2.

8 Estudio microscópico
de los microorganismos.

http://es.dreamstime.com/imagenes-de-archivo-microscopio-y-bacterias-image29404744
 Preparaciones
Microbiológicas
•Preparaciones en fresco (microorganismos vivos)
•Preparaciones fijas y teñidas (microorganismos muertos)
 Frotis
Una capa delgada de muestra extendida sobre un
portaobjetos que permite el paso de la luz a través de ella.

•Impronta •Gota de cultivo •Cultivo sólido

líquido resuspendido

•Cinta adhesiva •Hisopo

•Frotis sanguíneo
transparente
 Tinciones

•Positivas •Negativas

Se observa teñida la célula El fondo se tiñe de oscuro

sobre un fondo claro. para observar células o
estructuras refringentes.

Frotis Sanguíneo Cryptococcus neoformans

 Bacillus

Tinciones megaterium. Tinción

simple con cristal
violeta.

•Simples
Frotis sanguíneo con
Se utiliza un solo colorante Yersinia pestis.
(básicos). Tinción de Wrigth.
- Azul de metileno
- Safranina
- Cristal violeta
Médula ósea.
•Compuestas Tinción de May
Se utilizan dos ó más Grünwald-
colorantes. Pueden usar Giemsa.
mordentes y decolorantes
- Giemsa
- Wrigth Trypanosoma sp
en sangre.
- May Grünwald
Tinción de
(Eosina-Azul de metileno) Wrigth.
 Tinciones Tinción
negativa de
cápsula.
Streptococcus
•Tinción negativa de pneumoniae.
Cápsula

Tinción de
•Selectivas endosporas.
Bacillus subtilis.
Son utilizadas para dar
color y aislar partes
específicas de los
microorganismos
Tinción de
- Endosporas flagelos.
- Flagelo Proteus sp
- Núcleo
 Tinciones
Tinción de
Ziehl-Neelsen.

•Diferenciales
Reaccionan de manera
diferente entre las distintas
clases de bacterias. Tinción de
Gram.
- Ziehl-Neelsen
- Gram

Tinción de
Gram.
 Colorantes
Compuestos coloridos que al combinarse con otras sustancias les
imparten color; están formados por un grupo cromóforo que es la
parte responsable del color, y un grupo auxócromo que al formar
sales le permite disociarse y combinarse. Mordente : compuesto
químico intensificador de color.

•Ácidos. •Básicos.
El cromóforo es el anión de El cromóforo es el catión
la molécula. de la molécula.
Br Br
NaO O O Cl -
N
Br Br
(CH3)2N S N(CH3)2
COO- Na + +

Azul de metileno
Eosina
 Técnicas de tinción
Frotis

•Tinción simple
Colorante básico
(1 minuto)

Enjuagar con agua

Bacillus anthracis Neisseria Pseudomonas Staphylococcus

Tinción simple con gonorrhoeae. aeruginosa. aureus.Tinción
cristal violeta. Tinción simple con Tinción simple simple con azul
safranina. con safranina. de metileno.
 Técnicas de tinción

•Tinción de cápsula

Extendido
Streptococcus pneumoniae
Muestra + tinta china o
nigrosina

Secar al aire

Safranina de Gram o
Cristal Violeta (1 minuto)
Acinetobacter calcoaceticus
 Técnicas de tinción
•Tinción de endosporas

Verde de malaquita 5%
con emisiones de vapor
de agua (10 minutos)

Bacillus subtilis
Lavar con agua

Safranina 0.5% (1minuto)

Clostridium tetani
 Técnicas de tinción
•Tinción de flagelo

Colorante primario. Para-

rosa anilina
Proteus vulgaris

Mordente. Acido
tánico

Colorante de
contraste. Azul de
metileno

Vibrio cholerae
 Técnicas de tinción
•Tinción de Gram

Colorante primario. Cristal

violeta 1% en solución de
oxalato de amonio al 0.85%
(1 minuto)

Mordente. Lugol Iº/KI 1g/2g Streptococcus pyogenes

en 300 mL de agua (1 minuto)

Decoloración. Alcohol-Acetona
70:30. Hasta eliminar el exceso
de colorante

Colorante de contraste. Bacilos Gram

Safranina 0.25% (1 minuto) negativos y levaduras
 Bacilo
Ácido
Técnicas de tinción Alcohol
Resistente
•Tinción de Ziehl-Neelsen
(BAAR)

Colorante primario. Fucsina

fenicada con emisiones de
vapor de agua (10 minutos)
Mycobacterium tuberculosis

Decoloración. Alcohol-Acido
(etanol-HCl) 97:3. Hasta eliminar
el exceso de colorante

Colorante de contraste.
Azul de metileno de Loeffler
(1 minuto) Mycobacterium tuberculosis
 Fijar carbol- fucsina calentar Tinción
de
Ziehl-
Neelsen

Mantener humedo calentar lavar con agua

Decolorar con ETOH-HCl Contrastar con azul Observar 1000X

de metileno
Nocardia sp.

Bacterias filamentosas,
Acido-Alcohol-Resistentes
Microscopía
 Microscopía

http://twistedbacteria.blogspot.com/
 Microscopía

Las
bacterias y
las células
de arqueas
tienen
aprox. 1–5
micrómetros
(µm) largo.

Comparación de tamaño entre varios átomos, moléculas y microorganismos. No está dibujado a escala. Tomado de
Alcamo´s Fundamentals of Microbiology.
Microscopía óptica y
electrónica
 Tipos de microscopías
•Óptica de campo claro •Óptica de campo oscuro

•Contraste de fases •De contraste de interferencia

diferencial (DIC).
 Tipos de microscopías
•Confocal •De fluorescencia

•Electrónica de barrido •Electrónica de transmisión

 z En la microscopía de fluorescencia, el
especímen es cubierto con un colorante
fluorescente y se ilumina con luz ultravioleta.

Microscopía de fluorescencia de células esporulantes de B. subtitlus

Courtesy of Dr. Peter Lewis; School of Environmental and Life
Sciences, University of Newcastle
| La microscopía electrónica provee imágenes
detalladas de células, partes celulares, y virus.
z Los electrones son absorbidos, reflejados o
transmitidos dependidendo de la densidad de
las estructuras en la muestra.
z El límite de resolución es aprox. de 2nm.

Microscopía electrónica de
Transmisión (TEM)
 z Con la Microscopía Electrónica de Transmisión se
visualizan estructuras en cortes ultrafinos de
células.

Pseudomonas whole cells TEM

© CNRI/Photo Researchers, Inc.

 z La microscopía electrónica de barrido (scanning
electron microscope (SEM)) Se utiliza para visualizar
superficies de objetos no seccionados.

Pseudomonas whole cells SEM

© Dr. Dennis Kunkel/Visuals Unlimited

Confocal image of some dividing cells that are triple labeled for Golgi
apparatus (green), microtubules (red), and DNA (blue).

| http://www.microscopyu.com/staticgallery/featuredmicroscopist/deerinck/images/deerinckimage8larg
e.jpg
 Microscopía

http://endospore.freeblog.hu/files/e
arly_microscope.jpg