Fitoterapia 136 2019 104168

Listas de contenido disponiblres en la página de inicio de la revista Science Direct Fitoterapia:

www. Elsevier.com/locate/fitote
Alcaloides del indol del hongo coprófilo Aphanoascus fulvescen

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO

Palabras clave:
Aphanoascus fulvescens
Alcaloides de indol
Okaramina
Citotoxicidad

RESUMEN

Se investigaron los metabolitos secundarios del hongo Aphanoascus fulvescens aislado de estiércol
de ganso, que produjo cinco nuevos alcaloides de indol, okaraminas V – Z (1–5) y once derivados
conocidos (6–16). Sus estructuras se determinaron mediante 1D, espectros de RMN 2D y datos
HRMS. Los compuestos 6, 8, 11 y 12 mostraron una citotoxicidad significativa a moderada contra
la línea L5178Y de linfoma cel de ratón con valores de CI50 que van desde 4.0 a 14.7 μM. Se
discuten las relaciones preliminares de estructura-actividad.

1. Introducción
Las okaraminas, informadas principalmente por Penicillium simplicissimum y Aspergillus
aculeatus, constituyen una familia de alcaloides indol prenilados [1]. Son compuestos
insecticidas debido a su toxicidad contra las larvas de gusanos de seda y su actividad
selectiva en los canales de cloruro regulados por glutamato (GluCls) [2,3]. Estos
compuestos también han inspirado muchos esfuerzos tanto en la investigación
biosintética como en la síntesis total [4–6]. En nuestra búsqueda en curso de nuevos
compuestos bioactivos de Ascomycetes, aislamos el hongo Aphanoascus fulvescens del
estiércol de ganso recolectado cerca de la costa del Mar del Norte en el norte de
Alemania. A. fulvescens pertenece a la Ascomycota y se encuentra comúnmente en tejidos
ricos en queratina, como el cabello, las uñas y el excremento que se han desechado del
huésped [7]. Se informó que el hongo tenía la capacidad de degradar la queratina nativa
de las plumas a pH 7,58 ya una temperatura de 28,7 ° C [8]. Sin embargo, sus metabolitos
secundarios rara vez se investigaron, excepto por dos aminas, WF14865A y B, que se
informaron como nuevos inhibidores de catepsinas B y L con valores de CI50 en el rango
de 8.4–72 nM in vitro [9]. Nuestra investigación química de un endurecimiento intensificó
la aislación de cinco nuevos alcaloides de indol de tipo okaramina (1 a 5) junto con once
derivados conocidos (6 a 16) (Fig. 1). En este trabajo, se informa sobre el aislamiento, la
elucidación de la estructura y la bioactividad de estos compuestos.

2. Resultados y discusión.
El compuesto 1 tenía la fórmula molecular C32H36N4O4 según se determinó
por HRESIMS, que contiene un átomo de oxígeno adicional cuando se compara con el
compuesto conocido co-aislado, okaramina C (6) [10]. Los datos de 1H RMN de 1 (Tabla 2)
mostraron las señales para dos conjuntos de grupos α, α-dimetilililo, ocho protones
olefínicos asignados a dos anillos de benceno orto-disustituidos, dos metilenos y dos
metinos, lo que sugiere un indol preinilado esqueleto de dicetopiperazina similar a la
okaramina C (6). Sin embargo, la presencia de señales debidas a un grupo metileno aislado
en C-3 [δH 3.26 (d) y 2.26 (d)] y la desaparición de la señal de H-2 en 1 indicaron que C-2
de 1 era un carbono cuaternario . La unión de un grupo hidroxi adicional en C-2 en 1 se
confirmó mediante las correlaciones HMBC de Hab-3, H-8a (δH 5.48) y 3'-NH (δH 5.83) a C-
2 (δC 88.9), y del grupo hidroxi (δH 5.99) y Hab-3 a C-9 (δC 166.4). Se determinó que la
subestructura restante era idéntica a la de okaramina C (6) después de un análisis
detallado de los espectros de RMN 2D de 1. Además, se sugirió que la configuración
relativa de 1 era idéntica a la de la okaramina C (6) basada en en las correlaciones NOE
similares. Por lo tanto, la estructura de 1 fue tan elucidada como se muestra en la Fig. 1, y
al compuesto se le dio el nombre trivial de okaramina V. La configuración absoluta de la
okaramina C (6) se determinó mediante el método de Marfey [11] y la síntesis total. [5]. Se
asume que la okaramina V (1) comparte la misma configuración de configuración de la
asokaramina C (6) basada en la relación biogenética entre ambos compuestos.
Fig. 1. Estructuras de los compuestos 1-16.
La fórmula molecular de okaramina W (2) se determinó como C32H36N4O4 a partir de los
datos de HRESIMS. Los datos de 1H RMN de 2 (Tabla 2) fueron similares a los de la cocaína
C (6), excepto en la colocación de un protón metino singlete en C-8a (δH 5.52) en 6 [10]
por una señal intercambiable de agua (δH 5.52, br s, 1-NH) en 2. Las correlaciones COSY
entre 1-NH / H-2 / Hab-3 junto con las correlaciones HMBC de Hab-3 a C-2, C-3a, C-3b, C-
8a (δC 180.2) y C-9 indicaron división entre 1-N y C-8a y la presencia de un grupo carbonilo
en C-8a en 2. El análisis detallado de los espectros de RMN 2D de 2 reveló que la
subestructura restante y la configuración relativa de 2 fueron idénticas a las de la
okaramina C (6).

Tabla 1 Datos de 13C RMN de los compuestos 1 a 5.

a Grabado en CDCl3 a 150MHz.

b Grabado en acetona-d6 a 150 MHz.
c Grabado en DMSO-d6 a 150 MHz.
d Los datos fueron extraídos de HSQC y HMBC.
Sobre la base de los datos de HRESIMS, la fórmula molecular de 3 se estableció como
C32H34N4O3, que contiene dos átomos de H adicionales en comparación con el
compuesto conocido co-aislado, okaramina J (7) [11]. La comparación de los datos de RMN
de 1H y 13C (Tablas 1 y 2) de 3 con 7 reveló la desaparición de un protón intercambiable
con agua (δH 5.73, 3'-NH en 7) y el reemplazo de un grupo de metileno olefínico (δH 5.13 y
5.07 ) por un metil olefino (δH 5.97, H-4 ') en 3. Este último protón mostró una correlación
ACOGEDORA con H-5 '(δH 5.76) y HMBC con C-9 (C 169.1) y C-6 ′ (δC 37.2), confirmando el
linaje entre 3'-N y C-4 ′ para formar un anillo adicional. La subestructura restante y la
configuración relativa de 3 eran idénticas a las de la okaramina J (7) como se indica en el
2DNMRspectraof3. Se sugiere que la configuración de la regla de la tercera parte es
igualmente idéntica a la de la okaramina J (7) en función de su relación biogenética. El
método de Marfey [11] y la síntesis total [6] se habían realizado previamente para con fi
rmar la con fi guración absoluta de la okaramina J (7).

Okaramine Y (4) tenía la fórmula molecular C38H42N4O5 como se desprende de los datos
de HRESIMS. En comparación con la okaramina B (9) [12],
okaramina Y (4) mostró señales de una unidad de isoprenilo adicional (C-15 ′ a C-19 ′,
tablas 1 y 2) además de la sustitución de señales de un anillo de benceno orto-disustituido
por señales de un 1,2, Anillo de benceno 4-trisustituido a δH 6.96 (dd, J = 8.2, 1.3Hz, H-10
'), 7.19 (d, J = 1.3Hz, H-8 ′) y 7.49 (d, J = 8.2Hz, H- 11 ′). Además, las correlaciones de HMBC
de 7'-NH, H-1 ', H-8' y H-10 'a C-11a', de H-8 'y H-10' a C-15 'y de H2 –15 'a C-8', C-9 'y C-10'
indicaron la ubicación de la cadena lateral de isoprenilo adicional en la posición C-9 '.
Basándose en las relaciones NOE similares, la okaramina Y (4) compartió la misma
configuración relativa que la okaramina B (9). La fórmula molecular del compuesto 5 fue
determinada por HRESIMS como C32H36N4O2. Los datos de UV y 1H NMR de 5 (Tabla 2)
fueron similares a los de cycloL-Trp-L-Trp (13) [11]. La única diferencia entre ambos
compuestos es la presencia de señales atribuidas a dos unidades adicionales,
químicamente equivalentes α, α-dimetilalilo en δH 6.07 (dd, J = 17.5, 10.7Hz, H-11), 5.19
(d, J = 10.7Hz , Ha-12), 5.16 (d, J = 17.5Hz, Hb-12), 1.71 (s, Me-13) y 1.68 (s, Me-14) en 5, lo
que fue respaldado por las correlaciones COSZADO entre H -11 / Hab-12 y las
correlaciones HMBC de Me-13 y Me-14 a C-10 y C-11. La unión de la unidad α, α –
dimetilalilo a N-8 se confirmó mediante el desplazamiento químico de C-10 (C 59.1) y la
correlación HMBC de H-8a (δH 6.64) a C-10. Sobre la base de la relación biogenética, se
sugiere que la configuración absoluta de 5 es la misma que cycloL-Trp-L-Trp (13), cuya
configuración absoluta se había determinado previamente mediante el método de Marfey
[11].
Los restantes compuestos conocidos se identificaron como okaraminas C (6) [10], J (7)
[11], G (8) [13], B (9) [12], D (10) [14], A ( 11) [12], H (12) [15], cicloL-Trp-L-Trp (13), ciclo-
(6a'-α, α – dimetilalil-L-Trp) - L-Trp (14), ciclo - (N8-α, α – dimetililal-L-Trp) -L-Trp (15),
ciclo- (N8-α, α – dimetilalil-L-Trp) - (6a'-α, α – dimetilalil-L- Trp) (16) [11] basado en la
comparación de sus datos espectrales con la literatura. Todos los compuestos aislados se
analizaron para determinar su citotoxicidad contra la línea celular de linfoma de ratón
L5178Y utilizando el ensayo MTT. Entre ellos, las okaraminas H (12), G (8), A (11) y C (6)
mostraron citotoxicidad con valores de CI50 de 4.0, 12.8, 13.8 y 14.7μM, respectivamente.
 Se pueden concluir algunas relaciones de estructura-actividad preliminares basadas en los
resultados del bioensayo. La hidroxilación en C-2 (1 vs 6) o la división entre 1-N y C-8a (2 vs
6) condujo a la pérdida total de citotoxicidad. Cuando un grupo α, α – dimetilalilo se une a
8-N, la división entre 3'-N y C-4 '(8 vs 11) o la reducción a Δ1', 2 '(6 vs 11) tuvo poco efecto
en la cito Sin embargo, cuando un grupo de isisoprenilo se adjunta a C-7 en lugar de 8-N, la
reducción en reduction1 ', 2' (3 o 7 frente a 12) dio como resultado una pérdida total de
citotoxicidad.

3. Sección experimental.
3.1. Procedimientos experimentales generales.
Las rotaciones ópticas se obtuvieron con un perímetro de Perkin-Elmer-241 MC. Los
espectros de RMN 1D y 2D se registraron en un espectrómetro de RMN Bruker AVANCE
DMX 600. Los espectros de masas (ESI) se registraron con un espectrómetro de masas
Decana Finnigan LCQ y los espectros HRMS (ESI) se obtuvieron de un espectrómetro de
masas FTHRMS-Orbitrap (Thermo-Finnigan). Los disolventes se destilaron antes del uso y
los disolventes de grado espectral se utilizaron para las mediciones espectroscópicas. El
análisis de HPLC se realizó con un Dionex UltiMate3400 SD equipado con una bomba LPG-
3400SD acoplada a un detector de matriz de fotodiodos (DAD3000RS) y se usó el siguiente
gradiente (MeOH, 0.1% HCOOH en H2O): 0 min (10% MeOH); 5 min (10% de MeOH); 45
min (100% de MeOH); 60 min (100% de MeOH). La cromatografía en columna incluyó
Sephadex LH-20 y Merck MN Silica gel 60M (0.04–0.063mm). La HPLC semipreparativa se
realizó utilizando un sistema de HPLC Merck Hitachi (detector de UV L- 7400; Bomba L-
7100; Eurosphere-100 C18, 300 × 8 mm).
Tabla 2 Datos de RMN 1H de los compuestos 1–5.

a Grabado en CDCl3 a 600MHz.

b Grabado en acetona - d6 a 600MHz.
c Grabado en DMSO - d6 a 600MHz.
3.2. Material fungico
Los hongos endofíticos se aislaron de la mancha recogida en el estiércol. Peter-Ording
(Alemania del Norte) en marzo de 2017. Se identificó como Aphanoascus fulvescens
por amplificación de ADN y secuenciación de la región ITS como se describió
anteriormente [16]. A. fulvescens se cultivó en medio de arroz sólido en 30 ejemplares
de Erlenmeyer. El medio de arroz se preparó con agua desmineralizada (110 ml) y
arroz (100 g) en un recipiente de Erlenmeyer, seguido de autoclave (121 ° C, 20 min).
El hongo, una vez que cubrió toda la superficie de una placa de Petri, se inoculó en
este medio de arroz estéril debajo del banco limpio y luego se dejó crecer a 20 ° C
durante 28 días en condiciones estáticas.

3.3. Extracción y aislamiento.

El extracto bruto de EtOAc (5,85 g) se sometió a cromatografía líquida al vacío en gel
de sílice con una elución en gradiente por etapas de n-hexano-EtOAc y CH2Cl2-MeOH
para dar seis fracciones (Fr.A a Fr · F). P. B (eluido con 60% de n-hexano y 40% de
EtOAc) se sometió a un Sephadex LH-20 columado con CH2Cl2-MeOH (1: 1), seguido
de una bifurcación usando HPLC semipreparativa (MeOH-H2O: 0–2min, 55%; 2– 25
minutos, de 55% a 80%; 25-30 minutos, 100%) para rendir 1 (2,8 mg), 4 (1,5 mg), 8
(1,2 mg) y 12 (3,3 mg). P. C (eluido con 40% de n-hexano y 60% de EtOAc) se fraccionó
en una columna Sephadex LH-20 con MeOH y luego se separó mediante HPLC
semipreparativa (MeOH-H2O: 0-2 min, 35%; 2-28 min, de 35% a 58%; 28-30 min.,
100%) para rendir 9 (1.1 mg), 10
(1.3mg) y 11 (4.8mg). P. D (eluido por 25% de n-hexano y 75% de EtOAc) se sometió a
una columna de gel de sílice usando CH2Cl2-MeOH (15: 1) y se separó adicionalmente
mediante HPLC semipreparativa (MeOH-H2O: 0-2 min, 40%; 2–15min, del 40% al 55%;
15–30min, del 55% al 80%, 30–32min, 100%) para dar 2 (2,1 mg), 6 (9,3 mg), 7 (5,8
mg) y 16 (6.4mg). P. E (eluido con 70% de CH2Cl2 y 30% de MeOH) se fraccionó en una
columna de fase inversa C-18 usando un gradiente escalonado de MeCN / H2O, dando
como resultado 4 subfracciones (Fr.E1 a Fr.E4). El Fr.E3 se purificó aún más mediante
HPLC semipreparativa (MeOH-H2O: 0–2min, 25%; 2–15min, de 25% a 40%; 15–30min,
de 40% a 65%, 30–32min, 100 %) para obtener 3 (2.4 mg), 5 (1.4 mg), 13 (2.1 mg), 14
(1.8 mg) y 15 (2.0 mg).

Okaramina V (1): aceite incoloro; [α] 20 D + 30,4 (c 0,1, MeOH); Datos de RMN de 1H y
13C, tablas 1 y 2; HRESIMS m / z 541.2810 [M + H] + (C32H37N4O4, calculado
541.2809).
Okaramina W (2): aceite amarillo claro; [α] 20 D − 19.6 (c 0.15, MeOH); Datos de RMN
de 1H y 13C, tablas 1 y 2; HRESIMS m / z 541.2799 [M + H] + (C32H37N4O4, calculado
541.2809).
Okaramina X (3): aceite incoloro; [α] 20 D + 52,4 (c 0,15, MeOH); Datos de RMN de 1H
y 13C, tablas 1 y 2; HRESIMS m / z 523.2706 [M + H] + (C32H35N4O3, calculado
523.2704).
 Okaramina Y (4): polvo amarillo; [α] 20 D + 351 (c 0,1, MeOH); Datos de RMN de 1H y
13C, tablas 1 y 2; HRESIMS m / z 635.3227 [M + H] + (C38H43N4O5, calculado
635.3228).
Okaramina Z (5): aceite incoloro; [α] 20 D − 32.7 (c 0.2, MeOH); Datos de RMN de 1H y
13C, tablas 1 y 2; HRESIMS m / z 509.2903 [M + H] +

3.4. Ensayo de citotoxicidad

La citotoxicidad se probó contra las células de linfoma de ratón L5178Y utilizando un
ensayo MTT [17]. Los experimentos se repitieron tres veces y se llevaron a cabo por
triplicado. Kahalalide F y 0.1% EGMME / DMSO se utilizaron como controles positivos
y negativos, respectivamente.

Reconocimiento
X.Y. desea agradecer al Consejo de Becas de China, el Ministerio de Educación de
China, por una beca de doctorado. PÁGINAS. Quiere agradecer a la Fundación
Manchot por su apoyo. Estamos en deuda con la Dra. Margareta Proksch por ayuda
durante la recolección de muestras.
Anexo A. Datos suplementarios.
Los datos complementarios a este artículo se pueden encontrar en línea en https: //
doi.org/10.1016/j. Fi tote.2019.05.007.

Referencias

[1] D.K. O'Toole, Characteristics and use of okara, the soybean residue from soy milk
production — a review, J. Agric. Food Chem. 47 (1999) 363–371.
[2] S. Furutani, M. Ihara, K. Kai, K. Tanaka, D.B. Sattelle, H. Hayashi, K. Matsuda,
Okaramine insecticidal alkaloids show similar activity on both exon 3c and exon 3b
variants of glutamate-gated chloride channels of the larval silkworm, Bombyx mori,
NeuroToxicology 60 (2017) 240–244.
[3] S. Furutani, Y. Nakatani, Y.Miura, M.Ihara, K.Kai,H.Hayashi, K.Matsuda, GluCl a
target of indole alkaloid okaramines: a 25 year enigma solved, Sci. Rep. 4 (2014) 6190.
[4] C.Y. Lai, I.W. Lo, R.T. Hewage, Y.C. Chen, C.T. Chen, C.F. Lee, S. Lin, M.C. Tang, H.C.
Lin, Biosynthesis of complex indole alkaloids: elucidation of the concise pathway of
okaramines, Angew. Chem. Int. Ed. 56 (2017) 9478–9482.
[5] P.R. Hewitt, E. Cleator, S.V. Ley, A concise total synthesis of (+)-okaramine C, Org.
Biomol. Chem. 2 (2004) 2415–2417.
[6] J.M. Roe, R.A.B. Webster, A. Ganesan, Total synthesis of (+)-okaramine J featuring
an exceptionally facile N-reverse-prenyl to C-prenyl aza-Claisen rearrangement, Org.
Lett. 5 (2003) 2825–2827.
[7] J.Cano,M.Sagués,E.Barrio,P.Vidal,R.F.Castaneda,J.Gené,J.Guarro,Molecular
taxonomy of Aphanoascus and description of two new species from soil, Stud. Mycol.
47 (2002) 153–164.
[8] J. Bohacz, Biodegradation of feather waste keratin by a keratinolytic soil fungus of
the genus Chrysosporium and statistical optimization of feather mass loss, World J.
Microbiol. Biotechnol. 33 (2017) 13.
[9] T. Otsuka, Y. Muramatsu, T. Nakanishi, H. Hatanaka, M. Okamoto, M. Hino, S.
Hashimoto, WF14865A and B, new cathepsins B and L inhibitors produced by
Aphanoascus fulvescens, J. Antibiot. 53 (2000) 449–458.
[10] H. Hayashi, T. Fujiwara, S. Murao, M. Arai, Okaramine C, a new insecticidal indole
alkaloid from Penicillium simplicissimum, Agric. Biol. Chem. 55 (1991) 3143–3145.
[11] Y. Shiono, K. Akiyama, H. Hayashi, New okaramine congeners, okamines J, K, L, M
and related compounds, from Penicillium simplicissimum ATCC 90288, Biosci.
Biotechnol. Biochem. 63 (1999) 1910–1920.
[12] H. Hayashi, K. Takiuchi, S. Murao, M. Arai, Structure and insecticidal activity of
new indole alkaloids, okaramines a and B, from Penicillium simplicissimum AK-40,
Agric. Biol. Chem. 53 (1989) 461–469.
[13] H. Hayashi, A. Sakaguchi, Okaramines G, a new okaramine congener from
Penicillium simplicissimum ATCC 90288, Biosci. Biotechnol. Biochem. 62 (1998) 804–
806.
[14] H. Hayashi, Y. Asabu, S. Murao, M. Arai, New okaramine congeners, okaramines
D, E, and F, from Penicillium simplicissimum ATCC 90288, Biosci. Biotechnol. Biochem.
59 (1995) 246–250.
[15] H. Hayashi, K. Furutsuka, Y. Shiono, Okaramines H and I, new okaramine con-
geners, from Aspergillus aculeatus, J. Nat. Prod. 62 (1999) 315–317.
[16] J. Kjer, A. Debbab, A.H. Aly, P. Proksch, Methods for isolation of marine-derived
endophytic fungi and their bioactive secondary products, Nat. Protoc. 5 (2010) 479–
490.
[17] M. Ashour,R. Edrada, R.Ebel, V.Wray, W. Wätjen, K.Padmakumar, W.E.G. Müller,
W.H. Lin, P. Proksch, Kahalalide derivatives from the Indian sacoglossan mollusk Elysia
grandifolia, J. Nat. Prod. 69 (2006) 1547–1553.

Nombre del autor

Bombero del autor

Nombre de autor