SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE SENA

TECNOLOGO EN CONTROL AMBIENTAL

CENTRO MINERO

OBJETO: AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS APARTIR DE MUETRAS DE AGUA Y

SUELO.

Para aislar e identificar una especie bacteriana del medio y de otra especie que pueda
confundirse morfológicamente es necesario usar medios de cultivos, ya que nos permiten
diferenciar las características del crecimiento de las bacterias y establecer su identidad
según el medio de cultivo que se use. Los microorganismos se encuentran en muchos
ambientes naturales como el agua, el suelo, aire, el hombre y otros seres vivos,
alimentos, entre otros. Haciendo parte de los diferentes ecosistemas. Por esto se deben
usar los medios de cultivo adecuados que se asemejen al ambiente si queremos
posibilitar el crecimiento de la bacteria. Un medio de cultivo está diseñado para
posibilitar el desarrollo y nutrición de las bacterias por esto cuenta con una cantidad de
sustancias como: carbono, agua, azufre, fosforo, nitrógeno, potasio, sodio, magnesio,
entre otros. También su crecimiento depende de muchos factores entre ellos: un pH
preferiblemente neutro, humedad, oxigeno, temperatura, presión osmótica, todo esto
en condiciones adecuadas.

Los medios de cultivo se clasifican dependiendo de las características que se necesiten

para su óptimo desarrollo los cuales según su consistencia pueden ser:

 Líquidos: No contienen agar y favorecen el crecimiento bacteriano ya que las

bacterias poseen una gran libertad de movimiento y al difundirse por todo el
medio encuentran su componente nutritivo y requerimiento de oxigeno más
óptimo con gran facilidad, por ejemplo: las aerobias estrictas crecen en los
primeros 10-15mm de la superficie del medio, las microaerofilas ligeramente por
la superficie del medio, las anaerobias estrictas en los 10-20mm del fondo y las
facultativas por todo el medio.
 Solidos: Su concentración de agar es de 1.5% a 2%, en estos las bacterias crecen
con mayor dificultad, ya que los nutrientes pueden agotarse fácilmente, se
utilizan para ver colonias, aislar microorganismos, características de crecimiento,
color, tamaño, taxonomía, entre otros.
  Semi-solido: Su concentración de agar es de 0.5% y se utiliza para estudiar el
movimiento y algunas propiedades bioquímicas.

También según su aplicación se usa:

 Simples: son apropiados para la mayoría de microorganismos ya que poseen

requisitos nutricionales mínimos para desarrollarse.
 Enriquecidos: permiten el crecimiento de bacterias difíciles de cultivar, puesto
que se añade ciertos componentes muy ricos en nutrientes.
 Selectivos: estos medios contienen componentes que inhiben el crecimiento de
algunas bacterias cuyo crecimiento no interesa, permitiendo así aislar una
determinada especie.
 Diferenciales: en este se les adiciona sustancias para el crecimiento de
determinadas bacterias y al actuar sobre dichas sustancias adquieren un color
que las diferencia de otras colonias.
 Enriquecimiento: son medios líquidos que favorecen la multiplicación de
bacterias cuando la muestra obtenida es pobre.

De acuerdo con su aplicación los componentes usuales de los medios de cultivo son:

 Extracto de carne: constituye una fuente de carbono, nitrógeno, sales orgánicas y

otros nutrientes.
 Peptonas: son proteínas degradadas, ricas en nitrógeno y carbono.
 Cloruro de sodio: importante para proporcionar un adecuado equilibrio osmótico.
 Tampones estabilizadores del pH: necesarios para contrarrestar las variaciones
del pH debido a los productos del metabolismo bacteriano.

TÉCNICAS DE AISLAMIENTO

Existen distintas técnicas para la siembra en estrías, el objeto es obtener colonias

aisladas

• Técnica A: Consiste en cargar el ansa con la muestra y hacer estrías paralelas en

la cuarta parte de la superficie de la placa, se quema el ansa, se enfría, se gira la
placa a 90° y se vuelve a estriar tocando 3 o 4 veces el área sembrada
inicialmente y cubriendo otro cuarto de la placa. Por último, sin quemar el ansa,
se estría el resto de la superficie sin sembrar.

 Técnica B Con el ansa cargada se hacen 3 o 4 estrías; se quema el ansa, se

hacen 3 o 4 estrías perpendiculares a las anteriores, se quema el ansa y se
repite el procedimiento hasta agotar la superficie de la placa.
 • Siembra en agar en tubo inclinado o bisel: en este caso se colocan 5 ml de
medio de cultivo fundido y estéril, se inclina el tubo y se deja enfriar.

El inóculo se siembra, con ayuda de ansa, de la siguiente manera:

• En profundidad con ansa de punta: se pica con el ansa el cultivo a sembrar y se

introduce mediante punsión en el medio contenido en la parte inferior del tubo.

• En superficie con ansa de aro: se pica con el ansa el cultivo a sembrar y se

esparce el mismo sobre la superficie en bisel en forma de zigzag.
 Siembra en cajas de Petri por la Técnica de siembra masiva
Este método es muy utilizado para obtener un gran numero de microorganismos,
en la superficie de un agar. Esta técnica de siembra utiliza un hisopo, el cual se
pasa por toda la superficie de la placa en distintas direcciones y finalmente por
el borde para que, el crecimiento de los microorganismos sea total en la
superficie de placa.

Siembras en cajas de Petri por la técnica de punción

Método de siembra utilizada para observar el crecimiento de hongos y así más adelante
establecer su morfología; así como, para la transferencia o subcultivo de cepas
previamente almacenadas y/o conservadas. Consiste en tomar parte de micelio con una
asa micológica (o asa recta), y por punción suave en el centro de la caja inocular el
microorganismo a estudiar. Dependiendo del objetico, pueden hacerse múltiples
picaduras en el agar.
 Caracterización del crecimiento en placas de Agar Nutritivo
la descripción se realiza sobre las colonias formadas (agrupamiento originado por
el crecimiento y observable macroscópicamente), de forma aislada y se evalúa de
la siguiente manera.

METODOLOGÍA

1. Limpieza y desinfección del área de trabajo.

2. Preparación del medio: Se siguen las instrucciones del rótulo del medio de
acuerdo a la cantidad a preparar. Se transfiere el medio a un erlenmeyer y se
agrega la cantidad de agua destilada establecida. Con ayuda de un vigilante se
disuelven los grumos que puedan formarse y se lleva la suspensión a baño maría
hasta que el medio se torne transparente, se cubre el erlenmeyer con un tapón
de algodón (torunda) envuelto en gasa. Se cubre la torunda con material
impermeable y se esteriliza en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Si se
utiliza de inmediato, dejar enfriar a temperatura alrededor de 45°C. En caso de
que el medio solidifique, fundirlo nuevamente a baño maría antes de su uso.

3. Análisis muestra de suelos (técnica siembra placa masiva)

 1) En condiciones estériles (trabajar en campana de flujo laminar), adicionar 1 g del
suelo a una botella de dilución o matraz con tapa de rosca con 99 ml de solución
salina isotónica estéril (dilución 10-2). Dispersar el suelo y homogeneizar con
agitación vigorosa en vórtex.
2) Tomar 1 ml y transferirlo a un tubo con 9 ml de solución salina estéril (dilución
10-3). De ahí se hacen diluciones sucesivas hasta completar diluciones decimales
hasta 10-10 o las adecuadas, asegurándose de utilizar una punta o pipeta estéril
diferente en cada paso. Agitar de forma constante con vórtex en cada paso.
3) Tomar 0.1 ml de la dilución seleccionada y colocarla en el centro de la superficie
del medio de cultivo seleccionado para el crecimiento. Realizar esto por
triplicado y con tres diluciones próximas (ej. 10-3, 10-4 y 10-5) para asegurar la
cuenta.
4) Extender la alícuota en la superficie de la placa con una varilla de vidrio
previamente esterilizada (inmersa en alcohol y pasándola por la flama del
mechero permitiendo su enfriamiento). Asegurar una distribución homogénea por
toda la superficie del medio.
5) Incubar las placas de forma invertida a 25°C en ausencia de luz.
6) Después de un periodo de incubación (de 3 a 7 días, dependiendo del tipo de
microorganismo), contar el número de colonias y reportar como unidades
formadoras de colonias (UFC)/ g de suelo seco.

4. ANÁLISIS DE MUESTRA DE AGUA (técnica placa profunda)

1) Agitar el frasco de la muestra
2) Realizar diluciones seriadas en base 10 hasta 10-5
3) Tomar 1 mL de la dilución seleccionada y depositar en el medio de la placa.
4) Posteriormente adicionar el medio de cultivo seleccionado, asegurarse de
realizar la homogenización total de la muestra y el medio.
5) Incubar a 37°C por 48 horas, placa invertida.
6) Después del periodo de incubación, contar el número de colonias y reportar como
unidades formadoras de colonias (UFC)/ mL de agua.
5. CARACTERIZACIÓN MICROSCÓPICA
1) Trascurrido el tiempo de incubación, realizar la tinción de Gram a las colonias
presentes en el medio de cultivo.
2) Identificar la morfología microscópica del microorganismo.

Taller

1) Cuáles son los agentes diferenciales y selectivos para los medios cultivo?
2) En que consiste la Técnica de NMP (Numero más Probable)?
3) Investigue al menos tres medios de cultivo para aislar microorganismos
(bacterias y hongos) de fuentes hídricas y suelos? ¿nombre del microorganismo
aislar?
4) Cuáles son los pasos de la tinción de Gram?
5) Como se realiza el análisis de aire de un ambiente?
 6) Que otras técnicas existen para el análisis de agua? (diferente al recuento en
placa)
7) Factores que pueden influenciar en la siembra?

Bibliografía

SANTAMBROSIO E; Siembra y Recuento de Microorganismos, Universidad Tecnológica

Nacional.
<<http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia/prac
ticoIII.pdf>> citado <<6 de febrero del 2015>>

Manual de técnicas de análisis de suelos; Análisis microbiológicos <<

http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/509/analisis2.pdf>> citado <<7 de
febrero del 2015>>

ROJAS A, 2011; Conceptos y Pratica de Microbiologia general; Universidad Nacional de

Colombia.