INTRODUCCIÓN AL CULTIVO CELULAR

El cultivo de tejidos se desarrolló a partir de los últimos años del siglo XIX como
una continuación de las técnicas de la embriología.
 Se considera al zoólogo americano R. G. Harrison como el iniciador de los
cultivos de tejidos animales.
 En 1907, Harrison fue el primer científico que empleó técnicas in vitro para
el estudio de fenómenos in vivo, realizando cultivos de médula espinal
embrionaria de anfibios.
 La primera limitación para el establecimiento de cultivos era lograr un medio
 nutritivo adecuado.
 Burrows y Carrel demostraron que la vida del cultivo se puede prolongar
mediante subcultivos. Los medios empleados fueron plasma suplementado
con extractos de embrión
 Rous y Jones (1916) emplearon por vez primera extractos enriquecidos en
tripsina para disociar las células de embriones de pollo, estableciendo el
primer cultivo celular.
Uno de los mayores problemas que describen para el establecimiento de los
cultivos celulares es la aparición de múltiples contaminaciones, por lo que
desarrollaron numerosos métodos de manipulación en condiciones de asepsia que
aún hoy día se utilizan.
En 1913 Carrel demostró la posibilidad de mantener en cultivo células extraídas de
un animal, embrión de pollo, durante un periodo de tiempo superior al de la vida de
éste. Mantuvo en cultivo células de pollo durante 34 años. Gran parte del éxito en
el mantenimiento de los cultivos se debió al desarrollo del denominado frasco de
Carrel.
Entre los años 1920 y 1940 se desarrollaron diferentes estrategias de obtención
de cultivos y de mantenimiento de las condiciones estériles, pero sin grandes
avances. A partir de los años 40, con el aislamiento de los primeros antibióticos,
se desarrollaron numerosas aplicaciones.

TIPOS DE CULTIVO CELULAR

Actualmente se entiende por cultivo celular al conjunto de técnicas que permiten el
mantenimiento de las células 'in vitro', manteniendo al máximo sus propiedades
fisiológicas, bioquímicas y genéticas. Se distinguen cuatro tipos de cultivo celular:

1.- Cultivo de órganos

Se coloca el órgano sobre una rejilla situada en la interface líquido-gas de un
medio del que obtiene los nutrientes y al que puede liberar los desechos. Este tipo
de cultivo permite mantener, al menos en parte, la arquitectura característica del
tejido “in vivo”. Sin embargo, no crecen mucho (la proliferación celular se limita a
las células embrionarias de la periferia) y no se pueden propagar.

2- Explantes primarios
Se coloca un fragmento de tejido o de órgano en la interface sólido-líquido de un
soporte de vidrio o de plástico. Las células se adhieren a la superficie y las células
de la periferia del explante pueden migrar y proliferar por la superficie del soporte.
3.- Cultivo celular primario
Es el tipo de cultivo más utilizado. Se puede obtener a partir de explantes
primarios o de suspensiones de células disgregadas. La disgregación celular se
realiza por métodos enzimáticos o mecánicos. Sin embargo, las células son
capaces de proliferar y la población celular crece notablemente.

Existen dos tipos de cultivo celular primario:

• Cultivos en mono capa: las células crecen adheridas sobre un soporte sólido
(plástico o vidrio).
• Cultivos en suspensión: las células se encuentran dispersas en el medio de
cultivo.

4.- Cultivos histotípicos y organotípicos

Los cultivos histotípicos son cultivos de un solo tipo celular que consigue alcanzar
una elevada densidad celular. El objetivo final de este tipo de cultivos es la
creación “in vitro” de tejidos u órganos completamente funcionales que puedan ser
utilizados en injertos o en trasplantes. Los cultivos organotípicos constituyen la
base de una nueva disciplina denominada ingeniería de tejidos.

Aplicaciones del cultivo celular

Los cultivos celulares se utilizan tanto en la investigación básica como en la
aplicada. En la investigación básica, permiten estudiar fenómenos complejos
como, por ejemplo:

• la actividad intracelular: transcripción de DNA, síntesis de proteínas,

metabolismo energético, ciclo celular, diferenciación, apoptosis, etc.

• el flujo intracelular de biomoléculas: procesamiento del ARN, el movimiento

del ARN desde el núcleo hacia el citoplasma, el movimiento de las proteínas
hacia diversos orgánulos, el ensamblaje y des ensamblaje de los microtúbulos,
etc.

• genómica y proteómica: análisis genético, infección, transformación celular,

inmortalización, senescencia, expresión génica, rutas metabólicas, etc.

• ecología celular: el estudio de las condiciones ambientales responsables del

mantenimiento de la funcionalidad celular y de su diferenciación, el estudio de
las necesidades nutricionales, la cinética de la población celular, etc.

• las interacciones celulares: morfogénesis, proliferación celular, adhesión

celular, interacciones con la matriz, invasión celular, etc.
En la investigación aplicada, las técnicas de cultivo celular utilizan en áreas tan
diversas como:
• Virología: Cultivo de virus animales y de plantas, producción de vacunas, etc.
• Biotecnología: producción industrial de fármacos en biorreactores (interferón,
insulina, hormona de crecimiento, etc.)
• Inmunología: Producción de anticuerpos monoclonales, señalización,
fenómenos de inflamación.
• Farmacología: Efecto de diversos fármacos, interacciones con el receptor,
fenómenos de resistencia, etc.
• Ingeniería de tejidos: Producción de tejidos artificiales (piel, cartílagos) para el
tratamiento de grandes quemados, injertos o autotransplantes, des diferenciación
y diferenciación inducida, etc.
• Toxicología: citotoxicidad, mutagénesis, carcinogénesis, etc.
COMO AFECTAN LAS CONDICIONES DE UN CULTIVO EN
LA CINETICA CELULAR

La proliferación celular es un proceso cuidadosamente regulado que responde a

necesidades específicas de) organismo. Sin embargo, los estudios relacionados
con la división celular han avanzado despacio y todavía hoy continúan
estableciéndose las etapas claves para comprender los elementos que
contribuyen a estimular y controlar los procesos de crecimiento.

Ciclo celular
Un ciclo celular es una secuencia de acontecimientos interconectados que
comienza con la formación de una nueva célula y termina cuando dicha célula se
divide en otras dos hijas. Los ciclos celulares se describen generalmente
atendiendo a una serie de eventos identificables que se van produciendo en una
secuencia fija, de modo que para que se produzca cada uno de ellos hace falta
que se complete el anterior. Los periodos del ciclo celular procariótico son:

fase C (equivalente a la S eucariótica): replicación del ADN cromosómico;

fase D (equivalente a G2 + M): se distingue porque su terminación coincide con
el final de división celular;
fase innominada, equivalente a la G 1 eucariótica.

Lo característico del ciclo es que las fases C y D son relativamente constantes,

y, por lo tanto, cuando disminuye el tiempo de generación (g), lo hace a expensas
de la fase “G1”. Por ejemplo, en Escherichia coli, C = unos 40 min, y D= unos 20
min.

Las células tanto en cultivo como ‘in vivo” crecen a medida que avanzan por las
etapas del ciclo celular. Sin embargo, muchas células animales existen “in vivo” en
un estado quiescente, es decir, sin aumentar su masa, o sin pasar por el ciclo
celular. En la primera fase del ciclo, denominada fase de crecimiento o fase G~ las
células aumentan de tamaño. Después, replican todos sus cromosomas en la fase
de síntesis o fase 5. A continuación sucede una segunda fase de crecimiento 62
donde las células se preparan para la división celular y finalmente se dividen en la
fase M de mitosis para posteriormente llegar a una bifurcación tras la división del
citoplasma (citocinesis>. Todas las células hijas producto de la división celular

pueden volver a entrar en el ciclo y dividirse de nuevo. La duración del ciclo celular
varía de unas células a otras. La mayoría de las líneas celulares mantenidas en
cultivo a 370C emplean entre 18 y 24 horas. Las fases G1, 5 y G2 se denominan
en conjunto interfaces. G1 y 5 suelen durar entre 8 y 10 horas, G2 dura
aproximadamente 4-5 horas, mientras que las células experimentan la división
celular en un tiempo muy corto, alrededor de una hora. Sin embargo, una célula
hija también puede abandonar el ciclo celular y entrar en la fase G0 o quiescencia
donde se diferencia hasta adquirir la capacidad para desempeñar la tarea que le
corresponda en alguno de los tejidos del organismo.

CULTIVO CONTINUO (SISTEMAS
ABIERTOS). QUIMIOSTATO
            El cultivo continuo es un cultivo balanceado mantenido por tiempo
indefinido por un sistema abierto de flujo que se compone de:

una cámara de cultivo de volumen constante,

a la que llega un suministro de nutrientes,
y de la que se eliminan o separan los productos tóxicos de desecho (por un
dispositivo de rebosadero).

Una vez que el sistema alcanza el equilibrio, el número de células y la

concentración de nutrientes en la cámara permanecen constantes, y
entonces se dice que el sistema está en estado estacionario, con las
células creciendo exponencialmente.

Los parámetros a tener en cuenta son:

flujo (f), medido en ml/h

volumen de la cámara de cultivo (v, en ml)
densidad celular en la cámara (x)
factor de dilución D = f/v (en h-1).

Existe una pérdida de células por el rebosadero: -dx/dt = x·D

El crecimiento bruto es dx/dt = x·

Por lo tanto, el crecimiento neto es dx/dt = x· - x·D = x·( - D)

Si logramos que el coeficiente de crecimiento () se haga igual al factor

de dilución (D), entonces dx/dt = 0, y por lo tanto la concentración de
células se hace constante (x= x). El cultivo se encuentra entonces
en estado dinámico de equilibrio. Las pérdidas de células por drenaje
se compensan con las ganancias por crecimiento.
Una de las maneras de lograr un cultivo continuo es mediante el
llamado quimiostato: en el quimiostato podemos controlar de modo
independiente la densidad de la población celular y la velocidad de
crecimiento del cultivo. La densidad celular en el equilibrio se controla
ajustando el factor de dilución (D), mientras que la velocidad de
crecimiento se controla variando la concentración del nutriente limitante
en la cámara reservorio (SR).

En un quimiostato, los microorganismos pueden cultivarse a una amplia

variedad de tasas de crecimiento exponencial
El quimiostato permite crecimientos balanceados restringidos debido a que
existe un nutriente o sustrato presente en una concentración suficientemente
baja como para limitar la densidad de población.
Así pues, el quimiostato también permite elegir la densidad de células a la que
se quiere trabajar.
Algunos comentarios sobre el gráfico:

La densidad del cultivo es muy similar en un amplio margen de tasas de dilución

(D). Este margen es el más adecuado para hacer estudios en el quimiostato. En
cambio, el valor de tiempo de generación (g) varía ampliamente. O sea, el
quimiostato puede obtener tasas de crecimiento muy diferentes, sin que se
afecte la densidad celular.Sin embargo, a valores extremos de dilución, se
puede ver que el equilibrio se rompe:
A altas tasas de dilución la concentración microbiana cambia rápidamente, y en
un margen estrecho el cultivo puede drenarse totalmente (D C: dilución crítica).
Es decir, el cultivo se “lava” porque su velocidad de crecimiento es inferior a la
tasa de dilución.
A muy bajas diluciones (DM) el quimiostato no funciona si el nutriente limitante es
la fuente de energía. Ello se debe a que en esas condiciones, la fuente de
energía sólo se usa para reacciones de mantenimiento de la integridad celular,
pero no queda para el crecimiento. A este valor lo llamamos energía de
mantenimiento. Los procesos relacionados con esta energía de mantenimiento
son el potencial de membrana, el transporte de solutos y la renovación de
proteínas.

Aplicaciones del cultivo continuo en quimiostato:

Aportan una fuente continua de células en fase exponencial, lo que se aplica

a procesos industriales de fermentación (producción de bebidas alcohólicas,
 de antibióticos, de aminoácidos, etc).
En el quimiostato, el crecimiento a bajas concentraciones de sustrato permite
estudiar:

aspectos fisiológicos (por ejemplo, catabolismo del sustrato limitante);

selección de mutantes
estudios ecológicos.

6 CULTIVO EN SISTEMAS
          

CERRADOS
            En los sistemas cerrados (que pueden ser líquidos o sólidos), no
existe aporte continuo de nutrientes, ni drenaje de células ni de
sustancias de desecho.

            En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento

balanceado no restringido dura sólo unas cuantas generaciones,
debido al agotamiento de nutrientes y/o a la acumulación de desechos.