03/06/2019

Trabajo Práctico de
Laboratorio: Cultivo de
Saccharomyces Cereviceae
en un Biorreactor de
Tanque Agitado
Ingeniería de las Reacciones Químicas

M. Eugenia González
 M. Eugenia González

Trabajo Práctico de Laboratorio:

Cultivo de Saccharomyces
Cereviceae en un Biorreactor de
Tanque Agitado
Ingeniería de las Reacciones Químicas
PARTE A: ESTIMACIÓN DE BIOMASA EN UN CULTIVO EN BIORREACTOR
TANQUE AGITADODISCONTINUO DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE

I. Objetivos
El objetivo del presente trabajo es el de aplicar estos métodos de estimación de
biomasa para monitorear el crecimiento de la levadura Saccharomyces cerevisiae en
un cultivo discontinuo en biorreactor de tanque agitado.
II. FUNDAMENTO TEÓRICO
Biomasa es un término general que se refiere a los microorganismos presentes en un
sistema. A la vez también se puede referir
como la cantidad de células, de personas o
masa de seres vivos. El objetivo de la
biomasa es la reproducción de células. La
determinación de la biomasa es una de las
variables más importantes de un
bioproceso ya que su determinación nos
lleva a la comprensión de la eficiencia del
mismo. Se trata de una variable clave
para establecer las tasas de producción, de
consumo de nutrientes y el cálculo de los
balances de masa de cualquier proceso
Bioreactor de tanque agitado utilizado
biológico. Los métodos clásicos de
determinación de biomasa son métodos directos que se basan en el número de células
o en el peso celular. Para determinar la biomasa es necesario calcular el número de
células en una determinada muestra. Esto es importante en ciertas circunstancias;
por ejemplo, para determinar la inocuidad de muchos alimentos o drogas se requiere
cuantificar los microorganismos en esos productos. Los métodos para estimar el
número de microorganismos pueden medir la cantidad de células, la masa celular o
la actividad celular. Los métodos que cuantifican la cantidad de células son útiles
principalmente para enumerar organismos como bacterias o levaduras, mientras los
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M. Eugenia González

que miden la masa o actividad celular pueden utilizarse para todos los
microorganismos, incluidos los hongos filamentosos, en los que es difícil cuantificar
las células individuales
III. MATERIALES Y MÉTODOS
A. Materiales e instrumentos
Materiales
destilada
de ensayo
Tubos ependorf
de precipitación

Equipos
Centrifuga
(80ºC por 24 horas)
electrónica
Espectrofotómetro

METODOS

Microorganismo
Se utilizó la levadura Saccharomyces cerevisiae obtenida a partir de un pan de levadura de panificación
comercial.

Medio de Cultivo
Para llevar a cabo el trabajo práctico se utilizó un medio de cultivo (ML) que contiene 20g/l de glucosa,
10g/l de extracto de levadura y 20g/l de peptona de carne.

Activación
La activación del agente biológico se llevó a cabo en 3 matraces Erlenmeyer de 250ml. Se introdujo 50ml
de ML y se inoculó con 0,5g de levadura cada uno. Se introdujeron los matraces en un agitador orbital y
se cultivaron a 135rpm y 25°C por 12h.

Cultivo en biorreactor
El cultivo se llevó a cabo en un biorreactor de tanque agitado de 3l de volumen operativo. 1,850l de ML
y se inoculó con el inóculo obtenido a partir de los cultivos de activación (150ml). Las condiciones de
cultivo fueron 28°C, 180rpm y 2,1slpm (litros estándar de aire por minuto). Se tomaron muestras cada
hora y se estimó la biomasa del microorganismo.

2
 M. Eugenia González

Estimación de biomasa
Se llevó a cabo el seguimiento del cultivo a partir de dos métodos:
Densidad Óptica (DO): Se midió la absorción de luz a 600nm de una muestra de cultivo (3ml).
Cuando fue necesario, diluciones seriadas de la muestra con medio de cultivo fresco fueron
realizadas a fin de que el valor medido se encontrara en el rango de 0,1 –
0,9 unidades de absorción.

Peso Seco (CDW): Se centrifugaron 16ml del cultivo (por cada muestra), en tubos eppendorf de
1,5ml de capacidad, a 13500rpm y 18°C por 15 minutos. Se retiró el sobrenadante y se redisolvió el
pellet formado en cada tubo con 1ml de agua destilada.
Esto fue necesario para transferir toda la biomasa a un único tubo eppendorf, al que previamente
se le midió el peso. Luego, se centrifugaron los tubos correspondientes a cada muestra en las
mismas condiciones, se retiró el sobrenadante y se llevaron a estufa a 80°C por 24h. Por último, se
pesaron en una balanza analítica para determinar la masa de biomasa producida.

IV. RESULTADOS
1. La curva de calibración (CDW vs DO) para la estimación de biomasa.

CDW vs DO
0,08
0,07 y = 0,0117x + 0,0043
R² = 0,8722
Peso Seco mg

0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
0 1 2 3 4 5 6
Densidad Optica

2. La curva de crecimiento del microorganismo

Perfil de concentracion de Biomasa

0,0045
Concentracion de Biomasa en

0,004 y = 0,0004x - 1E-05

0,0035 R² = 0,907

0,003
mg/ml

0,0025
0,002
0,0015
0,001
0,0005
0
1 2 Nro. de 4muestra 8 16

La concentración de Biomasa surge del siguiente cálculo:

3
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𝑚𝑠 = (𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑇𝑢𝑏𝑜 + 𝑀𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑆𝑒𝑐𝑎) − (𝑃𝑒𝑠𝑜 𝐼𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑑𝑒𝑙 𝑡𝑢𝑏𝑜)

𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑆𝑒𝑐𝑜 (𝑔 )
𝑚𝐿 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 (𝑚𝐿)
3. Calculo de la velocidad de crecimiento de la levadura
Partiendo de la suposición del crecimiento equilibrado del cultivo llegamos a:

siendo :
𝑋𝑡 = 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑑𝑒 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑒𝑛 𝑓𝑢𝑛𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜
𝑋0 = 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑑𝑒 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙
𝜇 = 𝑉𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒 𝑐𝑟𝑒𝑐𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜
𝑡 = 𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜
Linealizando podemos obtener

Lo cual nos dice que graficando el Logaritmo natural de las concentraciones de biomasa la pendiente
de la recta será la velocidad de crecimiento

Curva de crecimiento
2
y = 0,213x - 0,688
1,5 R² = 0,8975
Ln(conc)

0,5

0
0 2 4 6 8 10 12
-0,5

-1
Tiempo (h)
𝜇 = 0.213ℎ−1
V.CONCLUSIONES
Se determinó la biomasa de la levadura mediante el método de peso seco y por Densidad Optica,
estimando su Biomasa y su velocidad de Crecimiento. La determinación de biomasa mediante peso seco
es un método fácil y rápido de realizar pero que también es un método impreciso debido a diversos
factores que se presentan en laboratorio. Encontramos el factor de conversión para este caso, logrando
construir la curva de calibración.

RECOMENDACIONES
1. Para obtener una muestra homogénea se debe agitar la muestra antes de colocarlas en las
celdas y de esta manera evitar errores en las lecturas del espectrofotómetro.
2. Calibrar el espectofómetro antes de tomar las medidas, ya que este pudo haber sido utilizado
con otras sustancias en experimentos anteriores. Del mismo modo calibrar la balanza analítica
par que nuestro porcentaje de error sea mínimo.

4
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PARTE B: MEDICION DEL COEFICIENTE DE TRANSFERENCIA DE OXÍGENO

EN UN CULTIVO EN BIORREACTOR TANQUE AGITADO DISCONTINUO DE
SACCHAROMYCES CEREVISIAE

I. Objetivos
El objetivo del presente trabajo es el de aplicar estos métodos dinámicos de medición
de transferescia de oxigeno; la determinación del coeficiente es esencial para evaluar
la eficiencia de aireación de un biorreactor y así poder satisfacer la demanda de
oxígeno de las células. Es decir, si kLa para un sistema es pequeño, la capacidad del
sistema para suministrar oxígeno al medio es limitada.
Existen diferentes métodos para calcular el kLa de un biorreactor, en el trabajo
práctico se utilizará el Método Dinámico de medición, como se menciono, para la
levadura Saccharomyces cerevisiae en un cultivo discontinuo en biorreactor de
tanque agitado.
II.FUNDAMENTO TEORICO
Método dinámico:

en este método solo es necesario medir la concentración de oxígeno en el fermentador a lo largo de un

tiempo determinado. De la ecuación diferencial

Para el estado estacionario:

Sustituyendo 𝑞0 𝑥 en la ecuación diferencial queda como

Integrando para un tiempo determinado queda la fórmula para calcular el coeficiente global de
transferencia de oxígeno (masa) en un fermentador:

5
M. Eugenia González

III. RESULTADOS
Con los datos obtenidos a partir de la experiencia de laboratorio realice:

a) Perfil de concentración a partir de la experiencia del laboratorio.

Perfil de concentracion de O2 Vs. Tiempo

(s)
Series1 -OUR Series3 Lineal (-OUR) Lineal (Series3)

20
18 y = 0,0903x - 5,4779
16 R² = 0,9692
ESTADO NO
14 ESTACIONARIO
y = -0,2397x + 33,19
tiempo (s)

12 R² = 0,985
10
8
6
4
2
0
0 50 100 150 200 250 300 350
concentracion de oxigeno disuelto mg/l

b) Calculo de velocidad del consumo de oxigeno (OUR).

Según el grafico en el inciso (a) durante la etapa de reoixigenacion el sistema se encuentra en estado
no estacionario. La velocidad con que varia la concentración de oxigeno disuelto durante este periodo
es igual a la velocidad de transferencia de oxigeno desde el gas hasta el liquido menos la velocidad de
consumo de oxigeno por las células(OUR).

La pendiente de la parte descendente de la curva del estado estacionario representa el valor de OUR.

OUR y = -0,2397x + 33,19

R² = 0,985
18

16

14

12

10

0
0 20 40 60 80 100 120 140

6
 M. Eugenia González

c) Calculo de KLA
Planteando el balance en estado no estacionario de la re oxigenación como vimos en la teoría llegamos
a que:

Entonces si graficamos la concentración en función de el tiempo la pendiente de la recta del mismo

seria mi coeficiente de transferencia Kla

0,8
0,7
0,6
y = 0,008x - 0,942
lln de Ca

0,5 R² = 0,9205

0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 50 100 150 200 250
tiempo

7
M. Eugenia González

PARTE C: CUESTIONES

Teniendo en cuenta la Ley de Henry, ¿Cómo cree que afectaría el alto de un fermentador
en la solubilidad del O2 en el medio de cultivo? ¿Qué otros parámetros podría modificar
para incrementar la concentración de O2 en el medio de cultivo?
Si el fermentador es más alto tengo mayor presión parcial del oxígeno en el líquido.

Transferencia de oxígeno en un biorreactor

En un reactor biológico las células toman al oxigeno que se encuentra disuelto en el medio acuoso, por
lo tanto, la transferencia de masa (oxígeno) de la fase gaseosa al líquido es de vital importancia.
El modelo que representa la transferencia de masa del gas al líquido es: 𝑁𝐴 = 𝐾𝐿𝐴(𝐶𝐴𝐿 ∗ − 𝐶𝐴𝐿)

Los factores que afectan a la demanda de oxígeno en un fermentador son los siguientes:
a) La especie celular
b) Las propiedades del medio de cultivo
c) La naturaleza de la fuente de carbono en el medio
d) La fase de crecimiento celular.
La demanda de oxigeno es función del tiempo o por lote debido a que considera la fase logarítmica de
crecimiento celular.

Velocidad especifica de consumo de oxígeno.

Es la velocidad con la que una célula consume oxigeno(𝑞0). Esta variable depende principalmente de la
naturaleza bioquímica de la célula y del medio de cultivo. Si 𝑄0 es la velocidad de consumo de oxígeno
por volumen de caldo, se tiene una ecuación matemática que es:
𝑸𝟎 = 𝒒𝟎. 𝒙
Donde
𝑥: es la concentración celular

Cuando la concentración de oxígeno en el medio caé por debajo de cierto valor, la velocidad de consumo
empieza a depender de la concentración de oxígeno.

8
 M. Eugenia González

Realice una búsqueda bibliográfica e indique otros métodos de determinación del kLA.
¿Cuál o cuáles podrían aplicarse con el biorreactor con el cual se trabajó?

Mecanismo de transferencia de oxígeno al medio

Se enlistan 8 pasos que obedecen a la transferencia de masa por difusión y por convección (1° y 2° ley
de Fick), se enlistan a continuación:
1. Transferencia del interior de la burbuja(gas) a la interfase gas-liquido
2. Transporte a través de la interfase gas-liquido
3. Difusión a través de la película estancada que rodea a la superficie del liquido
4. Difusión a través del seno del liquido
5. Difusión a través de la película de líquido estancado que rodea a la superficie celular.
6. Transporte a través de la interfase liquido-célula
7. Si las células están soportadas ocurre el transporte a través del solido hasta la célula.
8. Transporte a través del citoplasma al sitio de reacción
Las mayores resistencias a la transferencia de masa se encuentran en:
 La resistencia a la transferencia de masa en una burbuja es despreciable al igual que en la interfase
gas-liquido
 La transferencia en la capa del líquido que rodea a la burbuja es un paso limitante debido al espesor
de dicha capa1 . 1 (1Resistencia más importante a la transferencia de masa)
 En fermentadores bien mezclados el transporte de oxígeno a través del líquido es relativamente
rápida.
 Debido al tamaño de la célula, la capa del líquido que la rodea tiene un espesor muy pequeño por lo
que la resistencia a la transferencia de masa a través de este es relativamente baja.
 Si la célula esta soportada, entonces la capa que rodea al soporte ofrece una resistencia2 .
 La transferencia de O2 hacia la membrana es en cuanto a su resistencia despreciable.
Para el caso de fermentadores sumergidos en estado estacionario no hay acumulación de oxígeno en
ninguna parte de fermentador, por lo tanto la transferencia de oxígeno de las burbujas debe ser igual a
la cantidad de oxígeno consumido por las células.
De forma matemática el enunciado se ve de la siguiente manera:
𝑲𝑳𝑨(𝑪 𝑨𝑳 ∗ − 𝑪 𝑨𝑳) = 𝒒 𝟎 𝒙
Donde 𝐾𝐿𝐴: es el coeficiente global de transferencia de masa en cuanto al oxígeno
𝐶𝐴𝐿 ∗ : es la concentración de oxígeno en la interfase
La concentración celular que se puede soportar con ciertas condiciones de transferencia dadas es:

Para el cálculo del coeficiente de transferencia de masa crítica está dada por:

Medición experimental de 𝑲𝑳𝑨

Método del balance de oxígeno: se mide el contenido de oxígeno a la entrada y salida del
fermentador, con lo que se puede obtener la cantidad de oxígeno transferido por balance de materia de
oxígeno. Se modela de la siguiente manera: 2 Si el biorreactor es de lecho soportado (empacado) se
considera como la segunda resistencia más importante a la transferencia de masa.

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M. Eugenia González

Dónde: 𝑉𝐿: Volumen del líquido

𝐹𝐺: Flujo del gas
𝐶𝐴𝐺: Concentración del gas

Metodo de alimentación por Na2SO3:

se basa en la reaccion entre el sulfito de sodio con el O2 en medio ligeramente alcalino y en presencia de
iones Cu+2 o Co+2. El mismo, tal cual fue desarrollado, posee una simplicidad que lo hace muy util pero,
por otro lado, tienen el inconveniente de que como la reacción es muy rapida, el gradiente alrededor de
la burbuja se ve alterado y los resultados que se obtienen son sobredimencionados. Para solucionar ese
tema se desarrolló un método alternativo en el cual, en lugar de trabajar con la solución concentrada de
Na2SO3 en el reactor y con una concentración de O2 cercana a 0, se agrega una solución de Na2SO3 a
un caudal tal que toda la sal se consume al momento de ingresar al reactor. Como la velocidad de ingreso
de sulfito es menor la velocidad de trasferencia de O2, la concentración de O2 disuelto es distinta de 0.
Cuando se alcanza el estado estacionario el termino de consumo químico puede eliminarse de las
ecuaciones anteriores sustrayéndolas y se obtiene la ecuación que permite calcular el KLa
En las condiciones de operación, la concentración remanente de sulfito en el medio, la concentración de
O2 en la alimentación y en el reactor son despreciable frente a la concentración de sulfito en la
alimentación con lo que la ecuación.

Realice una búsqueda bibliográfica e indique de qué forma se produce Saccharomyces

cerevisiae (biomasa, levadura para panificación) a nivel industrial. Resulta de particular
interés que se señale el tipo de biorreactor utilizado, el sistema de cultivo (batch,
fedbatch,continuo), tipo de agitación (mecánica, neumática, etc.), etc.

SACCHAROMYCES CEREVISIAE

1. Taxonomía •Reino: Fungi Filo: Ascomycota Clase: Hemiascomycetes Orden:

Saccharomycetales Familia: Saccharomycetaceae Género: Saccharomyces Especie: S. cerevisiae

2. ¿Qué es la Saccharomyces cerevisiae? Saccharomyces cerevisiae es una levadura, un hongo

unicelular, del grupo de los ascomicetos, pariente de las trufas, colmenillas o el Penicillium. •
En la naturaleza se encuentra sobre sustratos ricos en azúcares o en los exudados y savias dulces
de algunas plantas.

3. El término "levadura”remite a la experiencia visual de la masa del pan que se "levanta" cuando
se añade levadura a la harina. Su nombre alternativo de "fermento” del latín fervere quiere decir
hervir y proviene del movimiento del mosto durante la producción de vino o cerveza.

4. Importancia en los alimentos: La Saccharomyces cerevisiae es fundamental es la cerveza y el

vino, ya que es por su metabolismo anaerobio por el que se produce alcohol.

5. METABOLISMO • Este organismo es conocido como “levadura del pan”, esto quiere decir que
sin dicho hongo no se produce el leudado y el CO2 se obtiene por medio de reacciones químicas,
como el Bicarbonato de sodio. Es sumamente importante, ya que es fundamental en dos de los
productos alimenticios más consumidos en Europa y América, principalmente.

6. REPRODUCCIÓN En Saccharomyces cerevisiae existen las cepas heterotálicas (condición

sexual en la cual la combinación de tipos de esporas es escencial para producir descendencia
fertil) presentando formas vegetativas tanto haploides como diploides, ambas capaces de
reproducirse asexualmente (Gemación) y formar colonias.

10 
 M. Eugenia González

La levadura que se utiliza en la panificación es la saccharomyces cerevisiae. Su temperatura óptima de

crecimiento varía entre los 22 y los 29ºC, y no sobrevive a más 53ºC. Se puede almacenar a temperaturas
de 7ºC o menores. Fermenta una solución de azúcar con una concentración inferior al 12%; se inactiva
cuando la concentración de azúcar supera el 15%, por la presión osmótica del medio (García, 1995). La
función de la levadura durante la fabricación del pan es generar dióxido de carbono, a partir de los
azúcares provenientes de la harina de trigo o los que se le adicionan. Además, la levadura produce otra
serie de compuestos que contribuyen al sabor y al valor nutritivo del pan, a causa de su alta composición
proteica. Para producir la levadura a escala industrial, los sustratos empleados son, por lo general,
melazas fortificadas con sales de amonio. Las melazas contienen un 50% de azúcar, así como sales y
compuestos orgánicos (García, 1995).

Imagen 1. Levadura saccharomyces cerevisiae (García, 1995).

PRODUCCIÓN DE LA LEVADURA.

La producción de levadura a escala industrial, se puede resumir en las siguientes etapas: el tratamiento
previo de la melaza, la obtención del inóculo de la levadura, y la separación y deshidratación de la
levadura (Hernández,2003). A continuación, se incluye una descripción de ellas.

a) El tratamiento previo de la melaza. La melaza se disuelve en agua y, luego, se esteriliza por

calor para impedir el desarrollo de microorganismos diferentes a la levadura. Una vez estéril, la melaza
se agita por medio de la introducción de aire comprimido estéril, y se deja reposar con el fin de que las
sustancias mucilaginosas (Viscosas) sedimenten. Después, el líquido sobrenadante se separa por
decantación, se le agregan sales de amonio, y se le ajustan el pH a 4.5 y la temperatura a 21ºC; así, se
convierte en el medio de cultivo en el que se desarrollara la levadura (Hernández, 2003).

b) La obtención del inóculo de levadura. El cultivo puro de levadura se obtiene en el laboratorio

por inoculación del microorganismo en placas de Petri, con sustratos de agar. Cuando hay crecimiento
en la placa, se trasladan las células a matraces pequeños, tipo erlenmeyer, que contienen líquidos
azucarados obtenidos por hidrólisis. Para aumentar poco a poco la escala del proceso, cada vez se utilizan
recipientes de mayor volumen (10, 100, 250, 700 y 2500 L) según se requiera (Hernández, 2003).

c) La reproducción de la levadura. La reproducción de la levadura se realiza en un recipiente de

fermentación grande (alrededor de mil litros) que contienen melazas como sustrato. La cantidad de
levadura que se utiliza en la inoculación es de 75 a 100 Kg. Después de la fermentación, que dura entre
9 y 12 horas, la levadura aumenta cinco veces su peso original (pesa entre 365 y 500 Kg). Conforme
avanza el proceso, es necesario suministrar una mayor cantidad de oxígeno para las levaduras; de otra
forma, el medio se tornará aerobio (que no utiliza oxígeno en su metabolismo) y la levadura, en lugar de
reproducirse, convertiría los azúcares en alcohol (Hernández, 2003).

d) La separación y la deshidratación de la levadura. La separación de la levadura del medio de

fermentación se hace, generalmente, por centrifugación seguida de decantación; luego, se lava con agua
y se deshidrata utilizando vacío. Posteriormente, se empaca en recipientes sellados herméticamente al
vacío o en una atmósfera de gas inerte para impedir el contacto del microorganismo con el medio y, así,
mantener su estado de inactivación (Hernández, 2003).

11 
M. Eugenia González

A través de los sistemas de cultivos continuos o batch alimentados, se alimenta el cultivo con un
componente que tenga un efecto crítico en el control de la fermentación. La principal ventaja de ir
añadiendo un componente del medio de a poco en vez de incorporar su totalidad al principio es que el
nutriente puede mantenerse a muy bajas concentraciones durante la fermentación. Un nivel bajo de un
nutriente (pero que se está reponiendo constantemente) permite:

 Mantener al cultivo dentro de los límites de capacidad de aireación del fermentador.

 Eliminar los efectos represores de los componentes del medio (fuentes de carbono, de nitrógeno o
fosfatos).

 Evitar los efectos tóxicos de un componente esencial del medio.

El método de cultivo mas ampliamente utilizado a escala industrial es el batch alimentado que permite
al tecnólogo un considerable control del proceso sin que se presenten las dificultades inherentes de los
sistemas de cultivo continuo. El BA es particularmente útil en procesos en los que el crecimiento celular
y/o la formación de producto son sensibles a la concentración del sustrato limitante, es decir cuando el
rendimiento celular o la productividad de la biomasa o del metabolito buscado se ven afectados. Así,
este método se emplea cuando se quieren evitar fenómenos de inhibición por sustrato y se requiere
alcanzar una alta concentración de biomasa.

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M. Eugenia González

13 