2 h proporcionó condiciones óptimas de remodelación ósea
in vitro al tiempo que redujo el riesgo de infección, lo que lo convierte en un candidato favorable para
futuras superficies de implantes

La prevención de la formación de biopelículas en implantes quirúrgicos es un desafío importante en el

campo de los biomateriales y dispositivos médicos. La infección puede resultar en una cirugía de revisión
traumática y costosa, y la prevención de dicha infección, sin impedir la función del implante, es de gran
importancia. Actualmente, solo unos pocos estudios han evaluado la adhesión bacteriana y de
osteoblastos a las superficies potenciales del implante, lo que sugiere que se pueden producir efectos
diferenciales adquirido. La mayoría de los estudios siguen centrados en la diferenciación de las células
formadoras de hueso, como las células madre mesenquimales (MSC) o los osteoblastos en las
superficies de los biomateriales. De hecho, el trabajo previo utilizando nanotopografía para estudiar la
diferenciación de células madre mesenquimales (MSC) ha demostrado que las MSC pueden ser objeto
de la producción de linajes específicos de tejidos, como los osteoblastos. Una limitación de estos
enfoques es que solo se usa un tipo de célula y esto no es indicativo de la situación in vivo más
compleja. In vivo, los osteoblastos y los osteoclastos trabajan juntos para mantener la homeostasis ósea
con osteoblastos formando hueso nuevo y los osteoclastos quitando hueso viejo. Los osteoblastos
tienen un papel regulador en la osteoclastogénesis a través de su capacidad para secretar citocinas clave
y factores de crecimiento para la formación y actividad de los osteoclastos (Figura 1 complementaria).
Los primeros factores de respuesta son el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) y el
activador del receptor del factor nuclear ligando κB (RANKL) que inducen osteoclastogénesis por fusión
de macrófagos. Esto es seguido por la expresión de fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP),
catepsina K y receptor asociado a osteoclastos (OSCAR) de los osteoclastos recién formados. Por el
contrario, los osteoblastos pueden inhibir el proceso mediante la expresión de osteoprotegrina (OPG).
En los últimos años, ha habido intentos de incorporar complejidad en las pruebas in vitro. Por ejemplo,
se han reportado co-cultivos de osteoblastos y monocitos o células mononucleares de sangre periférica
(PBMC) en combinación con M-CSF y RANKL. Otros estudios informaron el uso de cocultivos porcinos de
células estromales de médula ósea (BMSC) y células hematopoyéticas de médula ósea (BMHC), o de
cocultivos humanos de BMSC y BMHC CD34 + o MSC y PBMCs18. Recientemente desarrollamos una
metodología para permitir co-cultivos de células estromales de médula ósea (BMSC) / células
hematopoyéticas de médula ósea (BMHC) que podrían formar células maduras osteoblastos y
osteoclastos en cultivo en respuesta a materiales Además, hemos ilustrado que la nanoescala la
topografía en polímeros y en titanio puede presentar señales osteogénicas positivas mientras que la
osteoclastogénesis permanece sin cambios; es decir, se ha indicado bioactividad específica. Una prueba
in vitro más ideal para materiales candidatos se centraría tanto en comprender el crecimiento y la
diferenciación de osteoblastos / osteoclastos como en las superficies resistentes a las infecciones. Ti y
sus aleaciones son materiales de uso común para aplicaciones que incluyen implantes dentales y
ortopédicos. Se han logrado superficies de Ti antimicrobianas con la unión de antibióticos, péptidos
antimicrobianos o nanopartículas que tienen efectos bactericidas. Además, trabajos recientes ilustraron
que las topografías de alta relación de aspecto, diseñadas usando negro de carbón, pueden ser
bactericidas y más recientemente en Ti. Reunir el potencial de bioactividad específica y los efectos
bactericidas que puede tener la topografía sería un enfoque poderoso en la bioingeniería ortopédica sin
la necesidad de más recubrimientos o agentes farmacológicos.

Aquí empleamos nuestro sistema de cocultivo in vitro en una alta relación de aspecto (altura media de 1
μm y aproximadamente 25 nm de diámetro) nanocables de TiO2 cultivados en sustratos de Ti.
Demostramos que los sustratos de nanocables TiO2 apoyan el crecimiento de células osteogénicas sin
estimular una respuesta adicional de osteoclastos asociada. Al mismo tiempo, la viabilidad bacteriana de
un patógeno (Pseudomonas Aeruginosa) comúnmente involucrado en infecciones asociadas a
dispositivos médicos, se reduce en la nanotopografía óptima para el crecimiento celular de la médula
ósea (BM), proporcionando una buena superficie candidata para nuevos implantes ortopédicos y
dentales.

Superficies de nanocables TiO2. Las superficies de titanio de nanocables se generaron mediante la

aplicación de un proceso hidrotermal alcalino en función del tiempo, 2 h, 2.5 h o 3 h respectivamente.
Este método hizo posible la modificación de superficies de titanio con dimensiones controlables de
nanocables de TiO2. El tiempo variable para el tratamiento hidrotérmico (240 ° C) generó una capa de
estructuras en forma de espiga homogéneamente empaquetadas con una altura promedio de aprox. 1
μm y diámetros de aproximadamente 25.1nm ± 2.7nm (Fig. 1A – C) y (Figura complementaria 2). El
aumento de los tiempos de tratamiento de 2 a 3 h dio lugar a ligeras variaciones en la disposición de los
cables desde características puntiagudas con forma de pincel más compactas a las 2 h. hasta una
estructura ligeramente entrelazada a las 3 h formando haces pequeños con un ancho de 222 nm ± 53.8
los nanocables crecieron en altura en aprox. 1 μm con mayor tiempo de proceso. El diámetro del
nanocable se mantuvo sin cambios.

Cocultivos de médula ósea en nanocables de TiO2. Los cocultivos BMSC / BMHC se cultivaron en un
fino control de 14 mm de diámetro y discos de nanocables con superficies de Ti de 2 h, 2.5 h o 3 h.
Inicialmente, las células se cultivaron durante una semana para determinar el crecimiento celular y el
comportamiento en las superficies. Las células se extendieron con un citoesqueleto bien organizado en
las superficies de fino control, con las células acercándose a la confluencia (Fig. 2A-D). Se observó una
apariencia y comportamiento similar en los nanocables de 2 h aunque con una cobertura celular
ligeramente menos gruesa. Sin embargo, a medida que la topografía cambió con el tiempo de
tratamiento, en los nanocables de 2,5 h y 3 h las células crecieron en grupos, aparecieron más
pequeñas, se extendió menos y redujo en número con la tinción del túbulo volviéndose más densa
alrededor del núcleo y menos organizada en el citoplasma. hubo una disminución significativa en la
intensidad media de la tubulina en las superficies más entrelazadas de 2,5 y 3 h. Las células en la
superficie de 2 h mostraron un nivel de expresión de tubulina (Fig. 3A). Además, los números de células
presentes en las superficies más entrelazadas se redujeron considerablemente en comparación con el
control y la superficie de 2 h (p <0,001) (Fig. 3B). El área celular (Fig. 3C) y el perímetro (Fig. 3D) también
se redujeron significativamente para los más entrelazados Superficies de 2.5h o 3h en comparación con
las superficies de 2h o de control (p <0.001, para ambos parámetros), lo que indica que las celdas
prefieren superficies más compactas o más lisas para adherirse y extenderse. Estos resultados indicaron
que, de las tres superficies probadas, los nanocables de 2 h eran la superficie preferida.

Diferenciación celular. La expresión génica. Se analizaron varios genes mediante qRT-PCR para evaluar
los efectos provocados por la superficie del nanocable de 2h en la diferenciación de osteoblastos /
osteoclastos en comparación con el fino control. La expresión génica se evaluó a los 14 días (D14) y a los
35 días (D35) para garantizar que cualquier momento relacionado, No se perdieran las diferencias de
expresión. Se observó un aumento significativo en la expresión de los genes de linaje osteogénico OPN y
OCN en el Superficie de nanocables de 2 h en comparación con el control pulido (Fig. 4A, B, p <0.01 y p
<0.05 respectivamente). Los Se observó que la expresión de OPG, un regulador negativo de la
osteoclastogénesis, estaba significativamente (p <0.05) regulada negativamente en cocultivos en los
nanocables de 2 h en comparación con el control (Fig. 4C). Al mismo tiempo, se encontró que la
expresión del inductor de osteoclastogénesis RANKL aumentaba en los nanocables de 2 h (p <0.001) en
d14 pero reducido más tarde (Fig. 4D). Concomitantemente, la expresión del receptor OSCAR asociado a
osteoclastos (p <0.01) (Fig. 4E), TRAP (p <0.01) (Fig. 4F), catepsina (p <0.05) (Fig. 4H) y gen relacionado
con la inflamación TNFα (p <0.01) (Fig. 4I) se incrementó significativamente en comparación con el
control. Expresión de la citocina. Se encontró que IL-6 se redujo ligeramente en los nanocables de 2 h en
comparación con el control (Fig. 4G) en el cocultivos IL-6 participa en la remodelación ósea y puede
tener efectos positivos tanto en la osteoblastogénesis como en la osteoclastogénesis. (p <0,001). La
expresión de OCN fue, nuevamente, máximamente expresada en D14, pero fue significativamente
mayor en las 2 h superficie de nanocables en comparación con los cultivos de control en ambos puntos
de tiempo (p <0,001) (Fig. 5B).

Osteoclastogénesis. Las imágenes SEM mostraron que se observaron muy pocas células similares a
osteoclastos multinucleados en cualquier momento (D3, 14 y 35), lo que indica que los BMHC no se
fusionaron para formar osteoclastos maduros (Fig. 6). Además, se realizó la tinción histoquímica de
TRAP y se confirmó la observación SEM. En general, se observaron números muy bajos de células
reactivas de TRAP (Fig. 7A, B) y las mediciones de densitometría indicaron que se tiñeron menos áreas
reactivas de TRAP en el cocultivo en los sustratos de nanocables de 2 h en comparación con el control
pulido (Fig. 7C). Un osteoclasto maduro representativo se muestra en la Figura 4 complementaria.

Propiedades bactericidas de nanocables de 2h. Además del potencial osteogénico de los nanocables de
2 h, queríamos examinar las propiedades bactericidas de esta topografía. Las Figuras 8A, B muestran
micrografías de fluorescencia representativas de la unión de P. aeruginosa al control (superficies de Ti
pulidas) y superficies de nanocables de 2 h respectivamente a 1 h. La Figura 8E muestra el porcentaje
promedio de células de P. aeruginosa muertas teñidas en el control y 2 h Propiedades bactericidas de
nanocables de 2h. Además del potencial osteogénico de los nanocables de 2 h, queríamos examinar las
propiedades bactericidas de esta topografía. Las Figuras 8A, B muestran micrografías de fluorescencia
representativas de la unión de P. aeruginosa al control (superficies de Ti pulidas) y superficies de
nanocables de 2 h respectivamente a 1 h. La Figura 8E muestra el porcentaje promedio de células de P.
aeruginosa muertas teñidas en superficies de control y nanocables de 2 h en cultivos bacterianos de 1 hy
18 h. Los nanocables de 2 h mostraron una eficacia de eliminación de ~ 30% después de 1 h y una
eficacia de eliminación de 58% después de 18 h de cultivo bacteriano. Esto se puede ver claramente en
la Fig. 8C, D de imágenes confocales y las inserciones en la Fig. 8E de P. aeruginosa unidas a 2h y
superficies de Ti pulidas. Las células en el Ti pulido parecían sanas, mientras que las células en las
superficies expuestas de 2 h parecían haber sido perforadas por los nanocables a 1 h de cultivo y aún
más después de 18 h de cultivo. El colapso de la célula y la propagación entre las estructuras de
nanocables es evidente.

Discussion
que las modulaciones de la superficie del material a nanoescala afectan la adhesión celular, la
morfología y el fenotipo. Por lo tanto, las topografías de superficie permanentes que se pueden adaptar
para soportar selectivamente la actividad biológica deseada durante largos períodos de tiempo son
ventajosas para las tecnologías de implantes. La biomimulación de superficies antimicrobianas naturales
(por ejemplo, alas de insecto) parece respaldar esta justificación con clara preferencia por los
mecanismos de acción físico-mecánicos, independientes de la química. En este sentido, diferentes tipos
de nanocables de TiO2 se cultivaron hidrotermalmente en superficies de Ti a las 2h, 2.5h y 3h y se
evaluaron sus efectos sobre el crecimiento celular, el fenotipo y su posible uso en la remodelación ósea
en este estudio. Recientemente desarrollamos cocultivos progenitores de osteoblastos / osteoclastos
donde los fenotipos maduros de ambas líneas progenitoras podrían desarrollarse en nanoestructuras
poliméricas y metálicas. En este estudio, hemos utilizado el mismo sistema de cocultivo en las nuevas
superficies sintetizadas hidrotermalmente. De las tres topografías evaluadas (2 h, 2.5h y 3 h), solo los
nanocables de 2 h fueron permisivos para la morfología celular normal. Además, el análisis cualitativo y
cuantitativo de los marcadores osteogénicos OPN y OCN a nivel de transcripción y proteína demostró un
aumento en la osteogénesis en el sustrato de nanocables 2h.

Estábamos motivados para comprender si la bioactividad topográfica era específica (solo osteoblastos) o
general (promoción de osteoblastos y osteoclastos). Idealmente, la osteogénesis se incrementaría
mientras que la osteoclastogénesis se mantuviera normal. La evaluación de los efectos de la superficie
del nanocable de 2 horas sobre la osteoclastogénesis a través de la expresión génica (RANKL, OSCAR,
TRAP, catepsina) parece indicar que los cables pueden inducir la formación de osteoclastos. Sin
embargo, la observación fenotípica a nivel de proteínas y morfológica (tinción SEM y TRAP) indicó poca
diferencia, incluso una posible disminución en la actividad de los osteoclastos durante el tiempo de
cultivo de 35 días. Potencialmente, una combinación de posibles modificaciones postraduccionales y
señales inhibitorias provocadas por la superficie del nanocable puede explicar la falta de osteoclastos
maduros como se muestra por la tinción SEM y TRAP. Los resultados sugieren que la superficie del
nanocable TiO2 2h es específicamente bioactiva. Además, de manera similar al informe reciente del
grupo Ivanova, los nanocables de 2 h eran altamente bactericidas hacia la bacteria gramnegativa y móvil
P. aeruginosa, como se muestra en las imágenes SEM y el ensayo de viabilidad con una tasa de
mortalidad del 30% después de 1h y 58% después de 18 h en cultura. Las propiedades antibacterianas
exhibidas aquí por los nanocables de 2 h contra P. aeruginosa podrían ser cruciales in vivo al inhibir la
adhesión bacteriana en la etapa inicial y mejorar así la capacidad del cuerpo para combatir infecciones.
Esto es claramente importante ya que un mayor contacto óseo sin una mayor resorción, combinado con
un menor riesgo de infección, sería la superficie óptima del implante. Una de las principales
preocupaciones de las tecnologías de implantes es la infección, ya que puede producirse una falla rápida
de los implantes. Esta preocupación está en sintonía con las preocupaciones mundiales de la creciente
resistencia a los antibióticos e incluso la posibilidad de la era posterior a los antibióticos. El desarrollo de
antibióticos ha sido vital para nuestra supervivencia, pero la resistencia a los antimicrobianos amenaza
con volverlos ineficaces. La OMS estima que los tratamientos con antibióticos agregan un promedio de
20 años a todas nuestras vidas 40. Sin embargo, el uso excesivo de antibióticos ha ejercido presión sobre
las bacterias para desarrollar resistencia y esto está llevando a un aumento potencial en escenarios
donde los implantes no pueden usarse debido al temor a infección. Por lo tanto, está claro que el
desarrollo de métodos innovadores, como los implantes que tienen propiedades antimicrobianas
innatas, es una prioridad. Sin embargo, esto no puede ser sacrificado los efectos deseados, como la
osteointegración. La evaluación del cocultivo in vitro ha demostrado las propiedades osteogénicas de
nanocables de TiO2 de 2 h cultivados en sustrato de Ti sin una respuesta osteoclástica no deseada. Por
lo tanto, tenemos un enfoque de cocultivo exitoso en superficies de titanio que proporciona un análisis
in vitro mejorado del entorno del hueso del implante. Además, la actividad bactericida de nanocables de
2 horas contra P. aeruginosa podría reducir el riesgo de infección y las complicaciones posteriores a
largo plazo y, por lo tanto, facilitar la integración de los tejidos sin el uso de antibióticos. Sin embargo, se
deben analizar más cepas bacterianas, incluidos algunos patógenos ortopédicos comunes (por ejemplo,
Staphlylococcus aureus grampositivo) para caracterizar completamente la eficacia bactericida de tales
superficies. Finalmente, como estas superficies se fabrican fácilmente mediante un proceso simple, se
pueden cultivar fácilmente en diferentes implantes de titanio de forma y tamaño complejos.

MÉTODOS MATERIALES

Generación de nanocables de titania en sustratos de Ti. Las muestras de disco de Ti se prepararon a

partir de una hoja de Ti de grado 1 ASTM de 0,9 mm de espesor (Ti metals Ltd, Reino Unido). Fueron
pulidos a una imagen especular y limpiados ultrasónicamente en agua y etanol. Los nanocables se
crearon sumergiendo los discos de Ti en NaOH 1 M en un recipiente de acero revestido con PTFE
(recipiente de digestión ácida 4748, Parr Instrument Company, EE. UU.), A una temperatura de 240 ° C
durante 2, 2.5 o 3 h. El recipiente se retiró después de cada punto de tiempo del horno y se dejó enfriar
a temperatura ambiente. Las muestras se enjuagaron en agua y etanol, secuencialmente y
posteriormente se trataron térmicamente a 300 ° C durante 1 hora antes del intercambio iónico en HCl.
Para convertir los nanocables de titanato de sodio a TiO2, las muestras se sumergieron en HCl 0,6 M
durante 1 h, se enjuagaron en agua y etanol, y finalmente se trataron térmicamente a 600 ° C durante 2
h.

Aislamiento de BMSC humano y BMHC humano. La médula ósea se obtuvo de cirugías de artroplastia
de cadera y rodilla de tres pacientes sanos después de que el paciente informara y firmara su
consentimiento. Este tejido residual para el aislamiento celular y el uso posterior de células descrito en
este manuscrito fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación del Servicio Nacional de Salud
(NHS REC) con el número de referencia de aprobación 04 / S0702 / 22. Todos los métodos se realizaron
de acuerdo con las pautas y regulaciones relevantes aprobadas por NHS REC. El aspirado BM se dividió
en dos viales y se lavó dos veces en medio basal (DMEM (Sigma) suplementado con suero bovino fetal al
10%, L-glutamina 200 mM (Invitrogen), piruvato sódico 100 mM, MEM NEAA al 1% (Gibco) y antibióticos
( 6,74 U / ml de penicilina-estreptomicina, 0,2 μg / ml de fungizona)) y cada vez se centrifuga a 376 g
durante 10 min. Los sedimentos celulares se resuspendieron en medio basal y se superpusieron sobre
una capa de Ficoll. Esto se centrifugó a 445 g durante 45 minutos. La capa de interfaz mononuclear se
transfirió a un nuevo vial y se lavó dos veces más en medio basal. Las células se transfirieron a un matraz
de cultivo celular de tamaño apropiado y se incubaron a 37 ° C con 5% de CO2 humidificado. En el día 3,
después de la selección, las células no adherentes se transfirieron a un nuevo matraz y se cultivaron por
separado como células hematopoéticas de médula ósea (BMHC). Las células adherentes restantes se
cultivaron durante 7-10 días más hasta que se identificó una capa confluente de células del estroma de
la médula ósea (BMSC).

Cocultivos en superficies de nanocables de Titania. Después de 7 días de cultivo, las BMSC se

tripsinizaron y se resuspendieron en medios basales a una densidad de 1 x 104 células / ml / sustrato de
Ti. Cinco días después, se añadió 1 ml de suspensión de BMHC a una concentración de 1,5 x 105 células /
ml para formar el cocultivo. El medio se reemplazó cada 3 días de cocultivo.

Histoquímica: tinción de TRAP. En el día 35 de cocultivo, se realizó un análisis histoquímico en sustratos

duplicados de nanocables 2h, 2.5h y 3h o control pulido para evaluar la osteoclastogénesis. Las muestras
se fijaron en un fijador de formaldehído al 4% durante 30 s, se tiñeron con TRAP (leucocito de fosfatasa
ácida n. 387, Sigma-Aldrich) de acuerdo con las instrucciones del kit y se contratiñeron durante 10
minutos en solución de hematoxilina seguido de un lavado en H2O.

Inmunofluorescencia En el día 35 de los cocultivos, se analizaron 2 discos de cada sustrato mediante

tinción de inmunofluorescencia como se describió previamente en la ref. 8. Brevemente, las células se
fijaron en un fijador de formaldehído al 4% a 37 ° C durante 15 minutos y se permeabilizaron a 4 ° C
durante 5 minutos. Las muestras se bloquearon con BSA / PBS al 1% a 37 ° C durante 5 minutos y se
tiñeron con los anticuerpos primarios apropiados para osteopontina (OPN), osteocalcina (OCN) o
Tubulina (1:50 en BSA / PBS al 1%, Autogen Bioclear). Los filamentos de actina se tiñeron con faloidina
(1: 100, Invitrogen). Luego se realizaron dos lavados en 1 × PBS / Tween-20 al 0,5% (3 × 5 min a
temperatura ambiente) y se añadió un anticuerpo secundario conjugado con biotina (1:50, anti-ratón
monoclonal de caballo (IgG), Vector Laboratories) durante 1 ha 37 ° C. Las muestras fueron lavadas y se
añadió estreptavidina (1:50, Vector Laboratories) a 4 ° C durante 30 minutos, antes de que las muestras
recibieran un lavado final y se montaran en medio de montaje Vectashield (Vector Laboratories) que
contenía DAPI para teñir el núcleo. La visualización se realizó mediante un microscopio de fluorescencia
(Zeiss Axiovert 200M, aumento de 10x, NA 0,5). Archivos generados en formato JPEG o TIFF. Las
comparaciones de intensidad de tinción entre sustratos se analizaron mediante el software Image J
versión 1.42q.

Microscopía electrónica de barrido (SEM). La SEM se realizó en los días 3, 14 y 35 de cocultivo en

sustratos duplicados de Ti de control de nanocables 2h, 2.5h y 3h o pulido. Las muestras se fijaron en
gluteraldehído al 4% durante 1 hora a 4 ° C y luego se lavaron con cacodilato de sodio 0,2 M (pH 7,4). Se
fijaron posteriormente en tetróxido de osmio al 1% y se lavaron una vez en cacodilato de sodio. Luego,
las muestras se sumergieron en una solución de ácido tánico al 1% (v / v) / cacodilato de sodio 0,1 M
durante 1 hora y luego se lavaron en cacodilato de sodio al 0,2 M antes de que la deshidratación
atraviese una serie de alcohol incremental (70–100% v / v) . Se realizó una etapa de hexametildisiloxano
antes del recubrimiento por pulverización catódica (20 nm de oro / paladio). Se usó un microscopio Zeiss
Sigma FE-SEM para la visualización de la muestra.
qRT-PCR. El ARN total se extrajo de los cultivos de los días 14 y 35 con un kit y protocolo Qiagen RNeasy
Micro. Para estandarizar el análisis cuantitativo, se usaron cantidades iguales de ARN de cada muestra
para la síntesis de ADNc usando el kit y protocolo Qiagen QuantiTect RT-PCR. qRT-PCR se llevó a cabo
utilizando el kit Qiagen Quantifast SYBR Green y las reacciones se ejecutan en el ciclador de PCR en
tiempo real 7500 de Applied Biosystems. Se probaron tres réplicas biológicas (y 2 réplicas técnicas de
cada una) en cada punto de tiempo. La expresión de los genes de prueba (fosfatasa alcalina, OPN, OCN,
SOX9, OPG, OSCAR, RANKL, interleucina 6 (IL-6), TRAP, factor de necrosis tumoral α (TNFα) y catepsina-
K) se normalizó contra el gen de mantenimiento doméstico GapDH. Las secuencias de cebadores (Tabla
1) para los genes se validaron mediante análisis de curva de disociación / curva de fusión.

Preparación de cultivos bacterianos. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 se cultivó durante la noche
en 10 ml de caldo Luria Bertani (LB) en una incubadora con agitador a 37ºC a 220 rpm. La suspensión
bacteriana se subcultivó luego en caldo LB fresco hasta OD600 0.1 y se incubó adicionalmente hasta
alcanzar la fase exponencial media (OD600 0.5-0.6). Las células bacterianas se cosecharon (7 min, 5000
g) y se lavaron tres veces en tampón Tris-HCl (pH 7, Sigma). Las células bacterianas finalmente se
resuspendieron en tampón Tris-HCl a OD600 0.3 (aprox. 107 UFC / ml).

Ensayo de adhesión bacteriana. Se colocaron discos estériles de nanocables de 2 h y discos de control

(Ti pulido) en una placa de microtitulación de 12 pocillos y se incubaron con 2 ml de suspensión
bacteriana durante 1 hora o 18 horas a 37 ° C en condiciones estáticas. Las placas se colocaron en un
recipiente de plástico que contenía tejidos húmedos para mantener la humedad. Después de la
incubación, los discos se enjuagaron 3 veces en tampón Tris-HCl para eliminar las bacterias no
adherentes y se sumergieron en 1 ml de tinción de viabilidad bacteriana Live / Dead® BacLight ™
(Invitrogen, según las instrucciones del fabricante) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Los
discos se enjuagaron dos veces en tampón Tris-HCl y se sumergieron en 1 ml de tampón Tris-HCl para su
visualización por microscopía confocal. (Multicaser CLSM Leica SP511). Se tomaron cinco imágenes de la
pila Z por superficie y se utilizó el software de imágenes y análisis celular Volocity 6.3 para contar el
número de células con membranas intactas (SYTO 9, verde) y el número de células con membranas
dañadas (yoduro de propidio, rojo). El porcentaje promedio de células dañadas se determinó dividiendo
las células dañadas por el número total de células en la superficie (* 100). Todos los experimentos se
llevaron a cabo por triplicado y se repitieron en ocasiones separadas.

Microscopía electrónica de barrido (SEM) de cultivos bacterianos. Las superficies unidas con P.
aeruginosa se fijaron por inmersión en una solución de gluteraldehído al 2,5% (Sigma Aldrich) disuelta
en tampón de fosfato de potasio 0,1 M (Sigma Aldrich) durante 2 ha temperatura ambiente. Luego se
realizó una etapa de deshidratación de alcohol sumergiendo las superficies en etanol al 20%, 40%, 60%,
80% y 100% (Sigma Aldrich) durante 10 minutos cada uno antes de 10 minutos en hexametildisilazano
(Sigma Aldrich). Luego, las superficies se secaron al aire, se montaron sobre trozos de carbono y se
pulverizaron con platino durante 30 segundos. Se utilizó un microscopio electrónico de barrido Quanta
400FEI (SEM) para visualizar las superficies.