TorresMontero Jesus PDF

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS
Identificación y caracterización molecular de

cepas de Trypanosoma cruzi que circulan en
localidades rurales de la zona centro del estado
de Veracruz
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:
Doctor en Ciencias Biomédicas
PRESENTA:
Q.F.B. Jesús Torres Montero
Director de tesis:
Dr. Angel Ramos Ligonio
Xalapa, Ver. 31 de Octubre, 2012
Becario CONACYT No. 215333

JURADO
Dra. Aracely López Monteon
Dra. María de Jesús Rovirosa Hernández
Dra. Rossana Citlali Zepeda Hernández
Dra. Rosa Virginia García Rodríguez
Dr. Stefan Marian Waliszewski Kubiak

Esta tesis se realizó bajo la dirección del Dr. Angel Ramos Ligonio en el Laboratorio
LADISER Inmunología y Biología Molecular de la Facultad de Ciencias Químicas de la
Universidad Veracruzana, ubicado en la ciudad de Orizaba, Veracruz. México, con el
apoyo financiero del Fondo Mixto Gobierno del Estado de Veracruz – CONACYT
convocatoria 2007, con número de proyecto 67927. Además del recurso del programa
de becas para estudios de posgrado otorgado por el CONACYT No. de Becario
215333.
Dedicatorias
Se dedica esta Tesis afectuosamente a la Dulce Madre de Jesús. Nadie quiere a su hijo
Jesús tanto como ella.
A mi Madre
 Delfina Montero de Torres por su infinito Amor, por su paciencia, sus desvelos, la
comprensión que ha mostrado para conmigo. Además de sus atenciones y demás
dedicaciones... Gracias Mamá.
A mi Padre
 Roberto Torres Ramírez (Finado) por tener siempre dibujada una sonrisa en su rostro. Por
la Educación, el Respeto, el Amor que me brindo y la manera en que me enseño a ganar
el pan de cada día. Por ser un Gran Amigo... Gracias Papá.
... Los Amo
Es por ello que este trabajo es un obsequio a ustedes con todo mi Amor en honor a
ustedes.
Agradecimientos
A Dios
 Por darme la vida, mi Familia y ponerme una prueba más que superar. Gracias Señor.
A mi Familia
 A mis Hermanos y Hermanas: José Antonio, Miguel, María de los Ángeles, Antonia, José
Roberto, Hermelinda, Claudio, Rubén, Javier, que me han apoyado y han estado conmigo
en momentos difíciles y en situaciones hermosas; teniendo la certeza que siempre
contare con ustedes y ustedes conmigo. Porque Gracias a ustedes seguí con mis estudios,
y este trabajo es también de ustedes. Los Quiero Mucho.
 A mis Tíos (as), Primos (as), Sobrinos (as), cuñadas (os) y ahijado, que si los nombrara a
todos creo me llevaría más hojas de las que realicé en este trabajo de tesis... jejeje.
Muchas Gracias; ya que me han animado, apoyado y sobre todo que me entusiasman
cada día a seguir adelante. Muchas Gracias los Quiero Mucho Familia y sin ustedes este
logro no se habría realizado.
 A mis Abuelitos maternos y paternos que a pesar de que ya no están conmigo, siempre
los llevaré en mi mente y en mi corazón. Esto es de ustedes.
Ah y si piensan que aquí acaba todo; no es así, ya que empieza una nueva etapa, por lo
que a seguirme soportando jejeje.
...Muchas Gracias Familia
 A la familia de los Ricardos, Puebla. Así como amigos que viven en ese lindo lugar.
 A la familia de Xalapa, a la tía Evencia, primos (as) y sobrinos (as) que me brindaron su
hospitalidad. Muy agradecido Familia.
A mis amigos
 María Alejandra Ávila Castro por el apoyo brindado, por animarme durante el posgrado,
y a su linda y querida Familia. Gracias por tus consejos. Gracias Amiga mía.
 Miguel Angel Vela Zárate por su amistad brindada desde la licenciatura. Gracias Amigo.
 Néstor Rafael Quintero Murga y a su apreciable familia por su amistad y buenos consejos
que me has dado. Gracias Amigo.
 A los demás amigos que me dieron su confianza y mucho ánimo. Gracias por soportar
algunas situaciones difíciles; pero sobre todo por compartir momentos padrísimos; y que
sé contaré con ustedes y ustedes conmigo. Muchas gracias Karlita, Norita, Leidy Victoria,
Selene, Paco, Oscar, Mayra, Luz, Soledad, Carlos, Tavo, y creo me faltan.
 Al grupo de la escuela de pastoral y demás hermanos. Gracias por su apoyo y sus

oraciones.
 Al MRCCES de San Juan Bautista – Nogales, Ver., “Bienaventuranzas” le doy Gracias a

Dios por conocerlos y ser parte de mi vida. Muchas gracias por sus oraciones chicos.
Quisiera expresar mi sincera gratitud
 En primer lugar a la Mtra. Sofía Canales Chávez por haberme puesto en las manos de
Grandes Seres Humanos: “Dra. Chely” y “Dr. Ángel”. Mi admiración y respeto por
siempre.
 Al Dr. Ángel Ramos Ligonio que como Director me ha guiado y brindado la confianza en la
realización de este trabajo de investigación. Así mismo, por contar con su amistad y
respeto. Mucha Gracias Doc.
 A la Dra. Aracely López Monteon (Dra. Chely) por la maravillosa persona que es, Por
enseñarme las diferentes metodologías de trabajo, por su franqueza y ser una gran
amiga e iniciarme, apoyarme y animarme a la realización de estos estudios de
Doctorado. Además de formar parte del jurado. Gracias Dra. Chely.
 Al Dr. Eric Dumonteil por ser una gran persona, que me brindo hospitalidad, apoyo y
amistad desde el primer momento de conocerlo. Por su disposición y colaboración
durante la elaboración experimental del presente trabajo. Así como durante la
publicación de los artículos. Muchas Gracias Dr. Eric, es usted un ser humano Mayoreo...
 Al Dr. Víctor Manuel Monteon Padilla por instruirme con nuevos conocimientos durante
mi estancia en San Francisco de Campeche, Campeche, y a su esposa la Dra. Ruth por la
oportunidad de conocerlos, su amabilidad y gran hospitalidad que me ofrecieron.
 Al Dr. Roberto Zenteno Cuevas por las clases que me impartió, además de formar parte
del comité tutorial, con sus finos y acertados comentarios, que gracias a esas
observaciones fui avanzando en el desempeño de este trabajo y que me hizo ver que no
todo es tan fácil. Así como el apoyo al facilitarnos el equipo para secuenciar. Muy
agradecido con usted.
 Al Dr. Stefan Marian Waliszewski Kubiak por las clases que me impartió y por formar
parte del comité tutorial, le agradezco sus observaciones en cuanto a mi desempeño en
los tutoriales, las cuales me permitieron seguir delante, además de insistir en concluir y
presentar la tesis.
 A la Dra. María de Jesús Rovirosa Hernández por formar parte del jurado y por la revisión
que realizó al trabajo de tesis para finalmente concluirla, a pesar de las labores con las
que cuenta le agradezco su tiempo y sus observaciones.
 A la Dra. Rossana Citlali Zepeda Hernández por formar parte del jurado, además de la
exhaustiva revisión realizada al trabajo de tesis, que ayudó a la conclusión de la misma.
Le agradezco el tiempo para y sus observaciones.
 Al Dr. Enrique Meza por formar parte del jurado y por las observaciones realizadas en el
examen; además de aquellas descritas en el trabajo de tesis que permitieron la
conclusión de la misma. Muy agradecido con usted.
 A la familia que funge como equipo de trabajo en el LADISER Inmunología y Biología

Molecular, y ahora colegas: Laura Mónica Álvarez Rodríguez, Yadira Moran Utrera,
María de Lourdes Hurtado Melgoza, Daniel Guzmán Gómez por su disposición y apoyo
durante la realización del presente trabajo experimental.
 A los doctores que impartieron las clases y a los compañeros del Doctorado en Ciencias
Biomédicas, por las experiencias y gratos momentos en que convivimos. Lau, Yadi,
Arnold, Betzy, Nahum, Citlalli, Héctor, Mago, Diana y Eva… un honor haber formado
parte de la primera generación del Doctorado en Ciencias Biomédicas y compartirla con
ustedes.
 A los jóvenes Joaquín Israel Medorio Velázquez, Ernesto Yobal y Daniel por su apoyo en
algunos de los experimentos realizados en este trabajo y que durante su estancia en el
LADISER Inmunología y Biología Molecular mostraron ser muy trabajadores y dedicados
además de grandes seres humanos.
 A todos los estudiantes que han realizado experiencia recépcional, servicio social ó
estancias en el LADISER Inmunología y Biología Molecular; ya que una vez que están
dentro de él, de alguna u otra manera forman parte del desempeño de cada trabajo que
se realiza, y en este caso no es la excepción. Gracias por dejar que les mostrara un
poquito de lo que he aprendido, pero sobre todo les comparto que aprendo mucho de
ustedes. Recordándoles que ustedes serán las mentes del mañana.
 A la Profesora Eulalia Margarita Murillo Figueíras por el tiempo en que realizó su tesis de
maestría en el LADISER Inmunología y Biología Molecular, en donde compartimos
muchas experiencias. Gracias maestra por sus consejos y por su paciencia. He aprendido
muchas cosas de usted. Gracias por motivarme a salir adelante.
 A la participación de la gente en el proyecto, ya que sin su ayuda esta investigación no se

hubiese llevado a cabo.
 Al Centro de Salud y Protección Animal de Orizaba; Veracruz, por la autorización en la

toma de muestra sanguínea de animales, que sirvió para el análisis de las preferencias
alimenticias de los vectores en la investigación.
TÍTULO
Identificación y caracterización molecular de cepas de

Trypanosoma cruzi que circulan en localidades rurales de la
zona centro del estado de Veracruz
ÍNDICE
Página
ÍNDICE DE TABLAS……………………………………………...……………..... v
ÍNDICE DE FIGURAS…………………………………………………………....... vi
LISTA DE ABREVIATURAS……………………………………………………... ix
RESUMEN........................................................................................................ xi
ABSTRACT……………………………………………………………………….... xii
INTRODUCCIÓN.............................................................................................. 1
1. ANTECEDENTES…………………………………………………….............. 2
1.1 CAPÍTULO I ENFERMEDAD DE CHAGAS......................................... 2
1.1.1 Consideraciones generales……………………………………… 3
1.1.2 Consideraciones clínicas………………………………………… 4
1.1.3 Fisiopatología……………………………………………………..... 5
1.1.4 Cuadro clínico………………………………………………………. 6
1.1.5 Diagnóstico y tratamiento………………………………………... 11
1.1.6 Epidemiología de la enfermedad de Chagas........................... 14
1.1.7 Enfermedad de Chagas en México……………......................... 20
1.2 CAPÍTULO II CICLOS DE TRANSMISIÓN DE T. cruzi....................... 25

1.2.1 Transmisión vectorial…………………………………………...… 26
1.2.2 Transmisión por transfusión sanguínea……………………….. 27
1.2.3 Transmisión transplacentaria……………………………………. 28
1.2.4 Otras formas de transmisión…………………………………….. 28
1.2.4.1 Transmisión accidental…………………………………... 28
1.2.4.2 Transmisión oral…………………………………………… 28
1.2.4.3 Transmisión por trasplante de órganos……………….. 29
1.2.4.4 Transmisión por vía sexual……………………………… 29
i
Página
1.3 CAPÍTULO III L0S TRIATOMINOS……………………….……………. 30
1.4 CAPÍTULO IV CICLO DE VIDA DE T. cruzi........................................ 33

1.4.1 Ciclo biológico de T. cruzi en el triatomino………………....... 33
1.4.2 Ciclo biológico de T. cruzi en el huésped…………………….. 36
1.5 CAPÍTULO V El GENOMA DE T. cruzi............................................... 38
1.6 CAPÍTULO VI IDENTIFICACIÓN DE T. cruzi .................................... 41

1.6.1 Microscopia directa…………………………………..……………. 41
1.6.2 Aporte de la biología molecular en la detección de T. cruzi.. 41
1.7 CAPÍTULO VII CARACTERÍZACIÓN MOLECULAR DE T. cruzi…... 44
1.8 CAPÍTULO VIII UTILIZACIÓN DE ENSAYOS DE HETERODÚPLEX

ACOPLADO A PCR (HDA-PCR) PARA LA IDENTIFICACIÓN DE
FUENTES DE ALIMENTACIÓN.……………………………………….... 47
1.8.1Citocromo b………………………………………………………….. 48
2. JUSTIFICACIÓN………………………………………………………………. 51
3. HIPÓTESIS…………………………………………………………………….. 51
4. OBJETIVOS…………………………………………………………...………. 52
4.1 Objetivo general…………………………………………………………. 52
4.2 Objetivos específicos…………………………………………………… 52
ii
Página
5. METODOLOGÍA………………………………………………………………. 53
5.1 Recolección de vectores……………………….………………………. 53
5.2 Obtención de las muestras a partir del vector para la
identificación de T. cruzi……………………………………………….. 54
5.3 Identificación y caracterización de T. cruzi por la
amplificación de un fragmento específico mediante PCR……...... 55
5.4 Caracterización de cepas de T. cruzi en linajes por
amplificación del dominio divergente D7 del gen 24Sα rRNA y
del dominio de tamaño variable de la secuencia 18SrRNA…….... 56
5.5 Extracción de DNA de vectores……………………….………………. 59
5.6 Clasificación de T. dimidiata mediante la amplificación de
ITS-2………………………………………………………………………... 59
5.7 Recolección de sangre de animales reservorios…..………..…..… 60
5.8 Obtención del DNA de las muestras sanguíneas y de lavados
intestinales de vectores………..………………………………………. 60
5.9 Análisis Heterodúplex-PCR (HDA-PCR)……………………………... 61
5.10 Cultivo de T. cruzi a partir de vectores infectados vivos……….. 63
5.11 Análisis de datos……………………………………………………….. 63
6. RESULTADOS………………………………………………………………… 64
6.1 Recolección de vectores……………………………………………….. 64
6.2 Amplificación del kDNA para diagnóstico de T. cruzi…………….. 67
6.3 Caracterización de linaje de T. cruzi…………………………………. 69
6.4 Caracterización de vectores colectados (T. dimidiata)
en grupos mediante amplificación de ITS-2……………………….. 72
6.5 Obtención de amplificado de citocromo b………………………….. 76
6.6 Análisis Heterodúplex-PCR (HDA-PCR)……………………………... 78
iii
Página
7. DISCUSIÓN……………………………………………………………………. 83
8. CONCLUSIONES……………………………………………………………... 89
9. PERSPECTIVAS……………………………………………………………… 90
10. BIBLIOGRAFÍA………………………..……………..................................... 91
11. ANEXOS………………………………………………………………………... 104
iv
ÍNDICE DE TABLAS
Página
Tabla I. Cambios en los parámetros epidemiológicos por la 14

interrupción de la transmisión y descenso de la incidencia de la
enfermedad de Chagas. 1990-2000-2006
Tabla II. Municipios y localidades rurales que participaron en la 53

recolección de insectos vectores para llevar a cabo el estudio
Tabla III. Frecuencia de linajes ó DTUs de T. cruzi en T. dimidiata del 72

centro de Veracruz
Tabla IV. Análisis de identidad de la secuencia de fragmentos 81

específicos para citocromo b
Tabla V. Fuentes alimenticias de T. dimidiata de acuerdo a su hábitat 82
v
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1. Carlos Chagas (1878 – 1934) 3
Figura 2. Signo de Romaña en caso adulto 7
Figura 3. Dilatación patológica del esófago chagásico 10
Figura 4. Evolución de la esofagitis chagásica progresiva, demostrada

en cortes seriados del órgano en el material de necropsias 10
Figura 5. A. Estudio intestinal de bario por edema, observado en un

enfermo con estreñimiento pertinaz y dilatación del abdomen. B. 11
Estudio Post mortem del megacolon chagásico
Figura 6. Xenodiagnóstico 12
Figura 7. Flujo de migraciones de América Latina hacia regiones no

endémicas para la enfermedad de Chagas 16
Figura 8. Especies domiciliarias más comunes de Triatominos en

América Latina 19
Figura 9. Casos de Enfermedad de Chagas. México 1928-2004 21
Figura 10. Filogeografía de Triatoma dimidiata 23
Figura 11. Ciclo selvático, peridomiciliario e intradomiciliario de

T.cruzi en mamíferos y en el humano 26
vi
Página
Figura 12. Mecanismo de infección por T. cruzi en el humano 27
Figura 13. Estadios del triatomino vector 32
Figura 14. Formas de T. cruzi en el humano ó huéspedes reservorios 34
Figura 15. Ciclo de vida de T. cruzi 37
Figura 16. Representación esquemática del minicírculo de T. cruzi 39
Figura 17. Maxicírculo de T. cruzi 40
Figura 18. Distribución de Linajes y sublinajes de T. cruzi en América 46
Figura 19. Estructura proteica del citocromo b 48
Figura 20. Esquemas de la estructura de la proteína citocromo b 49
Figura 21. Diagrama para diferenciar el linaje de T. cruzi en lavados de

vectores empleando el gen mini-exón y las subunidades 24Sα rRNA y 56
18S rRNA como marcadores moleculares
Figura 22. Distribución geográfica de T. dimidiata en la zona centro de

Veracruz 65
Figura 23. Viviendas en condiciones apropiadas para la proliferación

de T. dimidiata en la zona centro de Veracruz 66
vii
Página
Figura 24. Amplificación del fragmento específico de T. cruzi por PCR 67
Figura 25. Variaciones estacionales en colectas de T. dimidiata 69
Figura 26. Caracterización de linaje de T. cruzi 70
Figura 27. Tipificación molecular de linaje en cepas de T. cruzi 71
Figura 28. DNA de vectores en gel de agarosa 1% 72
Figura 29. Caracterización de vectores colectados (T. dimidiata)

mediante amplificación de ITS-2 para el grupo 2 74
Figura 30. Dendograma de T. dimidiata 75
Figura 31. Obtención de DNA genómico 76
Figura 32. Estandarización de la amplificación del fragmento del gen

de citocromo b 77
Figura 33. Amplificado de 383 pb del gen citocromo b de posibles

fuentes alimenticias 78
Figura 34. Patrones de Heterodúplex para la identificación de las

fuentes de alimentación de T. dimidiata 79
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
A Adenina
ACDI Agencia Canadiense para el Desarrollo Internacional
AMPc Adenosin monofosfato cíclico
C Citosina
DNA Ácido desoxirribonucleico
dNTP’s Desoxinucleótidos trifosfatados
DTUs Unidades de tipificación discretas
ELISA Ensayo inmuno absorbente ligado a enzima
G Guanina
HDA Análisis de heterodúplex
HDA-PCR Análisis de heterodúplex acoplado a PCR
IgM Inmunoglobulina M
IFI Inmunofluorescencia indirecta
kDNA Ácido desoxirribonucleico de cinetoplasto
LIT Infusión de Hígado - Triptosa
LPG Lipofosfogliclanos
Mb Megabases
NNN Novy, Nicolle y McNeal
NOC Nivel optimo de conocimiento
NOM Norma Oficial Mexicana
OM Observación microscópica
OMS Organización Mundial de la Salud
OPS Organización Panamericana de la Salud
Pb Pares de bases
PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa
RAPD Amplificación Aleatoria de DNA Polimórfico
RNA Ácido ribonucleico
RNAr Ácido ribonucleico ribosomal
T Timina
ix
TA Tripanosomiasis Americana
T. cruzi Trypanosoma cruzi
T. rangeli Trypanosoma rangeli
T. brasiliensis Triatoma brasiliensis
T. dimidiata Triatoma dimidiata
T. infestans Triatoma infestans
T. sordida Triatoma sordida
TC I Trypanosoma cruzi I
TCII Trypanosoma cruzi II
TCIIa Trypanosoma cruzi IIa
TCIIb Trypanosoma cruzi IIb
TCIIc Trypanosoma cruzi IIc
TCIId Trypanosoma cruzi IId
TCIIe Trypanosoma cruzi IIe
UNDP Programa de las Naciones Unidas para el Desarrollo
x
RESUMEN
La enfermedad de Chagas (o Tripanosomiasis Americana) es endémica y de alto

impacto en Salud Pública en el Continente Americano, presentándose muchos casos en
el estado de Veracruz, México. Es causada por el parásito protozoario Trypanosoma
cruzi, el cual presenta gran diversidad genética. En este trabajo se estudio la dinámica
de infestación de los vectores de la enfermedad de Chagas para comprender la
transmisión de la enfermedad y diseñar estrategias de control efectivas. Se colectaron
insectos en 42 localidades rurales de los municipios de Omealca, Tezonapa, Tierra
Blanca y Zongolica de la zona centro del estado de Veracruz, confirmando la gran
distribución de Triatoma dimidiata en esta región. Se demostró un claro patrón de
infestación principalmente por insectos adultos. El parásito ha sido clasificado dentro de
seis linajes (TcI y TcIIa, TcIIb, TcIIc, TcIId, TcIIe) ó unidades típicas discretas (DTUs) y
se realizó la caracterización molecular de las cepas presentes en Triatoma dimidiata, el
principal vector en el centro de Veracruz, México. Sorprendentemente, TcI sólo
representó el 27% (9/33) de las cepas identificadas, y se reportó por primera vez la
presencia de TcIIb, TcIIc, TcIIa y TcIId de cepas en México, con una frecuencia
relativamente alta (13-27% cada una). Nuestras observaciones indican una gran
diversidad de DTUs de T. cruzi que anteriormente se estimó en al menos una parte de
México. Estos resultados tienen implicaciones importantes para la comprensión de la
filogeografía de las DTUs de T. cruzi y la epidemiología de la enfermedad de Chagas en
Norte América. El análisis de las fuentes de alimentación de Triatoma dimidiata con un
ensayo de Heterodúplex acoplado a PCR indicó una alimentación frecuente de los
humanos, de acuerdo con la alta seroprevalencia observada anteriormente. Las fuentes
de alimentación también confirman una dispersión significativa de insectos entre los
hábitats. La alta capacidad de dispersión y la infestación temporal por tanto puede ser
una característica común de varias de las especies de este complejo. Por lo tanto sería
esencial adaptar intervenciones de control vectorial debido a este comportamiento para
mejorar la eficacia y sustentabilidad, ya que el control de T. dimidiata ha sido
notablemente difícil.
xi
ABSTRACT
Chagas disease (or American trypanosomiasis) is endemic and major public health
importance in America, with cases in the state of Veracruz, Mexico. Is caused by
Trypanosoma cruzi, which presents extensive genetic diversity. We investigated here
the dynamics of house infestation by Chagas disease vectors to understand disease
transmission and design effective control interventions. Bug were collected in 42 rural
villages the municipalities of Omealca, Tezonapa, Tierra Blanca and Zongolica of central
Veracruz state, confirming the widespread distribution of Triatoma dimidiata in this
region. The collection data further indicated a clear pattern of seasonal infestation by
mostly adult bugs. The parasite has been classified into six lineages (TcI y TcIIa, TcIIb,
TcIIc, TcIId, TcIIe) or discrete typing units (DTUs) and we performed here the molecular
characterization of the strains present in Triatoma dimidiata, the main vector in central
Veracruz, Mexico. Unexpectedly, TcI only represented 27% (9/33) strains identified, and
we reported for the first time the presence of TcIIb, TcIIc, TcIIa and TcIId strains in
Mexico, at a relatively high frequency (13-27% each). Our observations indicate a much
greater diversity of T. cruzi DTUs than previously estimated in at least part of Mexico.
These results have important implications for the understanding of the phylogeography
of T. cruzi DTUs and the epidemiology of Chagas disease in North America. Analysis of
feeding sources of Triatoma dimidiata with a PCR-heteroduplex assay indicated a
frequent feeding of humans, in agreement with the high seroprevalence previously
observed. Feeding sources also confirmed a significant dispersal of bugs between
habitats. High dispersal capabilities and seasonal infestation may thus be a shared
characteristic of several of the T. dimidiata sibling species from this complex. It would
thus be critical to adapt vector control interventions to this behavior to improve their
efficacy and sustainability, as the control of T. dimidiata has been notoriously
challenging.
xii
Caracterización y Clasificación Molecular de Trypanosoma cruzi
INTRODUCCIÓN
La enfermedad de Chagas ó Tripanosomiasis Americana (TA) es una

enfermedad infecciosa que se encuentra ampliamente diseminada y es considerada
como un problema importante de salud pública que afecta a toda América Latina. El
agente causal de la enfermedad es el protozoario hemoflagelado Trypanosoma cruzi (T.
cruzi), y su principal mecanismo de transmisión es el vectorial, por insectos de la familia
Reduviidae, siendo el principal género Triatoma. La presencia del parásito se mantiene
en los ecosistemas debido al establecimiento de insectos vectores principalmente
cuando cuentan con suficientes fuentes de alimento, ya que pueden alimentarse de
diversas especies animales. Entre las principales especies animales de origen silvestre
se encuentran los armadillos, zarigüeyas, zorros y roedores; además de animales de
tipo domiciliar como perros y gatos, los cuales también son susceptibles de infectarse
por T. cruzi y pueden participar como reservorios. Se ha descrito que la prevalencia de
esta enfermedad se encuentra estrechamente relacionada con el subdesarrollo y la
pobreza en las zonas urbanas marginales y rurales de América Latina, donde las
condiciones precarias de las viviendas son el sitio ideal para la colonización por
triatominos, incrementando el riesgo de infección con la presencia de reservorios
domésticos. El aportar estudios y conocimientos acerca de los vectores que pueden
transmitir al parásito, constituye un avance epidemiológico muy importante. Conocer si
los vectores portan al parásito, indica el riesgo en el que la población está expuesta de
padecer la infección por T. cruzi por habitar en zonas endémicas en convivencia con el
agente vector. Recientemente se ha clasificado a T. cruzi en líneas filogenéticas, las
cuales incluyen distintos linajes. Debido a la gran diversidad genética que presenta
actualmente el parásito es necesario clasificar a T. cruzi y estudiar los hábitats en
donde éste se localice para proponer estrategias de control del vector y de la misma
enfermedad, con el fin de obtener una correlación entre la heterogeneidad de cepas y
su tropismo tisular (presentación clínica de la enfermedad). Por otra parte, el conocer la
clasificación del vector, sus fuentes de alimentación y su distribución en la zona, así
como identificar la presencia de T. cruzi en el vector representa un acercamiento de
gran alcance epidemiológico para determinar los ciclos de transmisión de las diversas
poblaciones del parásito entre los vectores y especies mamíferas.
1
1. ANTECEDENTES
1.1 CAPÍTULO I
ENFERMEDAD DE CHAGAS
La enfermedad de Chagas llamada también Tripanosomiasis Americana es una

enfermedad crónica que afecta la salud y el bienestar de un gran número de seres
humanos, además de ser una causa de mortalidad y morbilidad en América Latina, se
estima que 9 a 12 millones de individuos son los afectados (Schofield et al., 2006). El
parásito protozoario hemoflagelado Trypanosoma cruzi, es el agente causal de la
enfermedad de Chagas; descrita por primera vez por el Dr. Carlos Justiniano Riveiro
das Chagas (Figura 1), al examinar el contenido intestinal de insectos hematófagos
llamados “barbeiros”, observando protozoarios flagelados muy similares en cuanto a su
morfología y movimiento a los trypanosomas causantes de la enfermedad del sueño
(Chagas, 1909; Náquira y Cabrera, 2009).
El 14 de abril de 1909, Carlos Chagas examina a una niña de 2 años de edad,

llamada Berenice, a quien detecta fiebre, hepato y esplenomegalia; por la sospecha de
malaria, examina el frotis sanguíneo y encuentra un protozoario flagelado similar al
observado en los “barbeiros”. Es así que se da el primer caso humano descrito en el
mundo (Chagas, 1909; Lewinsohn, 2003).
2
Figura 1. Carlos Chagas (1878-1934). Tomado de: Náquira y Cabrera, 2009.
1.1.1 Consideraciones generales
La enfermedad de Chagas es considerada una afección parasitaria hemática y

tisular cuyo agente causal es Trypanosoma cruzi, que es transmitido en forma natural
por insectos hemípteros hematófagos pertenecientes a la subfamilia Triatominae (Sosa,
1997). Introducido en el organismo este parásito, tras haber circulado por el torrente
sanguíneo, anida y se reproduce en la estructura tisular que conforman diversos tejidos
del organismo humano (como el corazón), donde genera inflamación e infección (Sosa,
1997).
3
1.1.2 Consideraciones clínicas
Desde el punto de vista de su etiopatogenia la infección chagásica se transmite

en forma natural a través de las deyecciones de triatominos contaminadas con T. cruzi,
cuando entran en contacto con los mismos animales silvestres, domésticos y el hombre
(Sosa, 1997). De lo mencionado anteriormente se puede expresar el trípode
epidemiológico que constituyen: el agente causal (T. cruzi), el vector (Triatomino) y el
huésped (hombre, animal doméstico, o animal silvestre) en el sustento de la
enfermedad de Chagas (Sosa, 1997). Para comprender mejor las fases que se suscitan
en las manifestaciones clínicas ocasionadas por la enfermedad de Chagas, es
necesario conocer que:
 T. cruzi es un protozoario de la clase Mastigophora, tiene tanto una forma

flagelada (tripomastigote) como una aflagelada (amastigote,
esferoamastigote), además de contar con una forma de transición y
evolutiva (epimastigote).
 Los tripomastigotes, se encuentran en las deyecciones de los insectos

vectores, los que poseen además las formas amastigotes y epimastigotes;
las últimas de éstas, también observadas en el hombre y algunos
vertebrados.
 Los tripomastigotes, se encuentran en la sangre del hombre y en otros

vertebrados (ratón, tlacuache, armadillo, etc.) como una forma circulante;
en cambio los amastigotes, se hallan en los tejidos.
 El agente transmisor, es un insecto de orden Hemiptera, de la familia

Reduviidae, perteneciente a la subfamilia Triatominae, Género Triatoma.
4
1.1.3 Fisiopatología
Al atravesar la barrera defensiva cutánea o mucosa por el sitio de la lesión, el

parásito penetra en el organismo, diseminándose a través de la sangre y de la linfa
alcanzando diferentes vísceras. T. cruzi se ubica en el corazón, sistema nervioso,
músculos, sistema retículo endotelial, aparato digestivo, sitios donde el parásito con la
forma aflagelada de amastigote realiza su reproducción por división binaria. El parásito
genera en cada asentamiento alteraciones inflamatorias y fenómenos de destrucción
tisular, vinculados con reacciones inmunopatológicas que determinan la persistencia de
la enfermedad (Sosa, 1997).
La fase aguda de la enfermedad de Chagas está relacionada con la presencia

del parásito en el organismo humano, cuyo cuadro clínico tiene correlación serológica,
hematológica e histopatológica, con nidos de amastigotes en los tejidos comprometidos,
donde al multiplicarse intracelularmente constituyen seudoquistes, los que al romperse
son fagocitados por los macrófagos, produciéndose el pasaje de algunos parásitos
como formas tripomastigote a la circulación sanguínea (Sosa, 1997).
En la fase crónica, es escaso el parasitismo tisular o está ausente. En ésta

juegan posibles factores inmunoalergénicos y neurotóxicos de importancia, ya que el
huésped parasitado puede elaborar una respuesta tanto al parásito como a sus propias
células (Sosa, 1997).
5
1.1.4 Cuadro clínico
Las personas infectadas presentan distintas fases durante la evolución de la

enfermedad de Chagas: aguda, indeterminada y crónica (Sosa, 1997).
Fase aguda
En la fase aguda el 95% de los casos son asintomáticos o no presentan ninguna

signología. Generalmente afecta a los niños. El periodo de incubación es
aproximadamente de una semana en las primeras décadas de la vida (de 0 a 9 años)
(Sosa, 1997; Náquira y Cabrera, 2009).
En el sitio de la inoculación puede presentarse una reacción inflamatoria

(chagoma). En muchos de los casos la puerta de entrada es en zonas de la cara,
pudiendo ser conjuntival; presentándose un complejo oftalmoganglionar, existiendo una
reacción inflamatoria conocida como signo de Romaña (edema bipalpebral unilateral,
ganglio preauricular aumentado de volumen) (Figura 2). Se estima que este signo se
presenta solo en 20% de los individuos infectados; pudiendo ser en ocasiones no
reconocible. En esta forma clínica puede ocurrir invasión de tejidos profundos, o bien el
chagoma de inoculación puede estar ubicado en cualquier otra parte del cuerpo (Sosa,
1997). Además, la fase aguda se caracteriza por el hallazgo de tripomastigotes
sanguíneos del parásito en el examen directo, gota fresca o microconcentración. Puede
tomar las características de un cuadro infeccioso constituido por: fiebre de variable
duración, cefalea, inapetencia, disnea, precordalgias, adenopatías, malestar,
linfadenopatía, hepatoesplenomegalia, dolor muscular y articular, somnolencia,
calambres; y además tener edemas, diarrea, disturbios respiratorios, broncopatía,
cianosis, etc. Estos signos pueden desaparecer entre la cuarta y octava semana (Sosa,
1997; Teixeira et al., 2006).
6
Figura 2. Signo de Romaña en caso agudo adulto, Tomado de: Vega y

Náquira, 2006.
El compromiso cardiológico se expresa como miocarditis aguda inespecífica con

pericarditis, mientras que la complicación neurológica se manifiesta por una grave
meningoencefalítis (Sosa, 1997).
La evolución suele ser más favorable cuando afecta a personas de mayor edad.
Los exámenes de rutina como el hemograma, muestran leucocitosis, linfocitosis,

monocitosis, neutropenia y posterior eosinofilia; eritrosedimentación ligeramente
elevada. Puede haber hipoproteinemia, hipoalbuminemia e hiperglobulinemia (Sosa,
1997).
Se ha demostrado (por biopsias de los músculos gemelos) la presencia de nidos

de amastigotes en tejido muscular, explicable por el tropismo de T. cruzi por el musculo
cardiaco y esquelético, abriendo una posibilidad para el diagnóstico histopatológico.
Este hallazgo permitió conocer mejor la evolución de la enfermedad (Fernán – Zegarra,
1972).
7
Fase Indeterminada ó subaguda
Esta forma clínica ocurre posterior a la etapa aguda, es la más frecuente y se

caracteriza por la ausencia ó escasas manifestaciones clínicas. Puede ser asintomática
durante unos 10 a 20 años, siendo única evidencia de infección, la brindada por la
serología específica, el nombre de indeterminada se debe a que no se puede señalar
cuál será la evolución de la infección, pues podría ser asintomática de por vida
(portador) o en algún momento pueden aparecer manifestaciones de la forma crónica
de la enfermedad (Sosa, 1997).
La Organización Mundial de la Salud (OMS) considera que el criterio para

declarar a una persona como infectada por T. cruzi es que tenga dos o más pruebas
serológicas reactivas, además, se debe tener en cuenta para clasificarla como
indeterminada o subaguda, la ausencia de síntomas. El tratamiento etiológico de los
casos indeterminados puede ser opcional; sin embargo, deben ser vigilados por largos
periodos (WHO, 2002; Coura y De Castro, 2002).
Fase crónica
Las manifestaciones crónicas más frecuentes de la enfermedad de Chagas son

las lesiones cardiacas y la organomegalia (megaformaciones). La lesión cardiaca puede
expresarse como miocarditis crónica, siendo la causa más frecuente de muerte súbita
en zonas endémicas y de incapacidad progresiva permanente (el 15% y 20% hacen
lesión miocárdica) (Sosa, 1997). Los compromisos cardiacos con trastornos de la
conducción e insuficiencia cardiaca tienen mal pronóstico y generalmente de curso fatal
(Campos et al., 2001).
8
Algunos autores sostienen que la gravedad de esta tripanosomiasis radica en la

frecuente evolución hacia la cardiopatía crónica, la que se instalaría después de varios
años de evolución, en la edad madura, constituyéndose de este modo en la principal
causa de mortalidad de la enfermedad de Chagas por insuficiencia cardiaca irreversible
o por muerte súbita, justamente cuando es mayor la capacidad productiva del hombre
(Sosa, 1997).
Las megaformaciones como el Megaesófago (Figura 3 y Figura 4) y el

megacolon (Figura 5) han sido descritas en muchos países endémicos. Las mismas
pueden ser (Sosa, 1997; Náquira y Cabrera, 2009):
Esofágicas: exteriorizadas por disfagia progresiva, dolor retroesternal,

regurgitaciones y crisis de epigastralgía.
Colónica: megacolon, con estreñimiento, meteorismo y disminución del reflejo

defecatorio.
Órganos huecos: estando comprometidos vísceras como el estómago,

duodeno, yeyuno, uréter y vejiga.
9
Figura 3. Dilatación patológica del esófago chagásico.

Paciente de 32 años con disfagia y regurgitaciones; la motilidad del
órgano estaba muy disminuida. (Cortesía del Dr. JM de Rezende,
de Goias, en Brasil). Tomado de: Carrada – Bravo, 2004.
Figura 4. Evolución de la esofagitis chagásica progresiva, demostrada en

cortes seriados del órgano en el material de necropsias. El esófago
denervado puede alcanzar cuatro veces su diámetro normal. (Cortesía del
Profesor Fritz Köberle, de Sao Paulo, Brasil). Tomado de: Carrada – Bravo, 2004.
10
Figura 5. A. Estudio intestinal de bario por enema, observado en un

enfermo con estreñimiento pertinaz y dilatación del abdomen. Diagnóstico:
megacolon chagásico. B. Estudio Post mortem del megacolon chagásico,
obsérvese la enorme dilatación del órgano denervado. (Observación
cortesía del profesor J. M. de Rezende, Universidad Federal del Goias, en
Brasil). Tomado de: Carrada – Bravo, 2004.
1.1.5 Diagnóstico y tratamiento
Para establecer un diagnóstico, éste debe elaborarse con base en el estudio

clínico-epidemiológico integral, además de los datos aportados por el laboratorio, dado
que los síntomas y signos recabados son inespecíficos. Un paciente, o un donador de
sangre, procedente de una región endémica puede tener serología positiva, e incluso se
puede llegar a identificar T. cruzi o algunos de sus productos químicos en la sangre,
pero sin que presente síntomas. Es importante realizar la búsqueda de triatominos
dentro del hogar del paciente (Carrada – Bravo, 2004).
11
Para el examen directo “en fresco” con microscopia de contraste de fases: se usa
la sangre venosa citritada en tubo capilar, se separan los eritrocitos por centrifugación, y
se aprovechan también los frotis de sangre delgados teñidos con Giemsa, y el examen
en la gota gruesa. En los cortes histológicos teñidos con hematoxilina – eosina pueden
verse los amastigotes (Carrada – Bravo, 2004).
El examen parasitológico puede lograrse en todos los casos agudos e

infecciones congénitas hasta seis semanas después de la infección, pero solo es
posible en 40% de los casos crónicos. El triatomino transmite la infección solo cuando
se alimenta y defeca al mismo tiempo; por eso es muy importante realizar la
investigación entomológica y ecológica de los vectores (Carrada – Bravo, 2004).
El xenodiagnóstico se realiza con diez o más ninfas de triatominos criados en el

laboratorio, se colocan dentro de una cámara pequeña que se pega sobre la extremidad
del paciente, por 20 minutos (Figura 6). Días después (10-30 días) se buscan los
tripomastigotes metacíclicos en las heces de los insectos (Carrada – Bravo, 2004).
Figura 6. Xenodiagnóstico. Las ninfas al picar la piel,

sacan la sangre infectada del enfermo y T. cruzi se
muestra en las heces del insecto.
12
El hemocultivo se practica al inocular al paciente en los medios de Noguchi, de

Warren ó NNN (Novy, Nicolle y McNeal), revisándolos cada semana durante varios
meses. Hay laboratorios que acostumbran inocular la sangre en los ratones de
laboratorio, con edades de tres a diez días, y se busca el parásito T. cruzi circulante
semanalmente, por un mes (Carrada – Bravo, 2004).
Las pruebas serológicas se hacen positivas cinco a quince días después de

haber padecido los síntomas. Las más utilizadas son la hemaglutinación indirecta (HAI),
inmunofluorescencia indirecta (IFI) y ELISA. Para los bancos de sangre es
recomendable usar solo una prueba de cribado; sin embargo, en casos con fase
crónica, debe efectuarse más de un método serológico. Prácticamente nunca se hallan
los parásitos en el examen microscópico directo; en tales enfermos debe aplicarse el
xenodiagnóstico con 40 ninfas de triatominos, el hemocultivo tiene éxito en 50%. Es de
gran ventaja el solicitar siempre un electrocardiograma y radiografías posteroanterior y
laterales del tórax, para valorar la cardiomegalia. La esofagografía con medio de
contraste y el estudio del colon con enema de bario suelen mostrar aumento del tamaño
y dilatación patológica de colon descendente, sigmoides y recto (Carrada – Bravo,
2004).
Para el tratamiento de casos en lactantes se administra nifurtimox 12 a 15 mg/Kg

al día, en niños mayores con infección aguda confirmada, se administra el nifurtimox por
vía oral, 8 a 10 mg/Kg al día divididos en tres dosis, por 50 a 120 días. En adolescentes
se aplica 8 mg/Kg al día. Sin embargo este fármaco puede producir anorexia, insomnio
y nerviosismo, así como neuritis periférica que obliga a retirar el medicamento, son
raras las alucinaciones y las convulsiones. En la fase crónica se aplica el benzonidazol,
4 a 7 mg/Kg, durante dos meses. Este medicamento produce náuseas, cefalea,
anorexia, dolor abdominal, pérdida de peso, mareos, astenia, vómito, polineuritis,
dermatitis exfoliativa, trombocitopenia y púrpura alérgica. Los cardiópatas o los
enfermos del tubo digestivo deben ser referidos al especialista, particularmente aquellos
con bloqueo auriculoventricular o arritmias de repetición (Carrada – Bravo, 2004).
13
1.1.6 Epidemiología de la enfermedad de Chagas
La Tripanosomiasis Americana es una de las enfermedades prioritarias para el

Programa del Banco Mundial de la OMS/UNDP. La Organización Mundial de la salud
estima que cerca de 8-11 millones de personas alrededor del mundo están infectados
por T. cruzi (Schofield et al., 2006). Después de la malaria, es la enfermedad más seria
y de amplia distribución en los seres humanos del continente americano. Además el
25% de la población de América Central y Sudamérica tiene riesgo de adquirir la
enfermedad (Rassi y Luquetti, 1992; Schofield et al., 2006) (Organización Mundial de la
Salud 2007) (Tabla I).
Tabla I. Cambios en los parámetros epidemiológicos por la interrupción de la transmisión y

descenso de la incidencia de la enfermedad de Chagas. 1990-2000-2006. Tomado de: TDR/WHO,
PAHO, WHO.
Parámetros Epidemiológicos 1990 2000 2006
Muertes anuales >45.000 21.000 12.500
Casos humanos de infección 30 millones 18 millones 15 millones
Nuevos casos anuales 700.000 200.000 41.200
Población en riesgo 100 millones 40 millones 28 millones
Distribución 21 países 21 países 21 países
La enfermedad de Chagas es considerada una parasitosis en América Latina y

una zoonosis ampliamente extendida, siendo la cuarta causa de mortalidad y morbilidad
en el continente. No existiendo hasta la fecha un tratamiento, ni profilaxis que ayuden al
control de la enfermedad (OPS/ACDI 2004).
14
La enfermedad presenta una amplia distribución geográfica, que se extiende

desde el sur de los Estados Unidos hasta el sur de Argentina y Chile, afectando a 21
países. Sin embargo se la ha encontrado en el norte del continente Americano; así
como en Europa y otros países no endémicos (Figura 7) (Schmunis., 1991; Schmunis.,
2007). A finales de la década de 1980 el número de inmigrantes indocumentados de
América Latina en los Estados Unidos procedentes de países endémicos para T. cruzi
fue de 2,24 millones, de los cuales 1,55 millones eran de México (Statistical abstract of
the United States 1989). La posibilidad de encontrar personas infectadas con el agente
infeccioso T. cruzi también existió en Europa, Australia y Japón, donde a finales de
1980 se encontró que vivían 250.000, 80.000 y 200.000 inmigrantes respectivamente,
procedentes de América Latina (Schmunis; 1991). Los inmigrantes en Japón eran
principalmente de ascendencia brasileña, cuyas condiciones de vida en Brasil hacían
poco probable que no se infectaran con T. cruzi. En los Estados Unidos, más de 7
millones de personas provenientes de países endémicos de T. cruzi se convirtieron en
residentes legales entre 1981 y 2005 (US Census Bureau 2007).
Hoy en día las dificultades económicas, los problemas políticos, o ambos, han
influenciado aún más la migración desde los países endémicos con enfermedad de
Chagas a los países desarrollados. Siendo el principal destino de esta inmigración
Australia, Canadá, España y los Estados Unidos. De hecho, la infección humana a
través de transfusiones de sangre o el trasplante de órganos, así como la confirmación
de casos con infecciones congénitas se han descrito en España y en los Estados
Unidos (Schmunis; 2007).
En Australia los reportes indican que en el periodo 2005 – 2006, 1067 de los
65,255 inmigrantes provenientes de América Latina (16 por cada 1000) pueden estar
infectados con T. cruzi, en Canadá en 2001, 1218 de los 131,135 inmigrantes (9 por
cada 1000) cuyo país de origen también fue identificado y pueden haber sido
infectados. En Europa, España se ha convertido en un imán para los inmigrantes de
América Latina desde el año 2000, 6,141 de los 241,866 inmigrantes legales en 2003
(25 por cada 1000) podrían estar infectados (Schmunis; 2007).
15
En los Estados Unidos, 38,777 a 339,954 de los 7,2 millones de inmigrantes

legales (de 5 - 47 por cada 1000), donde a partir del año 1981 – 2005 pueden estar
infectados. Además de aquellos inmigrantes indocumentados que a diario cruzan
nuevas fronteras (Schmunis; 2007).
Figura 7. Flujo de migraciones de América Latina hacia regiones no endémicas para la

enfermedad de Chagas. Tomado de: Schmunis, 2007.
La presencia de la enfermedad de Chagas data de hace más de 2000 años; se

ha demostrado el megacolon chagásico y posiblemente cardiopatía en momias
exhumadas pertenecientes a los indios Wankarani establecidos en el norte de Chile
(Cáceres, 2005).
16
Debido a que aún no se ha desarrollado una vacuna eficaz para prevenir la

enfermedad, las estrategias para su control tratan de disminuir la transmisión vectorial,
por tratarse de la forma de contagio más importante (Paz et al., 2002; Beaver et al.,
2003). Actualmente, las acciones de control que se llevan a cabo están dirigidas al
ataque químico de los vectores triatominos sin tener en cuenta que existen factores de
riesgo, como la falta de higiene, el desorden y la presencia de animales dentro de la
vivienda, que parecen ser responsables de la persistencia de focos de triatominos en
áreas rurales (D’Alessandro y Saravia, 1991). Por lo tanto, el rociado de las casas con
insecticidas no es una acción totalmente efectiva para erradicar la enfermedad (Moser
et al., 1989; Paz et al., 2002).
Teniendo en cuenta que el nivel de conocimientos de los habitantes de zonas

endémicas sobre la enfermedad y sus vectores debería ser un elemento más para su
prevención y control; existen nociones que constituyen el nivel óptimo de conocimientos
(NOC) sobre la enfermedad de Chagas que debe tener presente todo habitante de
áreas endémicas, además de los factores que participan en la propagación de
triatominos y sus diversas formas de transmisión (Westenberger et al., 2005), las cuales
se dan a conocer en el siguiente listado:
1) Reconocimiento de chinches adultas y de ninfas.

2) La presencia de triatominos (chinches) se detecta por las heces en las paredes.
3) Dentro del domicilio, los triatominos pueden estar en la cocina y dormitorios.
4) En el peridomicilio, los triatominos pueden estar en los gallineros, corrales y los
depósitos.
5) Los refugios de los triatominos están en la pared, el techo, debajo de la cama y
en grietas.
6) La falta de aseo y el desorden en las viviendas favorece la presencia de
triatominos.
7) Las viviendas tipo “rancho” (con paredes de adobe, sin revoque, con techos de
paja, teja, barro o caña) favorecen la presencia de triatominos.
8) Cuando hace calor la cantidad de triatominos es mayor.
17
9) Los triatominos se alimentan de sangre.

10) Los triatominos pican cuando su huésped está en reposo, preferentemente de
noche, y pueden picar a los seres humanos, a otros mamíferos y aves.
11) Los triatominos transmiten una enfermedad que afecta al corazón (Enfermedad
de Chagas).
12) Los triatominos transmiten la enfermedad de Chagas a través de las heces.
13) La enfermedad la causan los parásitos (Trypanosoma cruzi) que transmiten los
triatominos en las heces.
14) La transmisión vectorial de los parásitos se efectúa por heridas o escoriaciones
de la piel producidas por la picadura del triatomino.
15) Los triatominos nacen libres de infección, adquieren al parásito al alimentarse de
algún reservorio infectado por Trypanosoma cruzi (T. cruzi).
16) La enfermedad de Chagas también se puede transmitir a través de transfusiones
sanguíneas con sangre infectada con el agente infeccioso T. cruzi.
17) Existen otras vías de transmisión de la enfermedad de Chagas: congénita, por
trasplante de órganos, digestiva, sexual.
Existe una amplia variedad en la tasa de prevalencia, vía de transmisión,

características de los parásitos, patología clínica y reservorios entre una región
endémica y otra. Los cambios económicos y sociales en estas últimas cuatro décadas
han estimulado la migración humana desde las áreas rurales hacia las ciudades, lo que
favorece que las tasas de incidencia, mortalidad y prevalencia, estén en constante
cambio (Westenberger et al., 2005).
El parásito es transportado por triatominos vectores y se transmite al humano

como huésped a través de las heces del vector siendo la principal vía de transmisión o
a través de transfusiones sanguíneas que es la segunda vía de transmisión más
importante. En ciertos países se ha visto una reducción substancial como resultado de
una gran campaña para erradicar los vectores y controlar las transfusiones sanguíneas
(Paz et al., 2002).
18
A las especies domiciliarias, se les atribuyen más del 80% de los casos humanos
en áreas endémicas, entre estas especies se encuentran T. infestans, T. brasiliensis, T.
dimidiata, T. sordida, Panstrongylus megistus y Rhodnius prolixus (Figura 8), estas
especies son muy comunes en América Central y Sudamérica (Sanmartino y Crocco,
2000).
Figura 8. Especies domiciliarias más comunes de Triatominos en América Latina.

Modificado de: http://www.educhagas.com.ar/galeria_imageneshtml.
19
1.1.7 Enfermedad de Chagas en México
En la república mexicana se sabe de la existencia de la enfermedad de Chagas

desde 1937 y, aunque actualmente en México se desconoce la prevalencia exacta de la
enfermedad de Chagas. De acuerdo al informe del Taller Internacional de
Epidemiología, Diagnóstico y Control de la Enfermedad de Chagas, no hay datos
precisos sobre el nivel del control de la transmisión transfusional del parásito en México;
pero la principal falla es el flujo de información. Esta falta de información detectada se
intentó resolver con la elaboración de una Norma Oficial Mexicana (NOM) (ahora
NORMA Oficial Mexicana NOM-032-SSA2-2002), para la vigilancia epidemiológica,
prevención y control de enfermedades transmitidas por vector, en la que se dispone la
obligatoriedad del tamizaje universal para T. cruzi de la sangre a transfundir. Según
estimaciones de la Organización Mundial de la Salud - Organización Panamericana de
la Salud, en el año 2005 había en México un total de 1, 100,000 de infectados y 7,700
casos nuevos por transmisión vectorial (www.mex.ops-
oms.org/contenido/Chagas/sitiaciònmex.htm.).
Se estima que en México existen de 2-6 millones de personas infectadas, es

decir 1-2% con seroprevalencia nacional severa (Ramsey et al., 2003; Bottazzi et al.,
2011). México tiene las características geográficas, climáticas, socioculturales, y un
gran número de transmisores existentes como para considerar su importancia desde el
hallazgo de los primeros triatominos naturalmente infectados con T. cruzi. Por lo que
prácticamente se puede considerar como área endémica a toda la República Mexicana,
pero los estados del sureste, particularmente Veracruz es uno de los más afectados;
pues aunque sea en forma aislada se han reportado casos clínicos, personas con
anticuerpos contra T. cruzi, así como mamíferos reservorios e insectos vectores
infectados en forma natural (Cruz-Reyes y Pickering-López, 2006) (Figura 9).
20
Pocos estudios sobre la Enfermedad de Chagas se han desarrollado en el estado

de Veracruz, y han reportado una seroprevalencia de 0.9% en este estado (Salazar et
al., 2007). La prevalencia alcanzada en la parte norte del estado fue de 5.2%, en la
jurisdicción de Tuxpan. Sin embargo, recientemente se identificó un área de muy alta
seroprevalencia contra T. cruzi en la zona centro de Veracruz y en donde se sugieren
estudios rigurosos para lograr caracterizar la propagación de la enfermedad de Chagas
en la región y su dinámica de transmisión en humanos (Ramos-Ligonio et al., 2010).
Figura 9. Casos de Enfermedad de Chagas. México 1928-2004. Modificado de:

CHAGMEX, Instituto de Biología, UNAMhttp://www.unibio.unam.mx/chagamex.
Hasta la fecha no se sabe cual es la dimensión real de este problema y aunque

se han realizado estudios seroepidemiológicos, clínicos y de transmisores y reservorios,
aún no se ha logrado caracterizar su distribución, prevalencia y dinámica de transmisión
en el país (Velasco-Castrejón et al., 1992).
21
La mayoría de estos estudios se han realizado con metodologías y criterios muy

diversos, lo que dificulta hacer un análisis válido de la información; sin embargo, hay un
hecho real y aceptado: en México se ha detectado la presencia del vector transmisor
infectado, existen los reservorios habituales y han enfermado personas, lo que significa
que la enfermedad está presente (Goldsmith et al., 1983; Cortés et al., 1985; Sánchez,
1988).
A partir del estudio de Hoffman en 1928 se estableció que la especie de

triatomino Conorrhinus dimidiatus, actualmente denominada Triatoma dimidiata, es la
responsable de la transmisión de la enfermedad en México. Diversos estudios
realizados en las décadas siguientes han confirmado la asociación de este triatomino
con la transmisión de T. cruzi en estados del país (Hoffmann, 1928; Lent y
Wygodzinsky, 1979; Vidal-Acosta et al., 2000; Guzmán-Bracho, 2001). La única especie
de vector reportada en Veracruz es Triatoma dimidiata, la cual ha presentado
relativamente bajos índices de infestación e infección (10.9% y 9.0%, respectivamente),
pero un elevado índice de colonización (50%) (Salazar et al., 2007). Confirmando un
importante riesgo en la transmisión de T. cruzi en muchas partes del estado.
En efecto T. dimidiata es uno de los principales vectores de la enfermedad de

Chagas con una gran distribución geográfica que va desde la parte norte de
Sudamérica, Centro América y Sureste de México (Dorn et al., 2007; Gourbière et al.,
2011).
El género Triatoma incluye importantes especies de vectores, como T. dimidiata

el principal vector de América Central hasta Ecuador. Presentando gran diversidad
fenotípica, genotípica y de comportamiento en hábitats silvestres, peridomésticos y
domiciliarios. La combinación de análisis de secuencias de DNA, métodos filogenéticos
y variación genética son aprovechados para investigar a T. dimidiata. La filogeografía
de Triatoma indica dos líneas de colonización al norte y sur del Istmo de Panamá
durante periodos ascendentes, presentando T. dimidiata una gran variabilidad genética
relacionada con la divergencia evolutiva originada desde Guatemala a México.
22
Una comparación molecular de triatominos (incluyendo especies de América

Central de Complejo Phillosoma) han utilizado la secuencia del segundo espaciador de
transcrito interno (ITS-2) del DNA ribosomal (rDNA) mostrando una variabilidad
intraespecífica de la secuencia para T. dimidiata. De un grupo que confina en Yucatán,
Chiapas, Guatemala y Honduras se desencadena un meritorio estado existente de la
especie: T. sp. aff. dimidiata. El segundo grupo confiere cuatro subespecies: T. d.
dimidiata en Guatemala y México (Chiapas) sobre límites de Honduras, Nicaragua, Isla
Providencia, y se introduce en el Ecuador; T. d. capitata en Panamá y Colombia; T. d.
maculipennis en México y Guatemala; y T. d. hegneri en Isla Cozumel (Figura 10)
(Bargues et al., 2008).
Figura 10. Filogeografía de Triatoma dimidiata. Distribución y ubicación de rutas de

T. d. dimidiata, T. d. capitata, T. d. maculipennis, T. d. hegneri y Triatoma sp. aff.
dimidiata en Mesoamerica, Centro América y la parte norte y sur de América
representadas de acuerdo a estudios y análisis de variación genética basados en la
secuencia ITS-2 de rDNA. Modificado de: Bargues et al., 2008.
23
Las diferencias de los distintos haplotipos que presentan juegan un papel muy
importante en su clasificación en grupos: 1A - 1B, 2 y 3. Predominando los grupos 2 y 3
en México, los grupos 1A y 1B se presentan por lo regular en Centro América. Esta
distinción de taxas facilita mucho el entendimiento de la diversidad de los vectores
antes incluidos en T. dimidiata, difiriendo en la epidemiología y capacidad de
transmisión de la enfermedad. T. dimidiata ofrece más problemas de control ya que
continua su resistencia a pesar de rociar con insecticida en países como Ecuador
(Bargues et al., 2008). De tal forma que, la seroprevalencia y la presencia de la
enfermedad de Chagas depende de un conjunto de factores, es decir, de la abundancia
de triatominos vectores, el grado de la infección natural, el tipo de vivienda, higiene, las
condiciones ambientales y las necesidades de transfusiones de sangre en las diferentes
poblaciones. Esta enfermedad a diferencia de otras enfermedades parasitarias, se
relaciona con el desarrollo socioeconómico del país y frecuentemente se asocia a
enfermedades “sociales típicas”, tales como desnutrición, diarrea, tuberculosis y otras
enfermedades parasitarias (Paz et al., 2002). Se estima que existen un gran número de
géneros y especies de triatominos en la República Mexicana, por lo que la transmisión
vectorial de T. cruzi debe ser estudiada en forma particular en cada una de las regiones
geográficas de nuestro país. Se hace énfasis que solo Brasil se compara con México en
el número de vectores potenciales del agente etiológico de la enfermedad de Chagas,
de ahí la importancia de los estudios a realizar en cada región geográfica (Rassi y
Luquetti, 1992).
24
1.2 CAPÍTULO II
CICLOS DE TRANSMISIÓN DE T. cruzi
La Tripanosomiasis Americana presenta 3 ciclos de transmisión; uno llamado

selvático o silvestre, en el que el protozoario T. cruzi circula entre vectores y reservorios
silvestres a lo largo de la mayor parte del continente americano (Figura 11). Los
ecosistemas primitivos de T. cruzi son muy diversos, encontrándose en los desiertos
norteamericanos, altiplanos andinos, florestas amazónicas y atlántica. La
tripanosomiasis silvestre prefiere ambientes ecológicamente cerrados o semiabiertos,
dependiendo de una serie de factores como el clima, altitud, humedad, características
fauno florísticas y disponibilidad de alimentos. Entre otros prevalecen aquellos
ecosistemas donde los vectores pueden formar sus colonias tales como palmeras,
cocos, troncos, pedregales, etc., (Paulone, 1996).
Un segundo ciclo es conocido como peridomiciliario, en el cual el parásito tiene

como reservorios a mamíferos tanto domesticados como no domesticados (roedores
domésticos, marsupiales, gatos, perros) que libremente entran y salen de las
residencias y los triatominos silvestres que son atraídos por la luz de las casas y por el
alimento. Este ciclo sirve de unión a los ciclos silvestre e intradomiciliario (Paulone,
1996; Abad et al., 2001).
El tercer ciclo se denomina intradomiciliario, teniendo el parásito como reservorio

principal al humano. Los insectos vectores se conocen como intradomiciliarios (T.
infestans, Rhodnius prolixus, T. dimidiata). Por lo tanto, la transmisión vectorial al
humano es en el interior de la vivienda, siendo la transmisión vectorial la principal vía de
infección en el humano (Abad et al., 2001).
25
Figura 11. Ciclo selvático, peridomiciliario e intradomiciliario de T. cruzi en mamíferos y en

el humano. A: Triatominos hematófagos infectados se alimentan de mamíferos (rata, armadillo). B:
Alternativamente, el triatomino puede alimentarse del hombre y así iniciar el ciclo intradomiciliario
de la enfermedad de Chagas. Nótese la presencia del parásito en el cuerpo humano al observarse
el signo de Romaña (arriba derecha) y el chagoma de inoculación (abajo derecha). Tomado de:
Teixeira et al., 2006.
1.2.1 Transmisión vectorial
El mecanismo de transmisión más importante hacia los humanos y otros

mamíferos es a través de las heces de triatominos infectados (Figura 12), representa
del 80-90% de transmisión. De las más de 100 especies de triatominos conocidos, solo
pocos son epidemiológicamente importantes como vectores de T. cruzi y colonizan
casas de bajos recursos. Otras especies habitan en la zona silvestre y nunca invaden
las casas, sin embargo algunas especies selváticas salen de su hábitat natural e
invaden el espacio doméstico y eventualmente transmiten el parásito al humano y a los
mamíferos domésticos (Velasco-Castrejón, 1992; Ministerio de Salud, 2004).
26
Figura 12. Mecanismo de infección por T. cruzi en el humano. El mecanismo de transmisión

por T. cruzi más importante hacia el humano y otras especies mamíferas es a través de las heces
del insecto vector, una vez que éste se alimenta defeca y en sus deyecciones puede ir el parásito.
1.2.2 Transmisión por transfusión sanguínea
En el humano, la transfusión sanguínea es el segundo mecanismo de

transmisión más importante, representa de un 5-20%. Un grupo de alto riesgo para
adquirir la infección son los pacientes hemofílicos, ya que requieren de transfusiones
seguidas (Westenberger et al., 2005).
27
1.2.3 Transmisión transplacentaria
El riesgo de la transmisión transplacentaria oscila entre 0 y 9% según autores,

donde la mediana esta cerca del 1%. Es decir, el 1% de las gestantes chagásicas
corren el riesgo de transmitir la infección al producto. En humanos, el mecanismo
congénito parece ocurrir entre el tercer y quinto mes de embarazo, dependiendo de la
colonización y daño de la placenta por parte del parásito, desde donde es capaz de
infectar al feto (Cruz-López, 2003).
Los niños recién nacidos de madres infectadas generalmente presentan la forma

típica de enfermedad aguda asociada con prematurez, hepatoesplenomegalia,
parasitemia alta y la presencia de anticuerpos IgM específicos (Velasco-Castrejón,
1992).
1.2.4 Otras formas de transmisión
1.2.4.1 Transmisión accidental
Esta puede ocurrir en laboratorios o en hospitales, por el manejo inadecuado de

material biológico contaminado por parte de los mismos investigadores, o del personal
colaborador que no acata las medidas de seguridad en el laboratorio. Por ejemplo:
manejo de triatominos, manejo de medios de cultivos de T. cruzi, así como animales
con infección aguda, manejo de sangre de pacientes infectados (Cruz-López, 2003).
1.2.4.2 Transmisión oral
Este modo de transmisión no tiene importancia epidemiológica, es posible a

través de la ingesta de triatominos o mamíferos infectados y por la alimentación con
leche materna al bebe de mujeres infectadas. Existen poblaciones en donde utilizan a
los triatominos como alimento afrodisíaco (Cruz-López, 2003).
28
1.2.4.3 Transmisión por trasplante de órganos
El trasplante de órganos de donadores infectados es un modo de transmisión de

T. cruzi que ha recibido poca atención, dada la poca documentación de tales casos. Los
pacientes que han recibido transplante de órganos de donadores con la enfermedad
crónica desarrollan episodios agudos de la enfermedad y el parásito se puede aislar de
sangre periférica. Algunos casos fatales se han reportado, en los cuales los parásitos se
han identificado y aislado de diferentes órganos. Como los individuos receptores están
bajo terapia inmunosupresora, su susceptibilidad aumenta considerablemente (Velasco-
Castrejón, 1992).
1.2.4.4 Transmisión por vía sexual
Descrita por Miguel Jörg en los años 80’s donde aparentemente varones
susceptibles fueron contaminados a través de relación sexual con mujeres infectadas
crónicas donde se ha aislado el parásito de su líquido menstrual. En el laboratorio,
investigaciones clásicas de N. Larrier y de S. Campos, en los 20’s, revelaron la
presencia del parásito en el líquido espermático de ratas y perros con infección aguda,
lo que abre otra posibilidad (nunca detectada) de transmisión entre humanos (Pinto
Díaz, 2005).
Como otras posibilidades, la vehiculación esporádica y absolutamente pasajera

de T. cruzi por artrópodos hematófagos como cimicideos (chinches de cama),
garrapatas, pulicidios y mosquitos diversos sin duda puede ocurrir y resultar en la
transmisión del parásito al hombre, especialmente cuando la fuente infectante es una
persona o animal en fase aguda, con parasitemia muy alta (Pinto Díaz, 2005).
29
1.3 CAPÍTULO III

LOS TRIATOMINOS
Son insectos que se caracterizan por poseer aparato bucal succionador; la

mayoría son fitófagos, algunos predadores y unos pocos son hematófagos. Su
distribución abarca América y Asia, pero la mayoría de las especies se localizan en
América. En la Republica Mexicana los insectos triatominos reciben distintos nombres
coloquiales (Salazar-Schettino et al., 2005). Dependiendo la región en la que se le
encuentre; algunos de los nombres más comunes son:
 Ajediente (en Puebla)

 Atompitz (en Morelos)
 Chinches besuconas (en Guerrero, Jalisco, Morelos, Veracruz),
 Chinches hociconas (en Aguascalientes, Distrito Federal, San Luis Potosí)
 Chi-rai (en zona huichola de Nayarit)
 Chumil (en Estado de México)
 Gavodo (en Hidalgo)
 Hijacamat (en Veracruz)
 Hediondillo (en Chiapas)
 Juilititos (en Guerrero)
 Jumites (en Estado de México)
 Pick (Maya) (en la Península de Yucatán, Campeche)
 Picudas (en Aguascalientes, Guanajuato, Guerrero, Hidalgo, Jalisco,
Zacatecas)
 Puiscate (en Guerrero)
 Shami (en Guerrero)
 Sarriá (en Zona huichola de Jalisco)
 Talaje (en Campeche, Chiapas, Oaxaca, Quintana Roo, Tabasco,
Veracruz)
 Turicata (en Querétaro)
30
Estos hemípteros son de tamaño pequeño o mediano, el cual varía

considerablemente en los diferentes grupos de géneros. La coloración es generalmente
sencilla, no obstante, existen especies con colores vistosos (Figura 8).
La picadura de estos insectos es poco dolorosa y se puede soportar, provocando

sólo a veces un ligero prurito y en algunas ocasiones una ampolla en el lugar de la
picada, siendo la cara, los miembros superiores y los pies los más afectados. Al
momento o después de alimentarse, el triatomino hace una deyección líquida que tiene
dos aspectos: uno de color amarillento que se seca rápidamente al contacto con el aire
y otro que se seca lentamente y es de color negro (Figura 12). Este comportamiento de
picar y defecar se debe a la necesidad del triatomino de succionar más sangre y
almacenarla desocupando su intestino. Las chinches besuconas nacen libres de
infección, se infectan al alimentarse del hombre y de los animales domésticos o
silvestres que se encuentran infectados por el parásito hemoflagelado. El desarrollo de
los vectores naturales del parásito presenta varios estadios en su ciclo de vida. Los
huevos son colocados de 10 a 15 días después de la cópula. Cada hembra pone entre
100 y 600 huevos durante su vida. Aunque algunas hembras no apareadas pueden
poner algunos huevos, pero estos serán infértiles. El número de huevos puestos por
hembra depende de la cantidad de sangre ingerida. Los huevos son de forma elíptica.
Al inicio, son de color blanco-perla, posteriormente cambian a rosado o rojizo a medida
que el embrión desarrolla. El tiempo que transcurre desde la puesta de los huevos
hasta que eclosiona la primera ninfa puede ser entre 10 y 30 días. De huevo pasan por
cinco estadios ninfales (Figura 13), en los que son muy parecidos a los adultos pero de
menor tamaño y carecen de alas. La obtención de sangre para los triatominos es muy
necesaria para la muda y continuación de su desarrollo. El ciclo de vida de los
triatominos oscila entre 4 y 16 meses o más (Cáceres, 2005).
31
Transcurridos tres días después de emerger, las ninfas están listas para
alimentarse. Pueden ingerir sangre hasta nueve veces su peso, mientras que los
adultos, aproximadamente de 2 a 4 veces. Todos los estadios de ninfa pueden
sobrevivir durante períodos largos sin ingerir alimento, llegando en algunos casos hasta
11 meses. Los triatominos adultos se diferencian de la ninfa por sus alas anteriores y
posteriores bien desarrolladas y por ser sexualmente maduros (Cáceres, 2005).
Figura 13. Estadios del triatomino vector. Se muestran los diferentes estadios del
o
triatomino, vector de la enfermedad de Chagas. De izquierda a derecha: adulto, ninfa de 5
o
estadío, ninfa de 4 estadío, ninfa de 3er estadío, ninfa de 2do estadío, ninfa de 1er estadío y
huevecillo. (A) T. dimidiata. (B) R. prolixus. Tomado de: Cáceres, 2005.
32
1.4 CAPÍTULO IV
CICLO DE VIDA DE T. cruzi
1.4.1 Ciclo biológico de T. cruzi en el triatomino
T. cruzi es un organismo pleomórfico que tiene dos fases en su ciclo vital, una en
el hombre o huéspedes reservorios y otra en los insectos transmisores. En el huésped
mamífero se encuentra en sangre con la forma típica de tripomastigote y en las células
del sistema reticuloendotelial y otros tejidos adopta la forma de amastigote, durante su
transformación también adopta la forma de epimastigote y tripomastigote sanguíneo
(Figura 14) (Carmona, 2004). En el insecto transmisor, T. cruzi presenta la morfología
de epimastigote y tripomastigote metacíclico. También se puede encontrar una forma
llamada esferoamastigota (en el estómago del insecto vector y en determinadas
situaciones experimentales in vitro). Formas muy semejantes a las halladas en
humanos y otros reservorios (Figura 14) (Carmona, 2004). En cuanto a su aspecto, los
tripomastigotes toman una forma de S ó C, sus dimensiones son de 20µm de largo por
2µm de ancho aproximadamente; mientras que, los amastigotes son ovales o
redondeados (esferoamastigotes), y de un diámetro de 2µm - 4µm (Sosa, 1997).
33
Figura 14. Formas de T. cruzi en el humano ó huéspedes reservorios.

Se muestra las diferentes formas por las que pasa el agente etiológico de la
enfermedad de Chagas. Cuando se encuentra en tejido (amastigote),
pasando posteriormente por las formas epimastigote y tripomastigote
sanguíneo.
El ciclo biológico de T. cruzi en el huésped invertebrado puede realizarse en

larva, ninfa o en el insecto adulto, se inicia cuando la sangre de animales infectados es
ingerida por el insecto y siempre se efectúa en el intestino del triatomino (Sosa, 1997).
Las formas tripomastigotes ingeridas por el insecto se transforman en epimastigotes
cortos, algunas veces las formas epimastigotes se agregan dando la impresión de
masas multinucleadas. Los cuales se multiplican y producen las formas epimastigotes
largas que se encuentran en la parte posterior del intestino medio. Al cabo de 8 ó 10
días aparecen en el recto pequeños tripomastigotes que se han originado de los
epimastigotes. Estos tripomastigotes metacíclicos salen con las heces y son infectantes
para el hombre y los animales (Beaver et al., 2003).
34
Una etapa importante de la interacción de T. cruzi con el huésped invertebrado

es la adhesión de las formas epimastigotes a la superficie del epitelio del intestino
medio y posterior, así como a la capa cuticular del epitelio de la glándula rectal y del
saco rectal, lo que puede observarse 8 días después de la infección. Algunos datos
obtenidos por Schaub y cols. (1987, 1988), sugieren que la adhesión de los
epimastigotes ocurre por interacciones hidrofóbicas con una capa de cera que cubre la
cutícula del vector.
Estudios “in vitro” pueden mostrar que solo las formas epimastigotes son
capaces de adherirse y que la adhesión ocurre predominantemente por el flagelo. En la
glándula rectal se ha encontrado una unión del tipo hemidesmosoma entre la
membrana flagelar y el epitelio. Algunos datos sugieren que ciertos componentes de la
superficie del parásito como lipofosfoglicanos (LPG) están involucrados en el proceso
de adhesión y que esta ocurre en las membranas que cubren la superficie de las células
intestinales, llamadas membranas perimicrobiliares. En el tubo digestivo ocurre la
transformación hacia las formas tripomastigote. Existen evidencias de que un péptido
derivado de la globina es capaz de activar la adenil ciclasa presente en la membrana
plasmática de los epimastigotes, las cuales activan el proceso de metaciclogénesis;
también se ha considerado que la orina del insecto, descargada en el saco rectal,
estimulan la metaciclogénesis. El adenosin monofosfato cíclico (AMPc) presente en la
orina puede ser uno de los factores de la estimulación (Carmona, 2004).
Muchos han sido los estudios sobre la composición química y el metabolismo del
parásito. T. cruzi metaboliza la glucosa y otros azúcares, realizando una fermentación
aeróbica con excreción de ácidos orgánicos (Cano et al., 1995).
35
1.4.2 Ciclo biológico de T. cruzi en el huésped
El parásito transmitido al huésped vertebrado (mamíferos y humanos) en las

heces del triatomino es llamado en esta etapa tripomastigote metacíclico. Los
tripomastigotes pueden invadir inmediatamente las células en la puerta de entrada o ser
transportados en la sangre a otros sitios para invadir las células del huésped. Dentro de
las células se transforman en amastigotes que se multiplican rápidamente. Los
amastigotes son redondeados con un flagelo externo muy corto o inexistente. El
desarrollo de amastigotes a tripomastigotes se iniciaría después de cumplirse un
número preprogramado de divisiones intracelulares, al cabo de las cuales la célula
hospedera se destruye y los tripomastigotes entran en el torrente sanguíneo.
Los tripomastigotes en sangre circulante tienen flagelo libre, un cinetoplasto

voluminoso, terminal o subterminal que contiene el 30% del DNA del parásito, y un
núcleo oval. Estos tripomastigotes pueden infectar otras células, pero no son capaces
de multiplicarse en la sangre ya que la única forma replicativa en el vertebrado es la
forma amastigote intracelular (Figura 15; Carmona, 2004).
36
Figura 15. Ciclo de vida de T. cruzi. Cuando el insecto vector se alimenta de sangre infectada ingiere
tripomastigotes sanguíneos (5), los cuales en el lumen del tracto digestivo del insecto se transforman
en epimastigotes (6), forma replicativa no infectiva (7). Los epimastigotes se diferencian en
tripomastigotes metacíclicos (8), los cuales son liberados en las heces del insecto y entran al huésped
vertebrado a través de la herida ocasionada por la picadura. Los tripomastigotes metacíclicos invaden
las células del huésped (1); escapan de la vacuola y se transforman en amastigotes (2); se replican en
el citoplasma (3) se diferencian en tripomastigotes sanguíneos (4), los cuales son liberados por la
ruptura de la célula huésped (5). Un subcíclo alternativo en el huésped vertebrado puede ocurrir
cuando los amastigotes, son liberados por la ruptura prematura de la célula huésped (4a y 5a), o a
través de la diferenciación extracelular de los tripomastigotes (1a) estos son ingeridos por los
macrófagos, donde pueden sobrevivir y completar el ciclo intracelular. Modificado de: Carmona, 2004.
37
1.5 CAPÍTULO V
EL GENOMA DE T. cruzi
Las poblaciones de T. cruzi circulan en la naturaleza entre el hombre, el vector y

los reservorios. A lo largo de su ciclo evolutivo sufren alteraciones profundas de forma
que reflejan su adaptación al medio en que se localizan. Esas formas reciben nombres
diferentes en función de su aspecto general, de la manera como el flagelo emerge del
cuerpo celular y de la posición relativa de dos importantes estructuras intracelulares: el
núcleo y el cinetoplasto (Hernández-Rivas y Scherf, 1997).
Aunque T. cruzi es el agente causal de una de las enfermedades de mayor

mortalidad en Latinoamérica, su estudio a nivel molecular es muy limitado. En cuanto al
análisis de su cariotipo, producción de bandas cromosómicas y análisis de ligamiento,
muestran de 20 a 42 bandas cromosómicas que van de 0.45 a 3.5 Mb (Hernández-
Rivas y Scherf, 1997). Sin embargo, considerando que el contenido genómico total es
de 87 Mb, es muy probable que el número real de bandas cromosómicas sea más
grande. Se han identificado varios grupos de ligamento y se cree que T. cruzi sea
diploide, ya que se han observado cromosomas aparentemente homólogos. Por último,
se estima que el número de genes necesarios para mantener el ciclo de vida del
parásito sea mayor de 6,000 (Cano et al., 1995;
http://www.dbbm.fiocruz.br/genome/tcruzi/statisti.html.(2006).Trypanosomacruzi,elinvas
or).
Una estructura especializada de T. cruzi es el cinetoplasto (kDNA). El cual

constituye una red de DNA extranuclear localizada en un punto específico de la
mitocondria. Esta red representa una proporción importante del DNA total celular, ya
que, dependiendo de la especie, puede contener del 10-20% del DNA total en la célula
(Cevallos y Hernández, 2004).
38
El DNA del cinetoplasto está estructurado por la concatenación de dos tipos de

moléculas circulares de DNA: los minicírculos y los maxicírculos. Los minicírculos
forman la mayor parte de la estructura. Como su nombre lo indica, son moléculas
circulares de DNA con una longitud de 100-2,500 pb, estos se encuentran organizados
dentro de 4 regiones conservadas de 120 pares de bases (Figura 16). Por muchos años
se dudó sobre su función, ya que no contienen información genética evidente. Ahora se
sabe que codifican para RNAs pequeños que participan en el procesamiento (por
edición) de RNAs mensajeros mitocondriales (Telleria et al., 2006). Los maxicírculos
son moléculas mayores de DNA, que contienen una longitud de 30,000-50,000 pb
(Figura 17). Se encuentran en mucho menor número que los minicirculos. Representan
el equivalente al DNA mitocondrial de otros eucariontes, pues codifican RNAs de
proteínas, RNAs ribosomales y de transferencia (Cevallos y Hernández, 2004).
Figura 16. Representación esquemática del minicírculo de T. cruzi. Se muestra la

organización de las cuatro regiones conservadas (rectángulos en azul), de aproximadamente
120 pb cada una, conteniendo los bloques de secuencias más conservadas de la molécula:
BSC-1, BSC-2 y BSC-3 (rectángulos negros). Los iniciadores para la amplificación por la
PCR, para uso diagnóstico, fueron diseñados a partir de las secuencias de esos bloques
conservados. Las regiones con secuencias hipervariables de los minicírculos de 330 pb
(flecha roja) se encuentran intercaladas con las regiones conservadas. Modificado de:
Sturm, et al. 1989.
39
Figura 17. Maxicírculo de T. cruzi. Todos los genes se muestran en forma de flecha indicando
la dirección codificante. Las regiones que no codifican de ambos genomas son distintas unas a
otras. Con la excepción de los elementos conservados duplicados entre la región repetitiva y el
12S rRNA. Modificado de: Westenberger et al., 2006.
40
1.6 CAPÍTULO VI
IDENTIFICACIÓN DE T. cruzi
En cuanto a la determinación de la infección de T. cruzi en triatominos es

importante implementar programas para reducir la transmisión del parásito hacia los
humanos. Tradicionalmente, T. cruzi ha sido detectado en estos insectos por
observación al microscopio de las heces del triatomino. La sensibilidad de esta prueba
no ha sido bien definida ya que no había un método en el cual la microscopía pudiera
ser comparada. Sin embargo, se propuso que este estudio fuera comparado con la
sensibilidad a la reacción en cadena de la polimerasa (Shikanai-Yasuda et al., 1996).
1.6.1 Microscopía directa
La detección por microscopía directa de parásitos flagelados ha sido el método

tradicional para demostrar la presencia de la infección en vectores triatominos en sus
heces (usualmente obtenidas por extrusión abdominal), o como se ha recomendado, la
disección y el análisis del triatomino entero (D’Alessandro y Saravia., 1991). Una
complicación del ensayo por microscopía directa en América Central es la morfología
similar de un parásito aparentemente no patógeno, T. rangeli (Dorn et al., 1999).
1.6.2 Aporte de la biología molecular en la detección de T. cruzi
Pocos descubrimientos del complejo mundo científico actual pueden ser

considerados relativamente revolucionarios. La biología molecular ha sido afortunada
con grandes cambios en tiempos relativamente cortos. Tal es el caso de la técnica de la
reacción en cadena de la polimerasa (conocida como PCR por sus siglas en inglés),
considerada como la técnica más revolucionaria del último cuarto del siglo XX
(Rodríguez-Sánchez y Barrera-Saldaña; 2004).
41
La PCR es un método in vitro de síntesis de DNA con el que un segmento

particular de éste es específicamente amplificado al ser delimitado por un par de
iniciadores (oligonucleótidos, cebadores ó primers) que lo flanquean. Su copiado se
logra en forma exponencial a través de repetidos ciclos de diferentes periodos y
temperaturas de incubación en presencia de una enzima DNA polimerasa termoestable.
Así se obtienen en cuestión de horas millones de copias de la secuencia deseada del
DNA (Mullis., 1990; Templeton., 1992).
La PCR es una técnica de biología molecular altamente específica, rápida,

sensible y versátil para detectar cantidades ínfimas de un cierto DNA específico,
posibilitando su fácil identificación dentro de una mezcla tan compleja como el propio
genoma humano, donde la secuencia de interés representa tan sólo una
diezmillonésima parte. Además, por si estos atributos fueran pocos, la técnica es tan
robusta que puede usar como substrato para la reacción al DNA, sin tener que
purificarlo de su fuente natural, y es común emplear productos biológicos diversos como
tejidos embebidos en parafina, semen recuperado de escenas de violación, lavados
bronquiales, exudados de mucosas, raíces de cabellos o cejas, sangre, extendidos
citológicos, etc.; muchas veces basta una simple ebullición de la muestra para lisar,
liberar y de paso desnaturalizar el DNA dejándolo listo para la reacción (Rodríguez-
Sánchez y Barrera-Saldaña; 2004).
Las aplicaciones de la PCR son múltiples, abarcando desde la evolución hasta la

clínica, pasando por la genética, la biología molecular y la biotecnología. En
microbiología, la PCR permite identificar al agente infeccioso independientemente de su
respuesta serológica. Estudios de comparación para detectar T. cruzi en vectores,
confirman que el método de microscopía directa es relativamente menos costoso
comparado con la PCR, sin embargo este último es más sensible para medir el índice
de infección en los vectores, aún así el mejor sitio anatómico para la detección de T.
cruzi por PCR aun es investigado (Breniere et al., 1995; Rodríguez-Sánchez y Barrera-
Saldaña; 2004).
42
El desarrollo de una prueba de amplificación de DNA, puede llenar los requisitos

para tener una prueba confiable de diagnóstico parasitológico. En términos generales, si
los primers (oligonucleótidos ó iniciadores) son específicos y son empleados a la
temperatura de reconocimiento adecuada, el producto de amplificación debería ser
específico. T. cruzi presenta dos genomas distintos, situados en dos compartimientos
celulares bien definidos como el núcleo y la mitocondria (Telleria et al., 2006).
La técnica de la PCR además de ser empleada en la detección de T. cruzi en

vectores, ha sido utilizada para detectar a T. cruzi en pacientes, convirtiéndose en una
alternativa para la detección del parásito por microscopía directa, usando “primers”
complementarios a la región conservada del DNA mitocondrial. Otros ensayos de PCR
para la detección de T. cruzi han sido desarrollados usando “primers” que son
complementarios al DNA satelital ó a otras regiones del kDNA (DNA de cinetoplasto). El
ensayo de la PCR se basa en la amplificación de minicirculos que se localizan en el
kDNA, estos se encuentran presentes en 10,000-20,000 copias por parásito.
Recientemente, se ha mostrado que el ensayo de la PCR utilizando “primers” para las
regiones conservadas de los minicirculos del kDNA que puede detectar
aproximadamente 100 minicirculos en 100 microlitros de muestra. Por lo tanto, la
mayoría de las pruebas de amplificación para el diagnóstico de T. cruzi, son basadas en
secuencias provenientes del kDNA (Moser et al., 1989; Telleria et al., 2006; Burgos et
al., 2007).
43
1.7 CAPÍTULO VII
CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE T. cruzi
Varios estudios han demostrado que las poblaciones clonales de T. cruzi están
asociadas a ciertas especies de huéspedes mamíferos ya que los diversos genotipos
del parásito tienen sus propias características biológicas y genéticas que pueden
modificarse en la relación huésped-parásito (Diosque et al., 2004; Yeo et al., 2005).
Los programas de control periódicamente monitorean la prevalencia de infección

por T. cruzi en chinches, a través de la observación microscópica (OM) de heces
diluidas de triatominos activos. Sin embargo, la OM presenta sensibilidad limitada en
muestras con bajo número de parásitos y posee baja especificidad debido a infecciones
con otros tripanosomátidos; tales como T. rangeli y Blastocrithidia triatomae (Chiurillo et
al., 2003). La obtención de una mayor sensibilidad y especificidad de la infección por T.
cruzi en chinches se logra por el método de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), el cual puede aplicarse directamente a preparaciones de DNA obtenidas de
muestras fecales de los insectos (Russomando et al., 1996; Dorn et al., 2001).
Las poblaciones de T. cruzi presentan un alto grado de variabilidad

intraespecífica detectada por marcadores biológicos, bioquímicos, inmunológicos y
genéticos (Macedo et al., 2001). Estudios basados en la electroforesis de enzimas han
servido para clasificar a la población de T. cruzi dentro de tres grupos de zymodemos,
nombrados Z1, Z2 y Z3 (Miles et al., 1978). Algunos otros métodos, se han utilizado en
la caracterización de cepas de T. cruzi, tal es el caso de ensayos de Polimorfismo de
Longitud de Fragmentos de Restricción (RFLP) aplicados en el DNA de cinetoplasto de
T. cruzi en donde dicho material presenta una heterogeneidad genética sobre el
parásito, sin embargo, el análisis del RNA ribosomal proporciona un mejor dimorfismo
que la heterogeneidad polimórfica (Macedo et al., 1992; Souto y Zingales, 1993).
44
T. cruzi se ha clasificado dentro de 2 linajes filogenéticos T. cruzi I (TCI) y T. cruzi

II (TCII) (Anonymous, 1999), recientemente se incluyeron 5 sublinajes designados
TCIIa, TCIIb, TCIIc, TCIId y TCIIe (Brisse et al., 2000). Estos linajes de T. cruzi
aparecen por la distribución heterogénea entre especies de triatominos, huéspedes y
hábitats de toda América (Figura 18).
Estudios epidemiológicos sugieren que TCIIb, IId y IIe son los más relacionados
con ambientes antroponóticos y pacientes crónicos de la enfermedad de Chagas, los
linajes IIa y IIc con ambientes selváticos y el linaje I con ambos (Barnabé et al., 2000;
Brisse et al., 2001; Yeo et al., 2005).
Un estudio empleado como marcador genético generado mediante el análisis de

la amplificación aleatoria de DNA polimórfico (RAPD) de T. cruzi, sugiere que en México
el linaje I es el que predomina en distintos estados del país, formando un grupo
homogéneo para ambos ciclos (doméstico y selvático) sobre el área geográfica en
México (Figura 18). No así el linaje II característico de los ciclos domésticos en
Argentina, Brasil, Bolivia y Chile (Bosseno et al., 2002).
45
Figura 18. Distribución de Linajes y sublinajes de T. cruzi en América.

Modificado de: Noireau et al; 2009.
46
1.8 CAPÍTULO VIII
UTILIZACIÓN DEL ANÁLISIS DE HETERODÚPLEX ACOPLADO A PCR (HDA-PCR)

PARA LA IDENTIFICACIÓN DE FUENTES DE ALIMENTACIÓN
Un heterodúplex es una región de DNA de dos bandas en la cual cada banda

tiene orígenes diferentes, es decir; moléculas de ácido nucléico de doble cadena (DNA-
DNA ó DNA-RNA) los cuales contienen regiones mal apareadas de nucleótidos no
complementarios. In vivo, estos heterodúplex pueden producirse por mutación o
recombinación genética; mientras que in vitro, se forman por la hibridación de ácidos
nucléicos. La mayor parte del heterodúplex es una doble hélice perfecta, sólo presenta
un sitio con un solo nucleótido mal apareado. La formación de los heterodúplex y su
estabilidad depende sobre todo del tipo de mutación en el fragmento, las cancelaciones
y las inserciones grandes crean heterodúplex relativamente estables, los cambios de
solo una base son más sensibles a la temperatura, a los solventes, y a la fuerza iónica
del medio almacenador intermediario. No hay manera de predecir la influencia de éstos
parámetros en la estabilidad del heterodúplex (Oefner y Underhill, 1998).
El heterodúplex se basa en la formación de una doble cadena híbrida de DNA, a

partir de una cadena simple de DNA molde y de otra cadena simple de un DNA
diferente a la primera, con variación en su secuencia; como consecuencia de esto el
DNA híbrido (heterodúplex) tiene una región con al menos un par de bases mal
apareadas. La región del mal apareamiento produce una migración del DNA en gel de
poliacrilamida por la alteración de la conformidad adoptada por el DNA heterodúplex,
causada por una curvatura en la localización del mal apareamiento (Lee et al., 2002).
47
1.8.1 Citocromo b
Los citocromos son proteínas con intensas y características bandas de absorción

de luz visible, debido a sus grupos prostéticos de hemo que contienen hierro y que
funciona como centro activo. Poseen la capacidad de sufrir oxidación y reducción,
uniéndose y transportando oxígeno y electrones hacia moléculas orgánicas. La palabra
citocromo proviene del griego “cito”-célula y “cromo”- pigmento. En la mitocondria se
pueden encontrar tres clases de citocromos, designados con a, b y c, que se diferencian
en sus características espectrales en el visible. Los grupos hemos de los citocromos a y
b se encuentran unidos fuertemente, aunque no de forma covalente, a las proteínas a
las que se asocian. Los citocromos de tipo c se encuentran unidos por enlace
covalentes a residuos de cisteína. Los potenciales de reducción estándar del hierro
hemínico de un citocromo dependen de su interacción con las cadenas laterales de la
proteína, y son, por tanto diferentes en cada citocromo. Los citocromos de tipo a y b, y
algunos de tipo c son proteínas integrales de membrana (Figura 19).
Figura 19. Estructura proteica del citocromo b. En color rojo

se observa al grupo prostético hemo que le confiere absorción
en la luz UV funcionando como centro activo. Tomado de:
http://superfund.pharmacy.arizona.edu/toxamb/c1-1-1-2.html.
48
El gen del citocromo b se utiliza ampliamente en trabajos de carácter filogenético

por varias razones. Aunque se desarrolla lentamente en términos de substitución,
debido a que el índice de evolución es relativamente rápido. La mayor parte de las
posiciones variables parecen estar situadas dentro de las regiones que codifican para
los dominios transmembranales o para los extremos amino y carboxi terminal.
El citocromo b se encuentra localizado en la mitocondria de todos los organismos

eucarióticos y se encuentra localizado en el Complejo III de la membrana interna de la
mitocondria junto con otras proteínas formando a su vez el complejo citocromo bc1.
Éste tiene 11 subunidades en humanos, de las cuales sólo una, el citocromo b es
codificado por el DNA. El citocromo b es una proteína involucrada en el transporte de
electrones de la cadena respiratoria mitocondrial. Contiene ocho hélices
transmembranales conectadas por los dominios intramembranales o extramembranales
(Figura 20; Irwin et al., 1991).
Figura 20. Esquemas de la estructura de la proteína citocromo b. Se muestran las ocho

hélices transmembranales y la manera en que son conectados por los dominios
intramembranales y extramembranales. Modificado de: Irwin et al., 1991.
49
El amplio uso del citocromo b ha creado un estado métrico universal, en el

sentido que los estudios pueden ser comparados fácilmente. Sin embargo, el gen del
citocromo b está bajo apremios evolutivos fuertes porque solo algunas partes del gen se
han conservado esto debido las restricciones funcionales (Esposti et al., 1993).
La implementación de nuevas técnicas moleculares que permiten un análisis más

preciso en la investigación es una realidad en nuestros días, la aplicación del análisis de
heterodúplex acoplado a PCR (PCR-HDA) es una herramienta que se ha empleado
para identificar sangre de vertebrados utilizando la amplificación específica de una
secuencia del gen de citocromo b seguido del análisis de heterodúplex. El método de
PCR-HDA fue capaz de distinguir la sangre de vertebrados de los que se alimentaba la
mosca Simulium bipunctatum Malloch (negra) y la mosca Glossina palpalis (tsetse),
realizando la primera amplificación específica de una secuencia del gen de citocromo b
seguido del análisis de heterodúplex pudiendo identificar vertebrados a nivel género.
Recientemente se presentaron modificaciones a este ensayo, para lograr la
identificación de vertebrados a nivel especie; en la sangre de la cual se alimentan
algunos insectos (Boakye et al., 1999; Strachan y Read, 1999; Lee et al., 2002)
50
2. JUSTIFICACIÓN
La OMS estima que 8 a 11 millones de personas alrededor del mundo están

infectadas por T. cruzi, agente etiológico de la Enfermedad de Chagas. T. cruzi puede
ser transmitido por triatominos (chinches) distribuidos en distintas regiones geográficas
de América Latina. México así como la zona centro del estado de Veracruz no es la
excepción, presentando gran cantidad de triatominos. Saber si los vectores portan al
parásito, indica el riesgo en el que la población está expuesta de padecer la infección
por T. cruzi por habitar en zonas endémicas en convivencia con el agente vector.
Debido a la diversidad genética que actualmente presentan T. cruzi y su vector, es
necesario clasificarlos, para estudiar los hábitats en donde éstos se localicen y proponer
estrategias de control del vector y del parásito; con el fin de obtener una correlación
entre la heterogeneidad de cepas y su tropismo tisular. Por otra parte el conocer las
fuentes de alimentación y distribución de los vectores en la zona, y la identificación de la
presencia de T. cruzi en ellos, representa un acercamiento de gran alcance
epidemiológico para determinar los ciclos de transmisión de las diversas poblaciones
del parásito entre los vectores y especies mamíferas. Es por ello que es de vital
importancia realizar la tipificación molecular de cepas de T. cruzi aisladas de vectores
colectados en localidades rurales de la zona centro del estado de Veracruz para contar
con una información más certera sobre la epidemiología de la enfermedad en la región;
así como herramientas para la predicción y vigilancia entomológica de la enfermedad
que permitan a las autoridades de salud intervenir de forma más eficiente.
3. HIPÓTESIS
o De acuerdo a las condiciones geográficas de la zona de estudio se

encontraran chinches infectadas con Trypanosoma cruzi.
o De acuerdo a lo reportado y a la variabilidad intraespecífica, las cepas de
T. cruzi analizadas corresponderán mayoritariamente al linaje I.
o De acuerdo al lugar de recolección de las chinches la fuente de
alimentación principal será el hombre.
51
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general
Identificar y clasificar mediante métodos moleculares la (s) cepa (s) del parásito
Trypanosoma cruzi y al vector Triatoma dimidiata presentes en localidades rurales de la
zona centro del estado de Veracruz.
4.2 Objetivos específicos
1. Colectar insectos vectores de la enfermedad de Chagas en zonas rurales y

determinar sus perfiles geográficos.
2. Identificar la infección por T. cruzi en los vectores colectados utilizando para el

diagnóstico el método de PCR.
3. Caracterizar el linaje de las cepas de T. cruzi mediante la amplificación de

fragmentos específicos de la secuencia de T. cruzi.
4. Clasificar a los vectores colectados (T. dimidiata) en grupos mediante la

amplificación de ITS-2.
5. Crear un mapa de distribución de T. dimidiata en la región mediante los grupos

creados.
6. Mantener en cultivo las cepas de referencia de T. cruzi, así como las aisladas
de los vectores infectados que serán colectados en las localidades rurales.
7. Analizar las fuentes de alimentación de los vectores mediante un ensayo de

PCR amplificando un fragmento específico de citocromo b.
52
5. METODOLOGÍA
5.1 Recolección de vectores
Se visitaron zonas rurales de los municipios de Tezonapa, Omealca, Zongolica y

Tierra Blanca, pertenecientes a las jurisdicciones sanitarias de Córdoba y Orizaba en el
estado de Veracruz, localizados en 18°36’ de latitud norte y 96°41’ de longitud este. Un
total de 42 localidades rurales fueron incluidas y georeferenciadas (Tabla II).
Tabla II. Municipios y localidades rurales que participaron en la recolección de insectos

vectores para llevar a cabo el estudio.
Municipios Comunidades rurales correspondientes a cada municipio

Tezonapa Atlizacuapan, Caxapa, El Mirador, El Otate, El Suspiro, La Joya, Laguna Chica,
Las Josefinas, Limonestitla, Manantiales de los Altos, Monte Alto, Palmarito,
Paraíso La Reforma, Rancho Nuevo, Raya Caracol, San Agustín del Palmar,
Tepecoxtla, Villa Nueva, Almolonga
Zongolica Amatepec, Aticpa, Ayojapa, Chicomapa, Cuahuixtlahua, Dos Caminos
Omealca Ampliación Ojo de Agua, Colonia Benito Juárez, Cruz Tetela, Rincón de Buena
Vista
Tierra Blanca El Cimarrón, El Fraile, El Tamarindo, Magueyito, General Emilio Márquez

Galindo, Mata Anonilla, Mata Borrego, Matamaguey, Palmerinda, Pitalillo, San
Francisco El Viejo, Zapotillo
Se informó a las familias sobre el propósito del proyecto de investigación,

mencionando los beneficios de su participación en la colecta de insectos-vectores
(chinches) en el domicilio y peridomicilio. Posteriormente se inspeccionaron lugares
tales como tejados, corrales, árboles y otros refugios para triatominos (Dumonteil et al.,
2009). Los vectores se recolectaron en frascos de plástico debidamente rotulados
53
incluyendo localidad, nombre del recolector, fecha de colecta, estadio del vector (ninfa,
adulto), lugar donde se encontró (intradomiciliario, peridomiciliario o silvestre). Todos los
insectos capturados fueron llevados a las unidades médicas rurales de la localidad para
resguardarlas hasta ser transportados al LADISER Inmunología y Biología Molecular de
la Facultad de Ciencias Químicas para su análisis. Los insectos fueron colectados
durante el periodo 2006-2008.
Los índices entomológicos fueron calculados como lo define la OMS (infección,

% de triatominos infectados por T. cruzi; infestación, % de triatominos positivos en
casas y % de colonización de triatominos positivos en casas con ninfas) (WHO,
2002.Control of Chagas disease. World Health Organ Tech Rep Ser 905: 1-109).
5.2 Obtención de las muestras a partir del vector para la identificación de

T. cruzi
A partir de vectores vivos se obtuvieron las muestras de heces por compresión

abdominal, mediante el empleo de pinzas de disección, las heces fueron colectadas en
portaobjetos para posteriormente ser observadas al microscopio e identificar la
presencia del parásito.
A los vectores muertos, la muestra se obtuvo por lavado intestinal, usando para
esto una jeringa de insulina conteniendo 0.30 ml de agua desionizada, siendo
introducida el agua en forma repetida en el ano del vector, obteniendo posteriormente el
lavado intestinal. La solución obtenida se depositó en un tubo eppendorf de 0.6 ml,
donde se calentó a 95º C durante 10 min. Para extraer el DNA, se centrifugó a 13,000 
g por 10 min y se tomaron 10 µl del sobrenadante para la detección de T. cruzi por
PCR.
54
5.3 Identificación y caracterización de T. cruzi por la amplificación de un

fragmento específico mediante PCR
Las condiciones de PCR para el diagnóstico del agente infeccioso T. cruzi fueron
previamente descritas (Dorn et al., 1996; Dorn et al., 1999; Dumonteil et al., 2002),
usando oligonucleótidos específicos para las regiones conservadas de los minicirculos
del cinetoplasto.
Los primers específicos que se utilizaron para la amplificación por PCR son Tc1
5’-TTGAACGGCCCTCCCAAAAC-3’ y Tc2 5’-GATTGGGGTTGGTGAAATATA-3’,
amplificando una secuencia de 235 pb. La mezcla de PCR consistió en: Tris-HCl 10mM
a pH 9.0, 0.1% Tritón X-100, KCl 75 mM, MgCl2 2 mM, dNTP’s (dinucleótidos
trifosfatados) 0.1 mM, primers Tc1 y Tc2 20 pmoles para cada uno, 1 U (unidad) de
enzima Taq DNA polimerasa Gold (Perkin-Elmer), en un volumen final de reacción de
25 µl, mediante las siguientes condiciones de reacción: un paso de desnaturalización
inicial a 94°C durante 3 min., 35 ciclos que consisten en una desnaturalización a 94°C
por 1 min., un alineamiento a 55°C por 1 min. y una extensión a 72°C por 1 min. Al
término de los ciclos se utilizó un paso adicional de extensión a 72°C durante 10
minutos. Se emplearon como controles internos un DNA no relacionado y un control sin
DNA. Como control positivo se empleo DNA molde obtenido por calentamiento a partir
de un cultivo de epimastigotes de T. cruzi de la cepa MHOM/BR/1950/Y.
Al termino de la reacción, los productos de PCR fueron analizados en geles de

agarosa al 1.8%, empleando amortiguador TAE 1X (Tris-Acetato 40 mM, EDTA 1 mM,
pH 8.3) los cuales fueron visualizados mediante la tinción con Bromuro de Etidio (BIO-
RAD) a una concentración final de 0.5 µg/mL en presencia de luz UV en un
transiluminador (High Performance Ultraviolet Transilluminator).
55
5.4 Caracterización de cepas de T. cruzi en linajes por amplificación del

dominio divergente D7 del gen 24Sα rRNA y del dominio de tamaño variable de la
secuencia 18S rRNA
Figura 21. Diagrama para diferenciar el linaje de T. cruzi en lavados de vectores empleando el
gen mini-exón y las subunidades 24Sα rRNA y 18S rRNA como marcadores moleculares.
56
Una vez diagnosticado el agente infeccioso T. cruzi, la identificación de los linajes

TcI, TcIIa, TcIIb, TcIIc, TcIId, TcIIe en muestras positivas se realizó como lo describen
anteriormente (Brisse et al., 2001; Marcet et al., 2006) (Figura 21). En resumen, la
amplificación del espacio no transcrito del gen mini-exon permitió distinguir entre TcI,
TcIIb-TcIId-TcIIe y TcIIc-TcIIa, respectivamente. Empleando oligonucleótidos
específicos para las diferentes moléculas a determinar, los cuales fueron: TCC 5´-
CCCCCCTCCCAGGCCACACTG-3´, TC1 5’-GTGTCCGCCACCTCCTTCGGGCC-3’ y
TC2 5’-CCTGCAGGCACACGTGTGTGTG-3’ (Souto et al., 1996; Brisse et al., 2001;
Salazar-Schettino et al., 2005), amplificando una secuencia de 350 pb específica para
linaje I (TcI), 300 pb específica para linaje TcIIb-TcIId-TcIIe y sin amplificado en el caso
de TcIIc-TcIIa según sea el caso. La mezcla de reacción de PCR se llevó a cabo en un
volumen final de 25 µl conteniendo 1 U (unidad) de enzima Taq DNA polimerasa Gold
(Perkin-Elmer), 20 pmol de cada primer, 0.1 mM de dNTP’s (dinucleótidos trifosfatados),
2 mM de MgCl2, 20-50 ng de DNA de lavado de vector, en amortiguador 1X, las
condiciones de reacción consistieron en una desnaturalización inicial a 94ºC por 5 min,
35 ciclos que consistieron en una desnaturalización a 95ºC por 30 seg, un alineamiento
a 60ºC por 30 seg y una extensión a 72ºC por 30 seg, al termino de los ciclos se utilizó
un paso adicional de extensión final a 72ºC durante 5 min. Como controles se
manejaron cultivos de epimastigotes de T. cruzi de las cepas de referencia Nayarit y
MHOM/BR/1950/Y (linaje I y linaje II respectivamente).
Los productos de reacción de PCR se analizaron en geles de agarosa al 1.8%,

empleando amortiguador TAE 1X (Tris-Acetato 40 mM, EDTA 1 mM, pH 8.3) los cuales
fueron visualizados mediante la tinción con Bromuro de Etidio (BIO-RAD) a una
concentración final de 0.5 µg/mL en presencia de luz UV.
Las muestras correspondientes a TcIIa, TcIIb, TcIIc, TcIId, TcIIe fueron

clasificadas por la amplificación del dominio divergente D7 del gen 24Sα rRNA y del
dominio de tamaño variable de la secuencia 18S rRNA (Figura 21).
57
Se empleo el siguiente juego de primers: D71 (5’ - AAG GTG CGT CGA CAG
TGT GG) y D72 (5’ – TTT TCA GAA TGG CCG AAC AGT) para amplificar el dominio
divergente D7 del gen 24Sα rRNA. A aquellas muestras que no amplificaron un
producto de 300pb (TcIIb-TcIId-TcIIe) se les procedió a caracterizar la región del
dominio divergente D7 del gen 24Sα rRNA y así definir el linaje TcIIc en caso de
obtener un producto de amplificación de 110 pb; mientras que un producto de
amplificación de 120 pb ó 125 pb ó 130 pb definiría el linaje TcIIa. Las muestras que
presentaron amplificados de 300 pb específico de TcIIb-TcIId-TcIIe y que al analizar el
dominio divergente D7 del gen 24Sα rRNA presentó fragmentos de 110 pb (y un
fragmento de 125 pb tenue) caracterizaría al linaje TcIId; pero si solo presentaba un
producto de amplificación de 125 pb se analizaría el dominio de tamaño variable de la
secuencia 18S rRNA empleando los primers V1 (5’ – CAA GCG GCT GGG TGG TTA
TTC CA) y V2 (5’ – TTG AGG GAA GGC ATG ACA CAT GT; Clark y Pung, 1994),
amplificando una secuencia de 165 pb específica del linaje TcIIb, pero si no presentaba
amplificado alguno definiría al linaje TcIIe (Souto et al., 1996).
La mezcla de reacción de PCR para la determinación de los linajes se llevó a

cabo en un volumen final de 25 µl contiendo 1 U (unidad) de enzima Taq DNA
polimerasa Gold (Perkin-Elmer), 20 pmol del oligonucleótido a utilizar, 0.1 mM de
dNTP’s (dinucleótidos trifosfatados), 1.5 mM de MgCl2, 20-50 ng de DNA de lavado de
vector, en amortiguador 1X, las condiciones de amplificación aplicadas para el dominio
divergente D7 del gen 24Sα rRNA consistieron en un paso de desnaturalización a 94ºC
por 1 min, un paso de alineamiento a 60ºC por 1 min, un paso de extensión a 72ºC por
1 min, los cuales se repitieron durante 30 ciclos, seguido de un paso de extensión final
a 72ºC por 5 min (Brisse et al., 2001). Para la caracterización del dominio de tamaño
variable de la secuencia 18S rRNA las condiciones de amplificación consistieron en un
paso de desnaturalización a 94ºC por 1 min, un paso de alineamiento a 50ºC por 1 min,
un paso de extensión a 72ºC por 1 min, repitiéndose dichos pasos durante 30 ciclos,
seguido de un paso de extensión final a 72ºC por 5 min (Souto et al., 1996). Como
control se manejó cultivo de epimastigotes de T. cruzi de la cepa de referencia
MHOM/BR/1950/Y.
58
Los productos de reacción de PCR se analizaron en geles de agarosa al 1.8%,

empleando amortiguador TAE 1X (Tris-Acetato 40 mM, EDTA 1 mM, pH 8.3) los cuales
5.5 Extracción de DNA de vectores
El DNA de los triatominos se extrajo macerando extremidades del vector (patas,

alas) mediante el empleo de mortero, posteriormente se adicionó 400 µl de
amortiguador de digestión (Tris-HCl 1 M, NaCl 5M, EDTA 0.5 M pH 8, SDS 10%, H2O
desionizada), y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 90 minutos en un
tubo eppendorf. Al término de la incubación la muestra se centrifugó y se transfirieron
300 µl del sobrenadante a un nuevo tubo. El DNA se precipitó con 300 µl de isopropanol
durante 10 minutos, posteriormente la muestra se centrifugó durante 5 minutos a 16,024
 g. La pastilla obtenida una vez seca se resuspendió en 25 µl de H2O desionizada.
5.6 Clasificación de T. dimidiata mediante la amplificación de ITS-2
Una vez obtenido el DNA del triatomino se realizó la mezcla de reacción de PCR
llevándose a cabo en un volumen final de 25 µl contiendo: 20-50 ng de DNA, 1 U
(unidad) de enzima Taq DNA polimerasa Gold (Perkin-Elmer), 10 pmol de cada uno de
los oligonucleótidos específicos para ITS [ITS TdF 5´-
TGGAAATTTTCTGTTGTCCACA-3´, ITS Td 1R 5´- CTTGCTTTATACAACAAGAAGTA-
3´ (grupo 2), ITS Td 2R 5´- TCATTGTTTTATACAGGAAGTAAA-3´ (grupo 3)] (Herrera-
Aguilar et al., 2009), 0.1 mM de dNTP’s (dinucleótidos trifosfatados), 2 mM de MgCl2, en
amortiguador 1X; mediante las siguientes condiciones de reacción: un paso de
desnaturalización inicial a 94°C durante 5 min, 35 ciclos que consistieron en una
desnaturalización a 95°C por 30 seg, un alineamiento a 60°C por 30 seg y una
extensión a 72°C por 30 seg.
59
Al término del ciclaje se utilizó un paso adicional de extensión a 72°C durante 5

min, llevándose a cabo en un termociclador de gradiente (Mastercycler Gradient
Thermocycler Machine (Eppendorf)). Los productos de reacción de PCR fueron de 250
pb; y se analizaron en geles de agarosa al 1.8 %, empleando amortiguador TAE 1X
(Tris-Acetato 40 mM, EDTA 1 mM, pH 8.3), y fueron visualizados mediante la tinción
con Bromuro de Etidio (BIO-RAD) a una concentración final de 0.5 µg/mL en presencia
de luz UV. Además, algunos productos de PCR fueron secuenciados para confirmar la
identidad del ITS-2 del Grupo 2.
5.7 Recolección de sangre de animales reservorios
Las muestras sanguíneas fueron obtenidas a partir de animales como cerdos,

bovinos; para lo cual se acudió al rastro de la ciudad de Orizaba, así mismo se visitaron
rancherías cercanas a la ciudad en donde se obtuvieron muestras sanguíneas de
animales tales como: caballo, becerro, borrego, gallina, conejo, perro, gato, rata y ratón
que pueden formar parte del repertorio de alimentación del vector. La obtención de la
muestra de sangre se hizo con anticoagulante mediante el sistema vacutainer
almacenándolas en alícuotas de 500 µl a 4ºC hasta su uso.
5.8 Obtención del DNA de las muestras sanguíneas y de lavados

intestinales de vectores
Una vez colectada la sangre con anticoagulante (EDTA), a las alícuotas de 500
µl, se les agregó 1 ml de amortiguador de lisis para eritrocitos (NH4Cl 155 mM, KHCO3
1 mM, EDTA 0.1 mM); la mezcla se colocó en un tubo eppendorf de 1.5 ml, agitando
suavemente y se dejó reposar por un tiempo de 30 min en baño de hielo,
posteriormente se centrifugó a 183.96  g por 10 min (MIKRO 22 R Hettich).
60
Al término de la centrifugación se eliminó el sobrenadante, a la pastilla obtenida

se le agregó 250 µl de amortiguador SE (NaCl 75 mM, EDTA 25 mM) para ser
resuspendida, se añadió 2 µl de Proteinasa K (20 mg/ml) y 12.5 µl de SDS al 20%, se
agitó el tubo ligeramente y se incubó por 30 min a 37ºC en un baño con recirculación
automática (Cole-Parmer), al término de la incubación se agregaron 250 µl de
amortiguador SE y 500 µl de fenol, se dio vortex a la muestra por 1 min y
posteriormente se centrifugó durante 5 min a 735.84  g (MIKRO 22 R Hettich). Se
transfirió el sobrenadante a un nuevo tubo y se agregó 500 µl de una mezcla de
Fenol/Cloroformo/Alcohol Isoamílico (25:24:1), se dio vortex por 1 min y el tubo se
centrifugó a 735.84  g por 5 min (MIKRO 22 R Hettich); la fase acuosa se transfirió a
un tubo de 1.5 ml y se adicionó 500 µl de la mezcla Cloroformo/Alcohol Isoamílico
(24:1), se dio vortex durante 1 min y se centrifugó a 735.84  g durante 5 min (MIKRO
22 R Hettich); a la fase acuosa obtenida se le agregó 1/10 de Acetato de Sodio 3 M (pH
5.2) de acuerdo al volumen obtenido de fase acuosa y 500 µl de Isopropanol, el tubo se
mezcló por inmersión suavemente y se incubó a -20ºC hasta la precipitación del DNA.
El tubo se centrifugó a 11,773  g por 5 min (MIKRO 22 R Hettich), eliminando el
sobrenadante y obteniendo la pastilla de DNA, realizando un lavado con 500 µl de
etanol 70% y centrifugando a 11,773  g por 5 min (MIKRO 22 R Hettich). Finalmente la
pastilla se resuspendió en 50 µl de agua desionizada para ser almacenada a -20ºC
hasta su posterior uso.
5.9 Análisis Heterodúplex-PCR (HDA-PCR)
La amplificación del fragmento del gen del citocromo b se llevó a cabo en una
mezcla de reacción con un volumen final de 25 µl conteniendo: 20-50 ng de DNA de la
muestra sanguínea ó lavado intestinal de vector, 1 U (unidad) de enzima Taq DNA-
polimerasa Gold (Perkin - Elmer), 10 pmol de cada oligonucleótido: 5’-
CCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3’ y 5’-CCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-
61
3’ (Bosseno et al., 2006), 0.1 mM de dNTP’s (dinucleótidos trifosfatados), 1.5 mM de

MgCl2, en amortiguador 1X.
La amplificación del fragmento del citocromo b de 383 pb se realizó mediante la

aplicación de un paso inicial de desnaturalización que consistió en un tiempo de 3 min a
95ºC durante 30 seg, un alineamiento a 60ºC por 30 seg y una extensión a 72ºC por 40
seg, al término del ciclaje se dio una extensión adicional por 5 min a 72º C. Los
productos de reacción de PCR fueron analizados en geles de agarosa al 1.8%,
empleando amortiguador TAE 1X (Tris-Acetato 40 mM, EDTA 1 mM, pH 8.3), los cuales
Los heterodúplex fueron generados siguiendo el método anteriormente descrito

(Lee et al., 2002; Bosseno et al., 2006) empleando cantidades iguales de los productos
de PCR de citocromo b: 12 µl del producto amplificado de citocromo b de Sus scrofa
domesticus (cerdo) utilizado como conductor; para la hibridación se mezclaron con 12 µl
de un producto amplificado de citocromo b de otra especie. Además, se realizó el
mismo procedimiento para los lavados intestinales de los vectores y así generar los
heterodúplex de éstos. La mezcla (1:1) se realizó en tubos eppendorf y se cubrió con 15
µl de aceite mineral para evitar la evaporación, la mezcla se sometió a
desnaturalización a 95°C por 2.5 min en un baño con recirculación automática (Cole-
Parmer), al término de la incubación los tubos se sumergieron en hielo durante 15
minutos para facilitar la formación de los heterodúplex. Posteriormente, los heterodúplex
generados se limpiaron del aceite mineral y fueron analizados en geles de
poliacrilamida al 10% en presencia de urea, utilizando amortiguador TBE 1X (Tris-HCl,
ácido bórico y EDTA) a un voltaje de 100 volts/20 mA (BIO-RAD) por intervalo de 90
min. Al término de la electroforesis el gel fue teñido con Bromuro de Etidio (0.5 µg/ml) y
se observó en un transiluminador en presencia de luz UV.
62
Los heterodúplex de las muestras de vectores fueron comparados con aquellos

patrones de heterodúplex obtenidos a partir de los diferentes DNAs de las especies de
vertebrados ya conocidas, incluyendo como huésped potencial para la alimentación a
Homo sapiens (humano), Mus musculus (ratón), Rattus rattus (rata), Felis silvestris
catus (gato), Canis lupus familiaris (perro), Gallus gallus (gallina), Oryctolagus cuniculus
(conejo), Ovis Canadensis (borrego), Bos taurus (vaca) y Equus ferus caballus
(caballo). Además, los productos de PCR de algunas muestras de vectores fueron
secuenciados para confirmar la identificación de las fuentes de alimentación.
5.10 Cultivo de T. cruzi a partir de vectores infectados vivos
Una vez que se identificó la presencia del parásito en los vectores por medio de
microscopía óptica, mediante disección se extrajo el intestino y se cultivó en 15 ml de
medio LIT (Triptosa 0.5%, infusión de hígado 0.5%) enriquecido con SFB 10%, hemina
50 mg/ml, glucosa 0.2%. Una vez aislado, la cepa se purificó manteniéndola en cultivo,
realizando pases sucesivos cada 20 días. Se tomaron 100 µl del pase anterior al nuevo
medio para su posterior caracterización molecular.
5.11 Análisis de datos
Se georeferenciaron todos los insectos colectados, los datos fueron introducidos

en una base de datos GIS (Qgis 1.7) para generar mapas de la distribución geográfica
de T. dimidiata en la región. Las diferencias potenciales en proporción a los datos
fueron analizadas por el método de 2.
63
6. RESULTADOS
6. 1 Recolección de vectores
Un total de 300 insectos fueron colectados para el estudio de identificación y

caracterización molecular de linajes ó unidades de tipificación discretas (DTUs) de T.
cruzi, mismos que fueron empleados para la identificación de taxa de T. dimidiata y sus
preferencias alimenticias de ésta. Los insectos se encontraron distribuidos en 4
municipios, incluyendo Omealca, Tezonapa, Tierra Blanca y Zongolica, y las 42
localidades estudiadas, indicando una distribución geográfica del vector en la región
(Figura 22).
Los vectores fueron colectados en lugares intradomiciliares (225/300; 75%), y el

resto en el peridomicilio. El análisis proporcional de sexo y estadío indican que el 83.3%
fueron insectos adultos, mientras que el 16.7% fueron estadios ninfales. Las viviendas
donde fueron colectados los vectores corresponden a lugares con techo de paja,
lamina; además de paredes de carrizo y adobe; lugares propicios e ideales para la
proliferación de los vectores (Figura 23). Las ninfas fueron encontradas en 12 diferentes
localidades (Figura 22). La proporción y abundancia de estadios ninfales en la población
sugiere un cierto grado de colonización, siendo el índice de colonización de 18%.
64
Figura 22. Distribución geográfica de T. dimidiata en la zona centro de Veracruz. Mapas pequeños de la izquierda muestran la
ubicación del estado de Veracruz en México, en gris claro se muestran los municipios (Zongolica, Omealca, Tierra Blanca y Tezonapa)
donde se colectaron los insectos. El tamaño de los círculos indican las localidades en proporción al número de insectos colectados, y las
áreas en negro de su interior representan la proporción de insectos infectados por T. cruzi. N: indica la presencia de ninfas.
65
Figura 23. Viviendas en condiciones apropiadas para la proliferación de T. dimidiata

en la zona centro de Veracruz. A. Se muestra una vivienda con techo de paja y pared de
carrizo, B. Se muestra una vivienda con techo de lámina y pared de adobe. La mayoría de
las viviendas muestreadas presentaron estas características siendo aptas para el refugio y
crecimiento de triatominos en el centro del estado de Veracruz (Zongolica, Omealca, Tierra
Blanca y Tezonapa).
66
6.2 Amplificación del kDNA para diagnóstico de T. cruzi
La presencia natural de T. cruzi fue determinada por la amplificación del DNA de

cinetoplasto mediante PCR en donde la aparición de un producto de amplificación de
235 pb denota un resultado positivo (Figura 24).
Figura 24. Amplificación del fragmento específico de T. cruzi por PCR. Gel de
agarosa al 1.8% teñido con bromuro de etidio. 1) Marcadores de tamaño, 2) Control
positivo de T. cruzi, 3) Lavado de vector positivo a T. cruzi, 4) Control negativo de
reacción utilizando un DNA no relacionado, 5) Control negativo sin DNA. La flecha
indica la presencia de un producto de amplificación de 235 pb específico de T. cruzi.
La infección por T. cruzi en insectos fue encontrada en 41/300 vectores T.

dimidiata de 15 de 42 localidades rurales (Figura 22), con una tasa global de infección
por T. cruzi de 13.7%. La tasa de infección no varió con el sexo ó la etapa de desarrollo
(17/134 (12.7%) vs 15/111 (13.5%) y 7/48 (14.5%) para hembras, machos y ninfas
respectivamente, 2=0.12, P=0.94).
67
La mayoría de los vectores se encontraron en el interior de los domicilios

(225/300; 75%). La comparación de la colecta en los municipios de Tezonapa y Tierra
Blanca, indican que una gran proporción de insectos fueron colectados dentro del
domicilio en Tezonapa comparado con Tierra Blanca (108/136 (79%) vs 25/55 (45%);
2=20.4, P<0.0001). Estos datos sugieren un alto riesgo de transmisión entomológica
en Tezonapa comparado con Tierra Blanca.
El análisis de las variaciones temporales en la recolección de insectos reveló

importantes variaciones en la infestación de las casas y en la proporción de estadios
ninfales. De hecho, solo el 10% del total anual de los insectos fueron colectados
durante los meses de enero-marzo, mientras que la mitad de los insectos fueron
colectados durante los meses de abril-junio (Figura 25). Es de vital importancia, la gran
cantidad de insectos que infestan durante este trimestre, sobre todo correspondiendo a
adultos (93/109; 85%), sugiriendo una invasión temporal por adultos. En cambio las
ninfas fueron observadas durante todo el año, lo que sugiere cierto grado de
domiciliación de T. dimidiata. Sin embargo, también hubo importantes variaciones
estacionales en la proporción de ninfas (2=9.80, P=0.020) con la proporción más alta
observada durante los meses de julio-septiembre (14/45; 31%), inmediatamente
después de la máxima infestación por adultos en abril-junio (Figura 25).
Finalmente, no hubo variaciones estacionales significativas en la tasa de

infección por T. cruzi (2=5.17, P=0.16), ni en la proporción del sexo de insectos
(2=4.6, P=0.20).
68
Figura 25. Variaciones estacionales en colectas de T. dimidiata. Se muestra el

número de insectos colectados cada tres meses indicando el sexo y estadio
desarrollado. El porcentaje arriba de cada barra refiere a la proporción de ninfas y *
2
indica considerables variaciones estacionales en esta proporción ( =9.80, P=0.020).
6.3 Caracterización de linaje de T. cruzi
Una vez identificados los vectores infectados, se analizaron para tipificar su linaje
ó DTUs a partir de la misma muestra obtenida del lavado. De esta manera con las 41
muestras positivas a T. cruzi se realizaron ensayos de PCR para determinar los linajes
utilizando oligonucleótidos específicos contra el espacio no transcrito (non-transcribed
spacer) del gen mini-exon, en dicha caracterización se utilizó un oligonucleótido común
y dos oligonucleótidos los cuales fueron específicos para cada linaje del parásito; dando
tamaños de 350 pb para linaje I y 300 pb para linaje II (Figura 26), por lo que la reacción
se realizó por duplicado, utilizando como templado el DNA que se extrajo del lavado de
los vectores y que resultó ser positivo a T. cruzi.
69
Figura 26. Caracterización de linaje de T. cruzi. Amplificación del fragmento específico

para los linajes I y II. MT) Marcador de Tamaño, 1) Control positivo de amplificación para
linaje I (cepa “Nayarit”), 2) Control negativo de amplificación para linaje I, 3) Control
negativo de amplificación para linaje II, 4) Control Positivo de amplificación para linaje II
(MHOM/BR/1950/Y). La flecha muestra el fragmento de 350 pb específico para linaje I y
de 300 pb específico para linaje II, en un gel de agarosa al 1.8% teñido con bromuro de
etidio.
De los 41/300 (13.7%) especímenes de T. dimidiata que resultaron positivos al

diagnóstico de T. cruzi, 8 muestras presentaron poca cantidad y/o degradación, y no
proporcionaron una clara amplificación con algunos de los primers para las secuencias
del mini-exon, 24Sα rRNA ó 18S rRNA por lo que fueron descartadas para el análisis.
De un resto de 33 muestras, 9 mostraron un producto de PCR de 350 pb
correspondiente al gen mini-exon; siendo identificadas como TcI (9/33, 27%), 13 dieron
un producto de 300 pb, correspondiendo de esta manera a TcIIb-TcIId-TcIIe (13/33,
39%) y 11 no amplificaron, siendo identificadas como TcIIc-TcIIa (11/33, 33%) (Figura
27).
70
Estos resultados indican claramente que los linajes ó unidades de tipificación

discretas (DTUs) correspondientes a T. cruzi II (TcIIa-TcIIb-TcIIc-TcIId-TcIIe), fueron los
más frecuentes representando el 72% de las cepas detectadas en T. dimidiata.
Figura 27. Tipificación molecular de linaje en cepas de T. cruzi. A) Gel de agarosa al

1.8% teñido con bromuro de etidio mostrando el análisis del gen mini-exon indicando la
presencia de linaje TcIIa-TcIIe (carriles 1-7) y linaje TcI (carril 8) en muestras de T. dimidiata.
Las cepas Nayarit y “Y” corresponden a los controles TcI y TcIIa-TcIIe (TcII-TcVI). B) Gel de
agarosa al 3% teñido con bromuro de etidio mostrando la identificación de linajes TcIIb (TcII),
TcIIc (TcIII), TcIIa (TcIV) y TcIId (TcV) en muestras de T. dimidiata basado en la amplificación
del gen 18S rRNA para TcIIb y del gen 24SαrRNA para TcIIc, TcIIa y TcIId. El producto de
PCR para el gen 24SαrRNA de la cepa “Y” también es mostrado como control.
El análisis posterior de estas muestras con los marcadores 24Sα rRNA y 18S
rRNA permitió la identificación de TcIIb en 4 muestras, TcIIc en 5, TcIIa en 6 y TcIId en
9; mientras que TcIIe no se detectó en muestra alguna (Tabla III). Mientras que las
cepas TcI de T. cruzi que previamente habían sido identificadas en México;
representaron solo el 3.6% de las cepas analizadas (Bosseno et al., 2002).
71
Tabla III. Frecuencia de linajes ó DTUs de T. cruzi en T. dimidiata del centro de Veracruz
Linaje ó DTU TcI (TcI) TcII (TcIIb) TcIII (TcIIc) TcIV (TcIIa) TcV (TcIId)
Frecuencia 9/33 (27%) 4/33 (12%) 5/33 (15%) 6/33 (18%) 9/33 (27%)
La clasificación de linaje ó DTUs se indica entre paréntesis
6.4 Caracterización de vectores colectados (T. dimidiata) en grupos

mediante amplificación de ITS-2
Para llevar a cabo la caracterización de los vectores dentro de los grupos 2 ó 3

de la clasificación filogenética. A partir de las extremidades (patas) u otras partes (alas
ó cabeza) de los insectos, se extrajo el DNA (Figura 28) mediante el uso de un
amortiguador de digestión descrito en los materiales y métodos.
Figura 28. DNA de vectores en gel de agarosa 1%.

Gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio
en el que se muestra DNA de insectos vectores.
1) Vector No. 1; 2) Vector No. 56; 3) Vector No. 84.
72
Una vez obtenido el DNA se amplificó los fragmentos específicos empleando

distintos oligonucleótidos que codifican para cada grupo filogenético (grupo 2 y 3)
presentes en México, debido a que se ha demostrado una secuencia intraespecífica
variable fuera de lo común en las poblaciones de T. dimidiata estudiadas, los productos
esperados para dicha clasificación empleando dos oligonucleótidos diferentes
combinados con un oligonucleótido en común resultan de un tamaño de 250 pb. Se
analizaron 300 vectores y todos los vectores analizados pertenecen al grupo 2 (Figura
29) dentro de la clasificación filogenética utilizando como marcador al segundo
espaciador de transcrito interno (ITS-2). Además de que algunos productos de PCR se
sometieron a secuenciación para confirmar la identidad del ITS-2 del grupo 2 (Figura
30).
73
Figura 29. Caracterización de vectores colectados (T. dimidiata)

mediante amplificación de ITS-2 para el grupo 2. Gel de agarosa al 1.8%
teñido con bromuro de etidio. 1) Muestra 1; 2) Muestra 56; 3) Muestra 84; 4)
Control negativo de amplificación para el grupo 2; 5) DNA no relacionado. La
flecha indica el fragmento de 250 pb específico para las ITS.
74
Figura 30. Dendograma de T. dimidiata. Se observan los grupos a los cuales

pertenecen vectores procedentes de diferentes estados de México (Campeche, Yucatán,
Veracruz); así como de otro país, los cuales fueron analizados mediante secuenciación y
dentro de los cuales se encuentran (*) vectores clasificados por nosotros mediante la
amplificación del ITS-2.
75
6.5 Obtención de amplificado de citocromo b
A partir de muestras sanguíneas de las distintas especies animales, se obtuvo el

DNA por el método de fases inmiscibles que sirvió de templado para la amplificación de
citocromo b. Observándose los DNAs genómicos como muestras representativas de las
especies de vertebrados utilizadas en el ensayo (Figura 31).
Figura 31. Obtención de DNA genómico.

1) DNA Humano; 2) DNA de cerdo, gel de
agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio.
Una vez obtenidos los diferentes DNAs, se realizó la amplificación del fragmento
correspondiente al citocromo b con un tamaño esperado de 383 pb. Primeramente, se
realizaron unos ensayos de PCR para obtener las condiciones optimas de amplificación
y para lo cual se realizó una curva de magnesio; empleando diferentes concentraciones
de cloruro de magnesio (0.5 mM, 1.0 mM, 1.5 mM, 2.0 mM), de oligonucleótidos (10
pmol y 20 pmol), así como el empleo de DNA sin diluir y en dilución 1:5 (Figura 32),
logrando la obtención de una sola banda correspondiente al amplificado citocromo b, y
76
se determinó que para la amplificación de este fragmento se utilizaría 10 pmol de

oligonucleótidos, DNA diluido 1:5 y 1.5 mM de Mg2+.
Figura 32. Estandarización de la amplificación del fragmento del gen de citocromo b.

A) DNA humano sin diluir-DNA humano dilución (1:5) c/ oligonucleótidos a 10 pmol en
++
concentración crecientes de Mg . B) DNA humano sin diluir-DNA humano dilución (1:5)
++
c/oligonucleótidos a 20 pmol en concentraciones crecientes de Mg .
Una vez estandarizadas las condiciones óptimas para la amplificación del gen
citocromo b, se amplificó el fragmento de 383 pb como se muestra en la figura 33.
77
Figura 33. Amplificado de 383 pb del gen citocromo b de

posibles fuentes alimenticias. Gel de agarosa al 1.8% teñido
con bromuro de etidio. 1) Marcador de tamaño; 2) Amplificado
Citocromo b humano; 3) Amplificado Citocromo b cerdo.
6.6 Análisis Heterodúplex-PCR (HDA-PCR)
Se determinó las fuentes de alimentación de T. dimidiata para comprender mejor

su ecología y los posibles ciclos de transmisión de T. cruzi. Una vez analizadas las
muestras de los insectos por la amplificación con PCR de la secuencia de citocromo b
de vertebrado fueron seguidas por ensayos de heterodúplex. Los controles de DNA de
las especies conocidas sirvieron para reproducir y distinguir claramente los patrones de
heterodúplex, como en estudios previos (Figura 34-A).
78
Figura 34. Patrones de Heterodúplex para la identificación de las fuentes de alimentación

de T. dimidiata. Secuencias de citocromo b fueron amplificadas mediante PCR y patrones de
heterodúplex obtenidos con los productos de PCR de cerdo como driver (controlador) fueron
resueltos por electroforesis en geles de poliacrilamida 10% teñido con bromuro de etidio. A)
Control de patrones de heterodúplex de especies conocidas con los carriles correspondientes a
humano (1), ratón (2), rata (3), gato (4), perro (5), gallina (6), conejo (7), borrego (8), vaca (9) y
caballo (10) respectivamente. B) Ejemplos de muestras representativas de T. dimidiata.
Carriles 1 y 2 identificados como humano, carril 3 como alimentación dual de humano y ratón, y
carril 4 como una triple alimentación de humano, gallina y vaca. Estas muestras fueron
confirmadas mediante secuenciación de los productos de PCR.
Se amplificó una secuencia de DNA de citocromo b de 50/300 insectos (17%)

analizados; posiblemente esto es debido a la pobre alimentación y logramos identificar
la fuente de alimentación en todos ellos una vez comparados (Figura 34-B). Para la
confirmación, algunos productos de PCR fueron secuenciados y comparados en el
GeneBank (Tabla IV) validando la interpretación de los patrones de los heterodúplex. La
mayoría de los insectos se había alimentado de una sola fuente de sangre 33/50 (66%),
14/50 (28%) contiene sangre de dos especies, y 3/50 (6%) contiene sangre de tres
especies. Hubo una diferencia significativa en las fuentes de alimentación entre los
insectos del domicilio y los del peridomicilio (2=15.5, P=0.016).
79
Para los insectos colectados dentro del domicilio, el humano fue la fuente de
alimentación más frecuente, representando hasta el 87% de alimento (Tabla V). La
segunda fuente de alimentación incluye roedores como el ratón y rata, que representan
el 25% y 20% de alimento de sangre respectivamente. Curiosamente la sangre de
animales domésticos incluyendo gallina, gato y perro fueron también identificados en
insectos intradomiciliares, lo que sugiere que cualquiera de estos animales está
presente en el interior de las casas, o que los insectos son capaces de moverse a los
peridomicilios para alimentarse. El análisis de las fuentes alimenticias de insectos de los
peridomicilios reveló un patrón de alimentación muy diferente (Tabla V). En efecto la
fuente de alimentación más frecuente de los insectos fue la rata, representando el 50%
del alimento. Como era de esperar la sangre de pollo, gato, perro y vaca fueron también
identificadas, pero en proporción limitada (12.5% c/u). Sorprendentemente, el 25% del
alimento de insectos peridomésticos contenía sangre de humano, por lo que es la
segunda fuente de alimentación más importante en este hábitat. En un triple alimento se
vio detectada sangre de humano, gallina y vaca. Estas observaciones apoyan
fuertemente la dispersión de los insectos desde el peridomicilio hasta el interior de las
casas para alimentarse, cuando el humano duerme.
80
Tabla IV. Análisis de identidad de la secuencia de fragmentos

específicos para citocromo b
%
Muestra Especie Secuencia
identidad
41 Gallus gallus cytochrome b gene, partial cds; mitochondrial FJ160756.1 99
273 Homo sapiens isolate HOSA cytochrome b (cytb) gene AY509658.1 99
286 Homo sapiens isolate HOSA cytochrome b (cytb) gene AY509658.1 98
291 Mus musculus domesticus clone 17386 cytochrome b (cytb) HQ270434.1 75

gene
132 Mus musculus domesticus clone 17386 cytochrome b (cytb) HQ270434.1 78

gene
81
Tabla V. Fuentes alimenticias de T. dimidiata de acuerdo a su hábitat
Huésped Intradomiciliar Peridomiciliar
Humano 35/40 (87.5%) 2/8(25%)
Ratón 10/40 (25%) ND
Rata 8/40 (20%) 4/8 (50%)
Gallina 2/40 (5%) 1/8 (12.5%)
Gato 2/40 (5%) 1/8 (12.5%)
Perro 1/40 (2.5%) 1/8 (12.5%)
Vaca ND 1/8 (12.5%)
Nótese que para cada hábitat la suma de los porcentajes es superior a 100% debido a varios alimentos de sangre en algunos
insectos. ND: No detectado. Hubo una diferencia significativa en las fuentes de alimentación entre los dos hábitats (X 2=15.5,
P=0.016).
82
7. DISCUSIÓN
El hallazgo de diferentes DTUs (TcIIb, TcIIc, TcIIa y TcIId) en México y en una

frecuencia relativamente elevada (13-27% cada uno) es de vital importancia. Esta
diversidad de linajes de T. cruzi en el centro de Veracruz contrasta mucho con estudios
similares en Jalisco (occidente de México), donde TcI solo ha sido detectado en
Triatoma Longipennis y Triatoma barberi (Bosseno et al., 2006; Breniere et al., 2007).
Los resultados indican claramente que puede haber una diversidad mucho mayor de
linajes de T. cruzi de lo que han reportado en una parte de México. Esto coincide con
observaciones previas sobre los análisis serológicos de infección por T. cruzi en
pacientes mexicanos, lo que sugiere que solo el 33% de estos fueron infectados con
TcI, 37% con TcIIa-TcIIe, y 30% fueron co-infecciones (Risso et al., 2011). La
identificación de varios linajes en México también puede ayudar a entender la
presencia de TcIIa en E.E.U.U. (Roellig et al., 2008) y la elevada frecuencia de co-
infecciones con TcI y TcIIa-TcIIe observadas en T. dimidiata de Guatemala (Pennington
et al., 2009), aunque no se llevo a cabo la identificación de IIa-IIe en el estudio.
También es importante destacar que es muy probable que los diferentes linajes
detectados circulan en los mismos ciclos de transmisión a medida que T. dimidiata es
una especie muy móvil con una dispersión significativa entre los hábitats y los patrones
estacionales de infestación de viviendas (Dumonteil et al., 2007; Payet et al., 2009),
incluyendo el centro de Veracruz (Torres-Montero et al., 2011).
Estos resultados tienen importantes implicaciones para la comprensión de la

filogeografìa de las cepas de T. cruzi y la epidemiología de la enfermedad de Chagas
en Norte América, y garantizar una evaluación mucho más amplia de la diversidad de T.
cruzi en México para identificar plenamente los linajes presentes en otras regiones y su
relación con especies de triatominos y huéspedes mamíferos.
83
Se sabe que la enfermedad de Chagas es endémica en el estado de Veracruz,

México, y previamente se identificó una región de alta seroprevalencia en humanos en
la región centro del estado (Ramos-Ligonio et al., 2010). Por lo tanto se evaluó la
dinámica de infestación por T. dimidiata en el centro de Veracruz, así como sus fuentes
de alimentación para aportar datos clave sobre la dinámica de transmisión de T. cruzi y
posibles intervenciones de control vectorial.
Se confirmó que T. dimidiata está ampliamente distribuida en la región, ya que se

detectó en todas las localidades estudiadas. La tasa de infección de T. cruzi que se
observó es ligeramente más alta, pero similar a la reportada en todo el estado de
Veracruz (13.7% vs 9.0%; Salazar et al., 2007) mientras el índice de colonización fue
bajo (18% vs 50%; Salazar et al., 2007). Curiosamente los índices entomológicos de T.
dimidiata son algo similares a los reportados en la península de Yucatán, México
(Dumonteil et al., 2002) así como en Belice (Polonio et al., 2009). En conjunto estos
datos confirman que existe un amplio riesgo de la enfermedad de Chagas en la región,
y concuerdan bien con observaciones previas de la alta seroprevalencia en humanos
(16.8%) en el centro de Veracruz (Ramos-Ligonio et al., 2010). De hecho, los datos
indican una mayor abundancia de insectos en el interior del domicilio en los municipios
de Tezonapa en comparación con Tierra Blanca, sugiriendo un mayor riesgo en el
primero, lo cual coincide muy bien con la seroprevalencia más alta observada en
Tezonapa y la baja seroprevalencia en Tierra Blanca (Ramos-Ligonio et al., 2010).
Estas discrepancias entre los dos municipios pueden estar relacionadas con diferencias
en las condiciones ecológicas como se sugirió antes (Ramos-Ligonio et al., 2010), ya
que localidades del valle de Tezonapa están rodeadas por suelo seco de los campos
abiertos para la agricultura con grandes y numerosos árboles que forman parte del
bosque tropical; mientras que en la llanura costera de Tierra Blanca el suelo es húmedo
y casi exclusivamente cubierto por campos y pastizales. Como alternativa puede haber
diferencias en la estructura de las viviendas y las condiciones entre los municipios, que
también pueden contribuir a las diferencias en la infestación por triatominos.
84
El estudio de las variaciones estacionales en la infestación de las viviendas

permitió evaluar la dinámica de infestación. La observación de estadíos ninfales durante
todo el año indica claramente que T. dimidiata es capaz de colonizar algunas casas,
según lo determinado antes en Veracruz (Salazar et al., 2007). Por otra parte también
se observó importantes variaciones estacionales en la abundancia de insectos, que son
muy similares a las anteriores observaciones en la Península de Yucatán, México
(Dumonteil et al., 2002., Dumonteil et al., 2009; Payet et al., 2009), Belice (Polonio et
al., 2009) y Guatemala (Monroy C. pers. Comm.). Estos datos indican claramente una
infestación de temporada principalmente por insectos adultos que intentan colonizar las
casas. Como se informó en la Península de Yucatán (Dumonteil., 2002), existe primero
un aumento dramático de insectos adultos durante los meses de abril-junio, seguido por
un incremento en estadíos ninfales durante los siguientes meses de julio-septiembre, ya
que los adultos se reproducen e intentan colonizar las casas. Al parecer T. dimidiata en
el centro de Veracruz, se comporta en gran parte como un insecto invasor causando la
infestación temporal en casas.
Los datos sobre fuentes alimenticias respaldan la situación antes mencionada,

pues estos pueden utilizarse para evaluar la dispersión de los insectos (Zeledon et al.,
2005; Pizarro & Stevens, 2008; Farfan-Garcia & Angulo-Silva, 2011). De hecho, se
observaron varios casos de insectos colectados dentro de las casas que se alimentaron
de animales domésticos tales como gallina, perro y gato, que son animales que
frecuentemente son más ubicados en el peridomicilio, así como insectos peridomésticos
alimentados de humanos y alimentación mixta. Estos datos sugieren que T. dimidiata es
capaz de dispersarse entre las dos direcciones el peridomicilio y el domicilio, de manera
similar a las anteriores observaciones en Colombia y Costa Rica (Zeledon et al., 2005;
Farfan-García & Angulo-Silva, 2011). Nuevos estudios sobre genética de población
permitirán evaluar el grado de dispersión entre estos hábitats (Dumonteil et al., 2007).
La abundante alimentación de humanos dentro del domicilio también confirma el alto
riesgo de transmisión de T. cruzi, de acuerdo con la elevada seroprevalencia observada
en el área (Ramos-Ligonio et al., 2010).
85
Por otra parte, la alimentación de varios animales domésticos sugiere que éstos
pueden jugar un papel muy importante como factores de riesgo para la infestación de
viviendas y la transmisión del agente infeccioso T. cruzi.
Otros estudios sobre las determinantes para la infestación de viviendas deben

ayudar a aclarar este punto (Gurevitz et al., 2011). Finalmente, las observaciones de los
diferentes patrones de alimentación entre insectos del domicilio y del peridomicilio
sugieren que T. dimidiata es altamente adaptable a las diferentes fuentes de
alimentación. Estudios anteriores muestran que T. dimidiata tiene ciertas características
(hematófagos, alta capacidad de dispersión, infestación temporal, así como su
adaptación a distintos hábitats y a las fuentes de alimentación) y puede alimentarse de
una gran variedad de huéspedes (Arzube Rodríguez, 1966; Quintal & Polanco, 1977;
Sasaki et al., 2003; Zeledon et al., 2005; Farfan-García & Angulo-Silva, 2011).
El gen citocromo b como marcador molecular, permitió identificar las fuentes

alimenticias de las cuales acostumbra alimentarse el insecto triatomino. Al emplear la
técnica como lo es el análisis de heterodúplex acoplado a PCR (HDA-PCR); que en
estudios anteriores había sido aplicado para la identificación de las preferencias
alimenticias del mosquito avian dando resultados satisfactorios (Lee et al., 2002), fue de
gran utilidad en el estudio para lograr conocer las preferencias alimenticias de los
vectores. Sometiendo dicho ensayo a las condiciones apropiadas para lograr un
resultado satisfactorio de los heterodúplex formados, una vez que éstos fueron
observados en los geles de poliacrilamida 10% en condiciones desnaturalizantes
(presencia de urea). Para corroborar el análisis sobre la alimentación del vector
mediante el ensayo de heterodúplex acoplado a PCR (HDA-PCR); algunas muestras
fueron sometidas a secuenciación, obteniendo resultados satisfactorios.
86
La alimentación de fuentes múltiples también fue con relativa frecuencia,

representando un 34% del alimento en sangre en el estudio, comparado con el 20% de
T. dimidiata en Guatemala (Sasaki et al., 2003). De hecho, estos datos sugieren que T.
dimidiata no tiene preferencias notables sobre sus fuentes de alimentación, sino que
simplemente aprovecha las fuentes de alimentos disponibles en su hábitat.
Favoreciendo a que si el vector se encuentra en contacto directo con el humano
infestando casas, así como con animales domésticos que entran y salen de las mismas,
tal como se encontró en el estudio, el riesgo de adquirir la infección por T. cruzi se
encuentra latente.
En el estado de Veracruz T. dimidiata es la especie más predominante como

vector. Debido a la migración humana, así como a la del mismo vector y en base a las
características de alimentación de éste, se realizó la clasificación filogenética de los
vectores. En conjunto éstos datos sugieren claramente que la alta capacidad de
dispersión y la infestación temporal pueden ser características compartidas de varios
grupos taxonómicos de T. dimidiata identificados en esta compleja especie (Bargues et
al., 2008). Por medio del análisis morfológico se clasificó al vector; sin embargo,
muchos vectores dependiendo su estadio, presentaron diferencias que fueron difíciles
de identificar; además de tener en cuenta las condiciones en las que se encontraron.
Por lo que mediante el empleo de un marcador molecular (ITS-2), el cual ha sido de
amplio uso en la diferenciación de especies de insectos (Beebe et al., 2000), se
confirmó claramente mediante el uso del segundo espaciador de transcrito interno (ITS-
2) que el grupo 2 de T. dimidiata se encuentra presente en el centro de Veracruz,
aunque no hay que descartar la posible aparición de otros grupos debido a los distintos
cambios climáticos y otros factores que influyen en la migración del vector y que pueden
contribuir a la aparición de nuevos focos de infección por T. cruzi, comportándose el
grupo 2 de T. dimidiata de manera similar a los grupos 2 y 3 hallados en la Península de
Yucatán, México, causando infestación temporal de casas. De este modo los genotipos
del ITS-2 de T. dimidiata podría no ser relevante o asociarse a las diferentes
capacidades de domiciliación de las subespecies de T. dimidiata.
87
Estudios previos demostraron que (Herrera-Aguilar et al., 2009) los factores

ecológicos locales pueden determinar la amplitud de domiciliación de T. dimidiata;
estudios adicionales sobre las determinantes de infestación y domiciliación ayudaran a
clarificar estos aspectos.
Finalmente, estas observaciones tienen implicaciones importantes para el control

del vector T. dimidiata en la región. De hecho, es bien sabido que la eficacia en el
rociado de insecticidas tradicionales dura poco, en el caso de triatominos no
domiciliares que estacionalmente infestan casas (Dumonteil et al., 2004; Ferral et al.,
2010; Barbu et al., 2011). Las medidas de control en Veracruz indican que las
aplicaciones de insecticidas en árboles, en intervalos de diferencia de 8 meses, fueron
necesarios para reducir la infestación de T. dimidiata (Wastavino et al., 2004), pero no
hubo un seguimiento para evaluar las posibilidades de re-infestación después de
interrumpir las fumigaciones. La re-infestación por T. dimidiata seguida del rociado de
insecticidas ha sido observada frecuentemente en la península de Yucatán, México
(Dumonteil et al., 2004; Ferral et al., 2010), así como en Guatemala (Nakagawa et al.,
2003). Por lo tanto, las alternativas en intervención del control se centran en los
triatominos no domiciliarios (Ferral et al., 2010; Barbu et al., 2011) pudiendo ser más
apropiadas para la región, y más generalmente para todos ó la mayoría de los grupos
taxonómicos del complejo T. dimidiata.
88
8. CONCLUSIONES
1. Se mantuvieron en cultivo 14 cepas (Nayarit, CIET-1, Silvio, Camp-6, Camp-7,

Camp-8, Camp-9, Camp-11, Tenabo, Calakmul, Calkini, CL-Brener, Tulahuen,
“Y”).
2. Se colectaron 300 insectos en los 4 municipios (Omealca, Tezonapa, Tierra
Blanca y Zongolica) y las 42 localidades estudiadas.
3. Se encontraron 225 vectores en lugares intradomiciliares (75%), 75 en el
peridomicilio (25%).
4. El análisis proporcional de sexo y estadío indicó que el 83.3 % fueron insectos
adultos, el 16.7% fueron estadios ninfales.
5. El índice de colonización de T. dimidiata fue de 18%.
6. La infección por T. cruzi en insectos se encontró en 41/300 vectores con una tasa
global de infección por T. cruzi de 13.7%.
7. De los 41/300 (13.7%) vectores T. dimidiata que resultaron positivos al
diagnóstico de T. cruzi, 8 muestras presentaron poca cantidad y/o degradación;
no proporcionando una clara amplificación. De un resto de 33 muestras, 9
mostraron un producto de PCR de 350 pb siendo identificadas como TcI (9/33,
27%), 13 presentaron un producto de 300 pb, correspondiendo a los grupos
TcIIb-TcIId-TcIIe (13/33, 39%) y 11 no amplificaron, siendo identificadas como
TcIIc-TcIIa (11/33, 33%), resultando un 72% de cepas de T. cruzi pertenecientes
al linaje II.
8. Se confirmó la extensa distribución de T. dimidiata perteneciente al grupo 2
dentro de la clasificación filogenética mediante ITS-2 en el estado de Veracruz,
México. Además se mostró por primera vez que T. dimidiata en Veracruz se
comporta de manera muy similar a aquellas presentes en la península de
Yucatán, México y en Belice con una fuerte infestación estacional de las casas,
principalmente por insectos adultos.
89
9. Se amplificó una secuencia de DNA de citocromo b de 50/300 insectos (17%)

analizados y se identificó la fuente de alimentación en todos ellos. La mayoría de
los insectos se había alimentado de una sola fuente de sangre 33/50 (66%),
14/50 (28%) contiene sangre de dos especies, y 3/50 (6%) contiene sangre de
tres especies.
10. Se confirmó la presencia de un importante riesgo entomológico por transmisión
de T. cruzi, indicado por la alimentación frecuente en humanos, representando
hasta el 87% de alimento.
9. PERSPECTIVAS
Los resultados tienen importantes implicaciones para la comprensión de la

filogeografía de cepas de T. cruzi y la epidemiología de la enfermedad de Chagas en
Norte América. Por lo tanto es necesaria una evaluación mucho más amplia de la
diversidad de T. cruzi en México para identificar plenamente los DTUs presentes en
otras regiones y sus relaciones con especies de triatominos y huéspedes mamíferos. El
aislamiento de cepas TcII de esta región será un factor clave para su posterior
caracterización y comparación con sus respectivos DTUs de América del Sur.
El análisis de las fuentes de alimentación del vector, sugiere una falta de fuentes
alimenticias y se confirma una dispersión significativa de los insectos entre el
peridomicilio y el domicilio. Por lo tanto es crucial intervenir en el control vectorial de
este comportamiento que presentan los insectos, para mejorar la eficacia y
sustentabilidad, a medida que el control de T. dimidiata ha ido cambiando notablemente
en muchas regiones.
90
10. BIBLIOGRAFÍA
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Heredia, Costa Rica. Mem Inst Oswaldo Cruz, 100: 607-12.
103
11. ANEXOS
104
ARTICULOS CIENTIFICOS PUBLICADOS
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114

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UNIVERSIDAD VERACRUZANA

CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS

Identificación y caracterización molecular de

Doctor en Ciencias Biomédicas

Xalapa, Ver. 31 de Octubre, 2012

Becario CONACYT No. 215333

Dra. Aracely López Monteon

Dra. María de Jesús Rovirosa Hernández

Dra. Rossana Citlali Zepeda Hernández

Dra. Rosa Virginia García Rodríguez

Dr. Stefan Marian Waliszewski Kubiak

... Los Amo

...Muchas Gracias Familia

 Al grupo de la escuela de pastoral y demás hermanos. Gracias por su apoyo y sus

 Al MRCCES de San Juan Bautista – Nogales, Ver., “Bienaventuranzas” le doy Gracias a

 A la familia que funge como equipo de trabajo en el LADISER Inmunología y Biología

 A la participación de la gente en el proyecto, ya que sin su ayuda esta investigación no se

 Al Centro de Salud y Protección Animal de Orizaba; Veracruz, por la autorización en la

Identificación y caracterización molecular de cepas de

1.2 CAPÍTULO II CICLOS DE TRANSMISIÓN DE T. cruzi....................... 25

1.3 CAPÍTULO III L0S TRIATOMINOS……………………….……………. 30

1.4 CAPÍTULO IV CICLO DE VIDA DE T. cruzi........................................ 33

1.5 CAPÍTULO V El GENOMA DE T. cruzi............................................... 38

1.6 CAPÍTULO VI IDENTIFICACIÓN DE T. cruzi .................................... 41

1.7 CAPÍTULO VII CARACTERÍZACIÓN MOLECULAR DE T. cruzi…... 44

1.8 CAPÍTULO VIII UTILIZACIÓN DE ENSAYOS DE HETERODÚPLEX

11. ANEXOS………………………………………………………………………... 104

Tabla I. Cambios en los parámetros epidemiológicos por la 14

Tabla II. Municipios y localidades rurales que participaron en la 53

Tabla III. Frecuencia de linajes ó DTUs de T. cruzi en T. dimidiata del 72

Tabla IV. Análisis de identidad de la secuencia de fragmentos 81

Tabla V. Fuentes alimenticias de T. dimidiata de acuerdo a su hábitat 82

Figura 1. Carlos Chagas (1878 – 1934) 3

Figura 2. Signo de Romaña en caso adulto 7

Figura 3. Dilatación patológica del esófago chagásico 10

Figura 4. Evolución de la esofagitis chagásica progresiva, demostrada

Figura 5. A. Estudio intestinal de bario por edema, observado en un

Figura 7. Flujo de migraciones de América Latina hacia regiones no

Figura 8. Especies domiciliarias más comunes de Triatominos en

Figura 9. Casos de Enfermedad de Chagas. México 1928-2004 21

Figura 10. Filogeografía de Triatoma dimidiata 23

Figura 11. Ciclo selvático, peridomiciliario e intradomiciliario de

Figura 12. Mecanismo de infección por T. cruzi en el humano 27

Figura 13. Estadios del triatomino vector 32

Figura 14. Formas de T. cruzi en el humano ó huéspedes reservorios 34

Figura 15. Ciclo de vida de T. cruzi 37

Figura 16. Representación esquemática del minicírculo de T. cruzi 39

Figura 17. Maxicírculo de T. cruzi 40

Figura 18. Distribución de Linajes y sublinajes de T. cruzi en América 46

Figura 19. Estructura proteica del citocromo b 48

Figura 20. Esquemas de la estructura de la proteína citocromo b 49

Figura 21. Diagrama para diferenciar el linaje de T. cruzi en lavados de

Figura 22. Distribución geográfica de T. dimidiata en la zona centro de

Figura 23. Viviendas en condiciones apropiadas para la proliferación

Figura 24. Amplificación del fragmento específico de T. cruzi por PCR 67

Figura 25. Variaciones estacionales en colectas de T. dimidiata 69

Figura 26. Caracterización de linaje de T. cruzi 70

Figura 27. Tipificación molecular de linaje en cepas de T. cruzi 71

Figura 28. DNA de vectores en gel de agarosa 1% 72

Figura 29. Caracterización de vectores colectados (T. dimidiata)

Figura 30. Dendograma de T. dimidiata 75

Figura 31. Obtención de DNA genómico 76

Figura 32. Estandarización de la amplificación del fragmento del gen