Seminario de Biología n°1: Dictado por Giusti

Mantenimiento y variabilidad del genoma humano

TEORIAS Y MODELOS
Mecanismos moleculares que permiten explicar cómo es posible que la célula transmita su genoma a las células
hijas, o en un organismo que un individuo, trasmita su genoma a la generación siguiente con un mínimo nro. de
cambios. El genoma humano tiene 3mil millones de pares de bases, y la estabilidad con la que trasmite es
asombrosamente alta para un genoma tan grande
¿Cuáles son los mecanismos que permite esa fidelidad de copias?
Y de manera complementaria, en aquellos casos que ocurren lo grandes cambio, ¿cuáles son los mecanismos por los
cuales ocurre?
La biología molecular es una rama de la biología, que estudia el modo que el genoma controla la fisiología humana.
Paper 1953 Watson y Crick donde interpretaron experimentos de otros autores y realizan una propuesta de un
modelo de la estructura de ADN y lo unen en un modelo integrador
Se sabía que existía una información llamada genética, que esa información que se trasmitía de célula a células
hijas, y de un individuo a la generación siguiente. También se sabía que esa información genética determinaba el
número de aminoácidos de las proteínas, pero se desconocía la molécula que lo realizaba, creían que eran las
propias proteínas que creían que tenían esa información. Del ADN se sospechaba que era una molécula de bastante
gran tamaño e inerte y la función era desconocida. Se sabía que poseían nucleótidos unidos entre sí, pero se
desconocía la estructura. Se creía era una estructura de 3 cadenas, donde los grupos fosfatos unían a la base
nitrogenadas y donde los grupos fosfatos estaban en el centro y las bases miraban hacia afuera. NO existía un
modelo de complementariedad de bases.
En experimentos previos al modelo de Watson Y Crick, utilizaron un experimento de Chargaff donde sabía que la
cantidad de timina era parecida a la cantidad de adenina, siendo también que la concentración de citocina siempre
era similar a la cantidad de guanina, en una muestra de ADN.
Esta relación de 1:1, usaron para la complementariedad de bases.
La estructura de doble hélice, en la que las bases hidrogenadas miran hacia el centro, se obtuvo de una difracción de
rayos X, en una muestra cristalizada. Crick fue el intérprete de la imagen y Wilkins que era el dueño del laboratorio.
Franklin era la científica que aisló los cristales de ADN y generó las imágenes.
“Hemos notado que apareamiento especifico de las bases de nuestro modelo, sugiere posible copiado para el
material genético”
Si el ADN tiene 2 hebras complementarias, la información de una de las hebras determina la secuencia de bases de
la otra hebra. Dado que existe complementariedad de bases. Una hebra sería el molde de la otra hebra
complementaria.
Demostró que la teoría tenía gran valor heurístico. Y permitió nuevos experimentos que demostraron la certeza del
nuevo modelo planteado.
Heurístico= una teoría ayuda a generar estrategias para diseñar nuevos experimentos. Obtiene un valor orientador.
Luego se realizaron nuevos experimentos para demostrar la manera de replicación del ADN.

Modelos propuestos para explicar la replicación del ADN

Se diseñaron 3 propuestas de modelos.
• Modelo de Replicación conservativa: luego de una rueda de replicación, la nueva hebra estaría compuesta
por 2 hebras nueva conservando la hebra parental por 2 hebra viejas.
• Modelo Dispersiva: donde al cabo de la primera replicación las 2 hebras hija contendrían fragmentos de las
hebras viejas y nuevas entremezcladas.
• Modelo Semiconservativo: en el cual, cada molécula tendría una hebra nueva y una hebra vieja (parental).

Experimentos de Meelson y Stahl: pusieron a prueba el modelo de replicación.

Usaron como modelo biológico al genoma de la bacteria de la Escheriquia Coli. En donde la bacteria se replica y
debe también replicar su genoma.
Pusieron a punto una metodología, que les permitiera distinguir los momentos diferentes en la replicación del
genoma. Para ello manipularon el medio liquido donde iban a crecer y proliferar las bacterias del experimento.
• A uno le agregaron a todos los componentes que tuvieran nitrógeno, tuvieran una variante pesada. Ósea un
isotopo pesado de Nitrógeno (15)
 • A otro le agregaron una variante liviana de Nitrógeno.
Al replicar el genoma se utilizan N del medio para realizar la replicación, por lo que la bacteria al cabo de un tiempo
tendrá en su genoma ya replicado N que incorporo del medio en que se encuentre. Entonces hicieron que ciertas
bacterias replicaran su genoma en el medio que tiene la variante liviana, y a otras en la variante pesada, para así
tener genomas con los 2 distintos isotopos de Nitrógeno.
Luego se imaginaron un modo de separar, físicamente las hebras que contuvieran la variante pesada, de las que
contuvieran la variante liviana de Nitrógeno. Para ello, lisaron a las bacterias en una solución de ClCe a 6M. En esa
solución se encuentran fragmentos del genoma de las bacterias que crecieron en los 2 medios diferentes mezclados
en una única solución.
Y luego de centrifugar por un largo tiempo y por altas velocidades, se obtendrá debido a la fuerza gravitatoria de la
centrifugación que los iones de ClCe quedando en el fondo se encontrará la parte más concentrada que la de arriba
que estará menos concentrada. Este gradiente de concentración se verá reflejando también en el gradiente de
densidad. Por lo cual, la parte que este más concentrada también serán más densa, desde el punto de vista de las
propiedades del líquido. En tanto las que estén menos concentradas con ClCe, serán menos densas.
Se puede visualizar, agregando una determinada solución e iluminando con luz ultravioleta una imagen con 2
bandas negra que representan las posiciones donde se colocan las moléculas del genoma liviano y del genoma
pesado.
Inicialmente hicieron crecer a las bacterias, varios ciclos bacterianos en una solución con nitrógeno pesado, para que
el total del genoma este marcado con el nitrógeno pesado. Luego las hicieron crecer en un medio liviano. Durante
un tiempo determinado, controlando el dicho tiempo. Y se van tomando muestras de ese medio liviano y analizando
su composición. Teniendo en cuenta que el tiempo de replicación de un ciclo bacteriano durante entre 20-30 min.
Pudieron observar a lo largo de diferentes tiempos de replicación, 3 tubos que contenían 3 pesos posibles: pesado,
liviano y uno semipesado.
Se pudieron observar al cabo de una generación donde se las hizo crecer en un medio pesado que existía un único
tipo de ADN: semipesado. Comparado con las distintas teorías, se esperaban diferentes tipos de ADN. Comparado
con la teoría Conservativa que esperaba 2 tipos de ADN, uno pesado y uno liviano, por lo que se descartó a esta
teoría que no ocurrió lo que predecía. Comparado con la siguiente teoría Dispersiva, la cual predice que tiene
fragmentos de ambas hebras hijas y parental, por lo que su peso será semipesado. Lo cual podría a llegar a ser
verdadero este modelo. Comparando con la última teoría Semiconservativa, la cual predice que cada molécula de
ADN posee una hebra parental y una hija, lo cual su peso será semipesado. Esta teoría también podría ser cierta en
dicho experimento.
Al cabo de 2 generaciones, y se pudieron observaron 2 tipos de pesos de ADN, liviano y semipesado. Comparando
con las teorías Dispersiva, decía que se obtenía un solo peso del ADN, en cambio en la semiconservativa, se
obtenían 2 peso de ADN, por lo que se pudo demostrar que esta teoría era la verdadera.

Mecanismo molecular de la replicación en células eucariotas

Concepto de orígenes de replicación, se descubrieron como secuencias especificas de ADN que se posicionaban la
maquinaria proteica que luego iba a ejecutar los primeros pasos de la replicación.
Se sospechaba que no podría existir un único origen de replicación no podía ser compatible con los tiempos de
replicación y con el gran tamaño del ADN, para ello tardaría semanas en completar la replicación del total del
genoma, siendo que en medios de cultivos la replicación dura aproximadamente 24hs.Se descubrieron entonces,
múltiples orígenes de replicación. En las últimas investigaciones sugieren que son alrededor de 30-50 mil orígenes
de replicación por cada célula humana.
La activación efectiva de la replicación que comienza en los orígenes de replicación es un proceso que se da en 2
fases:
Licenciamiento de los orígenes de replicación: que implica el contacto inicial, el reclutamiento de zonas específicas
del ADN de un conjunto de proteínas que van a dar para que comience el proceso de replicación del ADN. En el
ciclo celular, este proceso ocurre en G1, anterior a la replicación del genoma nuclear (durante la fase S). El primer
contacto con los orígenes de replicación es el complejo, llamado ORC (Complejo de Reconocimiento de los
Orígenes). Este complejo a su vez permite el reclutamiento de otras proteínas. Una de ellas son las Helicasas, de la
familia MCM, son las responsables de abrir/romper la doble hélice y exponer las bases que sirven como molde para
enlaces de unión peptídicas. Estas helicasas se localizan antes de que ocurra la replicación en la fase G1, por lo que
permanecen inactivas, y necesitan de una señal especifica de la célula para activarse.
Activación de los orígenes al comienzo de la fase S: en donde las helicasas se van a activar y van a abrir la doble
hélice para que comience la replicación genómica. Generando 2 horquillas de replicación bidireccionales en las
hebras del ADN. El mecanismo por el cual se activan las helicasas, se denomina fosforilación, que depende de un
grupo de enzimas, llamadas quinasas, que fosforilan a las helicasas y activan así el inicio de la replicación.
Fosfatasas son aquellas que remueven los grupos fosfato de las enzimas y las vuelven inactivas.

Flexibilidad de los orígenes de replicación.

En los mamíferos, en la etapa del ciclo celular de G1, lo orígenes se licencian, pero no todos los que se licencian en
esta fase van a ser activados, se activan 1 de cada 3 orígenes de replicación. También difieren de un tipo celular a
otro, los que se activan. Se desconoce porque se activan ciertos orígenes de replicación y no otros, se sospecha que
dependería con el grado de condensación de la cromatina o la actividad transcripcional de una región del genoma y
esto estaría vinculado con la activación de ciertos orígenes de replicación.
Las burbujas de replicación crecen de manera bidireccional, en direcciones opuestas. Donde las polimerasas son las
que se pegan al ADN y lo polimerizan; y las helicasas son las encargadas de romper la doble hélice para que las
polimerasas puedan realizar su actividad.
Se sabe que, por cada ciclo celular, la replicación del ADN se da una única vez. Pero surgió de manera experimental
la pregunta ¿qué impide a la célula que no replique más de una vez el ADN, siendo que tiene todas las proteínas
necesarias para la replicación? O ¿Qué impide que un origen de replicación no se active luego de hacer ocurrido la
replicación, y genere una nueva replicación del ADN?
El mecanismo por la que la célula, replica su ADN, una única vez por ciclo celular se debe a que depende de la
familia de las proteínas MCM.
Las quinasas activan a las helicasas, fosforilándola y luego éstas se pegan a los orígenes de replicación. Cuando se
produce el inicio de la replicación, las proteínas accesorias al complejo ORC, se despegan de los orígenes de
replicación y son degradadas por moléculas activadas en el ciclo S de la célula. O sea que una vez que el inicio de la
replicación se produjo en un origen de replicación, las helicasas no pueden volver a unirse ya que las proteínas
accesorias que las uniones fueron degradadas, evitando así que en un mismo sitio se produzca más de una
replicación. Si este fenómeno fallara estaríamos en una situación llamada, re-replicación, generando así una
amplificación del genoma en ese sitio que fallo este mecanismo de control. Este fenómeno de re-replicación, en
mamíferos en general no es fisiológico.
Existen otras proteínas cooperativas de las helicasas que mantienen abiertas las burbujas de replicación, ya que
ambas hebras tenderán a reunirse espontáneamente por medio de puente de hidrogeno, son las Proteínas de Unión a
la Simple Cadena de ADN, como SSB-proteína/RPA.
Otras proteínas: topoisomerasas I, producen cortes que permite aliviar la tensión del sobregiramiento de la doble
hélice, evita el superenrollamiento.
Existen componentes centrales, que realizan la replicación del ADN, que son las ADN polimerasas, descubiertas en
el año 1952. Solo copian al ADN, no lo generan de novo, por lo que dependen de un molde de ADN, para continuar
la replicación. Tenemos al menos 14 tipos de ADN polimerasas.
Existió un experimento de Kornberg, en el cual, encontrar las enzimas que realizan la síntesis del ADN. Aislaba
bacterias rotas para encontrar una enzima que tuviera la función de ADN polimerasas, agregando nucleótidos
marcados. Fallando varias veces hasta que agrego producto para ayudar a la formación del producto, por lo que
encontró una gran actividad en uno de los tubos, lo que no sabía es que las ADN polimerasas solo copian al ADN,
pero no lo generan de novo.
Las ADN polimerasas solo copian al ADN, no lo generan de novo, por lo que dependen de un molde de ADN, para
continuar la replicación. Nuestro genoma codifica al menos para 14 tipos de estas enzimas. α – β - δ- γ - ε. Y otras
más. Solo un subgrupo participa en la replicación del ADN, como la α- δ y ε. La ADN polimerasa γ participa en la
replicación del ADN mitocondrial. La ADN polimerasa β participa de la reparación del genoma nuclear.
Condiciones para la replicación:
• Sustratos: son aquellos que desaparecen o se consumen para obtener un producto.
• Requerimientos: son aquello que ayudan a obtener el producto, como la hebra molde de ADN.
Sustratos:
• dNTP´s: Nucleótidos + un grupo de 3 fosfatos + un azúcar desoxirribosa + base nitrogenada (adenina,
citosina, guanina, o timina)
ACLARACION:
• Desoxirribonucleótidos difosfatos: Nucleótidos + un grupo de 2 fosfatos + un azúcar desoxirribosa + base
nitrogenada.
• Desoxirribonucleósidos: base nitrogenada trifosfato + un azúcar desoxirribosa + un grupo de 3 fosfatos.

Requerimientos
• Molde de ADN de cadena simple, es esencial, ya que la ADN Polimerasas no generan ADN de novo.
• Molde de ARN, para polimerizar los extremos, que utilizan las Retrotranscriptasas.
• Cada extremo es diferente, están polarizadas.
Extremo 5´fosfato, un grupo fosfato unido al C5 de la desoxirribosa.
Un extremo 3´Oh, posee un OH libre unido al C3. Es donde comenzará la polimerización y desde se podrá desde
ahí. Este será el punto de entrada de la ADN polimerasa. SE dice que se polimeriza el extremo 3´
Las cadenas se caracterizan por tener dirección antiparalela, ya que en los extremos opuestos tendrán las mismas
características que en un mismo sitio de acoplamiento. Por eso también es que se unen, por medio de uniones
complementarias.
Existen un concepto, llamado procesividad: se le atribuye a las ADN polimerasas y significa que tiene la capacidad
de mantenerse unido al ADN por mucho tiempo y poder así replicar mucho más desoxirribonucleótidos. Una de las
proteínas con mejor procesividad es la PCNA.
• Los PCNA son factores de procesividad que tienen la capacidad de acercarse al ADN, y retener cercano a él
a las ADN polimerasas α y δ, para que no se despeguen. PCNA significa antígeno nuclear de células
proliferativas. En la fase S se encuentra en alta concentración. Se usan como indicador del grado de un
tumor, ya que indica que ciertas células se encuentran en proliferación y ello determina que si hay una
excesiva concentración de esta molécula significará que el tumor está en crecimiento.
• Teniendo en cuenta que las ADN polimerasas que no sintetizan de novo. Sino que sintetizan a partir de un
molde que lo sintetizan las primasas. Las primasas son ARN polimerasas que se encargan de crear un
pequeño molde de ARN o cebadores o primers para que las ADN polimerasas comienzan a replicar el ADN.
Tienen la capacidad de sintetizar de novo, perdiendo la fidelidad a la hebra molde.
El avance de las ADN polimerasas se da siempre en sentido 3´-5´, y de ahí surge un inconveniente ¿cómo sintetizan
a la hebra que va de 5´-3´, si se da en sentido opuesto al avance de la horquilla de replicación? Se creía que existía
una polimerasa que sintetizaba a partir del extremo 5´ fosfato, aunque esa teoría resulta ser falsa.
Se sabe ahora, que en realidad hay otro mecanismo de síntesis, con 2 procesos diferentes para las hebras de la doble
hélice del ADN. Uno se da a partir del extremo 3´ OH siguiendo el avance de la horquilla de replicación, y por ende
será continua, que también se denomina Hebra Adelantada, y sólo escindirá un solo primer de ARN. Y otro se da, a
partir de una serie de fragmentos, conocidos como Fragmentos de Okazaki. Estos fragmentos serán sintetizados en
sentido contrario al avance de la hebra misma, O sea siguen el sentido del avance de la horquilla de replicación.
Llamándose hebra Retrasada o discontinua.
La ADN Polimerasa α, tiene en su estructura subunidades adheridas de Primasa, que generar el primer a partir del
cual comienza la replicación. Luego la ADN polimerasa α en sí misma va a ser quien elongue ese primer, alrededor
de 50-100 nucleótidos serán los que sintetice.
• En la hebra Adelantada, la ADN polimerasa ε será la que finalice la síntesis de esta hebra.
• En la hebra Retrasada, la ADN polimerasa δ, finaliza la síntesis de la hebra.
Simultáneamente está ocurriendo la síntesis de histonas y la formación de nucleosomas, es decir la cromatina se está
formando a eucromatina a medida que va ocurriendo la replicación del ADN.
Problema en la replicación en el extremo 3´de los cromosomas
En los extremos, es decir en los telómeros, se encuentran secuencias no codificantes o secuencias repetitivas. Existe
una secuencia repetitiva en mamíferos TTAGGG, se llama secuencia telomérica y es característica de los telómeros.
Lo que sucede en cada replicación es que, en cada síntesis de los telómeros, se va acortando una pequeña porción en
cada división celular hasta llegar al punto de que la secuencia es demasiado corta que provoca que la célula no
pueda dividirse y entre en el proceso de apoptosis. Es señal de senescencia celular. Este acortamiento telomérico no
se hereda en la próxima generación, ya que lo que se transmite en la siguiente generación depende de las células
sexuales y la senescencia telomérica ocurre a nivel de las células somáticas.
Los telómeros pueden replicarse en ciertos tipos celulares por una maquinaria especial que no dependen de las ADN
polimerasas, sino a una enzima denominada telomerasa. La telomerasa es una ribonucleoproteína, es decir tiene un
componente proteico y un componente de ARN y tiene actividad de retrotranscriptasa. Las retrotranscriptasas
pueden sintetizar ADN utilizando ARN como molde. El molde de ARN que utiliza es un pequeño fragmento que
está contenido en la enzima misma. Entonces, la telomerasa puede elongar los extremos de los telómeros utilizando
el pequeño molde que ella misma posee.

Mantenimiento del ADN nuclear

• Los mecanismos de reparación para el mantenimiento del ADN nuclear.
• Se sabe que las ADN polimerasas poseen un alto grado de fidelidad, por lo cual se debe conocer cuáles son
las fallas que llevan a la reparación del ADN.
• Errores al momento de la replicación
• Errores o daños que se ocurren, en un momento diferente de la replicación.
Existe una distinción en los tipos de errores, dependiendo de si ocurre en una de las cadenas, o sea errores de simple
cadena, donde podrá utilizar “como guía” a la otra hebra por complementariedad de bases. Y errores que ocurren en
ambas cadenas, llamados también errores de doble cadena.
Errores en la replicación
Por deformación de la doble hélice, las polimerasas pueden cometer errores en la polimerización de un nucleótido
que no sea complementario con su molde. Por lo que este nucleótido tenderá a despegarse y no formará los puentes
de hidrógeno con la hebra complementaria. Este mal apareamiento puede ser detectado por la ADN polimerasa
misma si es que se encuentra en esta región del ADN. Varias ADN polimerasas tienen una actividad enzimática de
reconocer un mal apareamiento y escindir/clivar/remover ese mal apareamiento, realizando en el sentido contrario a
la síntesis de 5´-3´. Mecanismo como Profreading o lectura de prueba. Este sería el primer mecanismo de reparación
del ADN.
La ADN polimerasa α que sintetiza una pequeña cantidad de ADN, no posee esta actividad de profreading, en
cambio aquellas polimerasas que sintetizan una enorme cantidad como las ADN polimerasas δ y ε, si poseen la
actividad de profreading.
En los casos que hubo mal apareamientos o mismatches y donde la ADN polimerasa no detecto a tiempo y continuo
la polimerización del ADN, quedando así dicho error, existe otro mecanismo de corrección.
• Sistema de reparación de mal apareamiento de bases o REBA:
• Detecta el error: El mal apareamiento producirá una deformación tridimensional de la doble hélice, y donde
un conjunto de proteínas que monitorean a la doble hélice reconociendo esta deformación y uniéndose
fuertemente.
• Reconoce cuál es la hebra molde y cuál es la hebra nueva, así podrá remover el nucleótido correcto, pero
tiene cierto tiempo para hacerlo, ya que pasado un tiempo luego de la replicación se produce una metilación.
Se dice entonces que este sistema es post replicativo temprano.

• Sistema de reparación por escisión de bases o REBA:

Daños que ocurren espontáneamente y que se dan en cualquier momento del ciclo celular. Como, por ejemplo;
algunos nucleótidos pueden perder sus bases nitrogenadas, como las purinas y este fenómeno se lo conoce como
despurinación, otro ejemplo donde muchos nucleótidos pierden grupos aminos y se convierten en bases
nitrogenadas que no son naturales del ADN. En el caso de una citosina que pierde su grupo amino la convierte en
uracilo. Fenómeno llamado desaminación.
Este sistema debe actuar antes que ocurra la próxima replicación ya que si no lo hace se introducirá un error en la
nueva replicación.
• Detectan las bases nitrogenadas que no son naturales del ADN. Como por ejemplo Uracilo o aquellas que
hayan perdido la base nitrogenada.
• Luego remueven las bases no naturales del ADN, quedando un “hueco”, que es rellenado por la ADN
polimerasa β.
Este sistema no depende de si es la hebra molde o la hebra nueva.

• Sistema de reparación por escisión de nucleótidos o REN:

Por la exposición de los rayos UV puede generar un daño, provoca la formación de dímeros de pirimidinas. Es decir,
cuando existen 2 pirimidinas cercanas entre sí forma los enlaces covalentes entre ellas. Esto provoca una
deformación particular. Por lo que si no se repara a tiempo la ADN Polimerasa no podrá sintetizar y se producirá
una ruptura, no reconocerá esa unión. Este sistema tampoco no depende de si es la hebra molde o la hebra nueva.
• Detecta la unión de dímeros de pirimidinas.
• Remueven ese fragmento.
• Las ADN polimerasa δ y ε participan de la reparación del fragmento dañado.

Cuando la se produce roturas de doble cadena. Si este daño no es reparado, la célula activa una serie de
señalizaciones que activan la muerte celular programada. Existen 2 mecanismos por los que pueden repararse:
• Sistema de unión de extremos no homólogos: donde une a 2 fragmentos que se han roto y pudiendo
introducir algunas mutaciones.
• Recombinación homologa: utiliza la información de una de las hebras homologas que tenga alta identidad
con la hebra que se rompió. Este sistema tiene alta fidelidad de copiado.

Seminario de Biología n°2: Dictado por Giusti

Ciclo celular
Características:
• Organismos vivos con un sistema autónomo de la replicación del genoma.
• 2 eventos claves en el ciclo celular:
• Una célula debe replicar su genoma antes de dividirse, y existen mecanismos de fidelidad dado por:
• Estructura del ADN
• Fidelidad de las polimerasas en la replicación
• Mecanismos de reparación. Dando como resultado unas 3 mutaciones en un genoma de 3 mil millones de
pares de bases.
• Si la célula “madre” no expresa la enzima telomerasa, las células hijas sufrirán un acortamiento de los
telómeros, al cabo de un determinado número de replicaciones no podrán dividirse más y entrarán a un
proceso denominado senescencia celular.
• Segregación de cromosomas replicados en las células hijas.

Se analizarán 2 aspectos:
• Concepto de la proliferación celular en organismo multicelulares, poseen altas restricciones y pueden
eliminar la arquitectura funcional. La proliferación celular está restringida a ciertos tipos celulares.
• Mecanismos moleculares que controlan el avance del ciclo celular

Proliferación en el contexto de un organismo multicelular

Los tejidos poseen células con diversos tipos de diferenciaciones anatómicas y funcionales que las caracteriza que
van a alcanzar por un proceso de diferenciación celular. La diferenciación implica una regulación génica de cada
una de esas células. Existe también una organización particular de esas células que caracteriza a determinado tejido,
es decir a la forma que en se organizan para interactuar entre sí.
En tejidos adultos, solo un subgrupo retiene la capacidad proliferativa, manteniéndose en un equilibrio entre células
que están en proliferación y otro grupo que sufrirán apoptosis. Esta apoptosis no siempre se debe a daño celular,
sino que está determinado genéticamente, hay señales que pueden inducir activamente la muerte celular programada
y esto ha evolucionado para permitir en el tiempo la funcionalidad de los tejidos, eliminado células que podrían
obstruir esa arquitectura precisa.
En los tejidos adulto el proceso de proliferación no se da para un crecimiento, sino para mantención, ya que las
células viejas son eliminadas y reemplazada por células nuevas.
Existen distintos mecanismos por los cuales los tejidos sufren proliferación. Por ejemplo, en aquellos que tienen una
alta tasa de renovación, como en el epitelio intestinal. Epitelio simple que recubre la luz que da el intestino. Existen
distintos grupos de células, en donde algunas llegaron a su máxima diferenciación como células absortivas, o las
células caliciformes que secretan mucus. Pero también existe un subgrupo que permanecen en un estado
indiferenciado, que conservan la capacidad proliferativa y serán las células madres de ese tejido.

Concepto de célula madre:

 • Mantienen capacidad proliferativa
• Estado pobre de diferenciación
• Capacidad de autorrenovación, es decir que al menos una célula hija mantiene las mismas características que
la célula progenitora, el mismo rasgo de potencialidad.
O sea, la célula progenitora en su división producirá una célula madre con sus mismas características y una célula
hija que luego se diferenciará por ejemplo en una célula absortiva.

Otros tejidos tienen una estrategia similar, poseen un subgrupo de células madres, pero tienen una tasa de
renovación muy baja. Es un ejemplo de un tejido muy diferenciado como el tejido muscular esqueléticas. Sus
células están muy diferenciadas, por lo que no se dividen, pero se pueden encontrar entremezcladas entre las fibras
musculares, en la periferia a las células satélites son células madres con una limitada capacidad proliferativa
inducidas por una ruptura muscular.
Existe una excepción: Las células que forman el parénquima del hígado, los hepatocitos son células diferenciadas
pero que conservan la capacidad proliferativa inducidas por un daño o una remoción de una porción del tejido, y
pueden reingresar en el ciclo celular y culminar en una división celular.
Existe en el organismo que la capacidad de proliferación es casi nula y se encuentra en el músculo estriado cardíaco.
Implica que un daño en ese tejido no puede ser regenerado. Y ello implica un grave problema para ese tejido.
Otro tejido con casi nula proliferación es el tejido nervioso, pero cumple una función, como la preservación de la
memoria, si el tejido nervioso estuviera generándose todo el tiempo, la función de la memoria no podría existir
porque ésta depende de un circuito estable, de la permanencia en el tiempo de las mismas neuronas y de sus
conexiones. En los últimos años se ha descubierto que existen regiones muy localizadas del cerebro que mantienen
la capacidad neurogénesis, pero se duda de la relevancia que existen en individuos adultos.

Estudio descriptivo de la proliferación

Para estos estudios se usan líneas celulares inmortalizadas, células aisladas que pueden ser de algún animal o de
seres humanos, en el caso de una muestra tomada por una biopsia en humanos, se trata de células tumorales por lo
que se dicen que son inmortalidad replicativa, ya que expresan en todas sus células la enzima telomerasa y por ende
no tendrán un número limitado de divisiones celulares antes de entrar en senescencia celular.
Esto permite que en un medio de cultivo y agregando nutrientes puedan mantener en una estufa de cultivo de 7°C en
condiciones de CO2 controladas a las células proliferando en una placa de Petri. Se puede medir la capacidad
proliferativa en el tiempo colocando un número relativamente bajo de células y así se puede analizar el grado de
confluencia, es decir, en que proporción pueden cubrir la superficie de la placa a lo largo del tiempo. Y medir el
tiempo en que una línea celular llega al grado de confluencia y será directamente proporcional a la velocidad que
una línea celular puede atravesar el ciclo celular.
Otra forma es la citometría de flujo, implica generar a partir de la disociación de tejidos o de levantamiento y
disociación de células que están creciendo en un medio de cultivo, generar una suspensión de células; células que no
estén en el fondo de la placa o que no están adheridas entre sí, por conexiones o matriz extracelular. Esa suspensión
se pasa al citómetro, y que posee un conducto tan delgado que solo deja pasar una célula por vez, y se pueden
pretratar a las células con una tinción que se intercala en las bases del ADN y que emite fluorescencia con una
determinada luz de cierta longitud de onda. La cantidad de fluorescencia que emita cada una de ellas dependerá de
la cantidad de ADN que contengan cada una. El citómetro de flujo podrá medir entonces, la fluorescencia de cada
una de esas células y podrá analizar estadísticamente el perfil de la línea celular estudiada.
Esto se verá reflejado en un eje de coordenadas cartesiano. Donde, por ejemplo, se mostrarán 2 picos uno de menor
tamaño que el otro, y también picos de tamaños intermedios que estos. En el cual, el pico de mayor tamaño
representara las células que ya atravesaron la fase S, es decir que pueden estar en la fase G2. Y el de menor tamaño
representara a las células que no han comenzado la fase S. y los picos intermedios, representan los estadios
intermedios de la fase S, es decir, que están en diferentes pasos de la mitosis.
Otro estudio, que se realiza en un tejido es analizar el índice mitótico, mide la proporción de células que están en
mitosis en cierto tejido en un momento dado y que se cuantifica en relación con las células que están haciendo
mitosis sobre el número de células totales. Esto se realiza a partir de cortes histológicos teñidos con la técnica de
rutina. Este método es importante, ya que en un tumor el índice mitótico representa el grado de agresividad.
Se sabe que los tumores tienen una fase exponencial y luego una fase estacionaría, aunque siempre depende de cada
tipo de tumor. La fase estacionaria implica que el tumor ha crecido demasiado y ha acabado sus nutrientes. Esto se
conoce como descripción gompertziano:
• El crecimiento tumoral radica en función del tamaño del tumor.
• La fracción de crecimiento tumoral disminuye al aumentar el volumen del tumor.

Mecanismos moleculares que controlan el ciclo celular

Hatwell estudio a la levadura de cerveza, un hongo unicelular, pudo identificar algunos genes con función de
regulación la progresión del ciclo celular. Podía observar directamente el proceso del ciclo celular bajo el
microscopio teniendo una gemación significa que está a punto de replicarse. Podía identificar células puntuales que
tenían problemas de proliferación. Y podía inducir problemas en el genoma, que es haploide, cada gen está en única
copia. Por lo que al haber un gen mutado habrá una manifestación fenotípica. Logro identificar los genes que
denominó Genes CDC (ciclo de división celular), estas células mutantes tenían problemas proliferativos, entonces
estos genes deben de estar codificando para productos proteicos que son esenciales en el control del ciclo celular. De
modo tal que una mutación en las proteínas codificadas por esos genes detiene en puntos específicos de ese ciclo
celular.
El paso del tiempo no implica que la célula pase de una fase a la otra, sino que depende de otros mecanismos. Se
dice que deben atravesar cambios drásticos para pasar ciertas fases del ciclo celular, llamadas transiciones
reguladas. Los cambios drásticos, se creía que dependía de factores que activaran o desactivaran para pasar de una
fase a la otra.
• Una de las transiciones reguladas, son los llamados Puntos de Restricción, que se da en fines de G1 y
principios de la fase S. Es un punto muy difícil para célula atravesar esa transición.
• Otra transición, G2 a la fase M
• Mitad meiosis, de la anafase a la metafase.
Estos procesos de cambios drásticos están mediados por mecanismos de fosforilación, que realizan las enzimas
Quinasas obteniendo el fosfato de la molécula de ATP. Proceso que ocurre postraduccional de las proteínas La
fosforilación son una de las modificaciones que pueden sufrir las proteínas que pueden tener un efecto dramático
sobre su estabilidad o su actividad, por ejemplo, una proteína que se encuentra en un estado inactivo, luego de la
fosforilación, este grupo fosfato añade un cambio conformacional en la estructura tridimensional y volverla activa.
También puede darse el caso contrario. Otro ejemplo, es donde una proteína es sujeta a degradación constante y una
fosforilación la vuelve inaccesible a la maquinaria de degradación y permitir su acumulación en el tiempo. La
característica principal de la fosforilación se debe a la enorme rapidez. La fosforilación es un proceso reversible, por
lo que, si las quinasas añaden grupos fosfatos, existen otras enzimas que los remueven y son las fosfatasas. Cabe
destacar que la fosforilación se da en residuos de serina, treonina y tiroxina, dado que no cualquiera puede hacer
este grupo con cargas negativas.
Existen quinasas que regulan procesos que permiten los cambios drásticos a lo largo del ciclo celular, que se
denominan Cdk-Ciclinas (quinasas dependientes de ciclinas. Su estructura funciona es un heterodímero, un
complejo de 2 polipéptidos diferentes unidos por uniones no covalentes. De esas 2 subunidades, una es la que tiene
la actividad catalítica, la Cdk es la que es capaz de unir covalentemente el fosfato del ATP al residuo de treonina,
tiroxina o serina, es la que tiene la capacidad de fosforilación. La otra, la ciclina, es la subunidad regulatoria, regula
que la subunidad Cdk adquiera la estructura tridimensional adecuada para ser funcional.
Hay 4 familias principales, y su nombre lo adquieren del momento del ciclo celular que regulan:
• G1-Cdk
• G1/S-Cdk
• S-Cdk
• M-Cdk
Paul nurse, fue el que descubrió por primera vez la actividad de las Cdk, como los productores del avance del ciclo
celular, también se dio cuenta que los genes que codificaban para estas ciclinas eran los mismos genes que describió
Hatwell no solo estaban en las células de las levaduras, sino que se encontraban en todas las células eucariotas.
Otro grupo de investigación descubrió en experimentos a la hoy conocida M-Cdk, que promueve la segregación de
los cromosomas y denominaron Factor Promotor de la maduración, luego se descubrió que ambos eran la misma
molécula. Utilizaron ovocitos de rana miden entre 1-3mm, se podía inyectar “cosas” a los ovocitos por su gran
tamaño. Las ranas tienen la capacidad de producir y almacenar grandes cantidades de ovocitos que quedan
almacenados en G2, en la profase I. Si se inducía por inyección hormonal de progesterona, entrarían a la fase M lo
ovocitos. Tomaron citoplasma que entro a la mitosis y se los inyectaron a otros que no fueron inyectados, también
entraban en mitosis. Por lo que concluyeron que se debía a moléculas que se encontraban en el citoplasma lo que
inducia el cambio de fase.

¿Cómo se regula la actividad de las Cdk?

Se debe a la estructura misma, y se debe a las ciclinas. Aunque no siempre se encuentran presentes, se encuentran en
momento precisos en gran cantidad y luego disminuyen. Varía dependiendo de que fase se encuentre la célula y por
ende se incrementaran las ciclinas de la fase siguiente para regular dicho cambio de fase. También están reguladas
por el sistema ubiquitina-proteasoma, permite que ciertas proteínas se degraden de manera muy rápida e implica que
esa proteína debe unirse de manera covalente con una molécula muy pequeña que es la ubiquitina, si se añaden
cadenas de ubiquitina a lo largo de ciertas proteínas proceso llamado ubiquitinación, conducirán al mecanismo de
degradación por medio del proteasoma.
Tim Hunt fue quien descubrió y describió de las ciclinas.

Transición regulatoria de anafase a metafase.

En anafase ocurre la separación de las cromátides hermanas, que se debe a la ruptura de las cohexinas que lo
mantiene unidas a lo largo del cromosoma a las cromátides hermanas, aparte del centrómero. Separasa es la que
lleva a la separación de las cohexinas, pero se encuentra unida a la securina y para que la separa realice su actividad,
se necesita que la securina sea degradada previamente.
El complejo promotor de la anafase (APC) induce la ubiquitinación de la securina, su degradación en el proteasoma
y la liberación de la separasa. El AP es un complejo activo formado por 2 subunidades, el complejo promotor de la
anafase que se al complejo Cdc-20.
Cdc-20 se va a acumular cuando se encuentre activa la ciclina que activa la Fase M. El Cdc-20 es fosforilado y así
activado, por la M-Cdk.
APC también ubiquitina a la M-Cdk, o sea que existe un feed back negativo, porque rápidamente disminuye la
cantidad de ciclinas de la fase M.
Existen también una manera de activar este sistema de una manera máxima, que es fosforilando las Cdk-ciclinas,
por medio de otras proteínas.
Existen proteínas inhibitorias se unen al complejo Cdk-ciclinas e impiden que se unan a su sustrato, son ejemplo:
• p 27
• p 21
• p 16
• p 53
también ellas pueden estar a procesos de regulación, por lo que si son ubiquitinadas liberarán al complejo Cdk-
ciclinas y éstas podrán unirse a su sustrato.

Puntos de control
Señalizaciones intracelulares que se activa en aquellos momentos en que la célula no ha replicado la totalidad de su
genoma o cuando hay daños en el ADN.
p 53 es una proteína inhibitoria muy importante, ya que detiene el ciclo celular, inducido por daños en la doble
cadena de ADN. Se encuentra sometida a degradaciones constantes. Si se fosforila puede acumularse y así regular el
ciclo. Un factor de transcripción, p 21 cumple la función de inhibir a Cdk-ciclina que induce la transición de G1-S.

¿Cuáles son los requisitos que se necesita para pasar el Punto de restricción?
Se necesitan ciertos factores mitógenos, no necesariamente necesitaran de nutrientes para pasar este punto.
El rol de los mitógenos o factores de crecimiento
Mitógenos y factores de crecimiento, no son sinónimos, sin embargo, algunos factores de crecimiento actúan como
mitógeno, aunque tengan otras funciones involucradas en otros procesos.
Son ejemplos:
• FGF
• EGF
• PDFG
• Eritropoyetina
• Interleuquinas
 Son pequeños péptidos, segregados por un tejido que actúan sobre receptores de la superficie de las células de
una población competente. Y que produce una cascada de activación intracelular, que median diferentes
fosforilaciones.
La unión del mitógeno con su receptor que induce la vía de activación intracelular suele terminar con activación
de factores de transcripción de determinadas proteínas que van a inducir que se expresen determinados genes en
el genoma. Uno de los genes que suele ser transcripto como respuesta a la inducción de un mitógeno es un gen,
que a su vez es un factor de transcripción Myc. Una vez que se transcriba y traduzca es te gen se formará la
proteína Myc, que actúa en el promotor de otros genes produciendo a su vez inducirá una segunda oleada de
transcripción y traducción.
El gen Myc puede activar 3 genes:
• Ciclina D, que activa a G1-Cdk- ciclina, la ciclina G1 no está desde el comienzo, sino que, debe sintetizarse
en la célula y comienza a hacerlo cuando recibe una señal mitogénica que inició una vía de señalización
intracelular que activa Myc y promueve la síntesis de esta ciclina.
• Se transcribe una subunidad regulatoria que va a degradar a aquella proteína p27 que le ponía un freno a la
ciclina G1. El mitógeno induce a la síntesis de las proteínas que participan en la degradación de las señales
inhibitorias. De modo tal, que libera la actividad no solo de las ciclinas características de G1, sino también
de las que participan de G1/S.
• Ambas ciclinas, fosforilan muchos sustratos, entre ellos el Rb, la proteína del Retinoblastoma, tiene una
función inhibitoria de la proliferación, dado que secuestra al factor de transcripción que va a inducir la
síntesis de las ciclinas características de los complejos S-Cdk ciclina.
El control que tiene un organismo multicelular dependerá de la disponibilidad de los mitógenos, si ellos no se
encuentran presenten no podrán atravesar el punto de restricción por más nutrientes que posean.

Para entender el abordaje de los procesos patológicos que caracterizan a las células tumorales donde la proliferación
ha perdido el control regulatorio, se clasificaron a los genes del genoma según el fenotipo que se quiera analizar. Se
los dividió en 2 grupos
• A un grupo de genes que favorecen la proliferación celular, es decir tienen un efecto positivo, como por
ejemplos los genes que codifican para las ciclinas, las quinasas dependientes de ciclinas, los genes que
codifican para lo mitógenos y sus receptores. Se los llama Protooncogenes. Si ocurriera una mutación en
estos genes promovería la progresión aun si tener la señalización de un mitógeno, y entonces este gen
mutado se pasa a llamar Oncogen.
• El otro grupo será aquellos genes que detienen el ciclo celular, como, por ejemplo, p27, Rb, p53, proteínas
que ponen un freno. Son los genes denominados Genes supresores de tumores.

Seminario n° 3 de biología celular por el Dr. Giusti

Regulación de la expresión génica I

Conceptos básicos:
• Diferenciación celular: 2 tipos celulares del mismo organismo, por ejemplo, una neurona y un hepatocito, el
genoma de ambas es exactamente el mismo. No todo el genoma está siendo expresado. Se hicieron
experimentos para saber que transcriptos están siendo expresados en los diferentes tipos celulares. Los genes
se pueden agrupar en 3 grandes grupos:
• Algunos genes que son específicos en tipos neuronales
• Otros solo en hepatocitos
• En ambos tipos, genes de mantenimiento o housekeeping
• Mecanismos moleculares que permiten la diferenciación celular. Pueden expresar genes a partir de estímulos
que antes no se expresaban, como por ejemplo la prolactina en las células de la glándula mamaria en
respuesta a estímulos hormonales.
Existen 30.000 genes. De esos genes, no todos codifican para proteínas
• 21.000 codifican para proteínas.
• 9.000 codifican ARN no codificantes:
• snARNs (ARNs pequeños nucleares)
 • sonARNs (ARNs pequeños nucleorales)
• microARNS
La expresión de los genes comienza a partir de la transcripción de esos genes por parte de la ADN polimerasa, con
la transcripción de los genes, algunos de los transcriptos primarios necesitan una modificación como el splicing. Y
exportados del compartimiento nuclear al compartimiento citoplasmático y puede o no ser traducido.
Todos los procesos de la célula son regulados. Aunque se concentran en si se van o no a transcribirse.
Regulaciones
• Regulación pre-transcripcional: procesos que regulan antes de la transcripción modificando el grado de
compactación de la cromatina llamado control pre-transcripcional.
• Regulación de la transcripción: procesos que regulan el inicio de la transcripción.

Regulación pre-transcripcional o regulación epigenética

Epigenésis: “por encima de los genes” Conceptos
Una transformación química que puede afectar al ADN o a la cromatina pero que no afecta el orden de las bases.
• En biología molecular: mecanismos moleculares algunos de ellos heredados que proveen información
regulatoria al genoma sin alterar la secuencia de nucleótidos del ADN.
• En biología del desarrollo del desarrollo: aquel mecanismo que no es genético. Un evento epigenético que
impulso a un mecanismo de desarrollo.
El genoma está asociado a proteínas, histonas, que forma así la cromatina. En la célula se encuentra en estados más
laxos. En diferentes células habrá diferentes grados de compactación o de laxitud permitiendo que acceda la
maquinaria transcripcional.
El nucleosoma es el primer grado de compactación. Obtenido de imágenes de microscopio y de datos químicos,
formado por dímeros de histonas: 2*H2A, 2*H2B, 2*H3, 2*H4. H1
Técnicas de cristalografía de moléculas por Rx pueden purificar las moléculas, una vez que atraviesan los rx en las
moléculas y reconstruir la disposición de las moléculas.
Características de las histonas:
• Son proteínas muy conservadas. Conservan su estructura en el tiempo.
• Cada aminoácido cumple una función específica. Poseen entre 103-115 aminoácidos.
• Las H2A poseen una alta concentración de aminoácidos básicos que el resto de las histonas, poseen una
cadena positiva: Lisina (K), Arginina (R).
• Le otorgan una carga neta positiva a las histonas, y esto otorga a las histonas asociarse al ADN que es un poli
anión, con alta afinidad.
• Estructura de las histonas, son polipéptidos poseen ciertos dominios con alfa hélices y le permite plegarse,
que se llaman Pliegues Histónicos permite la asociación de histonas, también llamado “apretón de manos”.
• Se forman dímeros de histonas de la asociación de H2A-H2B y H3-H4.
• Los extremos N-terminales carecen de las estructuras de alfa hélice y protruyen hacia afuera de los dímeros,
y son el asiento de modificaciones químicas que permiten la compactación de la cromatina.
Modificaciones químicas de los extremos N-terminales de las histonas
Las acetilaciones y las metilaciones ocurren en el mimo tipo de residuos, ocurren en las lisinas (R) poseen un resto
de un grupo de 4 carbonos que presenta un extremo amino que le confiere la carga positiva, y las fosforilaciones
ocurren en los residuos de serinas (K).
• Acetilaciones: agrega un grupo de acetilo, consiste en un grupo de 2 carbonos (COHN-CH3) a la amina de la
lisina, cancela la carga positiva. Una histona acetilada tendrá una menor afinidad por el ADN, entonces a
mayor grado de acetilación menor grado compactación, mayor grado de transcripción.
• Metilaciones: también ocurren en el nitrógeno de la lisina. Agrega un grupo metilo (CH3). No modifica la
carga. Una lisina metilada no puede ser simultáneamente acetilada, o sea no puede ser modificada para la
descompactación de la cromatina.
• Fosforilaciones: son menos frecuente. Aumentan la carga negativa, pierde la afinidad por el ADN, por lo
cual a mayor grado de fosforilación menor grado de compactación.
Son modificaciones dinámicas. Hay enzimas que pueden producir que la remoción de estos grupos. En el caso de la
acetilación, las enzimas responsables son la desacetilasas de histonas. En la metilación son las metiltranferasas, y en
la fosforilación son las catalasas.
Las desacetilasas (HDAC) luego de remover el grupo acetilo, desfavorecen la expresión génica. Le quita la carga
negativa, y que la histona con carga positiva y tendrá más afinidad por el ADN entonces habrá mayor grado de
compactación.

Heterocromatina facultativa: puede estar o no compactada. En distintos tipos celulares o en un mismo tipo celular en
distintos tiempos reaccionan a distintos estímulos.
Heterocromatina constitutiva: siempre está en forma heterocromatinizada. Hay regiones del genoma siempre están
hetocromatinizada, son regiones pobres en contenido génico, como los telómeros.

Los complejos remodeladores de la cromatina

Son mecanismos que regulan la compactación de la cromatina, complejos enzimáticos que utilizan la energía para
generar movimiento en los nucleosomas que se generar debido a la hidrolisis del ATP.
Efectos:
• Pueden desplazar un nucleosoma de una región a una región adyacente, ese movimiento que un promotor
escondido quede levemente expuesto para que se active la transcripción.
• Pueden remover, de una región determinada del genoma, un nucleosoma y dejar una región sin asociación de
nucleosomas en esa región del genoma.
Ambas favorecen la expresión génica.
• Pueden sustituir los nucleosomas con las histonas clásicas por nucleosomas con histonas menos comunes.
Variantes de H3, llamada H3.3 que tiene terminaciones aminoacídicas, la cual le confiere menor grado de
afinidad por el ADN y por ende habrá menor grado de compactación y la caracteriza por un alto grado de
expresión génica. Hay otra variante de H3, con un mayor grado de afinidad al ADN, llamada CENP-A,
característica de regiones de heterocromatina constitutiva y centroméricas.

Metilación del ADN.

Características:
• Ocurre en algunos residuos de citocinas, es una modificación epigenética.
• La citocina tiene que estar yuxtapuesta con una guanina, esa guanina tiene que estar 3´con respecto con la
citocina.
• Se generan islas de CPG: regiones donde se encuentra la asociación de guanina-citocina, donde las citocinas
están metiladas y por lo general están asociados a promotores. De la sigla, la letra P, significa el grupo
fosfato que une a la guanina con la citocina y hace referencia de la posición de la mima.
• No cambia las secuencias de bases. Pero cambia la conformación tridimensional.
• La metilación deriva en el silenciamiento génica, ya que la Polimerasa II no puede ser adherirse al sitio de
unión para comenzar la transcripción.
• Ese cambio que se genera se forma una afinidad de enzimas, desacetilasas de histonas, esto genera que las
histonas se adhieran al ADN y por ende se compacte, y de ese modo se silencie la expresión génica.
• Las modificaciones de las histonas, algunas de ellas pueden ser transmitidas a las células hijas, aunque no
hay evidencia de todas las que lo producen, solo se sabe que existen 2 tipos, por ejemplo, la trimetilación de
la enzima 27 y la trimetilación de la enzima 9 de la histona H3, se sabe que son transmisibles a las células
hijas.

Regulación de la transcripción
Existen 3 tipos de ARN polimerasas, tipo I, II, y III. Transcriben distintos tipos clases de genomas.
• La ARN polimerasa I, transcribe ARN ribosomal.
• La ARN polimerasa II transcribe todos los ARN mensajeros cuyo producto final es una proteína.
• La ARN polimerasa II transcribe el ARNt, y ARN pequeños.
También existe una ARN polimerasa mitocondrial.
Características de la ARN polimerasa II,
• Es un complejo de polipéptidos de 2 subunidades. La subunidad 1 posee la función enzimática, un extremo
carboxi terminal, extremo CTD compuesto por 7 aminoácidos.
• Por si sola no es capaz de reconocer los promotores, no tiene afinidad por la secuencia del ADN.
• Existe un conjunto de 5 proteínas son imprescindibles, los llamados Factores Basales de la Transcripción
(TF2T), que permiten que la ARN polimerasa reconozca a los promotores. Están presenten siempre, no son
 específicos. Si falta uno la transcripción no se produce

¿Cómo reconocen los factores basales de la transcripción a los promotores? Los promotores son doble cadena de
ADN, entonces como es que hace una proteína para reconocer la secuencia si está el promotor arrollado sobre sí
mismo.
La doble hélice sufre diferentes modificaciones estructurales que son detectadas por proteínas. Existen diferentes
familias de proteínas que reconocen las estructuras especificas están las llamadas Dedos de Zinc existe un átomo de
zinc y que favorece la configuración tridimensional precisa.
También se encuentran las cremalleras de leucinas, son muchas de las proteínas que interactúan con el ADN y que
poseen homeodominios, son sectores polipeptídicos que pueden interaccionar con el ADN.
Se dice que cuando todos los factores basales de transcripción están posicionados y no ocurre la transcripción, se
dice que ese complejo esta inactivo.
La forma activa de la ARN polimerasa II, se fosforila el extremo carboxi terminal.

Existen elementos del genoma, secuencias regulatorias: Potenciadores (enhancers) o silenciadores (silencers). Se
posicionan un conjunto de proteínas que interactúan con lo silenciadores o potenciadores, son los llamados Factores
de Transcripción Específicos. Las proteínas que participan son diferentes, es decir varían de un gen a otro a
diferencia de los factores basales de la transcripción que siempre son las 5 mismas proteínas.
Se dice que un factor de transcripción es aquel que interactúa directamente con el ADN, y aquel que no se use de
manera directa se llama correguladores, se unen a otras proteínas. Aunque ambos tienes una actividad regulatoria
sobre la activación de un gen.
Entonces:
Los promotores son secuencias del ADN, que se le pueden unir los factores de transcripción y que, a su vez, a estos
últimos se les puede unir los correguladores.

Secuencias Potenciadores: activan /ayudan a la transcripción mediante diferentes proteínas.

Los silenciadores por su parte inhiben la transcripción.
Tienen su efecto rio abajo o rio arriba con diferencias de muchos o pocos pares de bases, y esto se debe a que la
molécula de ADN puede doblarse y así interactuar con la secuencia potenciadora
Mediador: complejo esencial en la transcripción, para la acción de un potenciador o de un silenciador, compuesto
por más de 30 proteínas, se lo puede pensar como un corregulador que está presente en la transcripción de todos los
genes. Su función condensa las interacciones proteicas de aquellos factores específicos de la transcripción que están
unidos a potenciadores o silenciadores, que a su vez éstos están unidos a los correguladores, que por este fenómeno
de acercamiento físico de las secuencias de ADN que contienen los silenciadores y potenciadores con los
promotores. Los mediadores pueden mediar la interacción de los factores específicos de la transcripción con la ARN
polimerasa II. Algunas de esas interacciones van a favorecer, el inicio de la transcripción y otras interacciones no
permitirán el inicio de esta. Serán entonces los factores específicos que se unen a potenciadores los que produzcan
que se inicie la transcripción y contrariamente serán los factores que se unan a represores los que la inhiban.
El mediador entonces la frecuencia con que la ARN polimerasa II inicia la transcripción.
Ciertas proteínas que tienen la capacidad de condensar la cromatina de manera local
Entonces los factores específicos de la transcripción se pueden unir o potenciadores o silenciadores. No pueden
unirse a promotor, sino que le se unen son los factores basales de la transcripción.
¿Que produce esta unión con el factor especifico de la transcripción?
El factor especifico de la transcripción en primer lugar puede reclutar a ese sitio proteínas que participen en la
remodelación de la cromatina, o que sean modificadoras de histonas, el factor de transcripción interactúa con las
proteínas y las atrae a ese punto de unos a otros.
Pueden reclutar, por ejemplo, al complejo remodelador de la cromatina para que elimine de esa zona los
nucleosomas o para que los desplace permitiendo, ahora la unión de los factores basales de la transcripción y la
ARN polimerasa II, también puede reclutar complejos que modifican los extremos N terminales de las cromatinas,
como una acetilasas de histonas, acetilando histonas y favoreciendo la descondensación local y se posicionaran
entonces los factores basales de la transcripción y la ARN polimerasa II.
Por lo cual el punto de inicio de todo este proceso es el posicionamiento de los factores específicos de la
transcripción que van a dirigir la modificación de la cromatina.
También se puede pensar en el ejemplo en el que un factor especifico de la transcripción se une a un represor, y que
esas proteínas recluten complejos remodelares de la cromatina, uniendo los nucleosomas entre sí, o a proteínas
modificadores de histonas que remuevan los grupos acetilos y agreguen grupos metilos.
No hay un factor específico para cada uno de los 30 mil genes existentes en el genoma. No actúan de manera
individual, sino que actúan de manera combinatoria, actúan en conjunto, y es la combinación particular de cada
conjunto lo que lo hace especifico. Una proteína individual, un factor especifico de la transcripción puede ser común
a varios conjuntos de iniciación de transcripción de un gen, pero el conjunto se vuelve específico para cada gen.
Puede regular varios genes, pero con un número limitado de proteínas.
Existen genes que regulan a los factores específicos de la transcripción, llamados Genes Maestros. Son ejemplos, en
embriología los genes HOX!!!!! Son genes que funcionan como factores de específicos de la transcripción.
Como conclusión: en la regulación de la expresión génica, los factores específicos de la transcripción tienen un rol
fundamental, reclutando la maquinaria de la transcripción por medio de mediadores, y correguladores, a su vez los
factores de la transcripción pueden ser regulados, y están activos o inactivos.

Seminario 4 de biología celular por el Dr. Giusti

Regulación de la expresión génica II
Un fenómeno que surge de la regulación de la expresión génica es que haya diferentes tipos celulares que a pesar de
compartir el mismo genoma expresen distinto subconjuntos de genes
Otros niveles de la expresión génica
Los transcriptos que produce la ARN polimerasa II (transcriptos primarios) sufren una serie de cambios que son
importantes para que el transcripto adquiera sus características funcionales finales. Estos procesamientos son
esenciales para que el ARN mensajero pueda ser exportado del núcleo hacia el citosol y para que pueda ser
correctamente traducido
Una vez en el citosol la vida media de los ARN esta finamente regulada
Eventualmente si un ARN mensajero es traducido, las proteínas también están sujetas a una regulación respecto de
su estabilidad y de su actividad

Procesamiento de ARNm eucariota

El transcripto primario producido por la ARN polimerasa va a sufrir modificaciones para permitir la funcionalidad.
3 pasos de procesamiento:
• Modificación en su extremo 5’ (capping). Ocurre apena 20 nucleótidos después de que la ARN polimerasa
comienza a sintetizar el transcripto. Se agrega en este extremo una 7 metilguanosina, se lo denomina cap.
Se une al ARN mensajero un conjunto de proteínas que tiene afinidad por el cap. (complejo de unión del cap.)
Función: evita que el ADN sea degradado por exonucleasas presentes en el exterior celular.
Segundo aspecto que permite la modificación cotranscripcional es el Trasporte del ADN a través de los poros
nucleares
• Modificación en su extremo 3’ (clivaje y poliadenilación). La enzima denominada poliA polimerasa,
agrega 200 nucleótidos de adenina al extremo del ARN mensajero (Cola poliA)
Función: regula fuertemente la estabilidad de los ARN mensajeros, esta estabilidad va a estar mediada por un
conjunto de proteínas que tienen una alta afinidad por la cola de poliA que se denominan poliA valid tropings.
La pérdida de la cola de poliA hace que en segundos el ADN sea degradado por nucleasas extracelulares
Estos procesamientos se dan al mismo tiempo que la ARN polimerasa está generando el transcripto primario
(procesos cotranscripcionales)
• Proceso de splicing o corte y empalme de exones.
Los genes eucariotas son discontinuos, las regiones que van a participar del fenómeno de la traducción se
encuentran interrumpidas por fragmentos de ADN que van a ser removidos por este proceso
Existen en el genoma ciertas secuencias consenso (conjunto de secuencias que tiene un alto grado de homología)
que determinan los límites de los intrones, estas van a ser reconocidas por la maquinaria enzimática que va a
escindir a los intrones y va a empalmar luego a los exones.
Hay 3 secuencias importantes que determinan que la región sea interpretada para este sistema enzimático como un
intrón. Una de ellas se encuentras en el extremo 5’ del intrón (GU). Segunda secuencia consenso, es interna al intrón
y es una adenina particular. Tercera secuencia se encuentra en el extremo 3’ del intrón.
Un error en un único par de bases haría por ejemplo que el transcripto maduro posea un corrimiento en el marco de
lectura, o sea que genere una proteína distinta probablemente no funcional respecto de la codificada originalmente.
Mecanismos del proceso de splicing
De la maquinaria participan grupos de ARN no codificantes llamados ARN pequeños nucleares (snArn). Tienen
entre 100 y 200 pares de bases. Suelen adoptar estructuras secundarias muy diversas, espontáneamente forman
complementariedad de bases internas a una misma hebra formando horquillas. En algunos casos los snARN pueden
formar apareamiento de bases con otros snARN.
Estos funcionan acoplados a un conjunto de proteínas accesorias que van a generar ribonucleoproteína pequeñas
nucleares.
SnaARN + proteínas accesorias = ribonucleoproteínas pequeñas nucleares (snurnp)
Existen 5 snurps:
• Snurps u1

• Snurps u2
• Snurps U4
• Snurps U5
• Snurps U6
La actividad catalítica enzimática es producida por el mismo ARN. Estos pueden reconocer por apareamiento de
bases los nucleótidos de las secuencias consenso que determinaban los límites de los intrones.
¿Cómo se produce este mecanismo?
Las snurps se unen a las secuencias consenso y forman un complejo de snurps conocido como el espliceosoma.
Las snurps pueden reconocerse entre sí debido a que los snARN pueden formar apareamiento de bases entre ellos.
Estos movimientos se van a caracterizar por dos reacciones de corte y formación de enlaces covalentes
(transesterificación)
El primer corte que se produce es en el sitio 5’ que va a clivarse y va a unirse covalentemente a la adenina
característica del punto de ramificación formando una estructura en el intrón similar a un lazo.
La 2º de las reacciones implica la ruptura de extremo 3’ y la unión covalente de los dos exones con precisión de un
nucleótido.
De este modo como subproducto de la reacción del splicing queda en intrón en forma de lazo que rápidamente va a
ser degradado por un conjunto de exonucleasas específicas.
Complejo proteico denominado complejo de unión de exones: se unen en el sitio donde fue producido el splicing
La precisión con la que se realiza el splicing no solo estará garantizada por los apareamientos de los ARN pequeños
con las secuencias consenso de los intrones, sino que otro elemento que favorece la precisión es este fenómeno de
splicing cotranscripcional.
permite aumentar la capacidad codificante del genoma.
Procesamiento por splicing alternativo diferencial: salteo de exones. Un exón va a estar presente como tal y va a
estar ausente en otros tipos celulares. En esos otros tipos celulares la maquinaria de splicing interpreto toda la
secuencia como intrones y la removió.
Otra forma de splicing alternativo implica que los sitios consenso que se encontraban en el extremo 5’ y 3’ no sean
utilizados, pero sean utilizados sitios muy parecidos que se encuentren en la proximidad.
Los mecanismos que existen para explicar este proceso son un conjunto de proteínas que están presentes en distintos
tipos celulares y pueden interactuar con los sitios consenso y están diferencialmente expresadas. Hacen que los
sitios consensos muy débiles que no pueden reclutar proteínas por si mismos puedan luego de esa unión reclutarlas
con mayor facilidad, en otras palabras, permitir que una secuencia sea removida cuando en ausencia de esa proteína
permanecería en el transcripto maduro. Esto puede explicar porque en un determinado gen se produce un transcripto
y en otro determinado gen un transcripto diferente.
Hay una secuencia de nucleótidos bastante larga presente entre el extremo 5’ y el codón de iniciación presente en los
mensajeros, estos no van a ser traducidos, se conoce como “extremo 5’ no traducido de los mensajeros”
Todos los nucleótidos presentes luego de codón stop, pero anteriores a la cola poliA presentes en el extremo 3’
tampoco se traducen
Ambos tienen un roll fundamental en regular la estabilidad de los mensajeros (no van a participar en la codificación
de aminoácidos en las proteínas) pero adquieren información regulatoria respecto de la vida media que van a
adquirir los mensajeros.
Todos los ARN adoptan estructura secundaria y están asociados a un enorme número de proteínas que aseguran su
estabilidad y su exportación al citosol.
TRADUCCION
Una vez en el citosol el ARN mensajero maduro va a interactuar con algunos complejos proteicos muy importantes
para su destino que son; los factores iniciadores de la traducción (EIF), que van a permitir el inicio de la traducción.
Una de estas proteínas va a interactuar directamente con el complejo de proteínas del Cap. (lo reemplazara), en tanto
que el otro complejo va a interactuar con las proteínas de unión a la cola de poliA, y además van a interactuar entre
si generando una estructura cerrada sobre sí misma.
Solo en esta configuración, donde los dos factores de inicio de la traducción se reconocen entre sí, el transcripto
maduro puede comenzar a ser reconocido por los ribosomas para iniciar la traducción.
Esto asegura que transcriptos que han sido correctamente exportados (que conserven sus 2 extremos) puedan ser
correctamente traducidos.
Esta traducción va a comenzar con el transcripto maduro cerrado sobre sí mismo siendo reconocido su extremo
5‘por la subunidad menor de un ribosoma y va a moverse a lo largo del transcripto hasta llegar el primer codón de
inicio de la traducción.
Cada uno de los mensajeros configurados de esta manera pude ser traducido múltiples veces por los ribosomas
generando en la célula polirribosomas o polisomas. La estructura de estos puede ser evidenciada en imágenes de
microscopia electrónica.
Un transcripto puede tener distintas estabilidades en distintos tipos celulares y por ende general distintas cantidades
del producto.
Bajo ciertas convicciones las células pueden estabilizar ciertos mensajeros y mandar a degradación a otros. Tienen
como característica central ser muy rápidas gracias a estar reguladas por estos mecanismos de la expresión génica.
Usualmente esta regulación de la vida media está dada por secuencias que están presentes en el extremo 3’ no
traducido de los mensajeros, y esas secuencias pueden ser reconocidas por un conjunto de proteínas que pueden
favorecer o desfavorecer la estabilidad de dicho mensajero.
Otro mecanismo de la estabilidad de los mensajeros esta mediado por una familia distinta de ARN no codificantes
(microARN) tienen alrededor de 20 nucleótidos, están codificados por el genoma y son procesados para generar sus
formas maduras, pero representan un mecanismo de acción.
¿Cómo funcionan los microarn? (reguladores negativos)
Suelen unirse a un efector formado por proteínas y actúan guiando al complejo efector por complementariedad de
bases a la secuencia de un determinado mensajero.
una vez que el complejo efector se posiciona sobre un transcripto en particular induce una represión de la
traducción, el desacople de los ribosomas y también induce la degradación del mensajero.
Estos microarn que pueden producir la regulación fina de estos transcriptos son transcriptos por la ARN polimerasa
II. Sufren dos grandes pasos de procesamiento hasta que adquieren su tamaño final y son ensamblados al citosol en
el complejo de silenciamiento.
Mecanismo de control de calidad de los ARN: degradación del ARNm por secuencias de terminación
prematuras (nnd)
Controlar que no haya habido algún error en el procesamiento que afecte la funcionalidad del producto final
Una mutación que genera un codón STOP recibe el nombre de una mutación sin sentido.
lo que va a verificar este mecanismo es que esté presente o no el codón stop, aquellas proteínas que lo tengan van a
ser activamente degradadas
Van a cumplir un roll importante los complejos proteicos de unión de exones, que indicaban los puntos de unión
entre dos exones.
Como funciona: en la primera traducción de este complejo maduro (traducción pionera) los ribosomas van a
interactuar por primera vez con estos complejos y los van a modificar o remover. Cuando son removidos o
modificados no disminuyen la estabilidad del mensajero.
¿qué pasa en la condición patológica?
Donde tenemos una mutación que hay generado además del codón de stop un codón stop prematuro.
El ribosoma una vez que llega al prematuro se va a desensamblar y va a dejar sin traducir el resto del ARNm y por
lo tanto no va a remover ni codificar los complejos de unión de exones posteriores al codón stop prematuro, estos
reclutan endonucleasas que rápidamente degradan el ARN.
es decir que si luego de la traducción pionera no se modifican o remueven, eso va a ser la señal celular para
determinar que debe haber degradación.
¡¡¡NIVEL FINAL DE LA REGULACION DE LA EXPRESION GENICA!!!
El hecho de que exista producción de una proteína no es igual a que exista actividad, y la regulación de que fracción
de esa proteína es activa o no activa en un momento dado puede producirse en un rango temporal muy acotado.
La fosforilación es una modificación que puede cambiar la actividad de la célula en cuestión de segundos.
¿Cómo se produce la degradación de las proteínas?
se produce a través de un sistema enzimático que se conoce como la vía ubiquitina proteosoma.
la ubiquitina es un pequeño péptido que se une covalentemente y conjuga a ciertos sustratos proteicos y constituirse
en una marca celular de degradación. Las enzimas que participan en el reconocimiento y el agregado de ubiquitinas
al sustrato se conocen con el nombre de ubiquitín ligasas.
Esta degradación final se da en unos complejos proteicos denominados proteosomas que reconoce las proteínas
poliubiquitinadas y las degrada activamente
Transcriptos que producen la formación de los ARNt y ARNr
ARNt: están codificados en el genoma. Los transcriptos primarios son más largos en comparación con los
transcriptos maduros que van a ser funcionales.
4 pasos de procesamiento que ocurren en el nucléolo que implican
• la remoción del clivaje por acción de ciertas enzimas en el extremo 5’.

• la escisión de una región intrónica cercana a la secuencia que luego va a funcionar como anticodón.
• la remoción de ciertos nucleótidos en el extremo 3’.
• la modificación química de algunas bases.
Todos estos pasos están llevados a cabo por enzimas proteicas que están localizadas en el nucléolo (es una zona
bioquímicamente delimitada dentro del núcleo).
ARNr: los ribosomas están constituidos por una subunidad mayor (60s) y una menor (40s). Cada una de estas
subunidades son enormes ribonucleoproteínas.
La mayor compuesta por 3 ARNr de distinto tamaño (5s, 28s, 5.8s respectivamente) y por casi 50 proteínas
La pequeña: un único ARNr de 18s y poco más de 30 proteínas.
La actividad peptidiltransferasa esta llevada a cabo por un sector de ARNr
¿Cómo se producen los ARNr?
Son los más abundantes de todas las células por la enorme cantidad de ribosomas y son activamente transcriptos. Se
transcriben a partir de 2 precursores, el más grande 45s que en el nucléolo son modificadas químicamente alguna de
sus bases, en tanto que otros fragmentos de este precursor son clivados y degradados. Este precursor 45s se
transcribe a partir de genes que son transcriptos por la ARN polimerasa I. esto es llevado a cabo por un conjunto de
ribonucleoproteínas, que están formadas por un péptido asociado a ARN pequeños nucleolares, y por lo tanto son
ribonucleoproteínas pequeñas nucleares.
Función: modificar químicamente algunas secuencias del precursor y favorecer en algunos casos el corte de
secuencias que no van a estar representadas en las formas maduras.
Se producen cambios químicos que permiten que esto adopten una forma tridimensional necesaria para que ejerzan
su función correctamente en el interior del ribosoma.
El otro precursor, mucho más pequeño codifica directamente para el ARN 5s.
Entonces de los 4 ARNr, 3 derivan del precursor 45s transcriptos por la ARN polimerasa I, y el 4to deriva de un
único transcripto de la ARN polimerasa III.

Un mecanismo que ha permitido compensar el enorme trabajo de las células se ha dado por un fenómeno de
amplificación génica en donde los genes que codifican para los ARNr se han multiplicado dentro de nuestro genoma
generando múltiples copias de los mismos.
Tienen una localización particular, en los brazos pequeños de los cromosomas acrocéntricos.
cuando la cromatina se encuentra descondensada todas estas zonas que poseen las copias interactúan entre sí y se
localizan en una misma región nuclear (el nucléolo).
Podemos pensar al nucléolo como una estructura que tiene una alta actividad bioquímica de procesamiento de ARN
y de generación de ribonucleoproteínas

Seminario de biología n°5 de Giusti

Técnicas
Las técnicas permites saltos conceptuales, ya que permite a las ciencias biológicas, desarrolle metodologías nuevas
y permite nuevos métodos de medicina, y de investigación.
• Técnica de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia pensada como una única técnica por sus
fundamentos,
• la técnica de fraccionamiento subcelular,

• la técnica de western-blot y
• la técnica RT-QPCR que es PCR cuantitativa con retro transcripción.
Objetivo de las técnicas:
• Cuantificar la expresión de proteínas o ARN
• Niveles de expresión en diferentes tejidos

• Determinación su localización
• Si se expresan homogéneamente o no

Para entender esta técnica vamos a hacer algunos pasos previos dado que, necesitamos comprender para entender el
fundamento de estas técnicas como se utilizan los anticuerpos como herramientas de investigación.
Estos anticuerpos también llamados, inmunoglobulinas son proteínas producidas específicamente por un subgrupo
de células del sistema inmune, que participan en un proceso inmunitario conocido como, inmunidad tumoral,
inmunidad mediada por anticuerpos o respuesta inmunitaria adaptativa.
En esta respuesta inmune un grupo de células del sistema inmune los linfocitos B, poseen en su membrana proteínas
denominadas inmunoglobulinas o anticuerpos. Que pueden unirse de manera específica a ciertas macromoléculas
que, pueden estar presentes en bacterias o toxinas, derivadas de bacterias y, este reconocimiento especifico se
produce porque nuestro sistema inmune a lo largo de su maduración ontogenética genera millones de clones
diferentes de linfocitos B que, difieren los unos de los otros levemente en cuál es el motivo que reconocen la
superficie molecular de sus anticuerpos de superficie y en función a esa maduración prácticamente cualquier
macromolécula exógena que ingrese a nuestro organismo será reconocida por un subgrupo particular de linfocitos B
que tenga anticuerpos que puedan unirse específicamente a esa macromolécula extraña que ingreso.
el proceso por el cual se crea esta enorme diversidad de clones depende de un proceso genético denominado
recombinación somática
Pero lo que nos interesa aquí es que una vez que un linfocito B ha reconocido a una proteína exógena por ejemplo,
que forma parte de la pared bacteriana de un patógeno, se diferencia y comienza a proliferar y a producir
plasmocitos que no son otra cosa que una diferenciación de linfocitos B especializados en secretar hacia el plasma
aquellas moléculas del anticuerpo que antes solo estaban localizadas en su membrana y estos anticuerpos ahora
solubles cuando reconocen a los patógenos facilitan su eliminación por otras células del sistema inmune.
Los anticuerpos o inmunoglobulinas, al tener esta capacidad de reconocer antígenos pueden ser utilizados como una
herramienta de investigación, de nuestro interés clínico
¿Como genero un anticuerpo para estudiar una proteína?
Los anticuerpos o inmunoglobulinas están compuestos por 4 cadenas polipeptídicas,
• 2 cadenas pesadas, internas
• 2 cadenas livianas, externas
Nota: ambas se componen de regiones C-terminales constantes y de regiones N-terminales variables.
Todos los anticuerpos producidos por un individuo son exactamente idénticos en la región inferior, donde están solo
las 2 cadenas largas o pesadas, y a esa región se la denomina fracción cristalizable o región FC de la
inmunoglobulina.
La región que es variable de un clon de linfocito B a otro y que permite este reconocimiento especifico, se halla en
los otros extremos de la molécula. En aquellos extremos que están compuestos por el extremo que N-terminal de la
cadena pesada y de la cadena liviana, esta región denominada Región variable es la región que va a permitir el
reconocimiento de esa proteína exógeno que, denominaremos antígeno, algo es un antígeno cuando tiene la
propiedad de antígeno cuando puede ser reconocido por un anticuerpo.
La forma de una inmunoglobulina, se la representa como una Y. Los 2 extremos entonces, es el lugar donde
reconoce a los antígenos

Volvamos a nuestra pregunta: “Como es posible generar anticuerpos que reconozcan específicamente a una
proteína?”
El proceso de generación de anticuerpos involucra utilizar el sistema inmune mamíferos que produzcan anticuerpos
una vez que inyectamos a ese animal con la proteína contra la cual queremos producir ese anticuerpo,
tradicionalmente se usaban conejos y ratones, también aves y gallinas.
Se inyecta una proteína que queremos estudiar, entonces reconocerá el sistema inmune a esa proteína de modo que
habrá algunos clones de linfocitos B espontáneamente en el sistema inmune del animal que reconocerán
específicamente a la proteína de interés y comenzaran a proliferar y a generar una diversidad de anticuerpos que
permitan reconocer distintos motivos estructurales que están presentes en la proteína de interés que luego van ser
purificados a partir del plasma de este animal y generar un plasma rico en esos anticuerpos que reconocen a esas
proteínas de interés.
Aspectos importantes:
• No es solo un clon que reconocen a la proteína de interés
• Esa proteína de interés contenga distintos sitios estructurales, cada uno de ellos pueden ser reconocidos por
distintos clones de linfocitos B.

Hemos mencionado que no hay probablemente un único clon de linfocitos B que posea anticuerpos que reconozcan
a la proteína que nosotros hemos inyectado sino que esa proteína de interés probablemente tenga distintos sitios
estructurales cada uno de ellos reconocido por distintos linfocitos B y esta particularidad de que una proteína tenga
distintas superficies que puedan sr reconocidas por distintos clones de linfocitos B y por ende generarse una
diversidad de anticuerpos que reconozcan distintos sectores de esta proteína denominamos a estos anticuerpos que
hemos purificado como ANTICUERPOS POLICLONALES porque provienen originalmente de distintos clones de
linfocitos B, cada uno de ellos reconociendo una superficie diferente de la misma proteína.
A cada una de las superficies diferentes de la proteína que fue reconocida por un anticuerpo la denominamos
EPITOPES. Una proteína tendrá distintos epítopos que pueden ser reconocidos por distintos clones de linfocitos B
de determinado animal y si yo utilizo este método de producción tendré una solución de anticuerpos policlonales,
todos reconocen la misma proteína, pero distintos motivos estructurales de la misma proteína.
Sin embargo, también es posible generar anticuerpos que sean monoclonales es decir que reconozcan un único
epítope de la proteína de interés y la generación de anticuerpos policlonales.
Desde el punto de vista técnico es más costoso porque involucra en un primer paso aislar un único clon de linfocitos
B de un animal que fue inmunizado con la proteína de interés y una vez que uno aísla ese único clon debe hacer que
ese clon se multiplique para generar ese único tipo de anticuerpos producido por ese clon y esto es dificultoso desde
el punto de vista técnico porque las células diferenciadas productoras de anticuerpos, los plasmocitos, suelen tener
un número limitado de divisiones celulares antes de entrar en apoptosis, es decir, si yo aíslo un clon de linfocitos B
y simplemente lo dejo en condiciones de cultivo para que produzca anticuerpos producirá, una pequeña cantidad
antes de que todas las células mueran en el cultivo y la técnica que permitió dar un salto y generar anticuerpos
monoclonales se desarrolló a fines de los años 70.
Dado que faltaban células productoras de anticuerpos, le faltaba un potencial mitótico, se diseñó un experimento
para fusionar a las células productoras de anticuerpos con células tumorales, con células que tienen una capacidad
ilimitada de reproducción debido a las mutaciones que poseen en los genes que regulan el ciclo celular y la fusión
experimental de células tumorales y células formadoras de anticuerpos genera lo que conocemos como
HIBRIDOMAS. Es un hibrido celular producto de la fusión de una célula tumoral y de una célula productora de
anticuerpos.
Los hibridomas heredan de las células productoras de anticuerpos esta capacidad para generar anticuerpos
específicos y heredan de las células tumorales su amplio potencial mitótico de modo tal que uno puede conservar a
los hibridomas en condiciones de cultivo por tiempos muy extensos y, cosechar cada tanto del sobrenadante del
medio de cultivo los anticuerpos que están siendo generados que serán anticuerpos, que reconocen un único epítope
de la superficie proteica. Este proceso de formación de anticuerpos monoclonales tuvo un impacto gigantesco en la
clínica y en la investigación por las enormes adscripciones que hoy le damos a los anticuerpos.
Los que desarrollaron esta técnica, y entre ellos estaba un argentino que recibió el premio Nobel, Milstein.
Hoy en día, no hace falta generar cada anticuerpo, sino que existen compañías que venden estos anticuerpos de las
diferentes proteínas que uno quiera investigar. Se consiguen anticuerpo tanto monoclonales como policlonales.

Técnica de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia

Esta técnica utiliza anticuerpo, y toda técnica que tenga el prefijo Inmuno, utilizara anticuerpos.
Se usa para determinar la localización de determinadas proteínas en un tejido o en una fracción subcelular. y pueden
aplicarse dos variantes:
• la inmunofluorescencia o inmunohistoquímica directa
• la inmunofluorescencia o inmunohistoquímica indirecta
La técnica más aplicada y la más frecuente la inmunofluorescencia indirecta.
El fundamento:
• utilizar anticuerpos que reconozcan una proteína de interés.
pero para hacer observable ese reconocimiento para poder identificar en qué lugar del tejido o en qué lugar de esa
célula, se ha unido el anticuerpo se le une a la fracción cristalizable del anticuerpo, moléculas de fluoroforos, es
decir, moléculas que al ser iluminadas con una determinada longitud de onda pueden emitir fluorescencia. De modo
tal que, si uno observa con un microscopio de fluorescencia a los cortes histológicos a las células de cultivo sobre
las cuales se aplicó el anticuerpo podrá ver puntos de señales fluorescentes en aquellos lugares en donde el
anticuerpo están unido a mi proteína de interés.
Cuando utilizo fluoroforo, la técnica se llama inmunofluorescencia.
Si en la fracción cristalizable en vez de fluoroforos colocamos una enzima capaz de generar un producto coloreado
cuando nosotros le agregamos el sustrato esa variante en la técnica la denominamos Inmunohistoquímica, es decir,
la detección estará dada porque unimos al anticuerpo un fluoroforo, o porque agregamos una enzima capaz de
generar un producto coloreado una vez que agregamos el sustrato

• La inmunohistoquímica/ inmunofluorescencia directa

El fluoroforo estará directamente unida a la Fracción Cristalizable del anticuerpo que reconoce la proteína de
interés. A ese anticuerpo lo llamamos, Anticuerpo Primario y es aquel que reconoce a la proteína de interés.
• La inmunohistoquímica/ inmunofluorescencia
Cuando aplicamos la técnica indirecta utilizamos dos clases de anticuerpos:
• Un anticuerpo primario
• Un anticuerpo secundario
El anticuerpo primario, que reconoce nuestra proteína de interés, el anticuerpo primario. Pero en este caso ese
anticuerpo primario no tiene en sí mismo conjugado ni el fluoroforo ni la enzima.
Sino que, utilizaremos un segundo tipo de anticuerpo denominado, anticuerpo secundario que reconoce la fracción
cristalizable del anticuerpo primario que, como son anticuerpos producidos por la misma especie estos anticuerpos
secundarios son simplemente anticuerpos específicos de la especie que reconocen esa fracción.
Es decir, habrá anticuerpos secundarios que reconozcan la fracción cristalizable de anticuerpos primarios
producidos en ratones, habrá otros anticuerpos secundarios que reconozcan la fracción cristalizable de anticuerpos
producidos en conejos, etc.
En esta configuración es el anticuerpo secundario quien tiene unidas de manera directa tanto los fluoroforos como
las enzimas que producen el producto coloreado y, la diferencia fundamentalmente es que, a un único anticuerpo
primario se unen varios anticuerpos secundarios y esto, implicara que, por cada proteína de interés, tendré asociados
muchos más fluoroforos que en el caso de la fluorescencia directa. Por cada proteína de interés hay más fluoroforos.
Los anticuerpos secundarios son policlonales, ya que se adhieren a diferentes partes de la Fc del anticuerpo
primario.
Nos da mayor sensibilidad, por eso se usa con mucha más frecuencia.

Descripción de una imagen: imagen de una célula, que tiene 2 anticuerpos que reconocen 2 antígenos diferentes de
interés; una era la actina, proteína principal del citoesqueleto, y otro para el citocromo oxidasa 4, proteína que
forma parte de la cadena de transporte de electrones mitocondrial, de localización de las mitocondrias. Se pueden
combinar distintos colores para detectar en simultaneo 2 antígenos de interés. Si el anticuerpo que se une a la
actina fue hecho en ratón, el anticuerpo secundario, reconocerá la Fc de ratón y tendrá unido un fluoroforo rojo,
que emita con fluorescencia color rojo. Si en cambio, al antígeno primario que se une al citocromo, fue hecho en
conejo, el anticuerpo secundario se unirá a la Fc contra conejo, unido con un fluoroforo de color verde. Podre así,
distinguir la localización de la actina que forma el citoesqueleto, y también donde están posicionadas las
mitocondrias, utilizando a la enzima como un marcador. Si se quiere visualizar al núcleo de una célula, se utiliza un
producto diferente, se usa un colorante DAPI, que se intercala en la bases del ADN y emite fluorescencia de color
azul.

En biopsias de tumores se utilizan técnicas de inmunohistoquímicas, que nos hablan de la agresividad de ese tumor,
caracterizado por el potencial mitótico, es importante saber cuántas células son mitóticamente activas. Cuantas
mayor sea el número de células mitóticamente activas, mayor será la agresividad de ese tumor. Esto determina el
pronóstico del paciente y así redirigir la terapia oncológica, por ejemplo.

Inmunohistoquímica
Como se usa para determina la expresión de una determinada proteína de interés en un subconjunto de células en un
tejido.
La proteína de interés es, en este ejemplo, Ki-67 que es un proteína que esta expresada en la fase S del ciclo celular
exclusivamente. Aquellas que sean visualizadas, significara que se encuentra en la fase S, y que son mitóticamente
activas, o sea que van a dividirse.
Descripción de una imagen: aquí estamos viendo el tejido, cada pequeño sector es una célula y se ven miles de
células en este tejido. Hay algunas de las células con una coloración pálida, es decir un violeta claro, y otras de
color marrón oscuro casi negro. Las células de coloración marrón son las que son positivas para la proteína de
interés. Los de color violeta, tienen una coloración de que tiñen sus núcleos.

¿Cuál es la diferencia que podemos observar entre la inmunohistoquímica y la inmunofluorescencia?

Es que el anticuerpo secundario que se une al anticuerpo primario, que a su vez reconoce Ki-67 no está asociado a
un fluoroforo, sino a una enzima que, al colocar un sustrato incoloro, que produce un producto coloreado que
precipita en el interior de las células. Entonces este color marrón que tiene la célula se debe a la precipitación del
producto de reacción de la enzima del anticuerpo secundario.
¿Como determinarían el índice mitótico de una biopsia de un tumor?
Por ejemplo, contando la cantidad de células de color marrón.

¿Y si tomamos una muestra más grande?

Podría por cantidad de células coloreadas/ células totales
También podría ser células coloreadas/una superficie dada.

Fraccionamiento subcelular
Esta técnica permite purificar/aislar distintos componentes celulares y tenerlos en tubos distintos para poder
analizarlos.
Fueron desarrollaron entre los años ´40- ´50, y permitieron un gran avance en la biología celular.
Esta técnica se usa en el contexto de la investigación y en caso muy particulares en el contexto clínico.
Si uno toma una muestra de tejido, y realiza una ruptura mecánica, como por ejemplo con unas cuchillas que giran a
altísima velocidad en una centrifuga, una especie de minipimer en miniatura, uno puede generar una solución, una
suspensión de ese tejido en un medio isotónico. En esa suspensión, se generará una suspensión llamada
Homogenato. Tendríamos componente de diferentes tamaños, núcleo, mitocondrias, ribosomas, el sector soluble: el
citosol, y un tipo de partícula, llamada microsoma, no es una organela propia de la célula, derivan de pequeñas
vesículas del retículo endoplásmico y del aparato del Golgi. Al romperse mecánicamente estas organelas se forman
pequeñas vesículas.
Esta técnica también puede utilizar otros métodos de ruptura mecánica, como por ejemplo sonidación, compresión,
pero todos obtendrán un homogenato en una solución isotónica.
La estrategia de la técnica esta, en la centrifugación ya que va a permitir que precipiten la fondo del tubo, cosa que
no ocurre de manera espontánea. Al aplicar la centrifugación, le permite por medio de la aceleración, es que
aumente la fuerza gravitatoria. Cuanto mayor es la densidad más fácil caerá al aplicar la fuerza gravitatoria.
Entonces se realizará una serie de centrifugaciones cada vez más veloces y por cada vez más tiempo, para que vaya
secuencialmente depositándose en el fondo del tubo, los distintos componentes presentes en la célula. En las
primeras centrifugaciones precipitara los elementos mayor tamaño y más densos, y en las centrifugaciones
siguientes, precipitaran los que tengan menor tamaño y menor densidad.
En cada una de estas centrifugaciones, uno obtiene 2 partes del homogenato:
• Aquellos elementos que precipitaron, llamado pelet
• Y la suspensión, llamado sobrenadante.
Uno parte de centrifugaciones relativamente bajas. A mil veces por 10minutos. Y obtengo un pelet, que analizare
después y con un sobrenadante. Separo el sobrenadante con una pipeta a otro tubo y lo vuelvo a someter a una
nueva centrifugación y otra vez tendré un pelet con un sobrenadante.
Este es el orden en que voy obteniendo los diferentes elementos celulares por medio de centrifugaciones, cada vez a
mayor velocidad y por mayor tiempo.
• Núcleo
• Mitocondrias (peroxisomas y lisosomas, menos frecuentes)
• Microsomas (Retículo endoplásmico, Golgi, Membrana plasmática)
• Ribosomas
• Citosol
Como se evalúa la efectividad del procedimiento de enriquecimiento/pureza de las fracciones subcelulares?
Se elige una enzima especifica que conozca y que tenga una localización subcelular particular, por ejemplo, la
citocromo oxidasa 4 era especifica de las mitocondrias. Si agrego producto de esta enzima en las diferentes
fracciones solo debería actuar en la fracción mitocondrial, dando un producto coloreado, si es que ha funcionado de
manera correcta la centrifugación.
La determinación de una enzima puede ser, o bien por aparición de producto, o bien por desaparición de sustratos.
Estas determinaciones se hacen para ver si no hay contaminación y si el fraccionamiento subcelular fue realizado
correctamente, por ejemplo, si hago la prueba de la enzima citocromo oxidasa con el pelet nuclear y observo una
reacción, diré que hay contaminación de mitocondrias y por ende no fue realizado correctamente.
También pueden observarse estos pelet, en microscopia electrónica y determinar cuáles son las partículas que
estaban presentes.
Descripción de una imagen: Pelet microsomal: ¿notan que hay vesículas que contienen gránulos en la membrana?
Son las vesículas que corresponden al REG, y esos gránulos serán los ribosomas que están presentes y las que no
poseen esos gránulos, serán seguramente los que provienen del REL.

Aplicación experimental: por ejemplo, si uno está estudiando una enfermedad de una disfuncionalidad mitocondrial,
uno podría partir de fracciones subcelulares y determina como esa funcionalidad.
Western blot o inmunoblot
Otra técnica que utilizara anticuerpos para determinar la presencia o los niveles de expresión de una proteína
particular con un anticuerpo especifico. Sin embargo, esta técnica tiene otros elementos.
• 1ra etapa: todas las proteínas van a ser separadas de acuerdo con su tamaño. Y eso se logra realizando una
electroforesis en gel.
 • Electroforesis en gel: utiliza la presencia de un campo eléctrico para permitir la migración de ciertas
moléculas, implica que las única que podrá migrar serán aquellas que tengan una carga electica neta. Osea
las que tengan cargas o bien positivas migrando hacia el polo negativo o bien negativas migrando al polo
positivo, aquellas que tengan carga neutra no podrá migrar.
Lo que primero se hace es tratar a la muestra biológica con un detergente carga eléctrica negativa, llamado SDS,
pude unirse a todas las cadenas polipeptídicas. Tratando a una muestra biológica, como un homogenato o alguna
fracción subcelular, con SDS hará que todas sus proteínas se desnaturalicen, pierdan su estructura terciaria y queden
recubiertas con las moléculas de SDS, es decir que queden rodeadas de cargas negativas. Y esto las hará apropiadas
para que puedan migran hacia el polo positivo.
La migración se da en un soporte, un gel de poliacrilamida. Los geles mirados en un microscopio y están formados
por una enorme cantidad de fibras, parecido a una red de telaraña y esas redes son los componentes de ese gel. Esto
implica las moléculas que van a migran en el gel, deben atravesar pequeños poros formados por estas tramas
formadas por el gel, y esto le impondrá una dificultad mayor para migrar, por esa red porosa, a las moléculas que
sean más grandes porque chocarán más veces con los filamentos del gel, en tanto que las moléculas más pequeñas
tendrán facilitada el pasaje y podrán migrar en determinado tiempo una mayor distancia en el gel. Por ende, las
moléculas más pequeñas migran más rápido, en un determinado tiempo que las de mayor tamaño.

• 2da etapa: no trabajar las moléculas en el gel, ya que el gel es muy frágil.

• Se transfiere, en ese orden, a una membrana más resistente. Esto es lo que le da el nombre de “Blot”, que en
ingles significa transferir. Determinar la presencia o ausencia de la proteína de interés, incubando a esa
membrana con anticuerpos específicos que permitan unirse a mi proteína de interés.
• Utilizando la técnica indirecta, un Anticuerpo 1rio que se una a la proteína de interés y después de lavados
para remover los anticuerpos en excesos y quedando pegado el anticuerpo a la proteína de interés. Se le
agrega el anticuerpo 2rio pegado con una enzima y agregando un sustrato, de o un producto coloreado, que
es lo más frecuente, o una luz y esto se detecta con una cámara o placas fotográficas.

Ejemplos 1: cual es la localización subcelular de la enzima aromatasa?

Uno puede partir de un ovario, de un animal de experimentación, y realiza un fraccionamiento subcelular, donde
uno obtiene el homogenato y a partir de centrifugaciones diferenciales las diferentes fracciones subcelulares. Pero
me reserve para de ese homogenato, no lo use todo en las diferentes fracciones.
Como determinamos donde se encuentra? Se puede hacer un Western blot de cada una de estas fracciones?
Imaginemos que si lo realizamos.
Resultado: las bandas que aparecen se deben a un marcador de peso molecular
• 1er calle: el homogenato, se encuentra marca en el homogenato, ya que es el tejido completo. Se deduce que
la aromatasa está presente. O sea, el tejido ovárico está presente la enzima, si no estuviera presente, entonces
tendría que buscar otro tejido que si expresara la aromatasa.
• 2da calle: la fracción citosólica, no hay señal. Significa que no está la aromatasa no es una enzima soluble
del citosol.
• 3er calle: la fracción microsomal, una gran señal, pero es de mayor intensidad que el homogenato. Se debe a
que está más concentrado en la fracción microsomal. Al tomar la misma cantidad de muestra. La aromatasa
se encuentra en el REL.
También podemos saber su PM, alrededor de 50 kDa. Puede haber distintas aromatasas de distintos pesos
moleculares.

Ejemplo 2: biopsias de 4 tumores de mama de diferentes pacientes.

Se quiere determinar si está presente una proteína de membrana la E-cadherina, es una proteína que permite la unión
célula-célula y la “E”, es porque se expresan específicamente en tejido epitelial.
¿Por qué es importante en biopsias de tumores, la presencia de marcadores de E-cadherinas? Porque es un indicio de
la agresividad del tumor. Y tienen la capacidad de hacer metástasis cuando pierden la expresión de E-cadherinas, ya
que les permite perder la adhesión, las células tumorales de las células circundantes y poder infiltrarse en los vasos
sanguíneos. La pérdida de la expresión de la E-cadherina, es un mal pronóstico, o de un mayor pronóstico de
realizar metástasis.
Para cuantificar la cantidad de expresión de esa proteína, se usa esta técnica de Western Blot. Se realiza entonces un
fraccionamiento subcelular, obteniendo un homogenato y corriendo esos homogenatos.
Resultados:
• Calle A:
• Calle B:
• Calle C:
• Calle D: hay ausencia de la expresión de la proteína. Tiene mayor proporción de realizar metástasis.
Comparando la intensidad de las diferentes calles y teniendo en cuenta que, a cuanta mayor intensidad, menos
probabilidad de realizar metástasis, eso implicará que la ausencia de la expresión tendrá más probabilidades de
realizar metástasis.
Entonces, en la calle D que hay ausencia seria el peor caso, le sigue el C, con una clara disminución de la intensidad
de la marca.
La intensidad de la marca supone que se extrajo de una misma “cantidad” de tumor, y lo que da una mayor
intensidad de marca no es en realidad que el tumor era más grande. Sino que se parte en los 4 casos con un tumor
del mismo tamaño
Se puede realizar 2 tipos de controles para saber si se parte de la misma cantidad de muestra: uno es haciendo una
cuantificación de una proteína, por un medio analítico y realizar luego el western blot. Otro es realizar un western
blot de una proteína estructura, por ejemplo, de la proteína actina, y luego realizar el western blot de la proteína de
interés.

Una limitación de las técnicas vistas se debe a que no tengamos buenos anticuerpos que reconozco la proteínas de
interés, no siempre tenemos un anticuerpo que sea especifico y sensible para la proteína que estamos estudiando. Un
anticuerpo puede reconocer un epítope de la proteína de interés, pero puede ser común a otras proteínas, por lo que
no será tan especifico. Pero también puede ser que un anticuerpo que sea especifico a una proteína, pero al ser
revelado de no de una marca, por lo que no será sensible a la proteína de interés.

RT-qPCR: PCR cuantitativa con retrotranscripción.

Es la única técnica que permite cuantificar moléculas de ARN. Se puede cuantificar transcriptos virales por medio
esta técnica, como carga viral del HIV, o cuantificar la cantidad de una proteína que se exprese más o menos en
comparación con una célula hepática o una célula nerviosa.
Con la técnica de PCR permitía amplificar múltiples copias de ADN. Se usa una ADN pol Taq (termoestable, solo
puede polimerizar ADN)
Pero esta técnica mide la cantidad de ARN, entonces debemos realizar un paso previo.
• Etapa 1: retrotranscripción.
Se realiza este paso, ya que la ADN pol no puede polimerizar ARN.
Se extrae todo el ARN total, se incuba una enzima retrotranscriptasas, que usan ARN como molde para generar
ADN. Son retrotranscriptasas a partir de virus.
El ADN que se obtiene es C-ADN; ADN complementario porque puede ser complementario al ARN original. Es
una copia de ADN doble cadena de un transcripto, como por ejemplo de un ARNm. Difieren en que en el sitio que
había un Uracilo, habrá ahora una Timina.

• Etapa 2: PCR cuantitativa

Solo amplifica el ADN complementario, que refleja al transcripto de interés que yo quería analizar.
De manera análoga al PCR, donde a pesar de tener todo el ADN solo amplificaba una secuencia específica, aquí
analizaremos los transcriptos primarios que sean de nuestro interés, seleccionando cuales son los primers que van a
utilizarse en esta técnica. De acuerdo con el diseño de los primers, si logro diseñar los primers de modo tal que
tengan complementariedad de secuencias del transcripto que estoy buscando, solo amplificare de todos los
transcripto, solo aquellos que sean del transcripto de interés. El diseño de los primers es lo que le da la especificidad
a la técnica.
Entonces se realiza una amplificación de estos ADN complementarios o transcriptos. Entonces las ADN polimerasas
los pueden usar como molde.
Esta reacción que ocurre en un tubo dentro de un termociclador, con las diferentes variaciones de temperaturas que
permite amplificar al transcrito de interés.
Se le agrega un colorante, suele ser Silver Green, que constituye moléculas que al unirse a ADN doble cadena va a
emitir fluorescencia. Se usa para ver el proceso de amplificación. A diferencia de la PCR que se cuantifica en el
último estadio, esta técnica permite ir cuantificar la amplificación en simultaneo que se va ocurriendo.
Se realiza con un termociclador, asociado con un detector de fluorescencia en cada tubo. Y generar diferentes tipos
de lectura, que nos muestre la fluorescencia en cada uno de los tubos.

Descripción de una imagen: eje de axisas. Donde X es nro de ciclos, es decir, en función del tiempo, y donde Y es
fluorescencia de cada tubos.
• Tubo 1: línea horizontal, no hay producto de amplificación
• Tubo 2: a partir de cierto momento hay un aumento de la fluorescencia, hay producto de amplificación.
Si yo parto de una cantidad mayor de producto, esperare que la ampliación se produzca en ciclos más tempranos.
Del mismo modo, si parto de una menor cantidad, la amplificación se dar en ciclo más tardíos.

Por eso esta técnica se utiliza para la detección de cargas virales, como es el caso de HIV, donde podremos ver que,
si el tratamiento está funcionando, teniendo en cuenta este tipo de cuantificaciones, si hay una disminución o
aumento de la carga viral del paciente.

Seminario 6

Seminario 7

Seminario n° 8 Giusti

Fenómenos de producción de energía asociados a las mitocondrias

Aprovecharemos a analizar aspectos estructurales, morfológicos como solo de la mitocondria sino de otras
organelas que participan en el metabolismo de oxigeno como los peroxisomas. Hablaremos de estas estructuras
dado que están vinculadas por esta utilización bioquímica de las moléculas de oxígeno.
Comenzamos a analizar esta biología celular y molecular de las mitocondrias:
¿Desde cuándo comenzó a construirse el conocimiento experimental, celular y molecular de las mitocondrias?
Si bien, estas estructuras y el nombre mismo de mitocondrias provienen de siglo 19, cuando se observaba bajo
microscopio óptica unos pequeños orgánulos citoplasmáticos. El conocimiento más profundo de las mitocondrias, el
que podemos considerar teórico, es el conocimiento que forma parte de las teorías validadas sobre estas organelas
comienza a surgir a mediados de los años 40 del siglo 20. Y esta temporalidad está dada por el surgimiento de la
microscopia electrónica que permitió, por primera vez a mediados de los 40, observar a células bajo el microscopio
electrónico y permitir analizar la ultraestructura de las organelas que sé que se encontraban dentro de la célula. Fue
entonces en los años 40 que comenzaron a evidenciarse la estructura de las mitocondrias; la estructura de la
organela: una membrana interna muy replegada sobre sí misma, estos repliegues de la membrana interna de
denominan, crestas mitocondriales y una membrana externa que limita con el espacio citosólico que es la membrana
mitocondrial externa (no replegada sobre si misma), por ende, con una superficie relativa mucho menor que la de la
membrana mitocondrial interna.
Estas dos membranas concéntricas, por ende, definen dos clases de espacios dentro de las mitocondrias; el espacio
contenido en el interior de la membrana mitocondrial interna “la matriz mitocondrial” y el espacio contenido entre
la membrana mitocondria interna y la externa, que es el espacio intermembranoso; es decir, estos espacios y
membranas de las mitocondrias que ustedes ya han analizado. Pero que se definieron originalmente a partir del
análisis de la microscopia electrónica.
Otra técnica que comenzó a desarrollarse también a los mediados de los 40 y con mayor fuerza en los años 50, fue
la técnica que estudiamos del fraccionamiento subcelular que permitió entonces de manera simultánea del análisis
ultraestructural de las mitocondrias, obtener preparaciones enriquecidas de mitocondrias a partir de un tejido
determinado. La obtención de las tensiones mitocondriales. Entonces permitió en estos años el análisis bioquímico,
caracterizar cuales son los componentes lipídicos y proteicos que están contenidas en las fracciones mitocondriales.
En los años 50 se perfeccionaron las técnicas de fraccionamiento subcelular y a partir de esta fracción mitocondrial,
podrían realizarse pasos de purificación posterior, obteniendo un procedimiento que se denomina “fraccionamiento
submitocondrial” y que permite tener en tubos separados, los distintos componentes mitocondriales. Entonces el
fraccionamiento submitocondrial parte de la fracción mitocondrial (obtenido de un fraccionamiento subcelular) y
mediante centrifugaciones y procedimientos, por ejemplo, la introducción de frox osmóticos en el medio del
proceso, purificar las membranas mitocondriales internas en un tubo; el contenido de la matriz mitocondrial en uno
y el contenido de la membrana externa en otro, y así sucesivamente. Este tipo de análisis permitió determinar que la
composición de lipídica y proteica por ejemplo de la membrana mitocondrial interna es muy diferente respecto al
contenido de lípidos y proteínas de la membrana mitocondrial externa. Son dos membranas muy distintas entre sí,
en particular puede observarse que la membrana mitocondrial interna tiene un contenido proteico inusualmente alto
pero las membranas biológicas; las membranas biológicas en general por ejemplo la membrana plasmática o la
membrana de las organelas como el Retículo Endoplasmático y Aparto de Golgi tiene en general un promedio de
40% de proteínas en su composición total. En contra posición con este valor de 40%, las membranas mitocondriales
internas llegan a un contenido proteico del 75%, son inusualmente ricas en proteínas.
Sin embargo, esta caracterización ultraestructural respecto de la disposición de las membranas y el análisis bioquímico que
permitió esta purificación mitocondrial dio durante mucho tiempo una imagen, un modelo de las mitocondrias de organelas
estáticas de pequeños bastones compuestos de doble membrana en el interior de la célula.
Pero las técnicas parte de las cuales hemos estudiado en los seminarios correspondientes a técnicas, permite hoy en día y han
permitido desde los años 50 observar las mitocondrias de células vivas y observar la dinámica temporal que tienen estas
organelas en el interior de la célula.

(Visualización de un video de una célula viva)

En la que sus mitocondrias están marcadas con la proteína fluorescente verde, es decir la proteína fluorescente verde se
localizó en las membranas mitocondriales y se filmó a una mitocondria durante un lapso. Así es cómo se comportan las
mitocondrias en una célula viva.

¿Qué cosas notamos en este video respecto de la imagen que tradicionalmente había sido ilustrada por los libros?
Una de las características es que no vemos a la mitocondria como bastones, sino solemos ver toda una red de túbulos
mitocondriales unidos entre sí. Si siguen con detalle a uno de esos túbulos van a observarse que algunos de ellos se fisionan, se
desprenden de otros túbulos generando pequeñas unidades mitocondriales. En estos casos esas subunidades se fusionan entre sí
para formar un túbulo. Y quizás el aspecto más sorprendente, es el hecho de que observamos movimientos en las mitocondrias.
Lo que hoy sabemos entonces es que las mitocondrias son organelas dinámicas. Es un movimiento producido a partir del
movimiento de las mitocondrias sobre los microtúbulos del citoesqueleto.
Es decir, las mitocondrias suelen poseer, tanto como en otras organelas, en su membrana mitocondrial externa vienen incluidas
proteínas motoras (Kinesina y dineínas) que se unen a los microtúbulos, por ejemplo, los que están en la célula y pueden
moverse a lo largo de esos microtúbulos; también poseen variantes de proteínas miosinas que les permiten desplazarse a través
de los microfilamentos de actina.

Los fenómenos de fusión y fisión de mitocondrias están siendo activamente estudiados hoy en día, se encuentran alterados por
ejemplo en el contexto de ciertas enfermedades de neurodegenerativas, el párkinson, la segunda enfermedad
neurodegenerativa en término de frecuencia de aparición. Al analizar las neuronas que terminan muriendo, uno puede observar
el modelo experimental que la dinámica de fusión y fisión de las mitocondrias de esa célula se encuentra alterada, lo que aún
desconocemos es qué relación existe entre los fenómenos de fusión y fisión, y la muerte posterior de la célula.

¿Cuál es el origen de las mitocondrias?

En los años 60 en partículas en 1967, se desarrolló y se publicó una teoría evolutiva respecto del origen de las mitocondrias en
la célula eucariota. Una teoría que quizás ustedes ya han oído nombrar, que es la teoría endosimbiótica que interpreta la
existencia de la mitocondria en el interior de la célula eucariota como el reflejo de un fenómeno evolutivo, en el cual ciertas
bacterias (bacterias aeróbicas) que podían utilizar el oxígeno molecular para producir (acoplando a procesos fisicoquímicos)
energía. Ingreso en el interior de las células eucariotas primitivas que carecían originalmente de estas organelas y que las
mitocondrias actuales entonces reflejan ese procedo de endosimbiosis, que ocurrió de manera temprana en la célula eucariota.

Esta idea en términos de argumentación evolutiva que plantea Lynn Margulis fue la científica que desarrollo y encontró
algunas evidencias experimentales para esta teoría. La argumentación sigue la siguiente lógica, en el momento en el que
surgen evolutivamente las primeras células eucariotas, la atmosfera de la tierra carecía de oxígeno, las primeras células
eucariotas evolucionaron en un ambiente anaeróbico. Sin embargo y surgimiento posterior del proceso de fotosíntesis en las
bacterias (ciertas bacterias fotosintéticas), permitió posteriormente la acumulación progresiva del oxígeno molecular en la
atmosfera. Y este cambio en el medio ambiente y la aparición de una atmosfera rica en oxigeno condiciono la evolución
posterior de las células eucariotas primitivas y aquellas células en donde que incorporaron bacterias aeróbicas para utilizar el
oxígeno moléculas como parte del proceso de producción de energía, tuvieron ventaja evolutiva respecto de aquellas otras
células que no lo hicieron (que terminaron desapareciendo).
La ventaja para la bacteria primitiva que ingreso a estas células procariotas es la disponibilidad de nutrientes en el citosol de la
célula predadora.

¿Qué evidencias presento Lynn Margulis? Y se generaron de manera posterior en apoyo a esta teoría endosimbiótica.
En primer lugar, ya se presentaba características simples no muy convincentes como por ejemplo la correspondencia del
tamaño de las bacterias y el tamaño de las mitocondrias, sin embargo, las evidencias más fuertes son otras por ejemplo el
hecho de que cuando se le analizan las proteínas especificas están expresadas en la membrana mitocondrial interna. Notemos
que según el esquema la membrana mitocondrial interna correspondería a la membrana proveniente a la bacteria en tanto que
la membrana mitocondrial externa según esta interpretación correspondería a la invaginación a la membrana plasmática, y
hecho cuando uno analiza bioquímicamente los componentes de la membrana interna, uno observa la presencia de proteínas
que tiene mucha simbología con proteínas bacteriales. En tanto que la composición de la membrana mitocondrial externa es
muy similar a la membrana plasmática. Sin embargo, las evidencias más fuertes a favor de la teoría endosimbiótica surgen del
análisis de la replicación y el mantenimiento de las mitocondrias por ejemplo las mitocondrias se dividen en el citoplasma a
partes de mitocondrias preexistentes, esto refleja de alguna manera está capacidad típica de identidades vivas que es la
capacidad de autorreplicarse.

Y un hecho fundamental en apoyar en esta teoría fue el descubrimiento en la matriz mitocondrial, en la mitocondria propio
genoma (ADN mitocondrial). Que en el caso de genoma mitocondrial de células humanas. Si como el de muchas otras
especies eucariotas el genoma mitocondrial, es un genoma compuesta por ADN doble cadena, circular que refleja la estructura
típica de los cromosomas bacterianos. ¿Cuál es contenido genético que posee este genoma mitocondrial humano? Que tiene
aproximadamente 16500 pares de bases de longitud, un genoma muy, muy pequeño, es un genoma que posee en total 37
genes, 13 de ellos son genes que codifican para proteínas, todas esas proteínas. 13 péptidos son péptidos que van a estas
incluidas, luego de su traducción en la membrana mitocondria interna, (si su destino celular final). Sin embargo, los otros
genes contenidos en las mitocondrias codifican pose ARN (ARNt y ARNr) dado que, dentro de las mitocondrias, acontecen los
fenómenos de transcripción del genoma mitocondrial y de traducción de esos 13 polipéptidos mitocondriales que no utilizan
las ARN de transferencia citosólicas, sino que utiliza ARNt codificados por el propio genoma mitocondrial. Y los ribosomas
que también están en la matriz mitocondrial contiene ARNr codificados por estos genomas. La existencia de este sistema
genómico en las mitocondrias es un apoyo muy fuerte a la teoría endosimbiótica. Dado que refleja este genoma muchas
características del genoma procariontes, no solo en esta estructura circular, sino que al analizar la secuencia de los genes
codificados en esté genoma, uno puede observar por ejemplo que los genes de estos polipéptidos carecen de intrones, otra
característica típica de los procariotas. Y durante la transcripción de esos genes suele generar transcriptos policistrónicos,
transcripto que contiene varios genes yuxtapuestos, otras de las características típicas de la transcripción procarionte.

Veremos en genética que mutaciones en el genoma mitocondrial también son origen de un conjunto de enfermedades
genéticas, enfermedades de transmisión mitocondrial que analizaremos específicamente durante la cursada de genética.
Esta noción de la existencia de un genoma mitocondrial a partir de la cual puede producirse 13 proteínas que van a estar
incluidas en la membrana mitocondrial interna, nos sugiere entonces que desde el punto de vista de su composición proteica
las mitocondrias son un sistema mixto. ¿Por qué? Razonemos no son solo 13 polipéptidos los que alcanzan para completar la
estructura y la función mitocondrial. La mitocondria tiene más de mil proteínas diferentes que componen sus membranas
mitocondriales interna y externa, como el contenido de la matriz y el espacio intermembrana. Esa cantidad superior a mil
proteínas como hemos visto no están codificados por el genoma mitocondrial, solo están codificados 13 polipéptidos cuya
localización es la membrana mitocondrial interna. El resto de esos péptidos esta codificado por el genoma nuclear, y va a ser
un proceso activo de traducción citoplasmática y posterior en relación con las mitocondrias, lo que permite a las mitocondrias
poseer el conjunto complejo de proteínas que las forman.
Este fenómeno, uno puede pensar ¿Cómo es posible? ¿Cómo es esto compatible con la teoría endosimbiótica? El hecho que
haya genes nucleares en el genoma nuclear que forma parte en la estructura de la mitocondria.
En el contexto de la teoría se supone que en un momento evolutivo ya pasado hubo una transferencia génica de parte del
genoma mitocondrial al genoma nuclear, permitiéndole a las células en donde había ocurrió esta transferencia de material
genético mitocondrial a nuclear, que le núcleo posee el control de la fisiología celular. Hubo una pérdida de independencia
total de esa bacteria y quedo regulada bajo la actividad del núcleo.

Entonces a partir de este análisis que hemos hecho el primer mecanismo molecular que vamos a estudiar: ¿Cómo se localizan
las proteínas mitocondriales, que son codificadas por el núcleo y traducidas en el citosol?, ¿Cómo se localizan en los diferentes
compartimientos mitocondriales? Y de hecho vamos a utilizar uno de los conceptos que ya hemos analizado en seminarios
anteriores y es el hecho que la localización de proteínas en compartimientos específicos depende de la secuencia señal que
están contenidas en la propia estructura primaria de las proteínas. Dicho de otro modo, son secuencia de aminoácidos que
forman parte de la cadena polipeptídica, las que suelen actuar como señal para que los sistemas celulares localicen, ese
polipéptido en un compartimiento determinado. Habíamos analizado en aquel seminario que existían señales por ejemplo de
localización nuclear, señales de exportación nuclear o péptido señales que inducían en la incorporación de proteínas hacia la
luz del retículo endoplásmico. De manera análoga existen señales de localización mitocondrial, desde el punto de vista
experimental, sabemos mucho más de aquellas señales de incorporación mitocondrial que dirige a componentes proteicos a la
matriz mitocondrial específicamente. Estas secuencias señales van a dirigir la incorporación del polipéptido a la matriz
mitocondrial está caracterizado por ser una secuencia de aminoácido que está en el extremo N-terminal de la proteína. Y suele
caracterizarse porque esa secuencia adopta rápidamente una estructura secundaria de alfa hélice y esa alfa hélice tiene
características bioquímicas muy particulares, es una alfa hélice anfipática, esto quiere decir, sus costados tienen características
fisicoquímicas distintas. Sobre uno de los costados de esta hélice se acomoda cierto residuo aminoacídico básico, es decir que
tienen carga electrónica positiva al pH celular, ósea uno de los costados de esa hélice está cargado positivamente. El otro
costado (opuesto), se acomoda en esa estructura aminoácido que tiene residuos hidrofóbicos, por ende, llamamos a esta alfa
hélice anfipática, de un lado posee cargas positivas y del lado opuesto posee residuos hidrofóbicos. Y es esa configuración,
polarizada anfipática que será reconocida por ciertos componentes de las membranas mitocondriales que van a actuar como un
receptor de esta señal de importación mitocondrial.

Los principales componentes de este sistema de importación de proteínas sintetizadas originalmente en el citosol. Los
transportadores principales, las proteínas transmembrana que actúa tanto como receptor de la secuencia señal y que participan
del proceso de importación de proteína. Hay 2 grandes complejos de transportadores: uno localizado en la membrana
mitocondrial externa se denomina “complejo TOM” (transportador de la membrana externa). El complejo TOM posee un
receptor para la secuencia señal, la alfa hélice anfipática de estas proteínas y permite la incorporación (la inyección) de esa
proteína hacia el espacio intermembrana, En el espacio intermembrana podrá interactuar con los complejos principales de la
membrana mitocondrial interna que se denomina de manera análoga “complejo TIM” (transportadores de la membrana
interna).

Entonces es la acción secuencial de los complejos TOM y el complejo TIM lo que permite la incorporación de estas proteínas
mitocondriales por ejemple en el caso de que la localización final de estas proteínas sea la matriz mitocondrial.

Otro complejo adicional, por ejemplo, el complejo SAM en la membrana mitocondrial externa, permite la incorporación de
aquellas proteínas que tiene como localización especifica la membrana mitocondrial externa. Por ejemplo, una de las familias
de proteínas que están enriquecida en la membrana mitocondrial externa son un conjunto de proteínas denominadas porinas. Y
se denomina de ese modo porque son proteínas que tienen muchos pasos transmembrana y generan poros proteicos en la
membrana mitocondrial externa, lo que le confiere a la membrana una de sus características centrales e instintivas respecto de
la membrana mitocondrial interna que es su alto grado de porosidad. Por ejemplo, si analizamos el contenido iónico y de
moléculas pequeñas que están presentes en el espacio intermembrana respecto del espacio citosólico, veremos una enorme
correspondencia en alta similitud, esto está dado por la distribución permitida a través de la enorme cantidad de proteínas que
presentan en la membrana mitocondrial externa. Todas las proteínas están codificadas por el genoma nuclear y son
incorporados a la membrana mitocondrial externa a partir de estos complejos SAM.

Otro complejo OXA, permite la incorporación a la membrana mitocondrial interna de aquellos péptidos que son producidos,
traducidos en la matriz mitocondrial y que surgen de la traducción del genoma mitocondrial. Esas proteínas entonces
originalmente sintetizadas en la matriz, solo esos 13 polipéptidos codificados del genoma mitocondrial serán incorporados a la
membrana mitocondrial interna a través del complejo OXA.
Recordemos que los 13 polipéptidos tienen una localización en la membrana mitocondrial interna. Esto implica por ejemplo
todas las proteínas solubles de la matriz mitocondrial están también codificadas por el genoma nuclear.
Si analizamos este proceso de incorporación especifica de proteínas hacia las mitocondrias. Debemos mencionar 2 aspectos, en
primer lugar, el hecho de la incorporación de proteínas hacia las mitocondrias implica una incorporación que es
postraduccional, las proteínas son completamente traducidas en el citosol y solo posteriormente son incorporadas a la matriz
mitocondrial, esto contrasta con la incorporación cotraduccional, por ejemplo, que ocurrirá a nivel de la luz en el retículo
endoplasmático. Y esta incorporación cotraduccional esta facilitada y permitida por el hecho que las proteínas suelen no
plegarse completamente, antes de la incorporación de las mitocondrias. Y este mantenimiento de un estado de no
completamente plegado se debe a la acción de un conjunto de proteínas chaperonas citoplasmáticas y mitocondriales.

En otras palabras, aquellas proteínas que tienen como destino la mitocondria, que son traducidas en el citosol, suele interactuar
de manera muy fuerte con un conjunto de proteínas chaperonas citosólicas que pertenecen a la familia hcp70. Como saben las
chaperonas, una de las funciones generales que tiene es permitir el correcto plegamiento de las proteínas. Y de hecho
chaperonas de esta familia pueden interactuar con un conjunto muy diverso de proteínas, porque reconocen la señal de
reconocimiento de las chaperonas, no es otra cosa los parches hidrofóbicos de los residuos de aminoácidos que forman parte
del polipéptido. Intentemos comprender la lógica por el cual esta es una señal para las chaperonas, una proteína que se pliega
en el citosol, de manera espontánea dado que el citosol es un ambiente acuoso.

Aquellos residuos polares que tengan carga electrónica van a interactuar de manera facilitada con el ambiente acuoso y polar
del citosol. En tanto que los residuos no polares hidrofóbico de proteína, suele unirse entre sí y ser repelidos por el ambiente
acuoso del citosol. Suelen quedar en el interior de esa estructura globular que adopta la proteína. Un mal plegamiento entonces
podría ser señalizado porque un parche hidrofóbico, no pudo ser incorporado en el interior del péptido y queda expuesto al
ambiente acuoso. Y justamente las chaperonas reconocen (identifican) estos parches hidrofóbicos en la superficie de la
proteína. En el caso de las proteínas mitocondriales a medida que esta proteína está siendo sintetizada los parches
hidrofóbicos, son reconocidos de manera secuencial por estas chaperonas, permitiendo la interacción con el conjunto TOM de
manera parcialmente desplegado. Estas chaperonas también se encuentran en su variante mitocondrial, chaperonas
mitocondriales de la misma familia, se encuentran en la matriz mitocondrial ayudando al proceso de incorporación. De hecho,
la existencia de estas chaperonas nos permite entender a esté proceso de transporte desde el punto de vista termodinámico; es
decir desde el punto de vista de la utilización de la energía. Porque sí pensamos que la localización de una proteína implica un
ordenamiento de la célula; desde el punto de vista termodinámico este ordenamiento, esa reducción de la entropía celular, es
un proceso no espontaneó que requerirá la utilización de energía para poder producirse.

¿Dónde está la energía invertida desde el punto de vista celular en este transporte? Parte de esa inversión de energía está dada
en la actividad de las chaperonas. Porque las chaperonas no suelen unirse de manera irreversible, sino que, suelen unirse y
despegarse de manera sucesiva de los péptidos a los que están asociados. Y cada una de estas uniones y despeges esta
catalizada por ruptura de ATP, entonces la unión de las chaperonas es un proceso que utiliza la energía almacenada en el ATP.

Otro fenómeno es el hecho de que de manera indirecta este proceso esta favorecido por la existencia en la membrana
mitocondrial interna, de una diferencia de voltaje (de una diferencia de cargas eléctricas) leve entre las dos caras de la
membrana mitocondrial interna. Esa diferencia de cargas está dada por la propia actividad de las mitocondrias, por el
funcionamiento de la cadena de transporte de electrones, como parte del proceso de generación de energía. Y pensemos que
esta distribución asimétrica de cargas a lo largo de la membrana mitocondria interna es tal, que la matriz suele ser negativa con
respecto del espacio intermembrana. Entonces dado que los péptidos que ingresan a la matriz mitocondrial tienen como
péptido señal alfa hélice cargado positivamente, son las cargas electrónicas negativas del interior de la matriz mitocondrial, lo
que favorece el desplazamiento de ese péptido hacia el interior de la matriz. Podemos pensar como un fenómeno de
electroforesis, el movimiento de una partícula en función de un campo eléctrico.
Veremos que el mantenimiento de estas diferencias de cargas es un proceso energéticamente costoso para las mitocondrias.

Otros factores importantes de las mitocondrias en el interior de la célula:

• Las mitocondrias participan de un fenómeno bioquímico denominado esteroideogénesis, que se refiere a la producción
de hormonas derivadas del colesterol (ej. Testosterona, los estrógenos son hormonas esteroideas). Y la fabricación de
esas hormonas desde el punto de vista celular hay algunos pasos que ocurren en las membranas mitocondriales. Si bien
la mayor parte de la síntesis de las moléculas derivadas del colesterol ocurren, tal como lo hemos visto en las
membranas del retículo endoplasmático. Hay algunos pasos bioquímicos que acurren exclusivamente en las
membranas mitocondriales. De hecho, existen contactos entre la membrana del retículo endoplasmático y las
membranas mitocondriales que permiten el pasaje de sustratos de una membrana a la otra. Por ejemplo, el primer paso
de la biosíntesis desde el colesterol hacia hormona esteroidea; es el paso del colesterol a un sustrato llamado
pregnelonona. Y este paso bioquímico, la enzima que convierte al colesterol a pregnelonona, tiene localización
mitocondrial. Luego de estos contactos mitocondria- retículo la pregnelonona para, difundir hacia la membrana del
retículo en donde las enzimas posteriores convierten a esta pregnelonona de manera única en hormona esteroidea.
 • Reservorio de calcio. El ion Ca+2 cumple una función central en regular la actividad de un enorme conjunto de
proteínas intracelulares, por ende, en condiciones basales, el ion calcio se encuentra en concentraciones bajísimas en el
citosol y altamente reguladas. Dentro de las células el calcio se encuentra secuestrado. Ante fenómenos de
señalización especifica liberado en estas organelas en la luz del Retículo Endoplasmático, ese es el principal reservorio
de calcio intracelular. Pero las mitocondrias, la matriz mitocondrial es el reservorio secundario dentro de la célula.
• Participa de los fenómenos de señalización que conduce al proceso de muerte celular programada. La liberación de
ciertos componentes mitocondriales hacia el citosol es un fenómeno de señalización que suele indicar a la célula (suele
activar en serie de proceso celular) que conducen a la muerte celular.

Síntesis de ATP celular por parte de las mitocondrias

Repaso de concepto bioenergéticas básicas:

¿Qué entendemos por reacciones químicas acopladas?

Desde el punto de vista energético las reacciones químicas desde el punto de vista termodinámico, las reacciones químicas
pueden ser espontáneas (ocurrir espontáneamente) o necesita energía para poder ocurrir. Esta distinción fundamental respecto
de la espontaneidad de una reacción de su requerimiento de energía para ocurrir distingue a estas reacciones, como reacciones
espontaneas asociadas a la liberación de energía, por ende, exergónicas y las distingue (las opone) a aquellas reacciones que
solo pueden ocurrir por el consumo de energía, las reacciones endergónicas que por ende son no espontaneas. Osea el concepto
de reacción espontánea y no espontaneas esta enteramente ligado a sí una reacción libera energía cuando se produce o si
necesita absolver energía para producirse.

¿Qué reacciones dentro de la célula son reacciones que implican el consumo de energía?
En términos químicos, la necesidad de energía o liberación de energía está asociado a la ruptura o formación de enlaces
químicos covalentes. Porque un enlace químico covalente implica energía almacenada por los electrones de ese enlace.

Procesos que implican la ruptura de esos enlaces covalentes, libertan energía al medio ambiente como reacciones espontaneas
y tanto que, si queremos formar enlaces covalentes, es decir queremos almacenar energía en esos enlaces, necesitamos energía
del medio ambiente para producirlos; y por ende son reacciones importantes. Dentro de la célula reacciones no espontaneas
serian, por ej. La formación de todos los enlaces que conducen a la agrupación de polímeros a partir de monómeros. La
generación de largas moléculas de ácidos nucleicos a partir de nucleótidos libres, la producción de péptidos a partir de
aminoácidos, por ej. Son reacciones no espontanea que típicamente ocurren dentro de la célula.
¿Cómo es posible entonces, de donde se obtiene la energía que necesitan estas reacciones espontaneas para producirse?
El hecho es que dentro de las células las reacciones químicas pueden acoplarse, esto implica que sí 2 reacciones químicas
ocurren de manera simultánea en tiempo y en gran proximidad espacial, la energía liberada por ejemplo: una reacción
espontánea puede ser utilizada por la reacción no espontanea que está ocurriendo en ese momento y lugar para poder
producirse Y en ese sentido decimos que las 2 reacciones están acopladas, ocurren en el mismo sector espacial en el mismo
tiempo y la energía liberada por una de las reacciones es utilizada para la producción de la otra. Este es el concepto de
acoplamiento de 2 reacciones químicas desde el punto de vista energético.

Dentro de las células la reacción espontánea que típicamente suele asociarse a la producción de reacciones no espontaneas es
la ruptura de un enlace covalente presente en una molécula de ATP, para liberar este grupo P (fosfato) y ADP. Esta reacción de
ruptura de enlace covalente pasando de ATP a ADP+P es una reacción espontánea y exergónica (libera energía). Y suelen ser la
reacción que típicamente es la célula con otras reacciones que requieren la incorporación de energía. Esto implica entonces que
una célula que está acoplando este tipo de reacciones, está rompiendo moléculas de ATP para generar, para fomentar
reacciones que morirían de otro modo si no utilizara esta energía liberada, esto implica que esas células con el tiempo van
disminuyendo sus cantidades de ATP. Porque todo el ATP que tienen las células en un momento dado, está siendo
transformado de manera continua a ADP+P.

¿Cómo es posible que las células regeneren sus cantidades internas de ATP?, ¿Cómo se produce la reacción contraria (la
generación de ATP a partir de ADP+P)?
La respuesta a esta pregunta es la que nos va a permitir comprender la función fisiológica de las mitocondrias en la interior
célula.

Otro concepto clave que nos va a permitir llegar a ese concepto son otras reacciones. Reacciones de oxido-reducción como
seguramente han estudiado en química. Recordemos conceptos centrales de las reacciones oxido-reducción: cuando hablamos
de reacciones de oxido- reducción hablamos de reacciones en donde no necesariamente participa el oxígeno molecular como
molécula. Entendemos entonces por reacciones de oxido-reducción, reacciones en donde una molécula sede electrones a otra
segunda molécula. La molécula que sede electrones diremos que se ha oxidado y la molécula que acepta los electrones cedidos
por la primera sea reducido, por ende, estas reacciones de transferencia de electrones implican siempre un par de oxido-
reducción, siempre abra una molécula que se oxide (seda electrones) y necesaria mente otras moléculas que las incorpore. Si
pensamos en la combinación de esta noción de reacciones de oxido-reducción con los criterios termodinámicos que vimos
recién, también podemos decir que estas reacciones de oxido-reducción pueden ser espontaneas y no espontaneas; es decir
liberar energía o necesitar energía para producirse.

¿En qué condiciones estas reacciones de oxido-reducción son espontaneas y liberan energía?
Esto ocurre cuando, pensando en propiedades intrínsecas en las moléculas, en la capacidad que tiene cada una de las moléculas
de atraer electrones o de cederlos. Porque según sus características fisicoquímicas particulares una molécula tiene una
determinada capacidad, atracción por los electrones que puede ser diferente de la capacidad de atracción de una molécula
diferente. Y podemos cuantificar a esta magnitud que hemos denominado capacidad de atraer electrones y esa magnitud en
términos cuantitativos se denomina potencial de reducción de una molécula. Y si una molécula tiene mayor potencial de
reducción que otra, es decir mayor capacidad de atraer electrones, ese fenómeno de incorporar electrones de la primera
molécula será espontánea y liberar energía. Entonces las reacciones de oxido-reducción son espontaneas cuando los electrones
pasan de una molécula de menor potencial de reducción a una que tiene mayor potencial de reducción (una mayor capacidad
de atraer electrones). Y analizamos estas reacciones por que veremos que son centrales en los procesos de producción de ATP
por parte de las mitocondrias, de hecho estas preparaciones de reacciones de fracciones mitocondriales, que les había
comentado que se inició a partir de los años 40 y 50, fueron estas preparaciones los que le permitieron a los bioquímicos
determinar cuáles son los sustratos que necesitaban las mitocondrias para producir ATP y una de las primeras cosas que
observaron es que muchas de las reacciones químicas que acontecían en estas fracciones mitocondriales eran reaccione de
oxido-reducción. ¿Y cuáles son las moléculas que van a comenzar a oxidarse progresivamente? Son moléculas originalmente
contenidas en los alimentos (hidratos de carbono y lípidos).

Tenemos que analizar una restricción bioquímica dentro de las células, estos fenómenos de oxido-reducción cuando ocurren
catalizados por enzimas en el contexto celular implican un desafío para las enzimas, porque las estructuras proteicas de las
enzimas suelen no estar preparadas para ser buenos aceptores de electrones entre una molécula que se oxida para dárselos a
una molécula que se reduce. Esta dificultad de las estructuras peptídicas para participar de este fenómeno de oxido-reducción,
suele estar acompañada por una serie de moléculas auxiliares dentro de la célula que participan como aceptores temporales de
los electrones en las reacciones enzimáticas. Y de hecho ustedes ya han visto los nombres de estas moléculas químicas que
actúan como aceptores temporales de electrones pensando en la propia dificultad de estas enzimas como aceptores. Por
ejemplo, una de estas moléculas que participan como aceptores temporarios de denominan coenzimas y suelen estar formadas
por moléculas orgánicas derivadas en muchos casos de nucleótidos. Una coenzima principal que participa de fenómenos de
oxido-reducción de los hidratos de carbono y los lípidos que van a culminar con la síntesis de ATP celular, es la molécula de
discontinuidad de dinucleótido, que tal como lo hemos planteado aquí sí puede participar en fenómenos de aceptación y ceder
electrones podemos encontrarlo en la célula de dos formas: en su forma oxidada, es decir cuando aún no ha incorporado a los
electrones sino que ya los ha cedido y en una segunda forma cuando ha incorporado los electrones que será la forma reducida.
La forma oxidada de esta molécula en NAD+ es cuando este dinucleótido de adenina y nicotinamida aún no ha incorporado
electrones y tiene una carga eléctrica neta positiva, esa es la forma oxidada de esta coenzima. Una molécula de NAD oxidad
tiene la capacidad, tiene un potencial de reducción tal que le permite incorporar 2e- a su estructura, puede participar de una
reacción de oxido-reducción donde una molécula cede 2e- y son capturados (almacenados) temporariamente esos 2e- por la
molécula de NAD. Ahora ¿Cuántas cargas eléctricas tendrá la forma reducida de este aceptor temporal de electrones, si
originalmente tenía una carga eléctrica positiva? Al incorporar 2e- tendrá una carga eléctrica negativa, sin embargo, hay
presente muchos protones cargas positivas (influyen en el pH celular), cationes de hidrogeno (H+) en el medio, ese NAD que
ahora una carga negativa ahora va a incorporar simplemente del ambiente celular un hidrogeno y va a quedar como NADH.
Entonces es que la diferencia de la forma oxidad y la reducida, desde el punto de vista funcional la importancia no está dada
por ese protón (H+) sino por esos 2e- que ha incorporado. El protón que incorpora posteriormente es simplemente un
fenómeno suplementario que contra resta la carga negativa dado que hay presente en el medio celular protones.

Otra coenzima que también es frecuente en los fenómenos metabólicos y participa como aceptor temporario de electrones es la
molécula de FAD que un dinucleótido también en este casi de adenina y flavina. De manera análoga este dinucleótido FAD
puede existir en 2 formas oxidada y reducida, su forma oxidada es cuando aún no ha incorporado esos electrones y su forma
reducida es cuando ya los ha incorporado. Dado que la molécula de FAD en estado basal no tiene carga eléctrica (carga
eléctrica neutra) luego de la incorporación de los electrones, quedará con 2 cargas eléctricas positivas incorporará entonces 2
protones del medio ambiente y su forma reducida será FADH2. Nuevamente esos protones que ha incorporado no son los que
le va a dar la importancia funcional sino los 2e- que ha incorporado en las reaccione de oxido-reducción.

¿Cuál es la diferencia fundamental ente NAD+ y NADH?

La diferencia fundamental es que NADH tiene 2e- más que NAD+, desde el punto de vista fisiológico Esto que hemos descrito
hasta ahora nos va a permitir explicar la obtención de ATP y la regeneración de ATP por parte de las mitocondrias a través de
catabolismo de los hidratos de carbono.

Concepto de catabolismo: Nos referimos a catabolismo como una parten de metabolismo, el metabolismo de forma global es
todos los conjuntos de reacciones químicas que ocurren dentro de la célula.

La ruptura de enlaces covalentes la generación de sustancias más simples a partir de sustancias más complejas son las que
denominamos catabolismo. Dicho la ruptura de enlace covalentes presentes en los hidratos de carbono y en los lípidos que
consumimos como alimento, van a formar parte de estas reacciones catabólicas que van a conducir a la liberación progresiva
de energía por parte estos enlaces y que tenemos que entender como esa liberación de energía se va a reflejar en la producción
de ATP celular. Por ejemplo, nosotros utilizamos la energía obtenida de los enlaces covalentes de los azucares, de los hidratos
de carbono que los consumimos con la dieta, a lo largo de nuestro tubo digestivo los hidratos de carbono complejo son rotos a
monosacáridos que son incorporaos a nivel intestinal en el torrente sanguíneo y luego a partir del torrente sanguíneo son
incorporados en el interior de todas las células, a través usualmente facilitado este proceso por la acción de la hormona
insulina. ¿Qué ocurre entonces en el citosol de la célula una vez ingresa estos hidratos de carbonos simples? Ocurre una serie
de 3 procesos que van a culminar con la producción de ATP celular utilizando la energía covalente de esos monosacáridos.
• Proceso: La glucolisis que ocurrirá en el citoplasma
• Proceso: El ciclo de Krebs
Ocurre en la mitocondria
• Proceso: la cadena de transporte de electrones

Con respecto a la Glucolisis mencionaremos algunos aspectos centrales.

Como sabemos la glucolisis es una pequeña vía metabólica compuesta por 10 reacciones que implicara la ruptura de un
monosacárido de 6 carbonos en 2 moléculas de 3 carbonos, en este proceso nosotros tenemos que comprender que la energía
que contienes esos enlaces covalentes que fueron rotos serán almacenas temporariamente en otras moléculas celulares y
tenemos que ver ¿cuáles son los procesos de almacenamiento temporal de energía?
Los primeros pasos de la glucolisis implican en realidad procesos endergónicos, que gastan energía, dado que hay una
fosforilación doble del sustrato original consumiendo en este paso 2 moléculas de ATP. Pero desde el punto de vista energético
esas moléculas de ATP, esa energía invertida dado que se rompieron 2 ATP para fosforilar a estos sustratos serán recuperado en
momentos posteriores de esta misma vía metabólica. Nos concentraremos en los últimos pasos finales de la glucolisis, en
particular en que parte de la energía contenida en estos enlaces covalentes, va a ser almacenada en la forma de 2 coenzimas
reducidas. ¿De dónde provienen entonces los electrones de las 2 moléculas de NADH que se han formado? Esas 2 moléculas
de NADH ¿Cuántos electrones han incorporado en total? Cada una de estas moléculas incorporo 2 electrones. ¿De dónde
provenían esos electrones, donde estaban originalmente? En los enlaces covalentes que formaban a este monosacárido, la
energía de esos electrones entonces se ha desplazado, ahora está contenida en las moléculas de NADH que han incorporado (se
han reducido) de manera simultánea a la ruptura de esos enlaces. Entonces este proceso implico la oxidación de las moléculas
de monosacárido, la perdida de electrones por parte de esta molécula y la reducción (el almacenamiento de estos electrones de
alta energía en la coenzima) de las coenzimas.
Otro aspecto, es el hecho de que también en la glucolisis se produce ATP de una manera bastante directa. Hay enzimas que
pueden transferir directamente estos grupos fosfato, de estos intermediarios de 3 carbonos, a moléculas de ADP para formar de
manera directa ATP y esta forma enzimática de generación de ATP mediante la transferencia de un grupo fosfato de un sustrato
orgánico al ADP para formar ATP es un modo de producción de ATP, que se denomina fosforilación a nivel de sustrato.
Veremos q este modo desde el punto de vista bioquímico es muy ineficiente, en esa reacción hay mucha energía que se disipa
en forma de calor y que no queda almacenada finalmente en el enlace covalente entre el grupo fosfato y el ADP. Veremos
entonces que desde el punto de vista bioquímico las fosforilaciones a nivel del sustrato resultan una excepción, no son muy
frecuentes dentro del metabolismo; pero vamos a utilizarla por que veremos que durante mucho tiempo fue la única hipótesis
que tenían los bioquímicos respecto a cuál era el modo de producción de ATP dentro de las células. Durante mucho tiempo se
sospechó que la generación de ATP celular se debía a todas ha fosforilaciones a nivel de sustrato. ¿Qué ocurre una vez que se
generan como consecuencia de la glucolisis estas 2 moléculas de 3 carbonos denominada ácido piruvato o pirúvicos?

Esas moléculas que aun contienen energía en sus enlaces covalentes son incorporadas hacia la matriz mitocondrial a través de
transportadores específicos. Y ocurre dentro de la matriz mitocondrial una primera reacción que es la reacción de
descarboxilación de ese piruvato, es decir esta molécula de 3 carbonos en la matriz mitocondrial, en una reacción enzimática
se va a escindir a romper un enlace covalente liberando a ese átomo de carbono en la forma de dióxido de carbono. Parte de la
energía liberada por la ruptura de este enlace covalente va a ser almacenar 2e- nuevamente en una coenzima, en donde una
molécula de NAD+ se transforma, se reduce a una molécula de NADH y se produce la unión de esta molécula restante que
ahora tiene 2 carbonos que llamamos grupo acetilo (C-C) la unión a una molécula orgánica que está presente en la matriz
mitocondrial y que denominamos Coenzima. Que también es nuevamente un derivado complejo de un nucleótido. ¿Cuál es la
lógica bioquímica de la incorporación de este grupo de 2 carbonos, esta unión covalente a un átomo de azufre que es el átomo
terminal de la Coenzima? Una de las razones que podemos dar que sea interpretado con respecto a la evolución de esta
reacción desde el punto de vista energético, es el hecho de que la energía contenida en este enlace covalente que se ha roto es
muy grande y la energía liberada por la ruptura de ese enlace no está contenida de manera completa en la coenzima reducida,
la energía restante se utiliza para formar un enlace covalente con la molécula de la Coenzima.

Dicho de otro modo, la formación de estos enlaces con la Coenzima es una forma de no disipar la energía que aun contenía ese
enlace entre los 2 carbonos que ha sido roto, el enlace entre el carbono y el átomo de azufre es un enlace que tiene menor
energía que el enlace originalmente que se había roto la molécula y es preservado (para evitar su disipación en forma de calor)
como un enlace temporario, y luego va a ser utilizado en posteriores reacciones. Es decir, no tenemos que pensar en los enlaces
en términos absolutos, hay enlaces que tienen mayor energía que otros, entonces romper un enlace de alta energía para formar
coenzimas reducidas y además formar un enlace de menor energía, es una forma de preservar esta energía que ha quedado en
este segundo enlace para evitar que se disipe en forma de calor. Y esa es la lógica de unir este grupo acetilo a la Coenzima.

Esta primera reacción de descarboxilación para formar acido piruvato y Acetil-Coa, es una reacción que ocurre en la matriz
mitocondrial gracias a un complejo enzimático presente en la matriz mitocondrial que es el complejo del piruvato
deshidrogenasa. Tiene muchas particularidades este complejo enzimático piruvato deshidrogenasa, en primer lugar es enorme
dese el punto de vista macromolecular, está compuesto de más de 30 subunidades peptídicas que forman un complejo de 3
clase de enzimas distintas, es mucho más grande que las enzimas monoméricas que cundo uno genera preparaciones,
fraccionamientos subcelular en donde uno puede purificar los componentes de la matriz mitocondrial y observar esos
componentes de la matriz mitocondrial al microscopio electrónico, uno puede observar las estructura de estos complejos
macromoleculares, en general no es frecuente que uno no observa a las proteína de manera directa en el microscopio
electrónico, suelen ser muchos más chicas que el poder de resolución del microscopio. Pero podemos observar estos complejos
formados por un gran número de polipéptidos. Existen mutaciones de algunos de los componentes moleculares de este
complejo que origina enfermedades metabólicas en humanos. Imaginemos cuales serían las consecuencias de que mutaciones
en proteínas en alguna de estas 3 clases de esta enzima que forma parte de este complejo, haga que este complejo disminuya su
actividad, la consecuencia de estas mutaciones es que estos individuo tiene reducida capacidad de extraer energía a partir de
los hidratos de carbono por ejemplo; la dustristasa la generación de AcetliCoA a partir del piruvato se encuentra disminuida en
términos de velocidad, y de hecho uno de los síntomas característicos de estos sujetos es la letargia, es la dificultad del
movimiento, no pueden moverse y suelen tener síntomas musculares y neurológicos, aquellos 2 tejidos que tienen mayor
consumo de ATP. Digo entonces que estas mutaciones implican en los pacientes disminución de la actividad de la piruvato
hidrogenasa, por que pensemos en que ocurriría en aquellas mutaciones que anularan la actividad de la piruvato hidrogenasa
¿Qué consecuencias esperaríamos? esas mutaciones son letales, no permiten la supervivencia del individuo. De hecho,
comprender el funcionamiento de este complejo enzimático central para el metabolismo permitió dilucidar la etiología de una
patología que hoy sabemos que es una deficiencia nutricional, estoy hablando de la enfermedad beriberi. Es una enfermedad se
debe a una deficiencia vitamínica, de la vitamina B1(tiamina), como hoy sabemos que la tiamina o vitamina B1 es un cofactor
necesario para que el piruvato deshidrogenasas funcione de manera efectiva. ¿Qué les ocurría a los pacientes que tenían esta
deficiencia nutricional? Síndrome de aletargamiento y sin signos neurológicos y musculares. Y comprender cuál fue el
mecanismo molecular por el cual los individuos que padecían de beriberi la padecían. Reconocer que esto era una deficiencia
nutricional cuando originalmente se pensaba que era un tipo de bacteria o virus el que producía estos signo y síntomas
permitió generar políticas públicas de suplementos de los alimentos, especialmente con vitamina B1 para erradicar esta
deficiencia nutricional. De hecho, beriberi en el lenguaje de los locales significa “no puedo, no puedo” justamente reflejando
este aletargamiento que tenía los individuos que tenían beriberi.
Comprender estos mecanismos moleculares nos permite diseñar estrategias de prevención primaria de la salud, saber con qué
suplementar los alimentos para evitar una epidemia des nutricional, es decir nos permite operar en ambas estrategias,
estrategias de cura y tratamiento, y también estrategias de prevención primaria de la salud. Recordemos que son justamente
estas estrategias las de prevención primaria de la salud, las que la organización mundial de la salud propone como estrategias
centrales para mejorar la salud como objetivo global. Dice la organización, no solo debemos invertir en medicina personaliza.

¿Cuál es la próxima reacción que ocurre con el Acetil CoA en el interior de la matriz mitocondrial?
La próxima reacción es una serie de reacciones denominadas ciclo de Krebs, ciclo de ácido cítrico o ciclo de los ácidos
tricarboxilicos. Nosotros esperamos la ruptura progresiva de los enlaces covalentes que están contenidos en el grupo acetilo
como los pasos posteriores para completar la liberación de energía del metabolismo. Y esta idea de ruptura progresiva de los
enlaces covalentes choca con la primera reacción que implica la unión de estos 2 carbonos a una molécula de 4 carbonos el
oxalacetato para formar una molécula de 6 carbonos, que es el ácido cítrico. Entonces lo anti intuitivo es que la primera
reacción del ciclo de Krebs forma moléculas más grandes, en vez de romper progresivamente los enlaces. Desde el punto de
vista bioquímico esto se puede explicar porque estos intermediarios del ciclo de Krebs son, a pesar de tener un mayor número
de carbonos, desde el punto de vista de reacciones enzimáticas van a ocurrir, son más factibles de sus enlaces covalentes de
romperse a través de reacciones enzimáticas. Es decir, estas moléculas que se generan tienen un mayor grado de facilidad en
términos de reacciones bioquímicas de ser sustratos de enzimas que rompan sus enlaces covalentes, desde el punto de vista
bioquímico la ruptura de los enlaces en el formato del grupo acetilo unido al acetilCoA tiene un mayor grado de dificultad
enzimática. La producción de moléculas de mayor numero de carbonos pero que finalmente van a permitir la ruptura
progresiva de estos enlaces covalentes liberando a los 2 carbonos en forma de dióxido de carbono, estas moléculas de dióxido
de carbono no polares pueden difundir de manera simple a través de las membranas mitocondriales y de la membrana
plasmática y serán seguramente incorporadas a una molécula de hemoglobina que pase por un vaso sanguíneo cercano y luego
se va al sistema pulmonar donde se produzca el cambio de gases. Pero desde el punto de vista energético nuevamente la
ruptura de esos enlaces covalentes implicara la liberación de electrones de alta energía que serán capturados por las coenzimas
generando NADH a partir de NAD y FADH2 a partir de FAD y que estas series de reacciones recibe el nombre de circulo
porque el último producto vuelve a ser la molécula de 4 carbonos que participo en la primera reacción. Mas haya entonces de
que las secuencias de estas reacciones permitan la ruptura de los enlaces covalentes que estaban comprimidos originalmente en
la molécula de acetato y que originalmente si seguimos el camino hacia atrás de la molécula del monosacáridos van a analizas,
que muchos intermediarios del ciclo de Krebs pueden ser utilizados como sustratos para reacciones anabólicas. Por ejemplo,
una de estas moléculas carbonadas en vez de seguir en el ciclo de Krebs puede ser utilizadas para generar (producir) algunos
aminoácidos. Por eso el ciclo de Krebs es un núcleo del metabolismo, contiene un conjunto de moléculas que puede el origen
de unas ciertas reacciones de anabolismo o el destino de catabolismo, del mismo modo la degradación de aminoácidos puede
generar componentes que ingresan al ciclo de Krebs y que contribuyan a la producción de energía. Entonces lo que tenemos
que pensar a medida que el ciclo de Krebs progresa a medida que estas reacciones ocurren comienzan a acumularse en la
matriz mitocondrial, coenzimas reducidas comienzan a acumularse NADH y comienza a acumularse FADH2 allí está
contenido la energía de electrones de alta energía que originalmente estaban en los enlaces covalentes de los alimentos. Del
mismo modo el ciclo de Krebs nos permite comprender como se genera energía a partir de los lípidos, a partir de grasas y
aceites cuando lo consumos en los alimentos.

Ustedes saben que las grasas y aceites en general están enriquecidas de moléculas triacilgliceroles cuya ruptura metabólica
genera ácidos grasos. Y los ácidos grasos también son una fuente para obtener AcetilCoA dentro de la matriz mitocondrial, es
decir el AcetilCoA no solo será producto del piruvato que es descarboxilado en el interior de la matriz mitocondrial y que
proviene de la glucólisis, sino que también puede provenir de la ruptura de ácidos grasos en el interior de la matriz
mitocondrial. Esta serie de 4 reacciones químicas que permiten obtener moléculas de AcetilCoA a partir de las moléculas de
ácidos grasos recibe el nombre de β-oxidación. Pensemos que los ácidos grasos está compuesto por una cadena usualmente
larga de carbonos por ej. 18 o 24 carbonos pueden tener las moléculas de ácidos grasos, en cada una de estas serie de 4
reacciones él ácido graso se une a la coenzima y a lo largo de las 4 reacciones se produce una ruptura del ácido graso
generando solo la unión de solo 2 carbonos de la molécula del ácido graso a la Coenzima es decir se genera en cada serie de 4
reacciones, una molécula de AcetilCoA; que implicara entonces el acortamiento en 2 carbonos de la molécula del ácido graso.

¿Cuántas moléculas de AcetilCoA puede generar, en una serie de reacciones de β-oxidación un ácido graso de 18 átomos de
carbono? una molécula de ácido graso de 18 átomos de carbono puede generar, luego de diversas reacciones de β-oxidación
número total de 9 moléculas de AcetilCoA. Por ende, en términos metabólicos los ácidos grasos son mucho más energéticos
que los hidratos de carbono, se pueden esperar muchas más moléculas de AcetilCoA por cada molécula de ácido graso que el
número de moléculas de AcetilCoA que se puede generar por cada mono sacárido. Y por ende las grasas suelen ser el
mecanismo preferido de almacenamiento energético de la endotérmica. No solo son más energético por unidad de moléculas
sino que desde el punto de vista del espacio que ocupa, los lípidos se almacenan de una manera mucho más eficiente porque al
ser no polares, no incorporan agua a las moléculas, los hidratos de carbono por ej. el glucógeno se hidrata en el citosol de la
célula y ocupa un menor volumen , ese volumen es mucho menor que el volumen ocupado por las moléculas de ácidos grasos
en el interior del citosol; y es una segunda razón por cual las grasas son el mecanismo preferido del almacenamiento
energético dentro de la célula a largo plazo. Entonces generar moléculas de AcetilCoA, generadas por los ácidos grasos del
mismo modo de las moléculas de AcetilCoA generadas por el piruvato que provienen de los hidratos de carbono, ambos
conjuntos van a seguir las reacciones del ciclo de Krebs y por ende van a contribuir al almacenamiento de coenzimas reducidas
de NADH y FADH2 en la matriz mitocondrial.
Llegado a este punto: Tenemos que hacer la siguiente vinculación → ¿Qué relación existe entre la generación de las moléculas
NADH y FADH2 (estos procesos de acumulación de coenzimas reducidas) con el fenómeno de producción de ATP? ¿Qué
relación hay entre esta oxidación y la fosforilación que necesitamos para producir APT?
Recordemos la hipótesis primaria que tenían los bioquímicos en aquel momento era que las reacciones de producción de ATP
eran fosforilaciones a nivel de sustrato, es decir la obtención de un fosfato de una molécula orgánica directamente transferida a
una molécula de ADP. Pero no se encontraba para los años 60 ni cual era ese intermediario fosfatado a partir del cual se iba a
obtener el fosfato ni cuál era la enzima que iba a producir esta reacción. A demás en esta hipótesis que no cerraba, otro aspecto
que no se podía explicar era ¿Por qué eran necesarias las membranas mitocondriales para producir ATP? Algo que era
observado en los experimentos solo cuando estaban las membranas mitocondriales se producía ATP en las fracciones
mitocondriales, pero no se podía explicar por qué las membranas eran necesarias. Aun cuando se extrajera todas las proteínas
de las membranas y las proteínas purificadas de las membranas se pusieran en un tubo, esas proteínas totales purificadas no
lograban producir el ATP, que se producía cuando estaban las membranas mitocondriales completas. Un científico Ingles en los
años 60 elaboro una hipótesis que permitió, luego ser corroborada experimentalmente que cambio el modo de pensar sobre
estas reacciones, luego permitió explicar esta relación existente de cómo se puede vincular en las células, la energía
almacenada en las coenzimas reducidas respecto de los fenómenos de fosforilación. Y este científico fue Peter Mitchell que en
el año 1961 publica un trabajo de investigación en la revista Science, en donde propone un método alternativo que va a
denominarse la teoría quimiosmótica. En esta teoría quimiosmótica que es el mecanismo que ya han estudiado en el CBC, de
producción de energía, implica que no hay una relación directa entre la oxidación y la fosforilación, sino que hay un espacio
intermedio fisicoquímico. La energía contenida en estos electrones de alta energía va a utilizarse para generar un gradiente
electroquímico, la acumulación de un ion en uno de los lados de la membrana y va a ser la disipación de ese gradiente lo que
libera la energía necesaria para la producción de ATP. La existencia de este intermediario, que no hay una transferencia directa
desde los electrones al ATP, sino que la energía de los electrones se utiliza para generar un gradiente y luego la disipación del
gradiente es directamente acoplada al fenómeno de fosforilación es el modelo propuesto por Mitchell. Que fue corroborado en
parte por el mismo y otros científicos años después.

Le preguntaba Mitchell ¿Conoces alguna enzima que pueda producir ATP gracias a la disipación de un gradiente
electroquímico? Sabemos que estas coenzimas reducidas que se acumulan en la matriz mitocondrial van a transferir sus
electrones a una serie de complejos proteicos que están en la membrana mitocondrial interna y que se denominan complejos
respiratorios. Cada uno de los complejos respiratorios está formado por más de 40 polipéptidos cada uno de estos complejos
respiratorios. ¿Cómo se produce estos fenómenos de oxido-reducción o de cadena de transporte de electrones?

Se producen de manera espontánea porque cada uno de estos complejos respiratorios tienen progresivamente un mayor
potencial de reducción respecto del complejo anterior, de modo tal que esas reacciones de pasaje de electrones a medida que
son crecientes los potenciales de reducción de cada uno de los complejos se producen de manera espontánea liberando energía.
¿Qué ocurre con esa energía libera por esos procesos de oxido-reducción que es utilizada para hacer cambios
conformacionales? En estos complejos respiratorios que les permiten bombear protones en contra de su gradiente de
concentración, es decir la energía de la oxido-reducción es utilizada en bombear protones y generar un gradiente, que será más
concentrado en el espacio intermembrana y menos concentrado en la matiz; es decir genera una diferencia de potencial en la
matriz, más negativa en la matriz y más positiva en el espacio intermembrana. Esa polaridad que solo va a producirse cuando
esté funcionando la cadena de transporte de electrones, es la que habíamos visto la que favorecía la incorporación de proteínas
en los procesos de transporte a través de la matriz mitocondrial. ¿No era que proteínas por su estructura peptídica eran malos
aceptores temporarios de electrones, como es posible entonces que estos complejos respiratorios fundamentalmente peptídicos
participen de estas reacciones de oxido-reducción?
Muchas de las proteínas que están presentes, que forman parte del complejo respiratorio poseen estructuras adicionales no
peptídicas que le permiten funcionar como receptores temporarios de electrones. Por ejemplo, muchas proteínas contienen
citocromos, los citocromos no son otra cosa que un grupo hemo, una molécula orgánica que posee en su interior un átomo de
hierro que puede actuar como el aceptor temporal de electrones metidos en una estructura peptídica. Otra de las proteínas muy
frecuentes también en los complejos respiratorios es la ferro sulfuro proteínas que contiene en este caso átomos de azufre y de
hierro que también suelen ser aceptores temporales de electrones, otras moléculas adicionales orgánicas pequeñas como la
ubiquinona permiten también actuar como moléculas que transfieren temporariamente electrones en estas reacciones de oxido-
reducción. Y como les decía la secuencia en las que los electrones van a ir recorriendo desde las coenzimas reducidas a los
complejos respiratorios se da en un orden que sigue el potencial de reducción creciente, siendo que todas estas reacciones sean
espontaneas y liberación de energía. ¿Cuál es último aceptor de electrones? Es aquella molécula que posee mayor potencial de
reducción de todos, el oxígeno molecular, el oxígeno actúa entonces como el ultimo aceptor de electrones que estaban en las
coenzimas reducidas y que originalmente estaban en los enlaces covalentes de los lípidos y monosacáridos que comenzaron a
oxidarse, porque es el que tiene mayor potencial de reducción. Cuando el oxígeno se reduce con 4 electrones produce 2
moléculas de agua, por ende, necesitamos para que la cadena de transporte de electrones funcione de manera continua
necesitamos un aporte continuo de oxígeno, porque el oxígeno está constantemente aceptando los electrones y
transformándose en moléculas de agua y eso explica entonces el fenómeno vital del intercambio de gases. Necesitamos el
intercambio de gases hacia el último aceptor de electrones de la cadena respiratoria y necesitamos liberar el dióxido de
carbono que surge de las reacciones de descarboxilación de las moléculas durante el mismo proceso de oxidación. Notemos
entonces que comprender la lógica de la cadena respiratoria nos permite comprender, por ejemplo, la acción de ciertos venenos
respiratorios que suelen ser tóxicos y causar la muerte de mamíferos y a los seres humanos en particular. por ejemplo, el
cianuro como veneno porque inhibe de manera irreversible al complejo respiratorio 4 y por ende también bloquea el transporte
de electrones, dado que todos los complejos respiratoria previos quedan saturados de electrones sin poder entregarle al último
aceptor los electrones y esto en ultima estancia detendrá el bombeo de protones y por ende la síntesis de ATP. Entonces el
bombeo de protones en contra el gradiente de concentración, genera una forma de acumulación de energía potencial que
Mitchell demostró, que esta energía potencial generada por la acumulación de protones en el espacio intermembrana, pueden
liberar energía al disiparse a través de una proteína transmembrana la ATP sintetasa, que es finalmente la enzima que explica
como la disipación de ese gradiente a través de esta enzima, es utilizada cuando se disipan los protones en el gradiente de
protones a través del poro generado por la ATP sintetasa, se produce un cambio conformacional en esa enzima que permite que
esa enzima haga chocar una molécula de ADP y a una molécula de fosfato permitiendo la generación de enlaces covalentes de
modo tal que la energía contenida en este gradiente va a quedar almacenada en los enlaces covalentes de las moléculas de ATP
generada por la acción de la ATP sintetasa. De este modo la teoría quimiosmótica de Mitchell permite explicar la producción
de ATP generada por la producción de gradiente temporario de protones.

Fosforilación oxidativa es que comprender este camino fisiológico no solo nos permite entender el mecanismo de producción
de ATP y cómo funcionan los venenos respiratorios. Sino que nos permite explicar la acción de ciertas moléculas, por ejemplo,
los desacoplantes de la cadena respiratoria de transportes de electrones; por ejemplo, una de estas moléculas desacoplantes es
el di nitrógeno.

Cuando uno dice que las mitocondrias están acopladas, lo que esta acoplada es la transferencia de electrones a través de los
complejos respiratorios respecto a la formación de un gradiente electroquímico que luego va a ser utilizado para formar ATP.
Pero notemos que ese gradiente solo puede formarse, gracias a una de las propiedades de su impermeabilidad. Gracias que es
impermeable a lociones, los protones que son bombeados pueden acumularse para formar un gradiente y solo pasar a través de
la ATP sintetasa. Pero hay moléculas como el dinitrofenol que produce poros temporarios, en la membrana mitocondrial
interna entonces el dinitrofenol cuando es administrado a las células y genera poros en la membrana mitocondrial interna
permitirá que los electrones circulen por la cadena respiratoria de electrones que existen reacciones de oxido-reducción pero
impedirá que se forme el gradiente de protones, dado que cuando los protones son bombeados volverán a favor del gradiente
de concentración a través de los poros generados por el dinitrofenol , o sea ¿habrá producción de ATP bajo condiciones de
desacoplamiento? No porque el ATP puede producirse por la disipación de ese gradiente a través de la ATP sintetasa, sin
embargo ¿funciona la cadena de transporte de electrones? Si, entonces el mecanismo es diferente con respecto a la cadena
respiratoria. Es interesante notar que cuando las membranas están desacopladas esa energía que no logra ser almacenada en
forma de ATP se disipa en forma de calor y las mitocondrias desacopladas aumentan su temperatura. Este mecanismo es
utilizado bajo unas condiciones fisiológicas por ejemplo el tejido que conocemos como grasa parda, el tejido adiposo parda
puede producir bajo ciertas condiciones proteínas que desacoplan a las mitocondrias de ese tejido que permeabiliza la
membrana de ese tejido. En consecuencia, cuando el tejido graso parda esta desacoplando a sus mitocondrias ese tejido se
vuelve tejido que produce calor, que produce termogénesis. Grasa parda por el alto contenido de las mitocondrias de los
adipocitos y el alto contenido de mitocondrias presenta un alto contenido de citocromos y los citocromos suelen estar
coloreados y eso es lo que le da el color a la grasa parda.
….QUEDO PENDIENTE PEROXISOMAS…

Seminario 9

Seminario 10

Seminario 11

Seminario 12 de Falzone

Cáncer
Un tumor se desarrolla a partir de una única célula que prolifera de manera anormal. A partir de una célula mutada
se producen células descontroladas ya crecidas. Un tumor puede ser benigno o maligno.
Un tumor benigno permanece confinado en su localización original, sin invadir el tejido sano adyacente ni
propagarse a lugares distantes del cuerpo.
Un tumor maligno es capaz de invadir el tejido normal y propagarse por el cuerpo mediante sistemas circulatorios o
linfáticos. Solo a estos se los denomina canceres, y es su capacidad para invadir y dar lugar a la metástasis
(distribución de tumores en todo el organismo) lo que lo convierte al cáncer en algo tan peligroso.
También se clasifican de acuerdo al tipo de célula del que proceden:
Los carcinomas: son alteraciones epiteliales.
Sarcomas: son tumores sólidos de tejidos conectivos como el musculo, el hueso, el cartílago y tejido fibroso.
Las leucemias y los linfomas: surgen a partir de células hematopoyéticas y de células del sistema inmune.
Causas del Cáncer

La primera alteración es la proliferación continua e incontrolada de las células cancerosas. Estas crecen y se dividen
de manera incontrolada, invadiendo órganos y tejidos sanos, diseminándose por todo el cuerpo. La pérdida del
control del crecimiento que muestran las células cancerosas es el resultado de la acumulación de alteraciones en
múltiples sistemas reguladores de la célula y se refleja en varios aspectos del comportamiento celular.

Desarrollo

Los tumores se desarrollan a partir de una única célula que prolifera de manera anormal. Es un proceso multietapa,
en el que las células se convierten en malignas progresivamente a través de una serie de alteraciones. Se considera
un proceso multietapa constituido por la mutación y selección de aquellas células con capacidad cada vez mayor de
proliferación, supervivencia, invasión y metástasis.
La iniciación del tumor se debe a una alteración genética que provoca la proliferación anormal de una única célula.
La proliferación celular da lugar a una población clonal de células tumorales.
La progresión del tumor ocurre a medida que se acumulan mutaciones adicionales en las células de la población del
tumor que les confieren ventajas selectivas, por lo que los tumores crecen y aumentan su carácter maligno e
invasivo. Este proceso se denomina selección clonal, ya que un nuevo clon de células tumorales evoluciona en
función de su ritmo de crecimiento más rápido o de otras propiedades, que les confiera una ventaja selectiva.
Progresión tumoral

Ocurre la remodelación de la matriz extracelular que está dada por las metaloproteasas. Estas proteínas degradan la
MEC, lo que permite a las células cancerosas invadir los tejidos normales adyacentes. La acción de las
metaloproteasas sobre la MEC es muy importante porque es capaz de alterar las uniones célula-MEC y célula-
célula, mediar la liberación, activación o desactivación de moléculas señalizadores autocrinas o paracrinas
(activadores de angiogénesis, por ejemplo) y activar o inactivar los receptores de la superficie celular.
Y también suceda la generación de nuevos vasos sanguíneos. Esto se denomina angiogénesis. La angiogénesis es
necesaria para mantener el crecimiento de un tumor por encima de un tamaño de un millón de células, en el que se
requieren nuevos vasos sanguíneos para proporcionar oxígeno y nutrientes a las células tumorales en proliferación.
Estos vasos se forman en respuesta a los factores de crecimiento secretados por células tumorales. También es
importante la formación de nuevos capilares para el establecimiento de metástasis.
Propiedades de las células cancerosas
• Manifiestan alteraciones en los mecanismos que regulan la proliferación, diferenciación y supervivencia
celular hormonal
• Siguen creciendo hasta alcanzar una densidad elevada de células en cultivo, de la misma manera que ocurre
con la proliferación incontrolada
• Continúan moviéndose tras contactar con otras, migrando sobre células adyacentes y creciendo en patrones
multicapa desordenados
• Son capaces de crecer en ausencia de factores de crecimiento
• Producen factores de crecimiento que estimulan su propia proliferación (estimulaciones autocrinas de
crecimiento)
• Tienen menor capacidad de adhesión que las células normales
Genes reguladores de la proliferación celular
Genes supresores de tumores: es un tipo de gen que elabora una proteína que se llama proteína supresora de
tumores, la cual ayuda a controlar el crecimiento celular o lo frena. Las mutaciones en genes supresores de tumores
pueden conducir al cáncer. Como, por ejemplo, p53, el retinoblastoma y el microARN (que puede ser también un
oncogén).

La función del P53 en estado normal es la de regulación del ciclo celular ante un daño del DNA. Cuando el ADN se
daña, el P53 se acumula en el núcleo, y es capaz de detener el ciclo celular en G1 antes que se duplique el ADN e
iniciar su reparación. P53 va a inducir la síntesis de proteínas inhibidoras de los complejos ciclina-CDKs,
bloqueando el ciclo celular. Si se repara la lesión el ciclo continúa, pero si no se repara se induce la apoptosis de la
célula. La alteración de la proteína P53 produce inestabilidad genómica, siendo las células incapaces de evitar la
proliferación o activar la apoptosis, cuando está comprometida la integridad del ADN, de manera que son capaces
de acumular las mutaciones para completar la carcinogénesis y continúan dividiéndose.

El retinoblastoma (Rb) inhibe el paso a través del punto de restricción en G1 reprimiendo la transcripción de
determinados genes relacionados con la progresión del ciclo celular y la síntesis de ADN. El paso a través de estos
puntos se regula por los complejos Cdk4, 6/ciclina D, que fosforilan e inactivan a Rb. Por lo tanto, la inactivación
de Rb en los tumores supone la pérdida de un regulador negativo de la progresión del ciclo celular.
Protooncogenes: es un que participa en el crecimiento normal de las células. Las mutaciones en un protooncogén
pueden hacer que este se convierta en un oncogén, que puede hacer que se formen células cancerosas.
El microARN puede funcionar como gen supresor de tumores o como oncogenes.
A estos se los considera reguladores de la expresión génica en las células eucariotas. Participan en la regulación de
una tercera parte de los genes que codifican proteínas, por eso es muy posible que estén implicados en el desarrollo
tumoral.
Hay ARNmi que se amplifican en varios tipos tumorales y actúan sobre ARNm que codifican proteínas que inhiben
la progresión del ciclo celular (inhibidor de Cdk p21) o favorecen la apoptosis (Bcl-2 Bim)
Vías por las que un proto-oncogén puede convertirse en un oncogén:
• Mutaciones puntuales: una sustitución de un par de bases por otro par en una secuencia de ADN
• Reordenamiento cromosómico: una parte de un cromosoma se liga al otro cromosoma, el resultado es un
cromosoma híbrido detectable en el cariotipo. Esto da lugar a una alteración en la transcripción del ADN.
• Por amplificación de genes: las células eucariotas están formadas por un genoma diploide. En determinadas
circunstancias una de las copias puede multiplicarse miles de veces aumentando su tasa de expresión, dando
lugar a la amplificación del gen. Es uno de los mecanismos más implicados en la carcinogénesis.
Los principales sospechosos de mutaciones relacionadas con el cáncer son los oncogenes, genes supresores de
tumores mutados, y los genes de reparación del ADN defectuoso, las mutaciones que figuran a continuación
también hacen daño:

• Activar y desactivar carcinógenos

• Control de suicidio celular (apoptosis)
• Control de la señalización celular
• Control de la diferenciación celular

Necrosis y Apoptosis

A nivel celular existen dos formas de morir: por necrosis o por apoptosis. Por necrosis mueren las células
accidentalmente cuando son lesionadas por agresión mecánica o tóxica. Por apoptosis mueren las células cuando
son inducidas a suicidarse.
En la muerte por necrosis se detectan una serie de cambios característicos:
• Las células y sus orgánulos se hinchan porque se altera la capacidad de la membrana plasmática para
controlar el paso de los iones y el agua
• Las células se rompen y su contenido se vierte al espacio intercelular
Se origina inflamación de los tejidos adyacentes
• Las membranas se rompen
Las células que son inducidas a sufrir apoptosis o suicidio celular presentan las características siguientes:
• Reducen su tamaño
• Sus mitocondrias se abren y dejan salir el citocromo c
• Las membranas no se rompen, la célula se va fragmentando en cuerpos apoptóticos
Los aspectos morfológicos de la apoptosis:
• Disminución del volumen celular
• Se generan ampollas en la membrana plasmática
• Los núcleos se rompen
 • La célula se fragmenta en núcleos picnóticos

La apoptosis tiene dos vías, una extrínseca y una intrínseca. La vía extrínseca es la que necesita una señal externa,
de afuera de la célula que la induzca.

Extrínseca: existen receptores fas con dominios externo e interno en la membrana celular. Se adaptan a él, el
ligando fas y proteínas FADD. Este complejo de tres partes envía señales para que la procaspasa 8 llegue y se
adjunte a ellos, liberando la caspasa 8 ya activa, en forma de tetrámeros. Estos tetrámeros activan la caspasa 3, la 6
y la 7. La caspasa 7 empieza a deshidratar el citoplasma, la 3 induce la fragmentación del ADN y la formación de
cuerpos apoptóticos, y la 6 se encarga de los procesos apoptóticos.

Intrínseca: se da en la mitocondria y no necesita ninguna señal. Involucra tres tipos de proteínas, las anti apoptóticas
(BCL-2 y BCL-XL), las proapoptóticas (BAX y BAK) y las proapoptóticas (BID, PUMA y BAD). Las proteínas
PUMA y BAX se juntan y comienzan un proceso de ruptura de la membrana externa mitocondrial. Cuando esta
abertura surge, el citocromo C de la mitocondria se libera hacia el citosol. Luego, el citocromo C se une a una
proteína Apaf-1 y al ATP. Este último complejo forma un apoptosoma. Para que este comience a funcionar, cuando
se forman varios apoptosomas se une a este la caspasa 9 que forma un anillo, al que se va a unir la caspasa 3 para
que comience el proceso de apoptosis intrínseca. Proteínas mitocondriales como la SMAC/Diablo entran al
citoplasma donde se unen a las proteínas citoplasmáticas que actúan como inhibidores de la apoptosis llamada IAP y
las inactivan. Estas IAP, bloquean la activación de las caspasas, incluidas las caspasas efectoras como la 3, para
mantener viva a la célula.