Técnicas de fijación

Fijación y procesamiento de tejidos

Fijación

La estructura de un tejido está determinada por las formas y tamaños de macromoléculas en y

alrededor de las células. Las macromoléculas principales dentro de una célula son proteínas y
ácidos nucleicos. En los animales vertebrados, las macromoléculas en las superficies externas de
las células y en los espacios extracelulares son glucoproteínas y proteoglicanos, en los que gran
parte del material de carbohidratos se une covalentemente a las moléculas de proteínas. Los
carbohidratos son hidrofílicos; retienen mucha agua en el espacio extracelular, mediante enlaces
de hidrógeno. También hay, por supuesto, mucha agua dentro de las células; El agua representa
alrededor del 60% del peso del cuerpo humano. En los huesos y dientes, la hidroxiapatita, un
mineral cristalino que contiene iones de calcio y fosfato, domina el dominio extracelular, juntos
con colágeno, una proteína fibrosa. Una parte esencial de todas las técnicas histológicas y
citológicas es la preservación de células y tejidos a medida que ocurren naturalmente. Para lograr
esto, los bloques de tejido, secciones o frotis generalmente se sumergen en un fluido fijador,
aunque en el caso de los frotis, simplemente secar la preparación actúa como una forma de
preservación. Los fijadores empleados evitan la autólisis al inactivar las enzimas lisosómicas y
estabilizan la estructura fina, tanto dentro como entre las células, al hacer que las macromoléculas
sean resistentes a la disolución por agua y otros líquidos. Los fijadores también inhiben el
crecimiento de bacterias y mohos que dan lugar a cambios putrefactos.

Al realizar su función protectora, los fijadores desnaturalizan las proteínas por coagulación,
formando compuestos aditivos o por una combinación de procesos de coagulación y aditivos. Un
compuesto que se agrega químicamente a las macromoléculas estabiliza la estructura de manera
más efectiva si es capaz de combinarse con partes de dos macromoléculas diferentes, un efecto
conocido como reticulación. El resultado son cambios conformacionales en la estructura de las
proteínas y la posterior inactivación de la mayoría de las enzimas. Algunos lípidos, proteínas,
carbohidratos y minerales son extraídos por líquidos fijadores en los que son solubles. La fijación
cambia los perfiles químicos y antigénicos de las proteínas. El dilema de la fijación siempre ha sido
que introduce algún artefacto para tener un efecto protector. Por definición, los fijadores cambian
las composiciones químicas y físicas originales de los tejidos. Además de alterar la naturaleza
química de las células y los tejidos a los que se aplican, los fijadores también causan cambios
físicos en los componentes celulares y extracelulares. Las células viables tienen membranas
superficiales que son impermeables a las moléculas grandes e hidrófilas. La fijación, especialmente
en líquidos orgánicos que disuelven o alteran los lípidos de la membrana celular, permite que las
moléculas relativamente grandes penetren y escapen. Además, el citoplasma se vuelve permeable
a las macromoléculas, formando una red proteica lo suficientemente porosa como para permitir
una mayor penetración de moléculas grandes. En este contexto, las "moléculas grandes" incluyen
las de la cera de parafina, las de los anticuerpos utilizados para la inmunotinción y las moléculas de
colorante más grandes. Los diferentes fijadores dan como resultado diferentes grados de
porosidad. Los coagulantes como el cloruro mercúrico, el ácido pícrico o el sulfato de zinc dan
como resultado un tamaño de poro mayor que los fijadores no coagulantes, como el
formaldehído, el glioxal o el glutaraldehído. Algunos fijadores son coagulantes y no coagulantes.
Por ejemplo, el ácido acético coagula la cromatina nuclear pero no las proteínas. Por lo tanto, los
fijadores coagulantes son generalmente beneficiosos para secciones de parafina posteriores.
Además de facilitar la penetración de secciones por anticuerpos, los fijadores coagulantes también
pueden aumentar la exposición de sitios antigénicos, una consecuencia de la deformación de las
formas macromoleculares que constituye la coagulación. La reticulación impide la penetración de
la parafina pero aumenta la fuerza física del tejido, especialmente si se necesitan secciones
congeladas. La adición química de moléculas fijadoras, con o sin reticulación, puede modificar los
sitios antigénicos y suprimir la inmunotinción. Este es un efecto bien conocido del formaldehído, a
menudo reversible por uno de los muchos procedimientos de recuperación de antígenos.

En un intento por combinar las mejores propiedades de los diferentes compuestos utilizados para
la fijación, se han desarrollado muchas mezclas. La mayoría contiene ingredientes coagulantes y
no coagulantes. Otras sustancias en soluciones fijas tienen acciones como controlar la presión
osmótica, ajustar el pH y contrarrestar la contracción o inflamacion causada por otro ingrediente.
La contracción o hinchazón que ocurre de manera uniforme a través de una muestra
generalmente no importa, pero la distorsión severa resulta de los cambios en el tamaño de
algunas partes del tejido, pero no en todas, como cuando las estructuras tubulares se encogen
dentro del tejido conectivo circundante o cuando se forman espacios artificiales. Alrededor de las
células.

Fijación antes de la inclusión en parafina

La mayoría de las muestras utilizadas para teñir tejidos normales y patológicos están incluidas en
parafina, y se han formulado varios fijadores teniendo esto en cuenta. Aquí se analizan los
fijadores más utilizados. Hay una gran cantidad de fijadores especiales que no se tratarán aquí,
pero se pueden encontrar en las referencias dadas en la bibliografía.

Formaldehído

La formalina es un artículo comercial que contiene 40% p / v (= 40% p / p) de formaldehído (que es

un gas) en agua. La mayor parte del formaldehído está presente como polímeros solubles, que se
despolimerizan en dilución. La formalina también contiene aproximadamente 10% de metanol,
que el fabricante agrega para retardar la formación de polímeros superiores, que eventualmente
se caen de la solución como paraformaldehído. Las botellas viejas de formalina, especialmente
después del almacenamiento en un lugar frío, a menudo contienen depósitos de este polvo
blanco. El formaldehído en solución también se deteriora al reaccionar consigo mismo (reacción
de Cannizzaro) y cambiar a metanol y ácido fórmico. El formaldehído monomérico existe casi por
completo como hidrato de metileno, un compuesto de adición formado por una reacción
reversible con agua. El formaldehído en sí es el compuesto que reacciona con las proteínas; está
presente a una concentración extremadamente baja en una solución de "formaldehído al 4%",
pero se produce instantáneamente a partir del hidrato de metileno después de la eliminación de la
solución en las reacciones de fijación. Estas propiedades químicas del formaldehído se resumen en
la Figura 1.
El fijador más utilizado para la histopatología es una solución acuosa de formaldehído al 4%, a
menudo llamada formalina al 10% porque está hecha por dilución diez veces mayor de formalina.
Durante aproximadamente 50 años, este fijador también ha incluido sales inorgánicas para
mantener un pH casi neutro y una presión osmótica similar a la del fluido extracelular de
mamíferos. La solución se llama formalina tamponada neutra, o NBF. No se arregla por
coagulación, sino al agregar a las cadenas laterales de aminoácidos básicos, especialmente lisina, y
a los átomos de nitrógeno amida de los enlaces peptídicos. Los puentes de metileno de
reticulación se forman donde dos sitios de unión de formaldehído están muy juntos (ver Figura 1).
Esto da como resultado una menor permeabilidad a las macromoléculas, pero las estructuras de
las moléculas de proteína no se alteran en gran medida. Los pequeños tamaños de las moléculas
de metilenglicol y formaldehído permiten una penetración rápida. En consecuencia, este fijador es
adecuado para muestras grandes o pequeñas. Desafortunadamente, a pesar de la rápida
penetración de los tejidos, las reacciones químicas del formaldehído con las proteínas del tejido,
especialmente la formación de puentes de metileno, ocurren lentamente. Un error comúnmente
cometido con los fijadores que contienen formalina es sub-fijar el tejido. Las piezas pequeñas (10 ×
10 × 3 mm) fijadas en NBF durante 12-24 horas generalmente mostrarán una buena conservación
citoplasmática y detalles nucleares. La adición de formaldehído se completa en gran medida en 24
horas, pero las reacciones de reticulación continúan durante al menos dos semanas. Las muestras
grandes y blandas, como los cerebros humanos completos, requieren de 2 a 6 semanas en NBF
para volverse lo suficientemente firmes como para cortar en rodajas de las que se pueden tomar
muestras para histología. Las variaciones en el tiempo y las condiciones de fijación causan la
mayoría de los problemas en histoquímica.

La fijación afecta profundamente la tinción histológica e inmunohistoquímica, por lo tanto, los

técnicos, los patólogos y los investigadores deben decidir el método más apropiado. Los aspectos
a considerar son la temperatura, el tamaño del contenedor de almacenamiento, la relación de
volumen, la concentración de sal, el pH y el tiempo de incubación. La fijación de formaldehído se
realiza típicamente a temperatura ambiente. El uso de un contenedor de muestras bajo y ancho
para permitir una penetración adecuada y la facilidad de recuperación por parte de un técnico es
la mejor opción para una relación de volumen adecuada. Además, se recomienda una proporción
de 1:20 en volumen de líquido a tejido y un espesor de muestra de 3–4 mm para una buena
penetración. Para evitar la hinchazón o la contracción de las células, se recomienda una solución
isotónica amortiguada a pH 7,2–7,4, para mantener la ultraestructura y minimizar la distorsión
celular. Cuanto más corto sea el tiempo transcurrido entre la extracción de la muestra del cuerpo y
la inmersión en fijador, mejor. La duración de la exposición al fijador debe optimizarse para cada
tipo de muestra. Por ejemplo, se ha observado en una encuesta de CAP que la preservación de
glucógeno en el hígado puede estar sujeta a artefactos de fijación. A medida que el NBF penetra
lentamente a través de la membrana del hepatocito, el glucógeno asociado con la matriz de la
proteína citoplasmática se desplaza hacia un lado de la célula. Esta observación se conoce como
polarización y se considera parte de la morfología al discernir el resultado de la tinción. (Figura 2:
polarización del glucógeno). Este es un gran ejemplo de cómo las muestras que tienen una
exposición prolongada a los fijadores pueden demostrar cambios morfológicos extremos. La
polarización del glucógeno es menos marcada después de la fijación en un líquido no acuoso, en el
que este polisacárido no es soluble.
Glyoxal

Glyoxal es el dialdehído más simple, con la fórmula OHC-CHO. Al igual que el formaldehído, forma
fácilmente hidratos y polímeros. La descomposición por medio de la reacción de Cannizzaro ocurre
rápidamente en soluciones neutras o alcalinas. Las soluciones acuosas deben estar tamponadas a
aproximadamente pH 4 para que sean estables, y también deben contener una pequeña
proporción de etanol, que cataliza la reacción del glioxal con proteínas. La adición y la reticulación
de proteínas es más rápida que las reacciones equivalentes de formaldehído. La fijación adecuada
de muestras pequeñas con glioxal se logra en una hora. Los fijadores a base de glioxal disponibles
para los laboratorios se venden como soluciones prefabricadas con nombres comerciales y
composiciones no reveladas. Evidentemente, no hay recetas publicadas para fijadores de eficacia
comprobada que contengan glioxal como ingrediente principal. Se ha informado que los fijadores
de glioxal patentados son útiles para la histología general y la inmunohistoquímica. Las diferencias
con la fijación de formaldehído (NBF) son: (a) Supresión de la tinción de proteínas ricas en arginina
por colorantes aniónicos (esto es importante si necesita teñir células de Paneth, leucocitos de
eosinófilos o colas de espermatozoides), y (b) Recuperación de antígeno se requiere con menos
frecuencia que después de la fijación en NBF. El secreto comercial asociado con los fijadores que
contienen glioxal puede impedir su uso en la investigación y en aplicaciones de diagnóstico donde
el patólogo puede ser interrogado sobre su competencia y conocimiento de los materiales
utilizados en el laboratorio.

Fluido de Bouin

Pol André Bouin (1870-1962) inventó varias mezclas de fijadores en los años 1895-1900; El más
frecuentemente asociado con su nombre, publicado por primera vez en 1897, contiene 10% de
formaldehído (25% de formalina), ácido acético 0.9M y ácido pícrico 0.04M, en agua. El ácido
pícrico penetra los tejidos con bastante lentitud, coagula las proteínas y provoca cierta
contracción. También tiñe el tejido de amarillo. El ácido acético coagula la cromatina nuclear y se
opone a la contracción causada por el ácido pícrico. Las reacciones del formaldehído ya se han
discutido; al pH del fluido de Bouin (1.5-2.0) estos ocurren más rápidamente que en NBF. Los
efectos complementarios de los tres ingredientes de la solución de Bouin funcionan bien juntos
para mantener la morfología. Las muestras generalmente se fijan en Bouin durante 24 horas. El
almacenamiento prolongado en esta mezcla ácida provoca hidrólisis y pérdida de ADN y ARN
teñibles. Es necesario lavar a fondo después de la fijación. Al igual que el cloruro mercúrico, el
ácido pícrico mejora la tinción posterior, especialmente con colorantes aniónicos ("ácidos"). Las
secciones de parafina de los tejidos fijados con formaldehído generalmente se sumergen durante
algunas horas en una solución de ácido pícrico (el líquido de Bouin se usa comúnmente) antes de
teñir con los métodos de tricromo. Las manchas de tricromo usan combinaciones de colorantes
aniónicos con ácido fosfotungástico o fosfomolibdico para impartir colores contrastantes al
citoplasma, las fibras de colágeno y otros componentes de los tejidos.

Cloruro mercúrico

Cada fijador conserva la morfología de manera diferente, por lo tanto, existen múltiples opciones.
Para algunas células y tejidos, el NBF( formalina neutral bufferada) no proporciona una fijación
adecuada. Ejemplos son los tejidos conectivos, algunas estructuras que contienen mucinas y la
médula ósea. El cloruro mercúrico (HgCl 2) se agrega a las proteínas y produce una coagulación
rápida con una granularidad resultante que es demasiado fina para ser visible con microscopía
óptica. El fijador B5 de Lillie es formaldehído acuoso al 4% con HgCl2 0.22M y ácido acético 0.22M.
Esta mezcla mejora los detalles nucleares, lo cual es importante para identificar tipos de células
normales y anormales en muestras de médula ósea (tejido hematopoyético). La coagulación de la
cromatina nuclear es un efecto del ácido acético. El cloruro mercúrico asegura una rápida
estabilización estructural y también facilita la tinción brillante de muchos de los colorantes
utilizados en microtecnia. Las razones de este efecto sobre la estabilidad no se entienden. Se
forma un precipitado cristalino marrón de aspecto sucio, probablemente cloruro mercurioso
(Hg2Cl 2) en todas las partes de los tejidos fijados en mezclas que contienen HgCl 2; Se llama
pigmento de mercurio y debe eliminarse, mediante tratamientos secuenciales con soluciones de
yodo y tiosulfato de sodio, antes de la tinción. Debido a que contiene mercurio, B5 está sujeto a
las regulaciones de eliminación de desechos tóxicos, que se aplican a la solución de fijación y a
todas las soluciones posteriores que han sido contaminadas con mercurio. Se deben mantener
registros de todos los volúmenes B5 utilizados en el laboratorio.

Sales de zinc

La toxicidad de los compuestos de mercurio ha desalentado su uso en laboratorios. De los otros

elementos en el Grupo 12 (IIb) de la tabla periódica (Zn, Cd, Hg), el zinc es el menos tóxico. El
sulfato de zinc se ha utilizado durante más de un siglo en lociones astringentes y gotas para los
ojos, que reducen la hinchazón de las superficies inflamadas al coagular las proteínas plasmáticas
extravasadas. El primer fijador de zinc-formalina fue probablemente el publicado por P.A.Fish en
1895, solo tres años después del descubrimiento de que el formaldehído conservaba muy bien la
arquitectura de los tejidos. En las últimas décadas se han desarrollado varios fijadores
inteligentemente formulados. Algunos son completamente coagulantes, con Zn2 + como el único
ingrediente que puede inmovilizar proteínas. La mayoría de los fijadores que contienen zinc
también contienen formaldehído, lo que los hace comparables con B5 y otras soluciones que
contienen mercurio.

Fijadores alcohólicos

El NBF (formalina bufferada neutra) es el fijador más utilizado, a pesar de no ser el mejor para
cada propósito. Esto se debe a que las deficiencias de NBF no son muy graves, siempre que las
muestras se arreglen durante un tiempo suficiente. Además, la apariencia de los tejidos fijados con
formaldehído es familiar para los patólogos, que han entrenado sus sistemas visuales para
reconocer características normales y anormales en secciones cortadas de materiales fijados
rutinariamente. Se han hecho argumentos para cambiar el fijador de rutina a una de varias
mezclas no acuosas, y se pueden hacer casos fuertes para el fluido de Clarke (etanol y ácido
acético, 3: 1 en volumen), el fluido de Carnoy (etanol, cloroformo y ácido acético, 60:30:10) y el
metacarn de Puchtler (Carnoy con metanol en lugar de etanol). Estos líquidos, que se fijan por
coagulación de proteínas y cromatina, no contienen agua. Deshidratan casi por completo el tejido,
por lo que el tiempo de procesamiento en cera de parafina es más corto que después de NBF u
otros fijadores acuosos. También hay muchas mezclas que contienen un alcohol (generalmente
etanol), formalina, ácido acético y 10% a 70% de agua, a menudo llamadas AFA o FAA o
nombradas por sus inventores, que incluyen Tellyesniczky (alrededor de 1900), Bodian (1930) y
Davidson (1940). En una mezcla de AFA, las reacciones químicas del formaldehído con proteínas
no se retrasan al amortiguar a un pH casi neutro. Todos estos fijadores alcohólicos contienen ácido
acético, que produce patrones característicos de la cromatina nuclear coagulada, lo que facilita el
reconocimiento de los tipos de células. Los núcleos que han estado en NBF durante una semana o
más exhiben patrones de cromatina menos pronunciados. El alcohol (etanol o metanol) solo
coagula instantáneamente las proteínas, pero causa una distorsión considerable de la
microanatomía en pedazos de tejido animal. A estos cambios no deseados se les opone la dilución
del alcohol con cloroformo (inmiscible con agua), agua y / o ácido acético (que coagula la
cromatina y se opone a la contracción, siendo miscible con agua, alcohol e hidrocarburos. Alcohol
solo (generalmente se prefiere metanol) es adecuado para la fijación de preparaciones de capa
fina, como películas de sangre o cultivos celulares. Las muestras sólidas tomadas de pacientes con
gota generalmente se fijan en etanol al 95% para la posterior detección histoquímica de cristales
de urato de sodio, que pueden ser disueltos fuera del tejido por el agua.

Descalcificación

Después de la fijación, existen técnicas disponibles para el histotécnico para mejorar la microtomía
y la calidad de la tinción. Cada técnica debe ser evaluada para cada ensayo para preservar la
morfología y proporcionar la mejor tinción posible (Tabla 1). El primer método, siguiendo el orden
cronológico de la histología, es la descalcificación de muestras que pueden ser difíciles de cortar
en un microtomo debido a los depósitos de carbonato de calcio o fosfato. La descalcificación se
puede lograr mediante ácidos o agentes quelantes. Primero, asegúrese de que el tejido se haya
fijado y enjuagado adecuadamente para evitar cualquier reacción no deseada con el agente
descalcificador. Los ácidos minerales diluidos (clorhídrico o nítrico) o el ácido fórmico se pueden
usar de manera efectiva si el punto final de la descalcificación se controla cuidadosamente. Los
detalles nucleares y citoplasmáticos se ven comprometidos si las muestras se exponen durante
demasiado tiempo a agentes de descalcificación ácidos, que pueden extraer ARN y eliminar las
bases de purina y pirimidina del ADN. También es imprescindible eliminar el ácido del tejido. Si la
preservación del ADN nuclear es importante, o si se pretenden métodos histoquímicos para ácidos
nucleicos o actividades enzimáticas, se prefiere un agente quelante a un ácido. Por lo general, se
usa la sal disódica de EDTA, con el pH ajustado a un nivel entre 7 y 8. Descalcificación por EDTA
mucho más tiempo que la descalcificación por ácidos: semanas en lugar de días.
Secciones congeladas

Para la histoquímica, las secciones de criostato dan resultados mucho más rápidos que las
secciones de parafina. Además, el fijador se puede usar con secciones de criostato, lo que permite
al histoquímico seleccionar un fijador diferente y óptimo para cada mancha, todo de la misma
muestra. El detalle morfológico y la resolución de las secciones congeladas suelen ser
considerablemente inferiores al tejido que se ha incrustado en parafina. En histopatología, las
secciones congeladas se cortan comúnmente de biopsias musculares y nerviosas y de tumores
extirpados quirúrgicamente. Las biopsias de músculos y nervios se subdividen en muestras para
fijación con formalina e inclusión en parafina, congeladas sin congelar para secciones de criostato,
fijación e inclusión en resina para microscopía electrónica (EM) y, en algunos casos raros, estudios
de inmunotransferencia bioquímica. Se requieren múltiples procesos de fijación porque se deben
utilizar múltiples técnicas. La porción de una porción de muestra destinada al seccionamiento
congelado debe transportarse sobre hielo húmedo, sobre una gasa humedecida con solución
salina y congelarse rápidamente en dos horas. No permita que el tejido se congele lentamente o
absorba el exceso de solución salina, ya que esto causará artefactos que pueden verse
microscópicamente e interferir con la interpretación diagnóstica. Se ha sugerido que el polvo de
talco puede aliviar la absorbancia de humedad del tejido muscular. Este procedimiento debe
evaluarse y probarse su calidad antes de introducirlo en un laboratorio. Al recibirlo en el
laboratorio de histología, oriente en compuesto OCT (temperatura de corte óptima) y congele
rápidamente en nitrógeno líquido / isopentano para obtener resultados óptimos. Para obtener
instrucciones e ilustraciones completas, consulte la página 312-314 en el libro de texto de Carson
& Hladik. La orientación, el tamaño y la rápida congelación son fundamentales para obtener
secciones no dañadas de fibras musculares no fijadas. La porción EM de una biopsia se fijará en
una solución tamponada de glutaraldehído y se fijará posteriormente en tetóxido de osmio,
generalmente por un especialista en microscopía electrónica. En algunos trastornos degenerativos
musculares, también se pueden requerir técnicas bioquímicas.

Frotis

Los histotécnicos a veces realizan tinciones especiales en citología, frotis de sangre y citopreps de
otros departamentos dentro del laboratorio. Cada vez más, el cytoprep comúnmente recibido es el
de la "preparación delgada". Estas manchas se fijan en húmedo en etanol al 95% inmediatamente
después de la preparación para preservar la estructura fina de la cromatina y ayudar en la
evaluación de los cambios nucleares. La tinción de May-Grünwald o Giemsa se evalúa
rutinariamente, y el método más complicado de Papanicolaou también se usa ampliamente,
especialmente en muestras tomadas de la vagina y el cuello uterino. El secado al aire se evita con
frotis para la detección citológica de neoplasia porque cambia la apariencia de las células. Los
portaobjetos con sangre o médula ósea, por otro lado, generalmente se secan al aire. Los frotis de
médula se tiñen en paralelo a las secciones de la biopsia del núcleo de la médula ósea

Procesamiento de la muestra

La calidad de la tinción se puede depreciar por una fijación inadecuada y, de manera similar, por
un pobre procesamiento del tejido. Un buen técnico debe evaluar y determinar el procesamiento
de elección para cada propósito, ya sean manchas especiales en parafina, congelados o
preparaciones de frotis de células. El procesamiento de parafina ha evolucionado y estabilizado en
el laboratorio de histología moderno con el uso de infiltración al vacío. Sigue siendo fundamental
recordar los conceptos básicos al procesar y solucionar problemas. Los métodos de procesamiento
de muestras presentados en este capítulo deben considerarse una breve introducción y no
incluyen todos los procedimientos disponibles.

Procesamiento de tejidos

Para preparar un tejido para su inclusión, debe infiltrarse con parafina. Debido a que el agua y la
parafina no son miscibles, las muestras deben deshidratarse gradualmente para lograr el
reemplazo del agua con alcohol antes de introducir el agente de limpieza. El tamaño y la capacidad
de penetración del tejido determinan la rapidez con que esto ocurrirá. Una vez que se deshidrata
con éxito, se infiltra un agente limpiador que es miscible con alcohol y parafina (es decir, xileno o
sustituto) a través del tejido. Finalmente, se introduce la parafina y completa el tejido para su
inclusión. Un sistema automatizado al vacío mejora la eficiencia de la infiltración de cera al
acelerar la eliminación del agente de limpieza. Tenga en cuenta que los laboratorios individuales
deben optimizar sus tipos de muestra. En general, las biopsias con aguja y las muestras con sangre
deben incubarse de forma conservadora, mientras que las muestras con grasa pueden procesarse
durante más tiempo que el promedio. En los últimos años se han realizado esfuerzos para
optimizar el tiempo de procesamiento mediante el uso de técnicas de calentamiento por
microondas. Los beneficios y riesgos asociados con la técnica se revelan a medida que más
laboratorios emplean la tecnología y publican sus hallazgos. Para obtener una lista de literatura
fácilmente disponible, revise la sección de bibliografía. En este momento, el concepto se
presentará con ejemplos de apoyo. Se ha informado que el procesamiento de microondas se
puede lograr ~ 60% más rápido que el tiempo de procesamiento convencional. Consulte la Tabla 2
para ver una comparación de las dos técnicas, cada una con muestras de biopsia de 1-3 mm de
espesor. Un aspecto crítico del uso de técnicas de microondas es garantizar que las muestras se
hayan fijado adecuadamente. Cada laboratorio debe evaluar sus métodos de control de fijación
para optimizar el uso del procesamiento de microondas. Aunque la disminución en el tiempo de
procesamiento aumenta el flujo de trabajo de la muestra, ha habido cierta resistencia a la
implementación de la tecnología de procesamiento de microondas, en parte por razones de
personal. Tradicionalmente, el personal de histopatología está disponible en las horas de la
mañana cuando el procesamiento nocturno convencional produce sus volúmenes más altos,
mientras que el procesamiento de microondas puede mantener al personal más tarde en el día. El
procesamiento acelerado por microondas es tan efectivo como el procesamiento tradicional más
lento, y las secciones se tiñen de manera idéntica con varios métodos: ácido periódico de Schiff,
Van Gieson, rojo Congo, tricromo de Masson, azul alciano, mucicarmina de Mayer y plata para el
retículo. Debido a que los métodos de tinción pueden variar de un laboratorio a otro, se
recomienda que los laboratorios individuales validen los métodos de microondas dentro de sus
entornos.

Si el laboratorio tiene tiempo inicialmente para validar la técnica y capacitar al personal en

consecuencia, prevalecen las consideraciones a largo plazo. La conversión a productos químicos
más seguros (es decir, menos humos, eliminación no regulada) puede incluir la rotación de
cantidades más pequeñas con mayor frecuencia, lo que provoca un aumento neto en el consumo
de productos químicos. Los beneficios de seguridad de eliminar los desechos regulados no
deseados, además de calcular los volúmenes netos, pueden ofrecer ahorros inmediatos en los
costos. Cada laboratorio debe sopesar sus beneficios para satisfacer sus necesidades.
Incrustación y microtomía

Una vez que el tejido ha sido procesado, está listo para ser orientado en un bloque de parafina y
luego seccionado. La orientación durante la inserción es crucial para la representación de la
morfología adecuada. Las estructuras en la piel, las biopsias gastrointestinales pequeñas y los
conductos deferentes se encuentran entre aquellos para los que la orientación es especialmente
crítica. Las buenas técnicas de microtomía minimizarán los artefactos que conducen a una difícil
interpretación diagnóstica de las manchas especiales. Uno de los factores más directamente
correlacionados es el grosor en el que se corta una muestra. Las muestras teñidas con H&E de
rutina se cortan de 3 a 4 μm, pero alguna morfología se representa mejor de lo contrario. Por
ejemplo, los depósitos amiloides están mejor representados a 8-12 μm, mientras que las biopsias
renales deben cortarse a 2 μm para una visualización óptima de las estructuras de los glomérulos.
Las técnicas que se usan con frecuencia para ayudar en la microtomía son el adhesivo para baño
de agua y los portaobjetos con carga positiva. Sin embargo, en algunas manchas de impregnación
de plata, los iones de plata son atraídos por el recubrimiento y producen un fondo general para el
portaobjetos. Para evitar este artefacto (Figura 3), use portaobjetos limpios sin recubrimiento.
Después de seccionar, el portaobjetos de tejido se drena y se puede calentar suavemente para
evaporar la capa de agua entre las secciones y el vidrio. Cuando se acaba toda el agua, se permite
calentar el portaobjetos lo suficiente como para derretir la cera, un procedimiento que puede
mejorar la adhesión. Para una fusión óptima de la parafina, consulte la temperatura de fusión y el
"punto plástico" en el inserto del producto de fabricación. El punto plástico suele ser unos pocos
grados más bajo que el punto de fusión y representa la temperatura más baja a la que puede
producirse una deformación permanente sin fractura.

Consideraciones técnicas

Hay algunos consejos técnicos que pueden aplicarse a todos los procedimientos preparatorios en
microtecnia. Asegúrese de que los portaobjetos de vidrio estén limpios y libres de escombros. El
lavado suave y el grosor mínimo de las capas celulares evitarán que las células se desprendan
durante la tinción. La interpretación de la tinción depende de una adecuada distribución y
distribución química. Asegúrese de que haya suficientes secciones para hacer un diagnóstico y de
que los reactivos se hayan aplicado uniformemente a los portaobjetos. Si se requiere
contratinción, asegúrese de no incubar en exceso

En el último caso, a medida que las células mueren, liberan enzimas de sus lisosomas y otros
orgánulos intracelulares, que comienzan a hidrolizar (es decir, descomponer o descomponer al
reaccionar con agua) componentes del tejido, como proteínas y ácidos nucleicos con la ayuda de
proteasas y nucleasas, respectivamente. Los casos de autólisis son más graves en tejidos ricos en
enzimas (por ejemplo, hígado, cerebro, riñón, etc.) y son menos rápidos en tejidos como fibras
elásticas y colágeno. Por lo tanto, es fundamental que la fijación se realice lo antes posible
después de la extracción de los tejidos para evitar la autólisis y la putrefacción, así como para
evitar que el tejido sufra shock, distorsión y contracción osmótica. Desafortunadamente, los
fijadores pueden, sin querer, introducir artefactos que pueden interferir con la interpretación de la
ultraestructura celular.