Memorias del Instituto de Biología Experimental vol.

4:29-32 (2005) © Ediciones IBE

Drogas antiparasitarias y su efecto sobre la regulación

de Ca2+ en Trypanosoma cruzi
YAEL GARCIA-MARCHAN1,3, CRISTINA SANOJA1, GILBERTO PAYARES1,
JULIO URBINA2 GUSTAVO BENAIM1,3
1
Laboratorio de Biofísica. Centro de Biología Celular. Instituto de Biología Experimental, Facultad
de Ciencias, Universidad Central de Venezuela. Apartado 47114. Caracas, Venezuela, 2Centro de
Biofísica y Bioquímica, IVIC y 3Centro de Biociencias y Medicina Molecular. Instituto de Estudios
Avanzados (IDEA) E-mail yaelgarcia@yahoo.com
El Mal de Chagas es una enfermedad que afecta a millones de personas en América y su agente causal es el
Trypanosoma cruzi. Esta enfermedad en su fase crónica fue considerada como autoinmune y su tratamiento enfocado
hacia el mantenimiento de los pacientes. Actualmente se sabe que la prevalencia de los parásitos en las lesiones crónicas
es un factor importante por lo que se ha impulsado una búsqueda de tratamientos que se basen en su eliminación. Dentro
de este tipo de terapia racional se ha venido desarrollando el uso de inhibidores de síntesis de esteroles. Compuestos de
nueva generación de este tipo, como el posaconazol, han probado su eficacia en la erradicación de todas las formas de
este parásito presentes durante la enfermedad. En la búsqueda de una terapia combinada de ensayo el uso de la
amiodarona, encontrando que este antiarrítmico también es capaz por si sola de inhibir el crecimiento de epimastigotes y
amastigotes de T. cruzi. Además se pudo demostrar que ambos compuestos actúan de forma sinérgica y que son capaces
de provocar una fuerte movilización del Ca2+ intracelular. También se pudo demostrar que uno de los principales
organelos afectado es la mitocondial y posiblemente los acidocalcisomas.

Introducción sobre el parásito se basan en inducir estrés oxidativo

El Mal de Chagas es una enfermedad causada por el
hemoflagelado Trypanosoma cruzi. Esta enfermedad
actualmente afecta a más de 20 millones de personas
en el continente americano del cual es endémica. Se
conocen dos fases o etapas de esta enfermedad, las
cuales se catalogan en fase aguda y fase crónica. La
primera, consiste en una respuesta rápida del sistema
inmune ante la agresión por el parásito y es cuando se
registran el mayor número de decesos, sobre todo en
niños. Durante la fase crónica el individuo desarrolla
una serie de alteraciones en órganos como el
intestino, esófago y el corazón causadas por el
alojamiento del parásito, que van menguando su
calidad de vida y generalmente culminan en una
muerte súbita producto de estas lesiones.
Hasta ahora muchos países del continente americano
han desarrollado planes para erradicar o por lo menos
controlar al Mal de Chagas realizando un intensivo
control de los insectos vectores. Este es el caso de
Uruguay, Chile y algunas regiones de Brasil y
Argentina. Sin embargo, aun quedan regiones en Sur
América donde la enfermedad sigue siendo un
problema de salud grave, entre los que se encuentra
Venezuela. Mas aun, siguen existiendo un numero
importante de personas con esta enfermedad en fase
crónica que no tienen un tratamiento adecuado
(www.who.int).
Actualmente el tratamiento contra el Mal de Chagas
se basa en dos drogas principales, Nifurtimox (Bayer)
y Benznidazol (Roche) cuyo mecanismos de acción
29
o reductivo respectivamente. El nifurtimox reduce el
grupo nitro de radicales nitroaniónicos, lo cual
conlleva a la formación de radicales libres del tipo
peróxido de hidrógeno o superóxidos, mientras que el
benznidazol actúa por modificaciones covalentes de
macromoléculas (2).
Estos compuestos son usados en la fase aguda de la
enfermedad y su efectividad es variable dependiendo
de región, probablemente debido a variaciones de la
cepa de los parásitos (10). Esto conlleva a la ausencia
de un tratamiento efectivo contra esta enfermedad en
su fase crónica. Mas aun, hasta mediados de la década
de los 90´s la fase crónica de esta enfermedad era
considerada y tratada como una enfermedad
autoinmune en respuesta al parásito y no como una
parasitemia en si, principalmente debido a la ausencia
aparente del agente patógeno en la sangre o en las
lesiones (5).
Esta visión del Mal de Chagas como enfermedad
autoinmune en su fase crónica, ha cambiado
drásticamente gracias a estudios recientes en los
cuales se ha evidenciado que la persistencia de los
parásitos es una causante importante de la patología
observada (13).
En este momento existen 4 grandes líneas de
investigación para el desarrollo de drogas que actúen
sobre diferentes sistemas del Trypanosoma cruzi, sin
afectar al hospedero mamífero: Inhibidores de cistein-
proteasas, Inhibidores del metabolismo del
pirofosfato Inhibidores de síntesis de esteroles, e
Inhibidores del transporte de purinas (13).
De estos 4 grupos nuestro interés se centra en la
inhibición de síntesis de esteroles. Este interés radica
en la posibilidad de que estos compuestos afecten de
manera significativa algunos de los organelos
reguladores de Ca2+ descritos hasta el momento para
Trypanosoma cruzi.
Los triazoles han sido utilizados desde la década de
los 80, para el tratamiento de eucariotas inferiores
como hongos. Su actividad se basa en la inhibición de
la ruta metabólica que produce los ergosteroles y
esteroles metilados en C-24. Su gran ventaja radica en
que el ergosterol es único en estos organismos y sus
funciones no pueden ser suplidas por el colesterol o
fitosterol producido por los eucariotes superiores.
El estudio de los inhibidores de síntesis de esteroles
sobre la proliferación de los tripanosomatidios
comenzó con compuestos derivados de imidazoles,
observándose un efecto antiproliferativo importante
en amastigotes de Leishmania tropica cultivados en
macrófagos humanos (1). Estos resultados impulsaron
la carrera por encontrar algún derivado de triazol que
pudiera detener la proliferación de los parásitos en su
forma intracelular de manera inocua para el
hospedador, y así convertirse en un candidato para
posibles tratamientos contra enfermedades producidas
por los tripanosomatidios patógenos. (13).
Uno de los primeros compuestos en ser evaluados,
fue el ketoconazol, el cual actúa inhibiendo la C14α
esterol demetilasa dependiente de citocromo P-450
(11). Su efecto antiproliferativo sobre epimastigotes
en cultivo, puede dividirse en dos grados dependiendo
de la concentración a la cual se utiliza. En el primero,
la droga a altas concentraciones (mayor a 30 µM)
produce una lisis completa de los parásitos,
probablemente debido a alteraciones en la membrana
plasmática. El segundo efecto se produce a bajas
concentraciones (∼1µM) donde se observa una
disminución casi completa de la proliferación, sin
alteraciones en su viabilidad aparente. Pasadas 120
horas de exposición, los parásitos sufren un proceso
de lisis que coincide con la depleción total de los
ergosteroles preformados (6).
Un estudio subcelular a través de microscopia
electrónica, del efecto del ketoconazol sobre
epimastigotes de T. cruzi evidenció una alteración del
sistema kinetoplasto-mitocondrion, consistente en la
perdida de la organización de la membrana interna así
como de los cuerpos electrón-densos de la matriz (7).
Alteraciones en la mitocondria gigante de T. cruzi
traen como consecuencia la perdida de la capacidad
de osmoregulación del parásito y una posible
alteración en la capacidad de regulación del Ca2+. Un
aumento en la concentración de Ca2+ intracelular, a su
vez, trae como consecuencia la activación de una gran
cantidad de cascadas enzimáticas que podrían mediar
30
en la respuesta del parásito a la droga y su posterior
lísis.
El SCH 56592 (Schering-Plough} conocido como
Posaconazol, es un compuesto que comenzó a ser
estudiado en la década pasada contra micosis
sistémicas (11). En los primeros estudios se
determinó que el posaconazol presenta un efecto
antiproliferativo tanto en epimastigotes como
amastigotes de Trypanosoma cruzi, siendo su
concentración media inhibitoria (CMI) del orden de
30 nM y 0.3 nM, respectivamente. Más aun, se
comprobó su capacidad para producir la cura en
modelos murinos infectados, en fase aguda y crónica
de la enfermedad, evaluada como porcentaje de
sobrevivencia y parasitemia en sangre (11).
Recientemente han sido incorporados algunos otros
inhibidores de síntesis de esteroles capaces de
producir efectos sobre tripanosomatidios, entre los
que se destacan, el ravuconazole (14), el azasterol (9)
y el UR-9825 (12).
Utilizando el indicador fluorescente de Ca2+ Fura
2/AM, evaluamos la concentración intracelular de
Ca2+ en epimastigotes incubados durante 48 y 96
horas, tanto a ketoconazol como a posaconazol,
encontrando un aumento significativo en los niveles
del catión a las 96 h (Tabla 1). Este hecho lleva a
pensar en que algunos de los sistemas reguladores de
Ca2+ de los parásitos se ve afectado por la incubación
con estas drogas.
Ketoconazol 0,3 µM Posaconazol 12,5nM
48 h 96 h 48 h 96 h
2 mM Ca2+
104,1±28,7 304,2±56,8 86,3±26,2 461,4±63,8
ext
0 mM Ca2+
NA NA 97.1±15.2 480±39.8
ext
2+
Tabla 1. Concentración intracelular de Ca en epimastigotes
En una primera aproximación podemos pensar en el
sistema mitocondrial, ya que evidencias previas (7)
demuestran, la afección directa de este sistema. En un
intento de corroborar estos resultados ensayamos la
capacidad transportadora de Ca2+ de este organelo
(Fig. 1) utilizando para ello Arsenazo III, pudiendo
observar una disminución considerable en la
capacidad de transporte de Ca2+ mitocondrial que
presentan los epimastigotes expuestos a ketoconazol.
Se ha observado que la exposición de los parásitos a
inhibidores de síntesis de esteroles, como el
ketoconazol, conlleva a un aumento en la cantidad de
acidocalcisomas, producto de una inducción de la
síntesis de los mismos que parece estar relacionada
con un proceso autofágico que involucra la asociación
de los acidocalcisoma con el sistema
endosoma/lisosoma (9).
 previamente con fura 2/AM, se observa un aumento
Digitonina sostenido de la concentración intracelular de Ca2+ que
Ketoconazol comienza a estabilizarse luego de transcurridos 50
0.3 µM
min. de experimento (Fig. 3). Esta respuesta es
Digitonina independiente de la presencia de Ca2+ extracelular,
Control por lo que se debe a liberación de Ca2+ de
FCCP
compartimentos extracelulares, más que a una entrada
masiva de Ca2+ desde el exterior.
15 µM

10 µM

5 µM
FCCP
Linea
base
Tiempo de exposición 144 horas

Figura 1. Transporte de Ca2+ mitocondrial en epimastigotes

expuestos a ketoconazol.

Se puede observar que el uso de agentes que

previamente fueron desarrollados para combatir
hongos, en la lucha contra enfermedades causadas por
tripanosomatidios ha generado grandes progresos en
cuanto a la obtención de una posible terapia.
Recientemente, fue descrito el uso de un antiarrítmico
conocido como amiodarona como un posible agente
antimicótico. A esta droga se le atribuyó un potente
efecto antifungicida en Saccharomyces, Candida,
Cryptococcus, Fusarium y Aspergillus (3). Los
efectos sobre la viabilidad en Cryptococcus son
impresionantes, observándose una disminución en la
misma de hasta 10 veces después de 1 horas de
tratamiento con 10 µM, y hasta 0.001% luego de 24
horas. El efecto de la amiodarona sobre la viabilidad
celular en Saccharomyces cerevisiae fue estudiado en
detalle, encontrándose un importante efecto de esta
droga sobre la homeostasis del Ca2+. (4).
Se pudo observar, utilizando a la acuorina como
Figura 2. Efecto de la amiodarona sobre la proliferación de
epimastigotes y amastigotes de T. cruzi
Los niveles de intracelulares de Ca2+ luego de
colocada la amiodarona alcanzan valores son 4,5
veces mayores de los del nivel normal. Incluso
cuando se exponen epimastigotes previamente
incubados con ketoconazol o posaconazol (Fig. 3) se
puede observar un efecto sinérgico, a las 96 h, en el
que los niveles de Ca2+ alcanzan valores 7 veces más
elevados que su respectiva basal.
Control 2mM Ca2+ ext Posaconazol 48 h
180 200

indicador luminiscente de Ca2+, una respuesta bifásica

INTRACELULLAR Ca2+ (nM)

180
160

en la concentración intracelular de este ion en 140

160

respuesta a amiodarona en Saccharomyces cerevisiae.

140

120

En la primera fase, se observa una entrada rápida del

120

100

Ca2+, la cual desaparece al colocar BAPTA

100

80 80

extracelularmente (quelante de Ca2+, impermeable a Control 0 Ca2+ ext Posaconazol 96 h

la membrana) y es inhibida por el La3+ y el Al3+,

200 750
INTRACELULLAR Ca2+ (nM)

700
180

siendo competitiva con el Mg2+(4). 160

650

Se quiso evaluar la capacidad de la amiodarona de

600
140
550

inducir una respuesta similar a la observada en 120

500

levaduras, en Trypanosoma cruzi. Se determinó que

100
450

80 400

la amiodarona presenta una respuesta dosis- 0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50

dependiente en el crecimiento de epimastigotes y TIME

TIME(min)
(m in) TIME
TIME(min)
(m in)

amastigotes, con una concentración mínima

inhibitoria a de 20 µM y de 8 µM respectivamente
(Fig. 2).
Posteriormente se evaluó la capacidad de este
compuesto de movilizar Ca2+ en epimastigotes de T.
cruzi. Cuando se coloca amiodarona directamente
sobre una población de epimastigotes cargados
31
Figura 3. Efecto de la amiodarona 12,5 µM (flecha) sobre la
concentración intracelular de Ca2+ de epimastigotes de T. cruzi.
Posaconazol 10ng/ml.
Tratando de encontrar el posible sistema regulador de
Ca2+ que se encuentra comprometido en la respuesta a
amiodarona, incubamos los epimastigotes de T. cruzi
con un indicador de potencial de membrana
mitocondrial conocido como rhodamina 123. Como
se puede observar (Fig. 4), la amiodarona es capaz de
provocar una liberación parcial del gradiente de
protones parecido al que se observa cuando
colocamos FCCP. Con este tipo de resultados
podemos evidenciar el efecto de la amiodarona tanto
en acidocalcisomas como en mitocondria, ya que
ambos organelos presentan un gradiente de protones
que podría ser marcado por la rodamina 123 y
sensible a FCCP.
63
FCCP
62
U.A. Fluorescencia
61
Amiodarona
60
59
58
57
56
0 200 400 600 800 1000
Tiempo (seg)
Figura 4 Efecto de la amiodarona 12,5 µM sobre el gradiente de
protones.
Experiencias utilizando amastigotes de Leishmania
mexicana, aislados de hámsteres infectados, cargados
con rodamina 123 y observados con microscopia
confocal nos permitieron determinar que el efecto de
la amiodarona se encuentra vinculado a una perdida
rápida del potencial de membrana mitocondrial.
Estas evidencias en conjunto nos permiten evidenciar
que tanto la amiodarona como el posaconazol alteran
los sistemas reguladores de Ca2+ de Trypanosoma
cruzi, y que su efecto puede ser sinérgico. El principal
organelo descrito hasta el momento que puede estar
afectado seria la mitocondria, sin embargo no se
descarta la posibilidad de que los demás sistemas
reguladores de Ca2+ se encuentren implicados.
Agradecimientos
Este trabajo ha sido financiado por el Fondo
Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación
(FONACIT): (S1-99000058 y G-2001000637 a G.B)
y Consejo de desarrollo Científico y Humanístico de
la U.C.V (C.D.C.H.-U.C.V): PI 03-33-4798-00 a
G.B.
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