Ing. Mg.

Ricardo Rodriguez Vilchez

 Introduccion
• En ocasiones al ver una serie en la t.v.; de las policíacas o de
médicos donde se hacen análisis a pequeñas muestras para
averiguar si hay DNA y si este coincide con el de la “víctima” o con
el “malo”, o si cierta sustancia puede afectar a la salud, etc..,
entonces uno ve que los investigadores hacen una serie de estudios
con las muestras, que en ocasiones son muy pequeñas, y dan
resultados; en la vida real sucede algo similar; cuando se tiene en el
laboratorio, en una solución, presencia de color, o cuando se sabe
que hay ciertas cantidades de algún elemento pero no se sabe
cuanto, se genera la inquietud de saber que elemento es, en que
cantidad está y es entonces que se producen una serie de
preguntas, tales como: ¿COMO LO MIDO? y otras más, entre ellas
pueden estar: ¿Qué es la luz?, ¿qué es longitud de onda, ¿cómo se
mide?, ¿que relación hay entre luz y color?; ¿para que sirve esto?,
¿de qué manera se mide una solución coloreada?.
• En este trabajo se propone de orientar de manera sencilla, sobre
este tema tratando de dar una idea fundamental de las preguntas
anteriores y otras más que se hacen en torno al tema que se está
presentando; espero este trabajo sea útil tanto a profesores como
alumnos para orientarse y poder entender más acerca de la
espectrofotometría a nivel laboratorio de ciencias biológicas.
Espectroscopía
• Características de la Luz
• Colores
• ¡Qué es longitud de Onda?
• Relación entre frecuencia, velocidad y longitud de onda
• Absorción / Absorbitividad
• Las leyes de Lambert y Beer

Espectrofotometría
 Colorimetría y Espectrofotometría como procedimientos
analíticos
Fotocolorímetro
ESPECROFOTÓMETRO
Curva Patrón

Referencias e Imágenes
La espectroscopia es el estudio del espectro de la
luz que emiten los cuerpos, sustancias y
elementos.

De este estudio se puede conocer la composición,

temperatura, densidad, velocidad de
desplazamiento y otros factores que les son
propios y componen a estos cuerpos, sustancias
o elementos
La luz tiene una naturaleza dual:
• Como onda
• Como una corriente de partículas o paquetes de
energía (fotones)
Albert Einstein desarrolló en 1905 la teoría de
que la luz estaba compuesta de unas partículas
denominadas fotones, cuya energía era
inversamente proporcional a la longitud de
onda de la luz.
 3
1

Foton

2
 La teoría electromagnética de la luz propuesta por
Maxwell: La perturbación que se propaga como ondas de
luz está formada por fuerzas eléctricas y magnéticas, y
la perturbación se produce en cargas eléctricas en
movimiento.
“Efecto de la emisión electromagnética”
El efecto fotoeléctrico demuestra el comportamiento de la
luz como partícula (gránulos o corpúsculos)
La naturaleza corpuscular de la luz se observa
en fotos de objetos iluminados muy débilmente.
La imagen se forma punto a punto, y muestra
que la luz llega a la película fotográfica por
unidades separadas que los producen.
 Estos descubrimientos dieron origen a toda la
tecnología moderna de telecomunicaciones como la
televisión
En estas imágenes
se puede apreciar,
debido a la toma
fotográfica los
elementos
“puntuales “ que
apoyan a esta
teoría
Los seres humanos (y algunos animales) apreciamos una
amplia gama de colores que, por lo general, se deben a la
mezcla de luces de diferentes longitudes de onda. Se
conoce como color puro al color de la luz con una única
longitud de onda o una banda estrecha de ellas.
Cuanto más larga la longitud de onda de la luz visible
tanto más rojo el color.
Asimismo las longitudes de onda corta están en la zona
violeta del espectro.
Así todos los elementos existentes poseen un
espectro ***
Hay varios tipos de espectros, los más comunes son
los espectros continuos, espectros de emisión y los
espectros de absorción.
Si es colocado frente al espectroscopio se podrá ver, un
elemento:
En situaciones en las que se le somete altas temperaturas y
presiones y no se presentan líneas obscuras se trata de un
espectro continuo.
En situaciones normales y se observan unas líneas de
colores frente a un fondo negro, se trata de un espectro de
emisión.
Y por último si sucede la primer situación y entre el
elemento afectado y el espectroscopio se coloca un
elemento a menor temperatura que el primero, se obtiene
el espectro de absorción
La luz blanca produce al descomponerla lo que
se llama un espectro continuo, que contiene el
conjunto de colores que corresponde a la gama
de longitudes de onda que la integran.
 Todos los elementos poseen un espectro propio,
que se puede medir al someterse a temperaturas
elevadas ya que producen espectros discontinuos .

**Para ver espectros de la tabla periódica buscar en esta página

http://site.ifrance.com/okapi/quimica.htm **
La distancia entre dos picos (o dos valles) de una onda se
llama longitud de onda (λ = lambda).

λ
CARACTERÍSTICAS DE LAS ONDAS

nodo
 La longitud y la frecuencia de onda son
inversamente proporcionales y se
relacionan mediante la siguiente ecuación
 U.V.
La luz visible es
X
L GAMMA
sólo una pequeña
u parte del
z
350 nm espectro
electromagnético
v con longitudes de
i onda que van
s aproximadamente
i de 350
b nanómetros hasta
l unos 750
750 nm
e Infrarrojo
nanómetros
Microondas <nanómetro, nm =
milmillonésimas de metro>.
Radio
 La luz blanca está compuesta de ondas de diversas
frecuencias. Cuando un rayo de luz blanca pasa por un
prisma se separa en sus componentes de acuerdo a la
longitud de onda
Así la luz blanca es una mezcla de todas las longitudes de
onda visibles.
En el espectro visible, las diferencias en longitud de
onda se manifiestan como diferencias de color.
La distribución de los colores se determina por la
longitud de onda de cada uno de ellos.
Las longitudes de onda mas largas que las del rojo se les
conoce como infrarrojas y las mas cortas que el violeta,
ultravioletas.

Ultravioleta Luz visible Infrarrojo

102 -104 ~ 104 104-107

UV Violeta Azul Verde Amarillo Naranja Rojo IR

4000 A Espectro Visible 7500 A
 Relación entre frecuencia,
velocidad y longitud de onda*
Frecuencia natural
Cualquier objeto oscilante tiene
una 'frecuencia natural',
(vibración en ausencia de
perturbación).
frecuencia es el Número de vibraciones por
segundo

Así Frecuencia, es número de veces

que la onda se repite por segundo.

La Frecuencia se mide en Hertz (Hz)

 ¿Quién es HERTZ?

HEINRICH HERTZ (1857-1894), Investigador alemán que

construyó un dispositivo para generar y detectar en un
laboratorio ondas electromagnéticas, demostrando su
existencia así como, se reflejan estas ondas, se refractan y
se comportan como las ondas de luz

Estimó que la frecuencia f de la onda era de alrededor de 3

x 107 Hz. Y determinó que su longitud l era de 10 m. Con
estos valores estableció que la velocidad v de la onda es

v = f l = (3 X 107 Hz) X (10 m)

= 3 X 108 m/s = 300 000 km/s

o sea, la velocidad de la luz.

 1 Hz (o hercio) es igual a 1 ciclo u
oscilación por segundo. (1 Hertz = 1
ciclo/seg)

Un kilohercio (kHz) = mil de ciclos por

segundo

Un megahercio (MHz) = un millon de

ciclos por segundo

Un gigahercio (GHz) = mil millones de

ciclos por segundo
Un péndulo de 1 m de longitud presenta
una frecuencia de 0,5 Hz, es decir que el
péndulo va y vuelve una vez cada 2
segundos.
Longitud de onda = velocidad de propagación / frecuencia

l c u
l= c / u
Donde c = vel. de la luz en m. por seg.

c = l . u (m-1s-1)
u=c/l
 Frec = Vel / l
Como la luz viaja a una
velocidad de
3 x 108 m/s

Freclimite luz visible = 3x108 (m/s) / 10-6 (m)=

3x1014 Hz
Es decir: 300 000 000 000 ciclos por segundo
Relación entre Medidas en valores Hertz y Metros
 Las ondas electromagnéticas de
frecuencias extremadamente
elevadas, como la luz o los rayos X,
suelen describirse mediante sus
longitudes de onda, que
frecuentemente se expresan en
nanómetros.
Un ejemplo es: Una onda
electromagnética con una longitud
de onda de 1 nm tiene,
aproximadamente una frecuencia de
300 millones de GHz.
 l= vel / u
El sonido se propaga a una velocidad de 340 m
cada segundo

La nota La tiene una frecuencia de 440 Hz

l= 340 (m/s) / 440 Hz (ciclos por seg) = 0.77 m
• 4 x 10-5 cm = 400 nm (luz violeta)
• 7 x 10-5 cm = 700 nm (luz roja)
 Algunas equivalencias

1m 0.001 mm 10-6 m

nm = mm 0.001m
10-9 m

1Å 0.0001m = 0 .1
nm 10-10 m
Comparación de las mediciones de las
longitudes de onda con la luz visible.
El color de un cuerpo depende de la luz que
recibe, refleja o transmite. Por ejemplo, el
color rojo se dá cuando absorbe en casi su
totalidad, todas las radiaciones menos las
rojas, las cuales refleja o deja pasar
dependiendo su estructura (sólida o
transparente).
La energía UV es mayor que,
cualquier color del espectro
visible. Sin embargo los
rayos X son más energéticos
que la luz UV, como se puede
apreciar por su longitud de
onda.

Con base a lo anterior se

puede entender que
existe una relación
inversa entre la longitud
de onda y la energía del
fotón correspondiente.
 Entonces, las energías en el rango ultravioleta-visible
excitan los electrones a niveles de energía superiores
dentro de las moléculas y las energías infrarrojas
provocan solo vibraciones moleculares
El color percibido de una solución depende de la
combinación de colores complementarios que la
atraviesan
 Proceso de Absorción

La energía de excitación a una molécula

proveniente de un fotón durante el proceso de
absorción se representa así:

A + hn  A*  A + calor
donde:
A es el absorbente en su estado de energía bajo,
A* es el absorbente en su nuevo estado de
excitación energética
hn representan a la constante de Planck y la
frecuencia respectivamente
• La energía del fotón incidente posee una
longitud de onda (l)
 
• A* es inestable y rápidamente revierte a
su estado energético más bajo, perdiendo
así la energía térmica correspondiente.
 
• La absorción de determinadas longitudes
de onda depende de la estructura de la
molécula absorbente (absortividad, “a”)
Cuando un rayo de luz monocromática con una intensidad I0
pasa a través de una solución, parte de la luz es absorbida
resultando que la luz emergente I es menor que I0

Luz incidente (I0) Luz absorbida Luz emergente (I)

a a=
absortividad
I0
I
c = concentración
(número de partículas por
b
Longitud del medio absorbente
cm3)

o ancho de la celda
 Absortividad (a)

a es una constante de proporcionalidad

que comprende las características
químicas de cada compuesto, o molécula
y su magnitud depende de las unidades
utilizadas para b y c.
Cuando se expresa la concentración en moles
por litro y la trayectoria a través de la celda
en centímetros, la absortividad se denomina
absortividad molar y se representa con el
símbolo  .
En consecuencia cuando b se expresa en
centímetros y c en moles por litro.

A=  bc
Donde A representa la absorbancia del
compuesto
Las leyes de Lambert y Beer *

o
los fundam
entos de la
de la luz q interrelació
ue se abso n
rbe y la qu
transmite e se
Ley de Lambert: cuando un rayo de luz
monocromática (I0) pasa a través de un medio
absorbente, su intensidad disminuye
exponencialmente (I) a medida que la longitud del
medio absorbente aumenta

I = I0e-ab
I0 I0 I I0 I
I

1 cm. 2 cm. 3 cm.

Ancho de la celda
Ley de Beer: Cuando un rayo de luz monocromática pasa
a través de un medio absorbente, su intensidad
disminuye exponencialmente a medida que la
concentración del medio absorbente aumenta

I = I0e-ac

I0 I I0 I I0 I
Lo que significa que combinando ambas leyes se crea la
Ley de Beer-Lambert donde la fracción de luz
incidente que es absorbida por una solución es
proporcional a la concentración de soluto y al espesor de
la sustancia atravesada por la luz. La relación entre la
luz incidente (I0) y la reflejada (I) dará una idea de la
cantidad de radiación que ha sido absorbida por la
muestra.
 Ley de lambert Beer:

I = I0e-abc

Si despejamos: I/I0 = e -abc

 Al cociente de las intensidades se denomina
Transmitancia

T = I/I0 = e-abc
Sacando logaritmos:
Loge I/I0 = abc

Convirtiendo a log10:
Log10 I/I0 = 2.303 abc
Log10 I/I0 = abc

Absorbancia = Log10 I/I0 = abc

La Transmitancia (T) es la relación entre la
intensidad de luz transmitida por una
muestra problema (I) con la intensidad de
luz incidente sobre la muestra (I0):

T = I / I0

Se expresa como % T
La absorbancia es directamente proporcional
a la longitud del recorrido b a través de la
solución y la concentración c del color
absorbente. Estas relaciones se dan como:

A = a·b·c

• A menudo b es dada en términos de cm. y c en gramos por litro, entonces la

absortividad tiene unidades de l·g–1·cm–1.
 ¿Qué relación guardan la transmitancia y la
absorbancia?

De acuerdo a las características de la sustancia

analizada, la luz que no se absorbe atraviesa la
solución
LUZ A
B
S
O Luz transmitida
R

I0 B
I I
D
A T = I/I0
 Por lo tanto la absorbancia es reciproca de
la transmitancia
Absorbancia contra concentración (comportamiento lineal)

Absorbancia

Concentración
% Transmitancia contra concentración (pendiente con signo
negativo y comportamiento exponencial)

% Transmitancia

Concentración
 Absorbancia

De loA anterior se desprende que la Absorbancia (A) o luz

que es absorbida por la muestra es igual al logaritmo en
base diez del recíproco de la transmitancia (T) o bien al
-log10 de la transmitancia, en el que el disolvente puro o
(“blanco”) es el material de referencia; esto es:

A = log10 1/T = log101- log10 T = 0 – log10 T = – log10 T

mg
La representación gráfica correspondiente a absorbancia y
transmitancia en un gradiente de concentraciones es la
siguiente:

ó bc
Concen
tración
Obtención de TRANSMITANCIA utilizando valores de
Absorbancia
Con base en la relación: T = 10-abc
y considerando que T se menciona en porcentaje (%)
%T = 10-abc x 100.
Aplicando logaritmos a la expresión anterior
log10 %T = -abc log 10
10 + log10 100
Invirtiendo términos
log %T = log10 100 -abc log 10
10 = 2 – abc * 1
log10 %T = 2 – abc
Como abc = Absorbancia = A
log10 %T = 2 – A.
Se le llama espectrofotometría a la medición
de la cantidad de energía radiante que
absorbe un conjunto de elementos o un
elemento en su estado puro, en función de la
longitud de onda de la radiación lumínica y a
las mediciones a una determinada longitud de
onda.

* Arco iris en Marte

¿Cómo se puede medir la radiación que emiten o
absorben los cuerpos?.
Un aparato capaz de obtener el espectro de
una radiación, es decir, de separar la radiación
en sus componentes, se llama un espectroscopio.
Si el aparato es capaz de fotografiarla se llama
un espectrógrafo, y
Si es capaz de medirla diremos que se trata de
un espectrómetro.
Cuando es capaz de medir también la intensidad
de la radiación, se llama espectrofotómetro.
Espectroscopio 1817

Espectógrafo
 Espectómetro

De fluorescencia Imagen de Marte vista con

ayuda de espectómetro de
rayos Gamma

De Emisión
Óptica
Para metales
 Colorimetría y
Espectrofotometría
como
procedimientos
analíticos *
Las técnicas colorimétricas se
fundamentan con la medición de la
absorción de radiación visible por
sustancias coloreadas.

Sin embargo, cuando una muestra a

determinar no posee coloración, es
necesario llevar a cabo un tratamiento de
color empleando substancias que que
reaccionen de forma proporcional con el
compuesto de interés
Las diferentes sustancias se analizan mediante
reacciones coloreadas. Cuanto mayor es la concentración
de la sustancia a analizar mayor es el color de la
reacción.
También es posible que la muestra pueda ser
“leída” cuando su espectro de absorción se
encuentra en las regiones no visibles del
espectro, como las referentes a las regiones de
UV o Infrarroja

Visón de las abejas

Orbitas de TITAN
Casiopea A: ecos de luz en infrarrojo  
La diferencia entre colorimetría y
espectrofotometría consiste en el tipo de
instrumental empleado:

El colorímetro es un aparato en los que la longitud de

onda se selecciona por medio de filtros ópticos que son
insertados en este.

En el espectrofotómetro la longitud de onda es

seleccionada mediante dispositivos monocromadores los
cuales están integrados a la máquina.
Algunos de los procedimientos colorimétricos o
espectrofotométricos con los que se cuenta
para precisar la concentración de una sustancia
en solución son los siguientes:

Referencia de color
Espectrofotómetro
Un espectrofotómetro es un instrumento
que descompone un haz de luz (haz de
radiación electromagnético), separándolo
en bandas de longitudes de onda
específicas, formando un espectro
atravesado por numerosas líneas oscuras
y claras, semejante a un código de barras
del objeto, con el propósito de identificar,
calificar y cuantificar su energía
Distribución de la luz en el
espectrofotómetro
  

Espectrofotómetro Mecanismo Interno

  

Met.Cient. I
COLOR LONGITUD DE ONDA (l)
Rojo (R) 700 nm
Verde (G) 546.1 nm
435.8 nm
Azul (B)
 
Es usual que al seguir una “receta” para la
determinación de la concentración de un compuesto
en particular se indica una longitud de onda (l)
específica a la que hay que leer con el colorímetro
o espectrofotómetro.

¿Porque leer a diferentes l (longitudes de onda)

compuestos parecidos pero diferentes?

La explicación radica en el hecho de que cada

producto químico se caracteriza por zonas del
espectro visible o no visible en el cual absorbe con
mayor o menor intensidad conformando en su
conjunto el espectro de absorción de tal sustancia.
Cada compuesto (de complejo a simple) presenta un espectro de
absorción característico
Absorbancia

l
Las longitudes de onda con mayor absorción (picos) corresponderán de
forma general a aquellas con las que se leerá la muestra para
determinar su concentración
Absorbancia

l
La relación entre la absorbancia por una sustancia a una l determinada
y su concentración es directamente proporcional es decir: a mayor
concentración mayor proporción de luz absorbida.

Absorbancia
Conc.
Así, el espectro de absorción de la clorofila es:
Colorante común, la Rodamina 6G en Metanol..

Espectro de Absorción (línea contínua) y Espectro de

Transmisión (línea discontínua).
celda de 5uL

La muestra se coloca en una cubeta* de

forma prismática
Se asume que el tubo, celda o “cubeta” en la cual
se vierte la solución a leer no debe desviar la
trayectoria de la luz como requisito para el
cumplimiento de la ley de Beer
Como el cuarzo aparte de ser muy transparente presenta un
comportamiento constante ante la variación de la longitud de
onda es común que las celdas del espectrofotómetro o
colorímetro sean de este material .
 Curva Patrón

El razonamiento para el proceso de

determinación de una concentración
desconocida es:
A partir de concentraciones conocidas de las
cuales también se sabe su absorbancia (curva
patrón), es posible interpolar (intercalar) la
concentración del problema sabiendo su
absorbancia (línea roja en figura siguiente)
 CURVA PATRÓN

0.6

0.5

A
Absorbancia del problema
B 0.4
S
0
R 0.3
B
A
N 0.2
C
I Interpolación
A 0.1

0
0 2 4 6 8 10 12
Concentración mg/lt
Con base en que la Absorbancia guarda una relación lineal con
la concentración, se comprende la existencia de una relación de
proporcionalidad entre la Absorbancia y la concentración:

A1 / A2 = C1 / C2
Donde:
A1 = Absorbancia del problema.
A2 = Absorbancia de un estándar de concentración conocida.
C1 = Concentración del problema.
C2 = Concentración del estándar.

Si despejamos C1 = Conc del problema

A1 (problema) * Conc estándar

Conc. (problema) =
A2 (estándar)
Un aspecto importante de la evaluación
espectrofotométrica, es que muchas moléculas orgánicas
no absorben en el intervalo del espectro visible sino en el
rango de longitudes de onda acordes al ultravioleta o al
infrarrojo

Por lo que es común, actualmente, que la mayoría de los

espectrofotómetros, actuales, se encuentren provistos
con lo necesario para leer en de tales intervalos

Así, los grupos carbonilo presentes en los aldehídos

(RCHO), cetonas (RCOR), ácidos carboxílicos (RCOOH),
l ésteres (RCOOR´) y amidas (RCONHR´) dan lugar a
absorciones intensas en la región del espectro de
infrarrojo situada entre 1780-1640 cm-1.
Absorciones máximas (picos de absorción) de algunos
compuestos que absorben en la región ultravioleta:
Grupos funcionales cuyos picos de absorción se localizan en la
región del infrarojo
 CUIDADOS
• Las muestras no deben tener burbujas, encontrarse
turbias o con precipitados.
• El volumen de la muestra en la cubeta, no debe ser
excesivo para evitar que se desborde, en caso de que
sucediera, se debe limpiar con un paño limpio o papel
absorbente suave, para evitar rayarla.
• La cubeta se sujeta por los lados opacos.
• La cantidad a adicionar es, máximo, hasta ¾ partes de
la cubeta
• No se deben derramar líquidos, sobre todo solventes,
ácidos o álcalis; dentro del contenedor de la cubeta, se
puede dañar parte del mecanismo
• Se debe mantener, el espectrofotómetro, limpio y libre
de humedad.