Recibido: 18 Abril el año 2016 | Revisado: 8 de Junio ​el año 2016 | Aceptado: 29 Junio ​el año 2016

DOI: 10.1111 / jfs.12301

ARTÍCULO ORIGINAL

Evaluación del ensayo de PCR en tiempo real para la detección de Ascaris

suum contaminación en la carne y las vísceras

Yen Thi Hoang Nguyen 1 | zhenzhen Wang 2 | Haruhiko Maruyama 2,3 |

Yoichiro Horii 1,3 | Nariaki Nonaka 1,3 | Ayako Yoshida 2

1 Laboratorio de Enfermedades Parasitarias Veterinaria,

Facultad de Medicina Veterinaria y Medicina de la Universidad Resumen

de Miyazaki, 1-1, Gakuen-Kibanadai Nishi, Miyazaki 889- Áscaris síndrome de larva migrans (áscaris LMS) es causado por gusanos redondos ascáridos incluyendo Ascaris suum. En Asia oriental, áscaris

LMS ha sido considerada como una enfermedad transmitida por los alimentos en la edad adulta que tiene el hábitat de la dieta de consumir carne
2192, Japón
y vísceras crudas o ligeramente cocidas. Para evaluar el riesgo potencial de A. suum la infección de estos alimentos, Ascaris especí fi c-PCR en
2 División de Parasitología, Departamento de Enfermedades
tiempo real fue desarrollado. El ensayo podría detectar constantemente A. suum ADN hasta 10 fg. su especificidad fi la ciudad se con fi confirmado
Infecciosas de la Facultad de Medicina de la Universidad de

Miyazaki 5200 Kihara, Kiyotake-cho, Miyazaki 889 a 1692, por nonampli fi cationes con Toxocara canis y Toxocara cati DNA. A. suum ADN podría ser ampli fi ed no sólo de una sola larva sino también de

Japón hígado de ratón se disparó con una larva. Por otra parte, el ensayo podría detectar
3 División de Cooperación Internacional y Educación, Centro

para el Control de Enfermedades de Animales de la

A. suum ADN en hígado de ratón infectado experimentalmente, y mostró una sensibilidad más alta que un método de digestión
Universidad de Miyazaki, 1-1, Gakuen-Kibanadai Nishi,
convencional. Este ensayo de PCR en tiempo real sería útil para detectar la A. suum contaminación de larvas en la carne y las vísceras.
Miyazaki 889-

2192, Japón

Correspondencia Aplicaciones prácticas

Ayako Yoshida, División de Parasitología, Departamento de
Se ha considerado que uno de los factores de riesgo más importantes para LMS áscaris en los seres humanos es el consumo de carne
Enfermedades Infecciosas ,, Facultad de Medicina de la

Universidad de Miyazaki, 5200 Kihara, Kiyotake-cho, Miyazaki

o vísceras crudas o poco cocidas de animales domésticos infectados con

889-1692, Japón. Ascaris suum. Por lo tanto, hemos desarrollado la novela-PCR en tiempo real con la alta sensibilidad y especificidad fi ciudad con el fin de especi fi camente

detectar A. suum ADN a partir de tejidos animales. Este ensayo se puede aplicar al procedimiento de inspección de la carne para la identi fi cación de
E-mail: kukuri@med.miyazaki-u.ac.jp
la contaminación de las larvas de parásitos que pueden afectar negativamente a la salud pública, así como sobre la salud y el bienestar animal.

KE YWORD S

enfermedades, parásitos, PCR en tiempo real, carnes, vísceras transmitidas por los alimentos

1| INTRODUCCIÓN ciclo como en los cerdos, pero llegar al intestino a través del hígado y pulmón (McCraw, 1974;

Yoshihara et al,. 2008). Permanecen en tejidos animales con la infectividad (Permin, Henningsen,

Ascaris suum conoce como una lombriz intestinal en cerdos se distribuye en todo el mundo. Los Murrell, Roepstor ff, y Nansen, 2000) y no crecen a adultos maduros. En los seres humanos, aunque A.

huevos se pasaron en el medio ambiente a través de las heces y se convierten infeccioso a los suum a veces puede crecer hasta convertirse en gusanos adultos (Arizono et al, 2010;.. Nejsum et

animales después del período de embrionación. Una vez los cerdos ingieren A. suum huevos al, 2005). Sin embargo, el problema de salud grave es el síndrome de larva migrans (LMS) causada

embrionados, nacieron en larvas en el sistema de digestión, entonces penetrar a través de la mucosa por la migración de las larvas de varios órganos. Este tipo de infección resultante una serie de

intestinal, y migrar al hígado a través del sistema portal hepático. Desde el hígado, las larvas migran a síntomas clínicos tales como eosinofilia, fiebre, tos, agrandamiento del hígado o neumonía se

los pulmones a través del sistema venoso. A continuación, las larvas romper los capilares alveolares y conoce como larva migrans visceral (VLM) (Izumikawa et al, 2011;. Lamberton y Jourdan, 2015;

migran hasta el árbol bronquial hasta la faringe, donde son tragadas. Ellos se convierten en gusanos Sakakibara et al.

adultos en el intestino delgado después de 6 - 8 semanas después de la infección.

2002). Otro tipo de infección resultante encefalopatía en el cerebro se conoce como larvamigrans

neuro (Inatomi y col., 1999; Umehara et al., 2006).

El parásito también puede infectar a otros animales tales como pollos, ganado, y seres humanos El estallido de VLM debido a A. suum estaba fi rstly reportado en Japón en 1996 (Maruyama,

(McCraw y Lautenslager, 1971; Yoshihara et al., 2008). Cuando A. suum infectar a dichos huéspedes Nawa, Noda, tres sen, y Choi, 1996). Desde entonces, los pacientes diagnosticados en VLM

inadecuadas, las larvas se someten a lo similar causados ​por A. suum han sido con frecuencia

J Saf Alimentos. 2017; 37: e12301. wileyonlinelibrary.com/journal/jfs V C 2016Wiley periódicos, Inc. | 1 de 6

https://doi.org/10.1111/jfs.12301
2 de 6 | NGUYEN ET AL.

TABLA 1 procedimientos analíticos para detectar A. suum DNA

Fuente de ADN La homogeneización Extracción de ADN la detección de ADN

larvas L3 mecánicamente rayada No método de lisis alcalina PCR en tiempo real

El tejido hepático se disparó con larvas L3 tramado mecánicamente si una método de lisis alcalina PCR en tiempo real

hígado de ratón infectado experimentalmente si una método de lisis alcalina PCR en tiempo real

una BioMasher ® sp (Nippi, Tokio, Japón) se utilizó para la homogeneización de los tejidos del hígado.

reportado en todo el mundo (Hoenigl et al., 2010; Izumikawa et al., 2011; Miller et al, 2015.; Pinelli, nados en 0.5NH 2 ENTONCES 4 en la cultura Florida preguntar en 25 8 C para 6 - 7 semanas. Después de

Herremans, Harms, Hoek, y Kortbeek, embrionación, los huevos se almacenaron a 4 8 C hasta su uso. Las larvas fueron luego tramado

2011, Sakakibara et al. 2002). Los humanos contraen la infección ya sea por ingestión accidental mecánicamente, aislado libre de contaminantes cáscara de huevo (Takamiya et al., 1993). Para el

de huevos embrionados en el suelo o en contacto con el vehículo crudo que se cultiva en el suelo aislamiento de ADN por el método de lisis alcalina, tramado mecánicamente A. suum Las larvas fueron fi fijado

fertilizado con A. suum -Porcina contaminada excrementos (Matsuyama, Mizoguchi, Iwami, por 70% de etanol (Wako, Osaka, Japón). larvas de pulmón L3 de A. suum se obtuvieron de conejos

Kawabata, y Osame, 1998; Tokojima, Ashitani, y Nakazato, 2004)., O por el consumo de carne y machos japoneses blancos (Kyodo, Kumamoto, Japón) utilizando el método de Baermann como se

órganos cruda o poco cocinada que están parasitados por larvas de parásitos (Izumikawa et al, describió previamente (Yoshida et al., 2012).

2011). En Asia oriental, la última ruta es considerada principalmente como la causa de LMS

áscaris debido al hábito de comer (Choi et al., 2012). El diagnóstico de la A. suum la infección en

los seres humanos se basa principalmente en los ensayos inmunológicos. El ensayo más 2.2 | La infección experimental en ratones
recomendado es el ensayo de inmunoabsorción enzymelinked (ELISA) utilizando el antígeno
6 ratones Dieciocho C57BL / (SLC, Shizuoka, Japón) se dividieron en cuatro grupos. Tres ratones
secretora / excretor derivado de las larvas de tercera etapa de A. suum ( Pinelli y col., 2011;
fueron utilizados como control, y fi VE ratones en cada uno de los otros tres grupos se inocularon
Schneider, Obwaller, y Auer, 2015). Sin embargo, es un método indirecto para detectar A. suum infección,
con 100, 300, y 900 A. suum huevos embrionados por vía oral. Después de 2 días después de la
y la reacción cruzada con otras infecciones parasitarias se observa a menudo. Aunque ELISA es
infección, todos los ratones fueron sacrificados y se recogieron los hígados. A continuación, el
útil para el diagnóstico de A. suum la infección en animales vivos, no se puede evaluar con
hígado de cada ratón se desmenuzó a fondo y se submuestrea 500 mg para el ensayo de PCR
precisión la existencia de larvas en la carne y las vísceras se cree que son la causa de LMS
en tiempo real. El tejido restante se pesó y se digirió por el método de digestión con pepsina / HCl
áscaris. Por lo tanto, la demostración directa de A. suum Se requiere la contaminación larvas en la
para recuperar las larvas. El protocolo de la infección experimental fue aprobado por el Comité
carne o vísceras para evaluar el riesgo real de infección en esos alimentos.
Ético de Experimentación Animal de la Universidad de Miyazaki (2011-523-5).

Pecson, Barrios, Johnson y Nelson (2006) informó en tiempo real el ensayo de PCR para
2.3 | Extracción de ADN

determinar los niveles de total y viable Ascaris huevos en soluciones de laboratorio, se van a detectar Ascaris
Se extrajo el ADN a partir de pulmón L3 larvas de A. suum, tramado mecánicamente larvas L3 de T.
larvas en los tejidos animales. Además, una PCR ordinaria fue desarrollado para detectar A. suum ADN
canis y T. cati y gusanos adultos de A. lumbricoides por PureLink TM Genomic DNA Mini Kit
en las larvas de áscaris incrustado tejido (Ishiwata et al., 2003). Sin embargo, el método era mucho
(Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante.
tiempo, y por desgracia, la sensibilidad no fue evaluado plenamente. El objetivo de este estudio es

desarrollar una sensibilidad, especificidad fi cy sistema de PCR en tiempo real de ahorro de tiempo con método de lisis alcalina también se realizó para la extracción de ADN a partir de larvas L3
el fin de detectar A. suum la contaminación de las larvas en la carne y las vísceras y luego para evaluar mecánicamente rayada de A. suum, de hígado de ratón se disparó con larvas L3 tramado
el riesgo de estos alimentos para la infección del parásito en los seres humanos. mecánicamente y experimentalmente A. suum- hígado de ratón infectado (Tabla 1). queso Brie Florida

y, larvas L3 mecánicamente rayada se pusieron en tubos de 2 ml, seguido de la adición de 1,8 ml de

NaOH 50 mM. Después de incubación a 95 8 C durante 10 min, 200 metro se añadió l de 1 M Tris-HCl

(pH 8,0) en cada tubo. Las muestras de hígado de ratón que son sobrecargadas con A. suum larvas,

2 | MATERIALES Y MÉTODOS y las de los ratones infectados y no infectados se homogeneizaron en tubos de 15 ml

proporcionadas por BioMasher ® sp (Nippi, Tokio, Japón) antes de añadir 1,8 ml de NaOH 50 mM, y

2.1 | Los parásitos después se hirvió durante 30 min. Entonces, 200 metro se añadió l de 1 M Tris-HCl (pH 8,0) en cada

tubo. La mezcla se sometió a vórtice cuidadosamente y se centrifugó a 14.000 3 g durante 10 min.

Los gusanos adultos de A. suum se obtuvieron de los intestinos de los cerdos en un matadero en
Por último, el sobrenadante se separó y se almacenó a 2 20 8 C.
Japón. Los gusanos adultos de T. canis y T. cati se obtuvieron de perros y gatos después de la

administración de antihelmínticos.

lombriz intestinal gusanos adultos que fueron expulsados ​en las heces de un paciente humano se

identificaron fi ed tipificación de ADN ribosomal por PCR-RFLP (Zhu, Chilton, Jacobs, Boes, y
2.4 | ensayo de PCR en tiempo real
Gasser, 1999). Todos los gusanos se lavaron varias veces en solución salina (0,85%). por A.

suum, T. canis, y T. cati, se extrajo el útero para recoger los huevos. Los huevos fueron luego nos modi fi ed inversa secuencia del cebador, la concentración de cebador en una reacción y las

embrio condiciones de ciclado térmico en un tiempo real método PCR informó

NGUYEN ET AL. | 3 de 6

TABLA 2 Los resultados de un tiempo real de ensayo PCR a cabo en ADN extraído de A. suum, A. lumbricoides, T. canis, y T. cati

número de copias de la Número de reacciones

región ITS1 una
Especies Cantidad de ADN C t valor (media 6 DAKOTA DEL SUR) positivas en triplicado

A. suum 100 pg 20.22 6 0.02 296876.1 3

10 pg 23.80 6 0.14 29893.3 3

1 pg 27.21 6 0.39 3408.0 3

100 fg 30.55 6 0.26 393,4 3

10 fg 34.81 6 0.57 26.2 3

1 fg 35.11 - 1

100 ag - - 0

A. lumbricoides 100 pg 21.23 6 0.05 181281.8 3

T. canis 100 pg - - 0

T. cati 100 pg - - 0

una número de copias de la región ITS1 en 1 metro l de la extracción de ADN se calculó basándose en la cantidad media de fragmento IST1 en reacción.

por Pecson et al. (2006) como se muestra a continuación. Un fragmento de ADN (82 pb) de la región fi filtró a través de un tamiz de malla de nylon con tamaño de poro de 100 metro metro. Entonces la

ITS1 fue ampli fi ed usando PCR en tiempo real con los conjuntos de cebadores de cebador directo 5 0- fi fue filtrado fi filtró de nuevo a través de un tamiz de malla de nylon con tamaño de poro de 10 metro metro.

TGCACATAAGTACTATTTGCGCGTAT-3 0 y el cebador 5 revertir 0- CCGCCGACTGCTATTACATCA-3 Las larvas atrapados en el tamiz de malla de nylon se recogieron, y el número de larvas en cada

0. Una sonda TaqMan con la secuencia de 5 0- FAM-CGTGAGCCACATAGTAAATTGCACACAAAATGTAMRA-3

muestra se contó en un estereoscopio.

0 fue diseñado en la secuencia de la ampli fi producto ed. ampli fi catiónico se realizó en un volumen El número de larvas en 500 mg de tejido de hígado se calculó en base al número de larvas

total de 25 metro l que contiene 1 metro l de molde de ADN y la siguiente mezcla de PCR: 12,5 metro l recuperadas y el peso del tejido hepático examinado.
de TaqMan® Universal de Fast PCR Master Mix (Ampli fi ed Biosystems, Carlsbad, CA), 300 nM de

ambos cebadores directo e inverso y 200 nM de la sonda TaqMan. La condición de PCR en tiempo
3 | RESULTADOS
real fue modi fi ed a 95 8 C durante 20 s inicialmente, a continuación, 40 ciclos de 95 8 C durante 1 s,

60 8 C durante 20 s. Las reacciones con triplicado se realizaron en un Sistema de PCR StepOnePlus

3.1 | La sensibilidad y especificidad fi ciudad de ensayo de PCR en tiempo real
en tiempo real (Ampli fi ed Biosystems). Los resultados de amplificación fi catión se analizaron por v2.2

Software StepOne (Ampli fi ed Biosystems). La sensibilidad del ensayo se determinó por la prueba A. suum ADN con dilución en serie a partir

de 100 pg a 100 ag (Tabla 2). Además A. suum

ADN, 100 pg de T. canis, T. cati, y A. lumbricoides ADN se ensayaron para evaluar la especificidad fi

ciudad (Tabla 2).

Para el establecimiento de curva estándar en PCR en tiempo real, PCR convencional se utilizó
El ensayo podría detectar A. suum ADN hasta 10 fg, igualando a 26 copias de la región
para amplificar un fragmento de la región ITS1 de A. suum ADN con conjuntos de cebadores de
ITS1. No hubo ampli fi cationes con 100 pg de T. canis y T. cati DNA. Sin embargo, 100 pg de A.
cebador directo 5 0- GGCAAAAGTCGTAACAAGGT-3 0 y el cebador 5 revertir 0- CTGCAATTCGCACTATTTATCG-3
lumbricoides ADN era ampli fi DE en todas las muestras de triplicado.
0. El producto de PCR se purificó fi ed por SigmaSpin TM Secuenciación de reacción de limpieza

(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), la concentración de ADN se mide por Qubit TM Fluorómetro (Invitrogen),

y se utiliza para construir una curva estándar. El número de copias de la región de ITS1 se calculó

mediante la siguiente fórmula: 3.2 | Detección de A. suum ADN extraído de las larvas

Detectar A. suum ADN extraído de larvas real, las muestras que contienen 1, 2, 5, 10, o 20 larvas

fueron procesados ​por el método de lisis alcalina,

El peso molecular (MW) de fragmento ITS1 (g / mol) 5 ( tamaño pb del fragmento ITS1) 3 ( 330 Da 3

2 nucleótidos / pares de bases) TABLA 3 Detección de A. suum ADN extraído de las larvas por PCR en tiempo real

Peso de una molécula ITS1 (g) 5 MW de fragmento ITS1 (g / mol) / Avogadro ' número s

(6.02214199 3 10 23 moléculas / mol) Número de reacciones

Número de C t valor (media 6 DAKOTA número de copias de la positivas en triplicado
número de copias de la región ITS1 5 cantidad de ADN en la reacción (g) / peso de una región ITS1 una
larvas DEL SUR)

molécula ITS1 (g).

0 - - -

1 33.86 6 0.18 56.5 3

2.5 | método de digestión 2 33.63 6 0,73 71.0 3

5 31.61 6 0.23 253.8 3

El hígado de ratón picada restante queda después de submuestreo para PCR en tiempo real se digirió en
10 30.33 6 0.64 626,3 3
pepsina-HCl digestión Florida uid [1,2% de pepsina (1: 10.000) (Nacalai Tesque, Inc. de Kyoto, Japón) y
20 29.25 6 0.22 1220.8 3
1% de HCl (35%)] en 42 8 C durante 1 h bajo agitación constante en 100 ml vaso de vidrio. La relación
una número de copias de la región ITS1 en 1 metro l de la extracción de ADN se calculó basándose en la
entre el tejido (g) y Florida uid (ml) fue de aproximadamente 01:10. Después de la digestión, Florida UID era

cantidad media de fragmento IST1 en reacción.

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TABLA 4 Detección de A. suum ADN extraído de los tejidos del hígado claveteado con A. suum larvas TABLA 6 Detección de A. suum ADN en 500 mg de hígado de ratones inoculados con los huevos

del parásito

Número de reacciones Dosis número de copias de la

Número de larvas C t valor (media 6 DAKOTA número de copias de la positivas en triplicado (Número de Número de C t valor (media 6 DAKOTA región ITS1 una ratones
región ITS1 una
de pinchos DEL SUR) huevos) ratones DEL SUR) positivos (%)

0 - - - 900 5 29.44 6 1.68 14200.9 5 (100%)

1 35.32 6 0,44 21,9 3 300 5 31.99 6 3.20 1160.3 5 (100%)

2 35.29 6 0,56 22,6 3 100 5 35.79 6 3.26 142,3 4 (80%)

5 35,76 6 1,13 18,9 3 0 3 - - 0 (0%)

10 33.90 6 0,53 57,0 3 una número de copias de la región ITS1 en 1 metro l de la extracción de ADN se calculó basándose en la

20 31.17 6 0,13 339,0 3 cantidad media de fragmento IST1 en reacción.

una número de copias de la región ITS1 en 1 metro l de la extracción de ADN se calculó basándose en la

cantidad media de fragmento IST1 en reacción. ensayo de PCR, el resto del hígado se pesó y se digiere por el método de digestión con pepsina /

HCl. Entonces, el número de A. suum larvas recuperadas se contó y se ajustó el número como

y se obtuvo 2,0 ml de lisado para cada muestra. A continuación, 1 metro l (0,05%) del lisado se una de cada 500 mg del hígado (Tabla 5). Las larvas se recuperaron en ocho ratones inoculados

aplicó por triplicado a la PCR en tiempo real como ADN molde (Tabla 3). ADN extraído de una A. con 300 o 900 huevos. No larva se recuperó en cualquier ratones inoculados con 100 huevos y un

suum larva fue ampli fi ed éxito con media C t valor en 33,86, mostrando que 56,5 copias de ITS1 ratón inoculado con 900 huevos.

se existentes en 0,05% del lisado total. El número de copias de ITS1 en 1 metro l de muestras

aumenta proporcionalmente con el número de larvas utilizado.

3.5 | Detección de A. suum ADN en los hígados de ratones infectados

experimentalmente

3.3 | Detección de A. suum ADN extraído de las larvas de pinchos en tejido Plantilla de ADN fue aislado a partir de 500 mg de hígado de ratón por alkalinelysis método. DNA

hepático de A. suum se detectó en todas las muestras de hígado de ratones inoculados con 300 y 900

huevos y 4 de 5 ratones inoculados con 100 huevos (Tabla 6). Por otra parte, la media C t valores y
Para evaluar la capacidad de la PCR en tiempo real para detectar A. suum larvas en la carne y
las copias de la región ITS1 eran en relación con el número de huevos inoculados.
órganos, molde de ADN se preparó a partir de la mezcla de larvas y tejido animal. En el

experimento, 1, 2, 5, 10, o 20 larvas fueron sobrecargadas en 500 mg de hígado de ratón no

infectado, y el ADN se extrajo de la mezcla por el método de lisis alcalina. Un microlitro de lisado de

ADN (0,05% de lisado total) se aplicó como plantilla. Como resultado, larva individual en 500 mg de
4 | DISCUSIÓN

tejido hepático puede ser detectado por la PCR en tiempo real (Tabla 4). Sin embargo, las
Ascaris suum ha sido considerado como una especie causales improtant de LMS ascáridos
muestras que contienen 1, 2, y 5 larvas se ampli fi ed con la media similar C t valor de alrededor de
resultantes de la migración de los gusanos redondos áscaris (Maruyama et al, 1996;.. Pinelli y col, 2011).
35, mientras que significa C t valor de las muestras que contienen 10 y 20 larvas fueron 33,90 y
Los seres humanos se infectan con
31,17, respectivamente.
A. suum a través de la ingestión de huevos infectantes del suelo o contaminados verduras

(Matsuyama et al, 1998;.. Tokojima et al, 2004), o la ingestión de las larvas en la carne y las

vísceras (Choi et al, 2012;. Izumikawa et al, 2011).. En este documento, se informó de que el
3.4 | recuperación de larvas a partir de hígados de ratones infectados experimentalmente desarrollo de una sensibilidad y especificidad fi c tiempo real de ensayo PCR permitiendo identi

por el método de digestión con pepsina convencional / HCl rápida y fiable fi cación de A. suum larvas en el tejido animal.

ITS secuencia de ADNr es el gen diana a menudo elegido para detectar patógenos debido a
Con el fin de detectar las larvas migratorias en el tejido, se utiliza comúnmente el método de digestión.
su alto número de copias. Además, la diversidad genética de esta secuencia podría ser utilizado
Después de tomar 500 mg de hígado de ratón para el tiempo real
para distinguir las especies de nematodos que están estrechamente relacionados y / o con

morfológicamente similar (Chilton, Gasser, y Beveridge, 1994;. Ishiwata et al, 2003). En este
TABLA 5 recuperación de larvas a partir del hígado de ratones infectados experimentalmente con Ascaris

suum huevos por el método de digestión con pepsina / HCl estudio, se estableció un ensayo de PCR en tiempo real la orientación región ITS1 de A. suum

ADN para detectar la contaminación de A. suum larvas en el tejido animal. especí fi c ampli fi catiónico
Dosis carga media de
larvas una
(Número de Número de ratones se dio sin detección de T. canis y T. cati DNA. Sin embargo, A. lumbricoides que poseen una
huevos) ratones (distancia) positivos (%)
extrema similitud de las regiones ITS1 (98,67% de homología) con A. suum ( Zhu et al.,
900 5 13,6 (0 - 29) 4 (80%)

300 4 5,3 (2,4 - 10) 4 (100%)

1999) fue amplificado fi ed por este sistema. Como resultado del correo ff ECTS de la quimioterapia
100 5 0 (0 - 0) 0 (0%)
en masa y mejorar el agua, el saneamiento y la higiene en los países desarrollados, la
una El número de larvas recuperado de cada muestra se ajustaron como uno recuperado de
prevalencia de A. lumblicoides la infección se ha reducido drásticamente (Jones, 1983,
500 mg de tejido hepático.
Kobayashi, Hara, y Kajima, 2006).
NGUYEN ET AL. | 5 de 6

Es poco común y por lo general los casos se cree que han sido importados (Mandell, Bennett, y fi apareció por primera vez en el hígado 6 hr después de la infección y luego acumula gradualmente en el

Dolin, 2005). Por lo tanto, el riesgo de contaminación por A. lumbricoides huevos podría ser órgano en 1 - 2 días después de la infección, aunque la recuperación de larvas en fase migratoria mostró

descuidados en estas áreas. Sin embargo, A. lumbricoides la contaminación debe tenerse en gran variación para cada individuo (Dold et al, 2010;. Lewis et al., 2007). En este estudio, se recogieron

cuenta al aplicar nuestro sistema en países en desarrollo donde A. lumbricoides la infección se el hígado de ratones infectados experimentalmente en segundos después de la infección día, y

encuentra comúnmente. evaluamos las copias de gen ITS1 y cargas de larvas en 500 mg de muestras de hígado para ambas

muestras por el ensayo de PCR en tiempo real y el método de la digestión. En general, hubo proporción

Comparando los resultados entre la aplicación de ADN extraído de las larvas de sí mismos directa entre las copias de la región ITS1 detectados por el ensayo de PCR en tiempo real y el número

y el hígado de ratón se trataron con el mismo número de larvas, número de copias de la región de larvas recuperadas por el método de la digestión en los ratones inoculados con 300 o 900 huevos. A

ITS1 de las últimas muestras fueron obviamente más bajos que los de los antiguos muestras. Por pesar de que ninguna larva fue recuperado por el método de la digestión, nuestro sistema podría

ejemplo, el número medio de copia era 56,5 para uno muestras de larva (Tabla 3), mientras que detectar A. suum ADN en 4 de cada 5 ratones inoculados con 100 huevos. Además, este sistema

era también podría detectar al menos 22.04 copias de gen ITS1 en una muestra de 100 de hígado de ratón

21.9 para muestras de tejido hepático de pinchos con una larva (Tabla 4), es decir, se observó huevos infectados (datos no mostrados), lo que equivale al límite de detección de nuestro sistema de

aproximadamente 2,6 veces menor número de copias en las últimas muestras. La reacción de PCR en PCR en tiempo real se determina basándose en el resultado en el uso de tejido hepático las muestras

las últimas muestras podría explicarse por la interferencia de la PCR por los inhibidores, tales como cargadas con A. suum larvas. Por lo tanto, no habría al menos una larva de migrar al hígado en 4 de los 5

hemo y así sucesivamente; y el exceso de cantidad de ADN huésped se originó a partir de tejido de ratones. Sin embargo, uno de fi ve esas muestras se convirtieron en negativos por el ensayo de PCR en

hígado en la última muestra. Aunque el correo FFI ciencia para la detección de las larvas se redujo tiempo real. Teniendo en cuenta el límite de detección de nuestro ensayo, no larva podría incluirse en el

cuando se aplica sobre el tejido de hígado, la sensibilidad de la PCR en tiempo real desarrollado todavía tejido hepático se utiliza para el aislamiento de ADN en tiempo real ratón negativo PCR.

era suficiente para detectar una larva.

Con el fin de detectar larvas de parásitos en los tejidos animales, kits de aislamiento de ADN

comerciales con tratamiento con proteinasa K se utilizan comúnmente para el aislamiento de ADN

(Ishiwata et al., 2003; López y Pardo, 2010). Aunque tal método proporciona alta calidad de ADN e FFI cientemente, El sistema de PCR en tiempo real se ha desarrollado en este estudio para detectar A.

es preferible que el procedimiento de inspección de la carne que la técnica es relativamente sencillo, suum contaminación larval en el hígado que tiene un riesgo de transmisión de

barato y que ahorran tiempo y mano de obra. Hemos adoptado el método de lisis alcalina para el A. suum. Este ensayo demostró tener una alta sensibilidad y especificidad fi ciudad. Aplicación del

aislamiento de ADN en este estudio, y tuvimos éxito para detectar A. suum ADN incluso si sola larva ensayo en el procedimiento de inspección de la carne puede contribuir a mejoras en la salud pública,

contaminado en el tejido hepático. Este simple método de aislamiento de ADN podría aplicarse al así como en la salud y bienestar de los animales. Además, este ensayo también se aplicaría para la

procedimiento de inspección de la carne para detectar no sólo A. suum larvas pero también otra evaluación de la tierra o el medio ambiente cajón de arena contaminada con huevos de parásitos.

contaminación parasitaria, tal como Toxoplasma gondii y Sarcocystis spp.

EXPRESIONES DE GRATITUD
Ishiwata et al. (2003) tenido éxito A. suum ampli DNA fi de cationes a partir de 50 mg de tejido
Estamos muy agradecidos a Hiroyuki Matsuoka gracias a la amabilidad de ofrecer A.
de hígado de cerdo incrustados con A. suum larvas. En este estudio, para extraer A. suum ADN
lumbricoides. Este trabajo fue apoyado por becas de la Sociedad Japonesa para la Promoción de
del tejido del hígado, las muestras se fi primera homogeneizada por BioMasher ® sp (Nippi, Tokio,
la Ciencia (subvención-en-Ayudas a la Ciencia fi c Investigación (C) 15K07723), el Ministerio de
Japón) que se puede aplicar al peso máximo de tejido, 500 mg. Nuestro sistema desarrollado
Salud, Trabajo y Bienestar (Promoción de la Investigación traslacional en tecnología médica
puede examinar el ADN en 10 veces más tejido que el método anterior. Sin embargo, teniendo en
H25Iryougijutsu-Shitei-012) y la Universidad de Miyazaki (Programa de Apoyo a la Mujer Los
cuenta el peso de carne y carne de órganos, 500 mg de tejido es extremadamente pequeña y no
investigadores 3901080200).
es su FFI ciente para evaluar la contaminación de las larvas en la carne y las vísceras totalmente.

La migración de A. suum larvas a través del hígado causa hemorragia, fi fibrosis, y la acumulación

de linfocitos presentes a manchas blancas (Nakagawa, Yoshihara, Suda, y Ikeda, 1983). Se ha

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Cómo citar este artículo: Nguyen YTH, Wang Z, Maruyama H, Horii Y, Nonaka N,
Yoshida A. Evaluación del ensayo de PCR en tiempo real para la detección de Ascaris suum
contaminación en la carne y las vísceras. J Saf Alimentos. 2017; 37: e12301. https://doi.org/10.
1111 / jfs.12301