CBCC6 2017 Práctico de Bioquímica

Práctico: “Estudio de la Hemoglobina” Año 2017

INFORME SOBRE LA ACTIVIDAD PRÁCTICA

Grupo B2
Nombres y C.I.:
Jimena de los Santos – 4.691.146-7
Camila da Silva – 5.362.506-7

Objetivos del práctico

General:
 Adquirir habilidades en el laboratorio que permitan identificar y caracterizar
hemoglobinas en sus distintas variantes.
Específicos:
 Caracterizar por medio de electroforesis en acetato de celulosa diversas variantes de
la hemoglobina.
 Realizar el análisis del espectro de oxihemoglobina, estudiando la formación y
caracterización de desoxihemoglobina y metahemoglobina.
 Analizar frotis de sangre al microscopio identificando los distintos tipos de células y
patología presentada.

¿Cómo puede cuantificar la cantidad de oxi-Hb y meta-Hb en el stock de la solución de

hemoglobina que le fue suministrada?
¿Cuál fue la concentración de la misma?

La cuantificación de oxi-Hb y meta-Hb se realizó utilizando un espectrofotómetro Spectronic.

Se hicieron diluciones de las mismas en un amortiguador fosfato de sodio 10 mM, pH 7.4. Y se
tomaron medidas de absorbancia a longitudes de onda de 577 y 630 nm.

Tomando en cuenta los datos obtenidos con el espectrofotómetro se utilizaron las siguientes
ecuaciones:

A577: 0,455
A630: 0,003

[Oxi-Hb] (μM) = 66 A577 -80 A630

[Oxi-Hb] = (66. 0,455) – (80. 0,003)

[Oxi-Hb] = 29,79 μM

[Met-Hb] (μM) = 279 A 630 - 3 A577

[Met-Hb] = (279. 0,003) – (3. 0,455)

[Met-Hb] = 0 μM

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Grafique en el mismo eje los espectros de la oxi-Hb, desoxi-Hb y su re-oxigenación.

¿Cómo actúa el ditionito en este experimento?

Absorbancia = f (λ)
0,3

0,25
Absorbancia

0,2

0,15

0,1

0,05

0
500
507
514
521
528
535
542
549
556
563
570
577
584
591
598
605
612
619
626
633
640
647
654
661
668
675
682
689
696
Longitud de onda (nm)

OxiHb inicial DesoxiHb OxiHb reoxigenada

El ditionito de sodio en este experimento actúa reduciendo a la hemoglobina, es decir, esta

última pierde el O2 que iba unido al hierro ferroso quedando como producto la
desoxihemoglobina.

¿Cuál es el efecto del nitrito de sodio sobre la oxi-Hb? Incluya una gráfica de dicho
efecto.

El nitrito de sodio actúa oxidando al hierro ferroso (Fe 2+) del grupo hemo de la
oxihemoglobina a su estado férrico (Fe 3+), de este modo se produce metahemoglobina.
Dicho compuesto ya no es apto para transportar oxígeno.

Abs = f(t)
0,3
0,25
ABSORBANCIA

0,2
0,15
0,1
0,05
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
TIEMPO (MIN)

En la gráfica se observa que va disminuyendo la absorbancia a medida que pasa el tiempo.

Esto ilustra la oxidación que sufre la oxihemoglobina con el agregado de nitrito.

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¿Cuál es la principal propiedad que determina la separación las muestras en la

electroforesis de acetato de celulosa? ¿Qué sucede si las mismas muestras se corren
en una electroforesis de poliacrilamida con SDS?

La electroforesis es una técnica en donde las moléculas cargadas migran a un cátodo y un

ánodo a través de un campo eléctrico. La distancia que dichas moléculas recorren en la cinta
de acetato de celulosa está determinada principalmente por su carga eléctrica, a mayor carga
más distancia recorrerán en la cinta de acetato de celulosa. Durante el práctico se usó esta
técnica para separar las proteínas de forma que las de carga positiva serán atraídas al cátodo
y las negativas al ánodo, dependiendo también de su tamaño, la intensidad del campo o
temperatura del medio.

La electroforesis de poliacrilamida con SDS también sirve para separar proteínas cargadas
dependiendo principalmente de su masa molecular. Dichas proteínas se desnaturalizan
gracias al sodiododecilsulfato (SDS) rompiendo enlaces no covalentes, sufriendo así la
pérdida de su conformación tridimensional.
Si en el práctico se hubiese utilizado esta técnica, la separación de los tipos de hemoglobina
no se habría podido apreciar claramente ya que estas tienen una masa molecular muy
parecida.

Conclusiones

Se realizó la espectrofotometría de la oxihemoglobina y se tomó la medición de tres

espectros. La primera muestra fue con la oxiHb mezclada con el Buffer de fosfato, la cual se
midió la absorbancia en función de la longitud de onda y lo que se observó fue los dos típicos
picos de 545 y 577nm.
Luego, a la oxihemoglobina se le agregó ditionito de sodio donde la hemoglobina pierde el
oxígeno que tenía asociado formando desoxihemoglobina. La desoxiHb se analizó bajo
espectrofotómetro nuevamente y la curva que dio fue con un pico solo quedando
comprendida entre los dos picos clásicos de la oxiHb. Posterior a la última medición, se
sacudió la muestra para “burburjearla” y al medirla nuevamente se observó que la curva iba
recuperando paulatinamente los dos picos de oxiHb indicando que el oxígeno se estaba
volviendo a asociar a la misma.
Finalmente, el último análisis por electroforesis fue realizada a la oxihemoglobina con el
agregado de nitrito donde esta sustancia oxidaba la Hb a metahemoglobina. En dicha
medición se observó una curva con tres picos, los dos primeros indicaban la transición de
hemoglobina a metahemoglobina y el tercer pico hacía referencia a la metaHb ya formada
con un pico de 630nm.
Para terminar, podemos decir que durante el experimento de electroforesis con acetato de
celulosa se observó una migración de HbA de adulto, HbF de feto y HbS falciforme según su
carga eléctrica. Se pudo apreciar que la HbA fue la que más migró a la carga positiva,
seguida por la HbF pero la HbS no migró tanto debido a su mutación en cadena beta donde
un residuo de ácido glutámico se cambió anormalmente por un residuo de valina quedando
netamente más positivo.