REACCION DEL AZUL DE PRUSIA PARA DEPOSITOS DE HIERRO EN

LAMINAS DE MEDULA OSEA.

Reactivos. -

1- Disuelva 4 gm de ferrocianuro de potasio en 20 ml. de agua destilada. Prepare esta

solución justo antes de usarla.

2- Acido clorhídrico concentrado.

3- 0.1% safranina en agua.

Coloración.-

1. Añada ácido clorhídrico ( 6 ml. ) a la solución de ferrocianuro de potasio

recientemente preparada hasta que esta se torne brevemente turbia.
Filtre la solución a través de papel de filtro Whatman N°42.
2. Coloque la solución en un vaso de Coplin junto con las láminas a ser teñidas.
3. Lave con agua corriente por 3 ó 4 minutos en otro vaso de Coplin (Este paso
es muy Importante.)
4. Coloque las láminas dentro de la solución de safranina por 1 minuto.
5. Lave con agua corriente y séquelas con cuidado.
6. Examine con aceite de inmersión.

COLORACION DE PEROXIDASA

Reactivos. -

1- Bencidina Hidroclórhídrica.

2- Alcohol etílico absoluto.

3- Acetato de sodio.

4- Sulfato de zinc.

6- Peróxido de Hidrógeno.

6- Formol de 37°
7- Hidróxido de sodio saturado.

8- Safranina.

9- Acetato cresyl violeta.

Soluciones.-

1. Fijadora: l0% formol etanol. Añadir l0 ml. de formol al 37%. de alcohol

absoluto.. Conservar y usar a temperatura ambiente.
2. Sulfato de zinc: 3.8 grn en 100 ml. de agua destilada.
3. Alcohol etílico al 30%.
4. Hidróxido de sodio 5 N. 131.6 ml. de hidróxido de sodio saturado se diluye a
500 ml. con agua destilada.
5. Solución Incubadora: Añadir 0.3 gm de Bencidina Hidroclórhídrica a 20 ml.
de etanol al 30%

Calcular bajo agua caliente hasta diluir totalmente la bencidina. Añada 80 ml.
más de etanol al 30%.

Agregar 1 ml. de sulfato de zinc al 3.8%, mezclar. Añadir 1 gm de acetato de

sodio. Mezclar.

Añada 0.7 ml. de H202, al 3% y 0.3 ml. de hidróxido de sodio 5.N.

El Ph final debe estar entre 6.0 - 0.5.

Agregar O2 gm. Safranina.

Mezclar por agitación, filtrar y conservar en botella color ámbar a

temperatura ambiente

Procedimiento. -

1. Use laminas frescas o aquellas que hayan sido conservadas en obscuridad un

tiempo rio mayor a 3 semanas.
2. Fijar exactamente por 1 minuto en formol etanol al 10% a temperatura
ambiente. Luego lave las láminas en agua corriente por 30 a 60 segundos.
 3. Coloree por un minuto en la solución incubadora en un vaso de Koplin a
temperatura ambiente. Lave brevemente por 5 a 10 segundos en agua
corriente.
4. Seque las láminas y examine la porción más delgada de la extensión con
objetivo de inmersión.
5. Colorear con Wright en la forma convencional.
6. Lave rápidamente y examine con objetivo de Inmersión.

COLORACION PARA LIPIDOS (SUDAN BLACK B )

METODO DE STOREY

Reactivos.-

1- Formol al 40%.

2- Buffer. Solución Stock.

Fenol 16 gm.

Alcohol absoluto 30 ml.

Disolver y añadir:

Fosfato disódico 0.3 gm.

Agua destilada de 100 ml.

3- Sudan Black 0.3 gm.

Alcohol absoluto 100 ml.

4- Solución de trabajo

Stock de buffer 40 ml.

Stock de sudan 60 ml.

Filtrar al vacío:

 Esta solución pierde su actividad en 2 a 3 semas.

5- Alcohol absoluto al 70%.

Procedimiento.

1- Fijar las láminas manteniéndolas de 5 a 10 minutos en un vaso de Koplin que

contenga formol el 40%.
2- Sumerja las láminas en la solución de sudan Black de 10 a 60 minuto.
3- Lavar en otra jarra de Koplin que contenga 70% de alcohol de 5 a 10
minutos.
4- Lave con agua. Las láminas pueden ser contrastadas con coloración de
giemsa. El colar azul de los eritrocitos puede ser eliminado por inmersión
durante 30 segundos en solución acuosa de fosfato monopotásico.

Las láminas pueden ser examinadas con lentes de inmersión o montadas en

bálsamo.

Método de Contraste con Giemsa:

Alcohol metílico libre de acetona 75 ml.

Glicerina libre de ácido 25 ml.

Colorante de giemsa 0.75 grn.

Coloque en baño maria a 60ºC. Agitar a través de papel # 4

La solución de trabajo se Obtiene:

1 parte sal Stock (giemsa)

4 partes de alcohol metílico.

COLORACION DE PAS.

Reactivos. -

1- Solución de ácido peryódico.

Cristales de ácido peryódico 5 gm

Agua destilada 500rnl.

Estabilidad 3 meses en botella arnbar.

2- Reactivo de Schiff.
 Solución de fusceina básica 5 gm.

Agua destilada caliente 500ml.

Filtrar cuando la solución este fría, saturarla con burbujeo do SO 2 por una
hora.La solución colocada en un frasco cónico es extraída con 2 gm. de carbón
activado por unos 30 segundos e inmediatamente filtrarlas a través de papel
Whatman. #1.

Procedimiento.-

1- Las láminas secas se fijan en una so solución de formol al 10% y alcohol

absoluto por 10 minutos.
2- Lavar brevemente las láminas en agua corriente.
3- Sumerja las láminas en la solución de ácido peryódico por 10 minutos.
4- Repetir el paso 2.
5- Coloque las láminas en un vaso de Coplin que contenga reactivo de shiff por
30 minutos.
6- Lave las láminas 5 veces con agua.
7- Lavar con agua corriente.
8- Dé coloración de contraste con hematoxilina de Harris.
9- Secar e Investigar con lente de Inmersión.
10- Montar en bálsamo si se desea.

FOSFATASA ALCALINA EN LEUCOCITOS (KAPLOW).

Reactivos.-

1- Naftol AS-BI fosfato sal sódica (SIGMA).

2- Fast Red violet salt LB. (SIGMA).

3- Dimetilforrnanide.

4- 2 amino - 2 metil — 1,3 propanodiol (KODAK).

5- 37% formol

6- Metanol absoluto.
7- 0.1 N ácido Hidroclórico.

8- Hematoxilina en polvo.

9- Yodato de Sodio.

10-Sulfato de aluminio y potasio.

Soluciones. -

1- Fijadora. Acetona al 60% a Ph 4.2 con buffer cetrato 0.03 M y cetrato de

sodio. Añadir 168 ml. del buffer de ácido cítrico a 32 ml. de 0.03 M de
cetrato de sodio y luego añada agitando lentamente 300 ml. de acetona
absoluta.

Conservar y usar temperatura ambiente.

2- Buffer.- Sol. stock. 0-2 M. propanodiol (disolver 21 granos de a amino 1,3

propanodiol en agua destilada y diluirá 1,000 ml.) Conservar en refrigeradora.

Sol. Trabajo: 0.05 M. propanodiol ( Ph 9.5 a 9.7 ) a 250 ml. de sol. Stock
añadir 50 ml. de 0.1 HCL y diluir a 1,000 ml. con agua destilada. Conservar
en refrigeración pero usar a temperatura ambiente.

3- Colorante de Contraste.- Hematoxilina de Mayer. Añada 1.0 gm de

hematoxilina a 500 ml. de H2O destilada, caliente hasta le ebullición y añada
otros 500 ml. de H2O destilada. Agregar 0.2 gm de yodato de sodio, 50gm. de
sulfato de aluminio y potasio. Mezclar bien y filtrar.

Conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente.

Procedimiento de Coloración, -

1- Use extensiones frescas de sangre periférica o mdu1a ósea. Si emplea sangre

venosa use sangre heparinizada. Evite usar EDTA.
2- Fije las 1amiinas de menas de 24 horas en acetona buffer 60% por 30
segundos a temperatura ambiente.
3- Lavar con agua corriente de 30 a 60 segundos.
 4- Deje secar las extensiones. Las laminas deben ser teñidas el mismo día de
extraídas, sin embargo estas pueden mantener el 90% de su actividad por 2 ó
3 semanas.
5- Sumerja las láminas frescas y fijadas en la mezcla siguiente 5 ml. de naftol
AS-BI fosfato 0.2 ó 0.3 ml. de dímetilformamide coloca - dos en un
Erlemeyer de 125 ml limpio y seco.

Añada 60 ml. de buffer de trabajo.

Agregar 40 gm. de Fast Red violet Salt C.B. Agitar y filtrar un frasco de
Coplin, Use la solución inmediatamente.

Incuba las láminas en la mezcla anterior por exactamente 10 minutos a

temperatura ambiente.

6- Lavar cuidadosamente en agua corriente por 30 60 segundos.

7- Usar la solución de contraste por 5 a 8 minutos (Hematoxilina de Mayer).
8- Lave con agua corriente por 1 ó 2 minutos.
9- Seque las láminas en el medio ambiente.
10- Use aceite de lrnnersi6n y lente 100 x para observar éstas láminas.

FOSFATASA ÁCIDA EN LOS LEUCOCJTOS.

Reactivos.-

1- Naftol AS-TR fosfato (Sal sódica).

2- Fast Red violet Sal C.B.

3- Dirnetilformamide.

4- Ácido acético glacial.

5- Acetato de sodio. 3 H2L.

6- Hematoxilina Cl.

7- Yodato de sodio.

8- Sulfato de aluminio y Potasio.

9- Acetona Pura.

10- 0.03M citrato de sodio 2 H2C (4.4)g)/ 500 ml. H20.

11- 0.03M Acido cítrico H2O (3.15 g)/ 500 ml. H2O.

Soluciones.-

1- fijadora.- Acetona al 60% con Ph 4.2 a 4.5 con acido cítrico y cetrato de sodio
0.03 M.

Añadir 168 ml. de 0.03 M de acido cítrico a 32 ml. de 0.03M de cetrato de

sodio y añada lentamente al mismo tiempo que agite 300 ml. De acetona pura.
Conservar y usar a temperatura ambiente.

2- Buffer.-

A) 0.1 M Acido acético (5.8 ml. De acido acético glacial para 1,000 ml. de
agua).

B) 0.1 M Acido de sodio (13.6 y de acetato de sodio para 1.000 ml. de H20).

Mezcle 200 ml. de la solución A con 800 ml. de le solución B. Conservar en

refrigeración.

3- Colorante de Centraste. - Hematoxilina de Mayer.

Procedimiento. -

1- Use extensiones frescas (de menos de 24 horas de extraídas).

2- Fijar las extensiones por inmersión, en buffer de acetona citrato por 5
segundos a temperatura ambiente.

Lavar en agua corriente por 10 a 20 segundos.

3- Incube las láminas en solución fresca preparada de la siguiente manera.

Disuelva aproximadamente 5 mg. de naftol AS-TR fosfato en 0.2 a 0.3m1. de

Dímetilformamide en un Erlemeyer de 125 ml. de capacidad. Añada Fast Red
violet Sal .L.R. (5 mg) Agite y filtre en un vaso de Coplin.

Coloque las láminas que se desee colorear en el vaso de Coplin e incubar en

un baño maría a 37ºC por dos horas.
 4- Lave con agua corriente por 30 a 60 segundos.
5- En un vaso de Coplin que contenga hematoxilina de Harris y coloree el
contraste por 4 minutos.
6- Lave con agua corriente por 2 minutos.
7- Dejar secar las láminas.
8- Examinar con aceite de inrnersión.

IDENTIFICACION DE MONOCITOS Y MONOBLASTOS USANDO

NAFTOL ASD ACETATO Y SU INHIBICION CON FLOURURO DE SODIO.

Reactivos. -

1- Formol al 40%.
2- Buffer fosfato.

0.1 M Na2 HPO4 6.80 gm. / 500 ml. Usar 40 ml.

3- Solución ASD acetato.

16 mg. naftol ASD acetato.

3 ml. acetona.

2 ml. propilenoglycol.

4- Fast Blue. 240 mg.

5- Floururo de sodio 75 mg.

Procedimientos. -

1- Fije las laminas en vapor de formol por 10 minutos, lave cuidadosamente y

seque al medio ambiente
2- Mezcla de incubación.
a. 100 ml de buffer fosfato.
b. 5 ml. de naftol AS.D. acetato.
c. 200 mg. de Fast Blue B.B Sal.
 Mezclar con agitador magnético por 3 ó 4 minutos.

3- 50 ml de la mezcla incubadora se filtra a través del papel Whatman # 1. a un

vaso de Coplin marcada: “Buffer”.
4- Añadir 75 mg. de Naf a los restantes 50 ml de solución incubadora. Filtrar a
un vaso de Coplin marcada con “Floururo de Sodio”.
5- Tome dos Láminas fijadas, lavadas y secas e incube una en cada vaso de
Coplin por 70 minutos a temperatura ambiente.
6- Luego de la incubación deposite las dos láminas en un vaso de Coplin
marcado “Agua”. Cambie el agua varias veces o mejor aún deje correr el
agua delicadamente dentro del vaso.
7- Corno coloración de contraste use hematoxilina de Harris por 10 minutos y
lave como en 6.
8- Seque el aire y examine con lente de inmersión.

1. LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA.

Los blastos de origen mieloide muestran positividad a la coloración de Sudan

Black, peroxidasa y esterasa (cloroacetato)

2. LEUCEMIA MIELO MONOCITICA.-

Positividad a peroxidasa, Sudan Black, cloroesterasa (Cloroacetato) y esterasa

acetato.

3. LEUCEMIA MONOCITICA.

Positiva a coloración de acetato esterasa.

Negativa a la peroxidasa y al sudan Black.

Algunos blastos pueden presentar gránulos aislados particularmente con

coloración de Sudan Black.