Los contaminantes emergentes en los sistemas

de saneamiento y sus efectos ambientales

Damià Barceló, M. José Lopez de Alda, Mira Petrovic, Silvia

Lacorte, Benjamí Piña, M.D. Hernando
Department de Quimica Ambiental, IIQAB-CSIC, Barcelona

Antoni Ginebreda
Agencia Catalana de l’Agua
 Resumen
§ Contaminantes emergentes
§ Clases y compuestos
§ Disruptores endocrinos (EDCs)

§ Análisis
Integración de análisis químicos y biológicos (RYA)
§ Ensayo con cepas de levaduras recombinantes
§ Inducción de la síntesis de vitelogenina en peces

§ Aplicación del método

§ Integración del análisis químico de EDCs y de la actividad estrogénica medida
por RYA en la cuenca del Llobregat
§ Integración del análisis químico de EDCs y de la inducción de la síntesis de
vitelogenina en carpas en los ríos Cardener and Anoia

§ Conclusiones
Nuevos Contaminantes Orgánicos (Emergentes)
Nuevos y más sensibles métodos de análisis químicos y biológicos

Def.: contaminantes previamente desconocidos o no reconocidos como tales

cuya presencia en el medio ambiente no es necesariamente nueva pero si la
preocupación por las posibles consecuencias de la misma

Línea prioritaria de investigación (OMS, EPA, UE)

Poco o no investigados
Escasez/ausencia de datos ambientales
Falta de métodos analíticos

...........No regulados...........
Elevada producción y consumo → continua introducción en el medio
ambiente: no necesitan ser persistentes para ocasionar efectos negativos.
 Contaminantes orgánicos emergentes
< Retardantes de llama (difenil éteres polibromados)
< Detergentes de tipo alquilfenol etoxilado y derivados
Parafinas cloradas 2455/2001/EC
< Ftalatos

< Compuestos organoestánnicos

Subproductos de desinfección del agua potable Ya legislados
< Productos de transformación de pesticidas Datos nuevos

Metil tert-butil éter y otros aditivos de la gasolina

Surfactantes perfluorados (PFOA, PFOS)
No legislados
< Fármacos
Datos insuficientes
Productos para el cuidado y la higiene personal
Toxinas de algas
< Bisfenol A
....
< Disruptores endocrinos

*Susan D. Richardson (2004) Anal. Chem. 76, 3337-3364.

Compuestos disruptores endocrinos (EDCs)
§ Los EDCs son compuestos sintéticos o productos
naturales que interfieren en el sistema endocrino
(hormonal)
§ El Sistema Endocrino produce hormonas que guían
el desarrollo, crecimiento, reproducción,
y comportamiento de humanos y animales

Mucha documentación de efectos Efectos sospechosos en humanos:

en organismos del medio natural:
• Disminución de la fertilidad y el
crecimiento
• Alteraciones sexuales
• Problemas en las cáscaras de los
huevos
• Funcionamiento tiroideo anormal
• Malformaciones en recién nacidos
• Problemas en los testículos
• Esperma anormal y pobre
• Funcionamiento tiroideo anormal
• Posible cáncer de testículos
• Cáncer de próstata
• Otros efectos
 Surfactantes de tipo alquilfenol etoxilados
- Detergentes en formulaciones
Alquilfenol industriales (textil, curtidos, papeleras)
O
etoxilados OH - Coadyuvantes de pesticidas
n
(APEOs) - Ingredientes de pinturas
R n=1-20
- Agentes humectantes
Productos de degradación
O
APEOs de nOH
aeróbica y anaeróbica
cadena corta R n=1-2 Niveles en - aguas: ng-µg-mg/L
OH - sedimentos: µg/Kg
Alquilfenoles - lodos: mg/Kg
(APs) R - biota: ug/Kg

Alquilfenoxi O
Efectos estrogénicos:
estrogénicos
carboxilados n
OCH2 COOH
1-20 µg/L (NP and NP1EO)
(APECs) R
Directiva 2455/2001
Análisis: GC-MS-MS (deriv.), LC-MS-MS Nonilfenoles; 4-p-Nonifenol
Octilfenoles, p-t-Octilfenol
Petrovic M y col. (2003) Environ. Sci. Technol. 37, 4442-4448
 Fármacos en el medio ambiente acuático
Analgésicos/antiinflamatorios: paracetamol, ác. acetilsalicílico, ibuprofeno, diclofenac
Antibióticos:
- Macrólidos: claritromicina, dehydroeritromicina, roxitromicina, lincomicina
- Sulfamidas: sulfametoxazol, sulfadimetoxina, sulfametacina, sulfatiazol
- Fluoroquinolonas: ciprofloxacina, norfloxacina, enrofloxacina
- Tetraciclinas: clortetraciclina, oxitetraciclina, tetraciclina
... cloranfenicol, tilosin, trimetoprim
Antiepilépticos: carbamazepina, primidona
β-Bloqueantes: metoprolol, propanolol, bisoprolol, betaxolol, nadolol, sotalol
Reguladores de lípidos: ácido clofíbrico, bezafibrato, gemfibrozil, ác. fenofíbrico
Medios de contraste en rayos-X: diatrizoato, iohexol, iopamidol, iopromide, iomeprol
Citostáticos (quimioterapia): ifosfamida, ciclofosfamida
Anticonceptivos orales: etinilestradiol, mestranol
Esteroides: coprostanol, estradiol, progesterona, testosterona.
Broncodilatadores, tranquilizantes, antihistamínicos, barbitúricos, antidiabéticos...

NIVELES: ng-µg/L; µg-g/Kg

Heberer T (2002) Toxicol. Lett. 131, 5-17.
 Antibióticos2:
Fármacos N Resistencia bacteriana
más problemáticos/ - 2/3 en medicina humana: posición 3.
- 1/3 en medicina veterinaria: 70%
menos estudiados1
.
Citostáticos:
Medios de contraste en rayos-X: N Prop. Carcinogénicas
N Persistencia Poca eliminación en STP
Poca eliminación en STP sniveles, destino, y riesgos
Aguas subterráneas
sMetabolitos Anticonceptivos orales:
N Efectos estrogénicos a ∼ 1ng/L
sMedio marino, sedimentos y fangos

U.S. EPA Contaminants Canditate List (CCL)3

Diclofenac (antirreumático)
Carbamazepine (antiepiléptico) Análisis:
Chloramphenicol (antibiótico)
LC-UV-FL
LC-MS → LC-MS-MS
GC-MS → GC-MS-MS
1Heberer T (2002) Toxicol. Lett. 131, 5-17.
2 Thiele-Bruhn S (2003) J. Plant Nutr. Soil Sci. 166, 145-167.
3 http://www.epa.gov/OGWDW/ccl/cclfs.html
Procedimiento integrado de análisis
químicos y ensayos biológicos
Environmental samples
Muestras ambientales
Extracción de componentes activos
SPE
SPE-C18
- C18 (aqueous
(muestrassamples)
acuosas)
PLE
PLE(solid
(muestras
samples)
sólidas)
Extractos

Correlación y cuantificación de factores

Medida de la estrogenicidad
Estrogenicity (vitelogenina)
screening
Recombinant
Ensayo levaduras
yeast assay
recombinantes
(RYA) (RYA)

Análisis de
Actividad positiva
compuestos diana
por LC-MS
HPLC fractionation
Fraccionamiento HPLC

causativos
Medida de la estrogenicidad
Estrogenicity (vitelogenina)
screening
Recombinant yeast assay
Ensayo levaduras (RYA)
recombinantes (RYA)

Fracciones activas

Identificación de comp.
desconocidos por LC-MS-MS
 Chemical analysis
Muestras sólidas
(sedimentos/lodos)
Muestras agua
Lyophilization
Liofilización

Filtración Extracción
Ultrasonic
conextraction
fluídos presurizados
Off-line On-line (steroids)
Rotary
Rotavapor
evaporation

SPE (ASPEC) SPE (PROSPEKT)

Purificación (clean-up)
LiChrolut RP-18 PLRP-s

SPE
Sep-Pak C18 Plus (esteroides)
LiChrolut RP18 (alquilfenoles)
N2 evaporación
N2 evaporación

LC-MS/(MS)
LC
LC-MS/(MS)
DAD MS
Análisis químico – compuestos diana

1. Detergentes no iónicos, nonilfenol etoxilado (NPEO), y octilfenol

etoxilado (OPEO) y sus productos de degradación nonilfenol (NP),
octilfenol (OP), y derivados carboxilados (NPEC y OPEC),
respectivamente.
2. Bisfenol A (BPA)
3. Ftalatos (DMP- dimetil ftalato; DEP – dietil ftalato, DBP - dibutil ftalato,
BBP - butil bencil ftalato, DEHP-di(2-etil-hexil) ftalato)
4. Hormonas sexuales esteroidales naturales y compuestos sintéticos
relacionados (E1-Estrona; E2- β-estradiol , E3-Estriol, EE- etinil
estradiol, DES-Dietilestilbestrol, PRO-Progesterona, NOR-
Noretindrona, LEV-levonorgestrel)
5. Benzotiazoles (HOBT. 2-hidroxibenzotiazol)
 Ensayo con cepas de levaduras recombinantes
(Recombinant Yeast Assay, RYA)

§ Basado en una cepa de levadura que expresa el receptor

humano de estrógenos (hER) y un gen de ensayo (ß-
galactosidasa) cuya expresión depende de la activación
del receptor del hER.
§ La actividad β-galactosidasa se mide fácilmente con
substratos cromogénicos o fluorogénicos y depende de la
presencia de ligandos del hER, por lo que puede ser
tomada como indicadora de actividad estrogénica.
§ Todo el ensayo puede ser llevado a cabo en placas de
ensayo de 96 pocillos
Concentration efectiva media (EC50) y factor de estrogenicidad
relativa obtenida para diferentes compuestos por RYA
Vitelogenina en plasma: Western blot

Cyprinus carpio

Extracción de sangre: 2 ml jeringa heparinizada + Aprotinina

Obtención plasma: Centrifugaciónn 1,000 g x5’
SDS-PAGE análisis: PAb anti-conejo (Biosense, Norway)
 APLICACIONES

Integración de análisis químicos de EDCs y ensayos con

cepas de levaduras recombinates para la determinación
de actividad estrogénica
Análisis de EDCs en la cuenca del río Llobregat
Análisis de fármacos en la cuenca del río Llobregat

Integración de análisis químicos de EDCs e inducción de

la síntesis de vitelogenina en carpas
Análisis de EDCs en estaciones de depuración de aguas residuales (EDAR)
catalanas y en los ríos receptores de los efluentes (aguas y sedimentos
fluviales).
Area de estudio: Cataluña

Mapa con los puntos de muestreo

en la cuenca del Llobregat.

Números 1 al 10 indican los puntos

de muestreo de aguas.
Letras A a la D corresponden a la
localización de las EDAR.

Zonas en gris indican la localización

de las poblaciones próximas a las
EDAR:
A-Manresa; B-Terrassa , C-Igualada;
D-Martorell.
 Concentraciones en µg/L de diferentes EDCs analizados por LC-MS

Puntos Río OP NP BPA NPEO1 NPEO2 DEP DEHP DBP

Aguas superficiales
1 Llobregat < 0.09 0.22 0.09 < 0.22 < 0.06 1.45 < 0.20 0.6
2 Llobregat < 0.09 < 0.15 0.09 < 0.22 0.61 1.5 < 0.20 0.34
3 Cardener < 0.09 0.39 < 0.09 3.22 2.53 6.85 < 0.20 0.3
4 Llobregat < 0.09 0.26 < 0.09 1.19 1.2 0.54 < 0.20 0.47
5a Llobregat 0.09 0.5 0.27 < 0.22 0.39 1.26 0.82 1
5b Llobregat < 0.09 0.45 < 0.09 < 0.22 < 0.06 2.05 3.09 1.3
6 Anoia < 0.09 1.23 < 0.09 < 0.22 < 0.06 0.85 0.65 < 0.19
7 Anoia < 0.09 0.53 0.12 < 0.22 1.27 0.58 0.45 < 0.19
8 Llobregat 0.26 2.57 0.11 3.54 1.17 0.46 0.31 < 0.19
9 Rª de Rubí 21.9 37.3 0.85 6.87 3.17 0.4 0.77 < 0.19
10 Llobregat 2.57 13.9 2.97 < 0.22 < 0.06 0.22 < 0.20 < 0.19
Aguas resid. EDAR
EDAR A Inf Manresa 0.17 17.1 0.94 19.3 5.56 1.62 3.17 0.07
EDAR A Efl Manresa < 0.09 2.99 0.34 9.53 8.97 0.93 1.34 < 0.19
EDAR B Inf Terrasa 0.08 29.8 < 0.09 < 0.22 < 0.06 12.97 0.26 0.83
EDAR B Efl Terrasa < 0.09 0.8 < 0.09 10.6 9.69 10.21 0.23 < 0.19
EDAR C Inf Igualada 0.24 44.8 6.98 2.37 5.61 3.19 0.82 8.86
EDAR C Efl Igualada < 0.09 1.24 < 0.09 < 0.22 < 0.06 2.25 1.12 < 0.19
EDAR D Inf Martorell 0.18 11.9 < 0.09 3.8 0.82 1.06 1.9 0.35
EDAR D Efl Martorell 0.09 0.89 < 0.09 < 0.22 3.87 0.56 0.33 < 0.19
-1
LOD (µg L ) 0.09 0.15 0.09 0.22 0.06 0.2 0.2 0.19
Cálculo de equivalentes de
estradiol a partir de los
resultados RYA.

Los círculos negros, los

blancos, y los triángulos
representan los valores
relativos de ß-galactosidasa,
obtenidos a diferentes
factores de dilución, en el
agua residual de entrada de
la EDAR de Manresa, en el
agua de salida, y en un punto
de muestreo próximo a ésta
(el 3), respectivamente.

Las funciones sigmoidales se

calcularon mediante métodos
de regresión no-lineal. Las
líneas gruesas continua y
discontinua corresponden a
las aguas de entrada y de
salida de la EDAR de
Manresa, y la línea fina
discontinua a la muestra de
agua en el punto 3.
Valores totales de estrogenicidad en equivalentes de estradiol para muestras
de aguas residuales (izquierda) y de aguas de río (derecha).
 Correlación entre los valores totales de estrogenicidad
(en eq. E2) obtenidos por RYA (eje X) y los estimados a
partir de la composición química de las muestras (eje Y).
 APLICACIONES

Integración de análisis químicos de EDCs y ensayos con

cepas de levaduras recombinates para la determinación
de actividad estrogénica
Análisis de EDCs en la cuenca del río Llobregat
Análisis de fármacos en la cuenca del río Llobregat

Integración de análisis químicos de EDCs e inducción de

la síntesis de vitelogenina en carpas
Análisis de EDCs en estaciones de depuración de aguas residuales (EDAR)
catalanas y en los ríos receptores de los efluentes (aguas y sedimentos
fluviales).
 Area de estudio: Cataluña
Detección de fármacos

ACIDO CLOFIBRICO
ACIDO ACETILSALICILICO
DICLOFENAC

EDAR ABRERA
Llobregat river
Cardona 150
RIO ANOIA Cardener river ng/L
100
150 50
ng/L
100 0
50
0
Manresa
N
Mediterranean Sea

Anoia river
(2) EDAR RUBI
Igualada Llobregat river
1200
ng/L
100
(4)
Abrera 50
(1) 0
Martorell

RIO LLOBREGAT
Sant Joan Despí 150
Barcelona ng/L
(3) 100
50
0 25 km
0
 Area de estudio: Cataluña
Concentraciones en ng/L de fármacos

à Octubre 2003
Fármacos
Ac. Ac.
Muestras Diclofenac
clofíbrico acetilsalic ílico
Distribució zona Ter - - -
MPATSA - 24.5 -
EDAR Abrera - 40 31.5
Anoia final - - -
Llobregat abans Anoia - 35 -
Llobregat després Anoia - 14 -
Edar Rubí 1200 107 50
Aigua tractada ETAP Abrera - - -
Llobregat captació ETAP SJD - - -
Aigua tractada ETAP SJD - - -
 Area de estudio: Cataluña
Concentraciones en ng/L de fármacos
à Abril 2004

Ácido Atenolol
Ibuprofen Diclofenac
clofíbrico
Muestras - - -
ETAP Cardedeu aigua tractada - - - -
MPATSA, 28-04-04, 10:00 - - - -
EDAR de Abrera, 28-04-04, 10:30 134.30 240.68 - -
Llobregat abans Anoia, 28-04-04, -
27.42 11.8 -
11:00
Anoia final, 28-04-04, 11:30 127.20 31 - -
EDAR Martorell, 28-04-04, 12:00 53.70 134 - -
ETAP Abrera (aigua tractada), 28-04- -
- - -
04, 12:40
Llobregat després Anoia, 28-04-04, -
30.50 14.40 -
14:30
Abocament ETAP (SJD), 28-04-04, -
- - -
15:15
Captació ETAP SJD, 28-04-04, 17:00 17.46 - - -

Aigua tractada ETAP SJD - - - -

 UNIDADES
AI
GU
A
TR
AC
TA
DA
ET
ED AP
AR AB
SO RE

0
5
10
RT RA
ID 3
A
AB
DI RE
ST RA
RI 3
BU
C.
LL ZO
OB NA
RE 3
GA
TA M
AP
BA TS
NS A
AN 3
OI
A
3

AN
OI
AI A
GU FI
NA
A L
TR E D 3
AC
TA A R
DA RU
ET BI
LL AP 2
OB SJ
RE A
GA 3
TD
ES
PR
MUESTRAS pH ACIDO

ES
2

BL
AN
BL C
AN
C
OH
-
BL
AN
C
H+
Area de estudio: Cataluña – Ensayo RYA

1:90
1:30

Fig. Gráfico de unidades ß- galactosidasa de las muestras extra ídas a pH ácido.

1:500
1:270
 Area de estudio: Cataluña – Ensayo RYA

CONTROL POSITIVO
00
15

1:30
UNIDADES

1:90
00
10

1:270
1:500
0
50
0

228
NA

A
ON
EI
ST

CT
NI

LA
GE

RO
TE
EN
Fig. Gráfico de unidades ß- galactosidasa de control positivo (Genisteína 1.9
mM) y negativos (0). Véase la diferencia de escala con respecto a la anterior
figura.
 APLICACIONES

Integración de análisis químicos de EDCs y ensayos con

cepas de levaduras recombinates para la determinación
de actividad estrogénica
Análisis de EDCs en la cuenca del río Llobregat
Análisis de EDCs en la cuenca del río Llobregat

Integración de análisis químicos de EDCs e inducción de

la síntesis de vitelogenina en carpas
Análisis de EDCs en estaciones de depuración de aguas residuales (EDAR)
catalanas y en los ríos receptores de los efluentes (aguas y sedimentos
fluviales).
Area de estudio: Cataluña
0 30 60 km

N
Río Cardener

EDAR4
Río Llobregat l
Spain C1 C2
EDAR1
EDAR2 C3
EDAR3
Río Anoia Barcelona
A1
A2 A3
Mar Mediterráneo

A1-A3, C1-C3
Agua
Sedimento
Pez (Cyprinus carpio)
sangre, hígado, bilis, tejido
(130 machos adultos, 116 hembras de carpas)
 Variación temporal de las concentraciones de compuestos
nonilfenólicos en aguas y sedimentos del río Anoia

50 Río Llobregat
40 AGUA
30 EDAR1
µg/L Río Anoia EDAR2
20 EDAR3
NPEO
10 A1 NP1EC
0 A3 Barcelona
I III V VII A2 NP
0
200 50
µg/kg
400 40 50
30 40
600 SEDIMENTo µg/L AGUA
20 30
800 µg/L AGUA
10 20
0 10
I III V VII 0
0 I III V VII
0
200
µg/kg 200
400 µg/kg
400
600 SEDIMENT
SEDIMENTO 600 SEDIMENTO
800
800
 Variación temporal de las concentraciones de compuestos
nonilfenólicos en aguas y sedimentos del río Cardener

Río Cardener
Río Llobregat
STP
C1 NPEO
NP1EC
C2 C3
NP

10
AGUA 10
8 Barcelona AGUA
8
µ g/L 6 6
4 µg/L
10 4
2 AGUA
8 2
0
I III V VII 6 0
µg/L I III V VII
0 4
0
100 2
µ g/kg 0 100
200 I III V VII µg/kg
200
0
300 SEDIMENTO
300
100 SEDIMENTO
400
µg/kg 400
200

300
SEDIMENTO
400
Variación temporal de las concentraciones de esteroides en aguas y
sedimentos del río Anoia
25
E3 E2
20 EE E1
DES NOR
15
ng/L

LEV PRO

10

0
A1 A2 A3 A1 A2 A3 A1 A2 A3 A1 A2 A3
Enero 2000 Marzo 2000 Mayo 2000 Julio 2000
0

1
ng/g

E3 E2
3 EE E1
DES NOR
22.8 LEV PRO
4
Variación temporal de las concentraciones de esteroides en aguas y
sedimentos del río Cardener

30
71.1 E3 E2
25 EE E1
DES NOR
20
ng/L

LEV PRO
15
10
5
0
C1 C2 C3 C1 C2 C3 C1 C2 C3 C1 C2 C3
Enero 2000 Marzo 2000 Mayo 2000 Julio 2000
0
1
2
3
ng/g

4
E3 E2
5
EE E1
6 DES NOR
7 11.8
LEV PRO

8
Niveles de vitelogenina, en µg/mL de plasma, en
carpas macho (Cyprinus carpio) del río Anoia

Anoia Control
A1
A2
(7:3)
120
(10:4) A3
VTG ( g/ml plasma)

x100
80

(4)
40 (6) (6)
(4) (4) *
(3)
(5)
(6) * *
(9) (6)
0
Enero Marzo Mayo Julio
Correlación entre la concentración de VTG en plasma y
la concentración de NP en agua de río

16
14
R = 0.82
12
10
µg NP/L 8
6
4
2
0
0 20 40 60 80

µg VTG/mL plasma
 Cromatograma obtenido en el análisis off-line de etinil estradiol por
LC-NI-ESI-MS-MS (295>145) en un sedimento tomado en una
zona en donde se observó una alta incidencia de peces intersex y
de niveles de vitelogenina.

9500 MRM Etinil estradiol

9000
22.8 ng/g sedimento A2
Abundancia

8500

8000

7500
Control
7000
Anoia
VTG-Anoia A1
(7:3)
A2
6500 120
(10:4) A3

plasma)
( g/ml plasma)
x100
21 22 23 24 25 26
80
Tiempo (min)
VTG (µg/ml

(4)
40 (6) (6)
(4) (4) *
(3)
(5)
(6) * *
(9) (6)
0

January
Enero Marzo
March Mayo
May Julio
July
 Conclusiones/propuestas para la mejora de la
calidad del agua en Cataluña

- Mejor depuración de las aguas residuales urbanas

- Incremento significativo del tratamiento terciario en la depuración de
aguas residuales urbanas
- Reutilización creciente de aguas depuradas
- Tratamiento separado, y diferenciado desde el origen, de las aguas
de procedencia industrial
- Máxima reutilización del agua industrial mediante circuitos cerrados y
autodepurados
- Implementar la calidad integral de las aguas promoviendo programas
de vigilancia ambiental para los contaminantes emergentes de forma
que se garantice la conservación del medio acuático natural, la
gestión integral de los recursos hídricos, la eficacia en el uso del
agua y la reutilización de la misma.
Agradecimientos

Projecto de la UE P-THREE (EVK1-CT-2002-00116)

(Removal of Persistent Polar Pollutants Through
Improved Treatment of Wastewter Effluents)

Ministerio de Ciencia y Tecnología

(PPQ2002-10945-E)