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Aislamiento y caracterización del Coronavirus 2019-nCoV de los Pangolines

Malayos

Resumen:

El brote de 2019-nCoV en la ciudad de Wuhan, en el centro de China, a finales de

2019, plantea problemas de salud pública sin precedentes tanto para China como

para el resto del mundo1. El nuevo coronavirus comparte la identidad de secuencia

alta con el SARS-CoV y un coronavirus de murciélago recientemente identificado2.

Si bien los murciélagos pueden ser el reservorio de varios coronavirus, sigue siendo

ambiguo si 2019-nCoV tiene otros huéspedes. En este estudio, un coronavirus

aislado de pangolinas malayas mostró una identidad de aminoácidos del 100%,

98,2%, 96,7% y 90,4% con 2019-nCoV en los genes E, M, N y S, respectivamente.

En particular, el dominio de unión al receptor de la proteína S del Pangolin-CoV es

virtualmente idéntico al de 2019-nCoV, con una diferencia de un aminoácido. La

comparación de los genomas disponibles sugiere que 2019-nCoV podría haberse

originado a partir de la recombinación de un virus similar a Pangolin-CoV con un

virus similar a Bat-CoV-RaTG13. Los pangolines infectados mostraron signos

clínicos y cambios histopatológicos, y los anticuerpos circulantes reaccionaron con

la proteína S de 2019-nCoV. El aislamiento de un coronavirus que está altamente

relacionado con 2019-nCoV en las pangolinas sugiere que estos animales tienen el

potencial de actuar como el huésped intermedio de 2019-nCoV. El coronavirus

recientemente identificado en el mamífero más traficado podría representar una

amenaza continua para la salud pública si el comercio de vida silvestre no es

controlado efectivamente.
 El actual brote de COVID-19 ha supuesto una gran amenaza para la salud

pública mundial y ha causado tremendas pérdidas económicas3. El virus en

cuestión, el SARS-CoV-2 (denominado posteriormente en el informe 2019-nCoV),

es uno de los tres coronavirus zoonóticos (los otros dos son el SARS-CoV y el

MERS-CoV) que infectan las vías respiratorias inferiores y causan graves

síndromes respiratorios en los seres humanos4 ,5. El virus 2019-nCoV fue detectado

por primera vez en Wuhan, China central. Con la migración de la población durante

el período de Año Nuevo chino, se propagó rápidamente desde Wuhan a todas las

provincias de China y a algunos otros países. Hasta ahora ha sido más contagioso

pero menos mortal que el SARS-CoV, y el número total de infecciones humanas

supera con creces el causado por el SARS-CoV.

2019-nCoV tiene alrededor de 86,9 a 88% de similitud en la secuencia

genómica general con el SARS-CoV y los coronavirus relacionados con el SARS de

los murciélagos (SARSr-CoV), y se agrupa con ellos en los análisis filogenéticos de

las secuencias genómicas1,6. Además, recientemente se informó de la existencia de

un coronavirus de murciélago (Bat SARr-CoV RaTG13) con una identidad de

secuencia de ~96% hasta 2019-nCoV a nivel del genoma completo2. Por lo tanto, es

razonable suponer que los murciélagos son el huésped nativo de 2019-nCoV, como

se ha sugerido anteriormente para los SARS-CoV y MERS-CoV7,8. Sin embargo,

sin un huésped intermedio, los CoV derivados de murciélagos rara vez infectan

directamente a los humanos. Como el brote comenzó en diciembre en una gran

ciudad, era poco probable que los murciélagos en hibernación fueran la causa

directa de la epidemia. Esto plantea la preocupación de que si existen otros

huéspedes de 2019-nCoV y transmitieron el virus a los humanos, al igual que

durante los brotes de SARS y MERS.

Como los coronavirus son comunes en los mamíferos y las aves9, usamos el
conjunto
secuencia del genoma de 2019-nCoV (WHCV; número de acceso al GenBank

MN908947) en una búsqueda explosiva de secuencias de CoV similares al SARS en

todos los datos virométricos, metagenómicos y transcriptómicos disponibles de

mamíferos y aves. Esto condujo a la identificación de 34 contiguos altamente

relacionados en un conjunto de metagenomas virales de pangolín (Cuadro S1). Por

lo tanto, hemos centrado nuestra búsqueda posterior del SARSr-CoV en este animal

salvaje.

Obtuvimos los tejidos pulmonares de cuatro pangolines chinos (Manis

pentadactyla) y 25 pangolines malayos (Manis javanica) que fueron recolectados de

un centro de rescate de vida silvestre durante marzo-diciembre de 2019, y

analizados para el SARSr-CoV usando RT-PCR con cebadores dirigidos a una

región conservadora de β CoV. El ARN de 17 de los 25 pangolines malayos generó

el producto esperado de la PCR, mientras que el ARN de los pangolines chinos no

logró amplificarse. En el análisis de muestras de plasma de ocho de las pangolinas

malayas mediante un ELISA de doble antígeno diseñado para la detección de

anticuerpos IgG e IgM contra el 2019-nCoV, una muestra reaccionó fuertemente con

un valor OD450 de 2,12 (valor de corte: 0,11). El plasma permaneció positivo en la

dilución de 1:80, sugiriendo que el pangolín estaba infectado naturalmente con un

virus similar al 2019-nCoV. Comparando con un pangolín β CoV-negativo, los

exámenes histopatológicos de los tejidos de cuatro pangolines β CoV-positivo

revelaron la aparición de neumonía intersticial en el pulmón y una severa congestión

e infiltración de células inflamatorias en el hígado, riñón, nódulos linfáticos y otros

órganos. Se observaron hemorragias menores en los conductos alveolares del

pulmón y en la superficie epitelial de la vejiga (Fig 1 y Fig S1).

Para aislar el virus, el sobrenadante del tejido pulmonar homogeneizado de un
muerto
animal fue inoculado en células Vero E6. Se observaron claros efectos citopatógenos

en las células después de 72 horas de incubación. Las partículas virales fueron

detectadas por microscopía electrónica de transmisión principalmente dentro de

vesículas de doble membrana, con unas pocas fuera de ellas. Mostraron la

morfología típica de los coronavirus (Fig 1). El análisis RT-PCR del cultivo viral

utilizando cinco juegos de cebadores dirigidos a los genes spike (S) y RdRp produjo

los productos PCR esperados en tres de ellos (Fig S2). Los productos de la PCR

tenían

~84,5% y 92,2% de identidad de secuencia de nucleótidos a los genes parciales S y

RdRp de 2019-nCoV, respectivamente (Fig S3).

El ARNseq de la Ilumina se utilizó para identificar el virus en el pulmón de

nueve pangolines. El mapeo de los datos de secuencia del genoma de referencia

2019-nCoV (WHCV) identificó la secuencia de CoV se lee en siete muestras (Tabla

S2). Mediante el ensamblaje de novo y la PCR dirigida, se obtuvo un genoma de

CoV casi completo (29.578 pb), y fue designado como Pangolin-CoV. Los genes S,

E, M y N predichos de pangolin-CoV tienen una longitud de 3.798, 228, 669 y

1.260 pb, respectivamente, y comparten el 90,4%, el 100%, el 98,2% y el 96,7% de

identidad de aminoácidos hasta 2019-nCoV (Tabla 1). En un análisis de Simplot de

las secuencias del genoma completo, el genoma de Pangolin-CoV fue muy similar

en todo el genoma al 2019-nCoV y al Bat SARSr-CoV RaTG13, con una identidad

de la secuencia entre el 80 y el 98%, excepto por el gen S (Fig. 2). Un análisis

comparativo ulterior de las secuencias del gen S sugiere que hubo eventos de

recombinación entre algunos de los SARSr-CoV analizados. En la región de los

nucleótidos 1-914, el Pangolin-CoV es más similar al Murciélago SARSr-CoV

ZXC21 y al Murciélago SARSr-CoV ZC45, mientras que en la parte restante del

gen, el Pangolin-CoV es más similar al 2019-nCoV-como y

Bat-CoV-RaTG13 (Fig. 2). En particular, el dominio de unión al receptor (RBD) de

la proteína S de Pangolin-CoV tiene sólo una diferencia de aminoácidos con

respecto al 2019-nCoV. En general, estos datos indican que 2019-nCoV podría

haberse originado a partir de la recombinación de un virus similar a Pangolin-CoV

con un virus similar a Bat-CoV-RaTG13 (Fig 2). Para apoyar aún más esta

conclusión, evaluamos las relaciones evolutivas entre los coronavirus β en el

genoma completo, los genes RdRp y S, y las diferentes regiones del gen S (Fig 3).

Las topologías mostraron principalmente la agrupación de Pangolin-CoV con 2019-

nCoV y Bat SARSr-CoV RaTG13, con 2019-nCoV y Bat SARSr-CoV RaTG13

formando una subclase dentro de la agrupación (Fig 3). Sin embargo, en el análisis

filogenético de la región RBD del gen S, Pangolin-CoV y 2019-nCoV se agruparon.

Los conflictos en la formación del cúmulo entre los análisis filogenéticos de

diferentes regiones del genoma sirven como una fuerte indicación de la

recombinación genética, como se ha visto anteriormente en el SARS-CoV y el

MERS-CoV5,10.

Dado que se ha demostrado que las proteínas S tanto del SARS-CoV como del

2019-nCoV reconocen específicamente la enzima convertidora de angiotensina II

(ACE2) durante la entrada de las células huéspedes2 ,11 , realizamos un análisis

comparativo de la interacción de las proteínas S de los cuatro virus del SARSr-CoV

estrechamente relacionados con las proteínas ACE2 de los seres humanos, las

civetas y las pangolinas. Como era de esperar, la RBD de la proteína S de las bandas

ACE2 del SARS-CoV de los humanos y las civetas de manera eficiente. Además,

parece ser capaz de unir el ACE2 de las pangolinas. Este también es el caso del Bat-

CoV-RaTG13. En contraste, las proteínas S de 2019-nCoV y Pangolin-CoV pueden

potencialmente reconocer ACE2 sólo de humanos y pangolines. Por lo tanto, las

proteínas ACE2 de los humanos y

Las pangolinas probablemente pueden reconocer las proteínas S de los cuatro virus

del SARSr-CoV, mientras que el ACE2 de las civetas probablemente sólo puede

reconocer las proteínas S del SARS-CoV y del Bat-CoV-RaTG13 (Fig. 4).

Las investigaciones epidemiológicas del brote de 2019-nCoV mostraron que los

pacientes iniciales estaban asociados con el Mercado de Mariscos de Huanan, donde

también se vendía fauna silvestre viva12. Aunque el virus 2019-nCoV se detectó en

algunas muestras de ambiente del mercado, hasta ahora no se ha implicado a ningún

animal como portador del virus. El virus del SARSr-CoV identificado en pangolines

en el presente estudio está genéticamente relacionado con el 2019-nCoV, pero es

improbable que esté directamente vinculado al brote debido a las importantes

diferencias de secuencia entre el 2019-nCoV y el Pangolin-CoV. Sin embargo, un

virus relacionado con Pangolin-CoV parece haber donado la RBD de la proteína S a

2019-nCoV. Las secuencias del SARSr-CoV fueron detectadas previamente en

pangolines malayos muertos13. Estas secuencias parecen ser de Pangolin-CoV

identificadas en el presente estudio a juzgar por su similitud de secuencia. En el

presente estudio se han aportado pruebas virológicas, serológicas e histopatológicas

de la virulencia del Pangolin-CoV y de las posibles pangolinas como reservorio

zoonótico de 2019 coronavirus similares al CoV. Además, como la RBD de

pangolin-CoV es prácticamente idéntica a la de 2019-nCoV, y tiene una fuerte

capacidad de unión al ACE2 humano, Pangolin-CoV presenta una potencial

amenaza futura para la salud pública. El amplio rango de unión del ACE2 de

pangolin a la RBD de las proteínas S reafirma el potencial de las pangolinas como

huésped intermedio del SARSr-CoV. Tanto los pangolines como los murciélagos

son animales nocturnos, comen insectos y comparten nichos ecológicos

superpuestos, lo que hace de los pangolines el ideal
huésped intermedio para algunos SARSr-CoV. Por lo tanto, se debería implementar

un monitoreo más sistemático y a largo plazo de otros SARSr-CoV en pangolines y

otros animales relacionados para identificar la fuente animal potencial de 2019-

nCoV en el brote actual.

Los resultados del estudio apoyan el llamado a una mayor prohibición del

comercio ilegal de pangolines. Debido a la insaciable demanda de su carne como

manjar y a las balanzas para su uso en la medicina tradicional en China, los

pangolines chinos están al borde de la extinción

(http://www.iucnredlist.org/details/12764/0). El contrabando ilegal de otros

pangolines del sudeste de Asia a China es desenfrenado14 ,15. Casi todos los

pangolines en el mercado ilegal de caza son pangolines malayos, y la aduana

confisca un gran número de pangolines malayos cada año. Se debe implementar una

cooperación internacional y regulaciones más estrictas contra el comercio ilegal de

vida silvestre y el consumo de carne de caza. Pueden ofrecer una mayor protección

de los animales en peligro de extinción, así como la prevención de los principales

brotes causados por el SARSr-CoV.

Materiales y métodos

Análisis metagenómico y ensamblaje del genoma viral

Recopilamos datos virométricos, metagenómicos y transcriptómicos de

diferentes mamíferos y aves en bases de datos públicas, incluyendo el Archivo de

Lectura de Secuencias del NCBI (SRA) y el Archivo Europeo de Nucleótidos

(ENA), para buscar posibles secuencias de coronavirus. Las lecturas en bruto de las

bases de datos públicas y algunos conjuntos de datos metagenómicos internos se

recortaron en primer lugar utilizando fastp (v0.19.7) 16 para eliminar el adaptador y

las secuencias de baja calidad. Las lecturas limpias fueron mapeadas a la secuencia

de referencia 2019-nCoV (MN908947) usando BWA-MEM (v0.7.17)17 con > 30%

de coincidencias. Las lecturas mapeadas fueron cosechadas para el análisis

posterior. Los contigs fueron ensamblados de novo usando Megahit (v1.0.3)18 e

identificados como 2019-nCoV relacionados usando BLASTn con valores E < 1e 5

y la identidad de la secuencia > 90%.

Muestras

Los pangolines utilizados en el estudio fueron confiscados por la Aduana y el

Departamento de Silvicultura de la provincia de Guangdong en marzo-diciembre de

2019. Entre ellos figuran cuatro pangolines chinos (Manis pentadactyla) y 25

pangolines malayos (Manis javanica). Estos animales fueron enviados al centro de

rescate de vida silvestre, y en su mayoría estaban inactivos y sollozando, y

finalmente murieron en custodia a pesar de los agotadores esfuerzos de rescate. Se

tomaron muestras de tejido del pulmón, nodos linfáticos, hígado, bazo, músculo,

riñón y otros tejidos de los pangolines que acababan de morir para exámenes

histopatológicos y virológicos.
Histopatología
 Se realizaron exámenes histopatológicos de muestras de tejido de cinco

pangolines. Brevemente, los pulmones y otros tejidos recogidos fueron cortados en

pequeños trozos y fijados en formalina tamponada al 10% durante 24 horas. Se

lavaron sin formalina, se deshidrataron en grados ascendentes de etanol durante una

hora cada uno, y se limpiaron dos veces en cloroformo durante 1½ horas. Después

de ser incrustados tres veces con cera de parafina fundida a 58°C en una plantilla,

los bloques de tejido fueron seccionados con un microtomo a 3-μm de espesor. Las

secciones se extendieron en un baño de agua caliente (42°C) y se transfirieron a

portaobjetos de vidrio sin grasa. Los portaobjetos se secaron al aire, se

desparafinaron y se rehidrataron mediante grados descendentes de etanol y agua

destilada durante cinco minutos cada uno. Se tiñeron con un kit de tinción de

hematoxilina y eosina (Baso Diagnostics Inc., Wuhan Servicebio Technology Co.,

Ltd.) siguiendo los procedimientos recomendados. Finalmente, los portaobjetos

teñidos se montaron con un cubreobjetos y se examinaron bajo una Olympus BX53

equipada con una cámara Olympus PM-C 35.

Aislamiento de virus y análisis RT-PCR

El tejido pulmonar extactado de los pangolines fue inoculado en células Vero

E6 para el aislamiento del virus. La línea celular fue probada libre de contaminación

de micoplasma usando el kit de detección de PCR de micoplasma LookOut

(SIGMA). Las monocapas de células cultivadas se mantuvieron en el Medio Águila

Modificado de Dulbecco (DMEM) / F-12 de Ham. El inóculo se preparó moliendo

el tejido pulmonar en nitrógeno líquido, diluyéndolo 1:2 con DMEM, filtrado a

través de un filtro 0.45 μm (Merck Millipore), y tratado con 16 μg/ml de solución de

tripsina. Después de la incubación a 37 durante 1 hora, el inóculo fue retirado
de la cultura y reemplazado por un medio de cultivo fresco. Las células se

incubaron a los 37 años y se observaron diariamente por el efecto citopático.

El ARN viral fue extraído del tejido pulmonar usando el mini kit de ARN viral

QIAamp® (Qiagen) siguiendo los procedimientos recomendados por el fabricante, y

examinado para el CoV por RT-PCR usando un par de primers (F: 5'-

TGGCWTATAGGTTYAATGGYATGGAG-3', R:

5'
-CCGTCGATTGTGTGWATTTGSACAT-3' ) diseñado para amplificar el gen S de β

CoV.

Microscopía electrónica de transmisión

Los cultivos celulares que mostraron efectos citopáticos se examinaron para detectar

las partículas virales mediante microscopía electrónica de transmisión. Las células

se recogieron del cultivo por centrifugación a 1.000× g durante 10 min, y se fijaron

inicialmente con una solución de glutaraldehído al 2,5% a 4 durante 4 horas, y de

nuevo con tetraóxido de osmio al 1%. Se deshidrataron con etanol graduado y se

incrustaron con resina PON812. Se cortaron secciones (de 80 nm de espesor) del

bloque de resina y se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo

secuencialmente. Las rejillas teñidas en negativo y las secciones ultrafinas se

observaron bajo un microscopio electrónico de transmisión HT7800 (Hitach).

Prueba serológica

Las muestras de plasma de ocho pangolinas malayas se analizaron para detectar

anticuerpos anti-2019-nCoV utilizando un kit ELISA de doble antígeno para la

detección de anticuerpos contra

2019-nCoV de Hotgen (Beijing, China), siguiendo los procedimientos

recomendados por el fabricante. En el ensayo, el antígeno de recubrimiento era la

proteína S1 expresada en la célula eucariótica, y el etiquetado era la región RBD de

la proteína S. La reacción fue leída en un lector de microplacas multimodal Synergy

HTX (BioTek, EE.UU.). Las muestras positivas fueron analizadas de nuevo con

plasma diluido en serie.

Secuenciación metagenómica

El tejido pulmonar se homogeneizó mediante un vórtice con perlas de sílice en

1 mL de solución salina tamponada con fosfato. El homogeneizado se centrifugó a

10.000× g durante 5 min y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,45 μm

(Merck Millipore) para eliminar las partículas grandes. El filtrado o sobrenadante de

cultivo viral se utilizó en la extracción de ARN con el kit QIAamp® Viral RNA

Mini. El ADNc se sintetizó a partir del ARN extraído utilizando la transcriptasa

inversa PrimeScriptScript II (Takara) y cebadores aleatorios, y se amplificó

utilizando el fragmento Klenow (New England Biolabs). Las bibliotecas se

prepararon con NEBNext® Ultra™ DNA Library Prep Kit for Illumina® (New

England Biolabs). La secuenciación del extremo del paréntesis (150 pb) se realizó

en un Illumina NovaSeq 6000. Se utilizaron ensayos específicos de PCR para llenar

los huecos de la secuencia del genoma, utilizando cebadores diseñados en base a las

secuencias que flanquean el hueco.

Análisis filogenético

La alineación de secuencias múltiples de todos los datos de secuencia se hizo

usando MAFFT v7.22119. La relación filogenética de las muestras se construyó

utilizando RAxML v.8.0.14

20
. Se identificaron los modelos evolutivos más adecuados para las secuencias de cada
conjunto de datos
usando ModelTest21. Los posibles eventos de recombinación y la ubicación de los

posibles puntos de ruptura en los genomas de los coronavirus de β se detectaron

utilizando Simplot (versión 3.5.1) 22 y RDP 4.9923.

Simulación molecular de las interacciones entre RBD y ACE2

La interacción entre la RBD de la proteína S del SARSr-CoV y la ACE2 de los

humanos, las civetas y las pangolinas se examinó mediante la simulación dinámica

molecular. La estructura cristalina del dominio RBD del SARS-CoV que se une al

complejo de proteínas ACE2 de los humanos fue descargada del Banco de Datos de

Proteínas (entrada en el PDB: 2AJF24). Las estructuras de los complejos formados

por ACE2 de civetas o pangolinas y RBD de 2019-nCoV, Bat-CoV, y Pangolin-CoV

construidas utilizando el enfoque de modelado de homología en el servidor de

modelo suizo25, y superpuestas con la plantilla (PDB: 2AJF). La identidad de la

secuencia del SARS-CoV RBD (PDB: 6ACD) a RBD de 2019-nCoV, Bat-CoV y

Pangolin-CoV fue del 76,47%, 76,79% y 74,19%, respectivamente, mientras que la

secuencia de la proteína ACE2 de los humanos a la de los pangolines y civetas fue

del 85,40% y 86,93%, respectivamente.

Las simulaciones dinámicas moleculares en todos los complejos RBD-ACE2 se

llevaron a cabo usando el AMBER 18 suite26 y el campo de fuerza ff14SB 27 como

se describió anteriormente

(Liu et al., 2018). Después de la minimización en dos etapas, NVT y NPT-MD, un 10-
ns

Se aplicó la simulación de producción MD, con el paso de tiempo establecido en 2fs

y las trayectorias coordinadas guardadas cada 1ps. El enfoque MM-GBSA28 se

utilizó para calcular la energía libre de unión de cada proteína ACE2 a la RBD de
CoV
Proteína S, usando el script de pitón MMPBSA.py29 en el procedimiento de

incorporación de la suite AMBER 18. Los últimos 300 fotogramas de todas las

simulaciones se extrajeron para calcular la energía libre de enlace que excluye las

contribuciones del enlace de disulfuro. El método de descomposición de la energía

libre30 se utilizó para identificar y cuantificar los residuos clave que participan en la

interacción entre la IECA2 del huésped y las proteínas S del virus.

Agradecimientos:

Esta labor contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de

China (Subvención Nº 31822056 y 31820103014), el Programa Nacional de I+D

Clave de China (2017YFD0500404), el Fondo para el Programa Clave y el Grupo

de Investigación Creativa del Departamento de Educación de la Provincia de

Guangdong, y el Proyecto 111 (D20008), y el Ministerio de Ciencia y Tecnología de

China, la Academia China de Ingeniería, la Academia China de Ciencias, el

Departamento de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Guangdong y el

Departamento de Agricultura de la Provincia de Guangdong.

Contribuciones del autor:

YS, LX y WC concibieron el estudio; JJZ, FHH, YJW, SMP, MH, WJX, QHC y WC

recogieron muestras; JZ, NZ, XZ, NL, YG, XL, XS, ZZ, FS y WH realizaron el

aislamiento y la secuenciación del virus; KX, YF, YL, ZiZ e YS contribuyeron al

análisis; YS y LX escribieron el manuscrito; YF y RAC editaron el manuscrito.

-CoVs.