La crioconservación de esperma humano es rutinariamente realizada para aumentar la

disponibilidad de inseminación artificial programas, a un banco de esperma de

hombres sometidos vasectomía o la quimioterapia, y, lo más es hace poco, mientras
semen de donante sufre la pantalla del síndrome de inmunodeficiencia adquirida. Así
que es crucial que los espermatozoides se procesan de manera que optimiza la
viabilidad. Uno de los factores críticos que afecta supervivencia de los
espermatozoides es el crioprotector medio utilizado para preservar el esperma durante
la freezethaw proceso.
Fue la primera crioprotector utilizado para el glicerol congelación sperm.1 A pesar de
que resulta en sólo un 30% cryosurvival a 60% de los espermatozoides humanos,
glicerol solo sigue siendo el más ampliamente utilizado Debido agente TIC de la
simplicidad; tampón crioprotector más complejo.
Los sistemas se han introducido en los últimos años, y varios parecen mejorar la
recuperación de los espermatozoides humanos sobre thawing.2-5 Sin embargo, hay
una única comparativa estudio ha sido realizado con el uso de estos diversos sistemas
de tampón para la determinación de los mejores para el medio crioprotector humana
utilizar. Era el objetivo de este estudio directamente comparar la efectividad de varios
crioprotector los medios de comunicación actualmente en uso para determinar la
óptimasistema tampón para la crioconservación de esperma humano.
MATERIALES Y MÉTODOS
Las muestras de semen se recogieron del 12 al 15 donantes fértiles y agrupada.
Después de un semen prefreeze análisis, el semen agrupado se separa en ocho
partes, mezcladas con cada uno de ocho tampones, y congelados como se describe a
continuación.
Este procedimiento era realizado en ocho réplicas. Las muestras fueron
aleatoriamente descongelado 1 a 2 meses después de la congelación y analizó como
se describe.

Preparación de medios crioprotectores:

Se evaluaron los siguientes ocho sistemas tampón y comparación como
crioprotectores para personas esperma:

(1) El glicerol: añadida al semen a una concentración final de 7,5%.

(2) CEG: citrato-yema de huevo-glicerol; 325 mOsm citrato de sodio, pH 7,0, 20% (vol /
vol) de huevo fresco yema de huevo, 2% (vol / vol) 325 mOsm fructosa. La mezcla se
centrifugó a 10.000 x g durante 10 minutos,y el sobrenadante se filtró a través papel
de filtro (Whatman I). El glicerol se añadió a una concentración final de 7,5%.

(3) PRUEBA DE-C-I: un sistema tampón iónica preparada zwitterión por valoración de
325 mOsm TES con 325mOsm TRIS para hacer la solución de ensayo; 48% (vol /vol)
TEST, 30% de citrato de sodio, 20% de yema de huevo, 2% fructosa se mezclaron y
procesada como se describe para la CEG. Se añadió glicerol a una concentración final
de 6%.

(4) TEST-C-II: 70% (vol / vol) TEST, 12,5% de sodio citrato, 17,5% de yema de huevo,
mezclado y procesado como se describe para CEG. Se añadió glicerol a una
concentración final de 10%.
(5) TEST-C-III: una solución de TEST-C-II pero sin glicerol.
(6) TEST-leche: 30% (vol / vol) PRUEBA, 30% 325 mOsm leche en polvo, 18% de
citrato de sodio, 20% yema de huevo, 2% de fructosa, la mezcla se calentó a
92 ° a 95 ° C durante 10 minutos, se filtró a través de estéril gasa, y se centrifugó a
10.000 x g durante 15 minutos. El sobrenadante se filtró a través de filtro papel. La
presión osmótica se ajustó a 325 mOsm y pH a 7,0. El glicerol se añadió a una
concentración final de 6%.

(7) GPSP: medio de conservación del esperma humano; un medio de Tyrode

modificada con glicerol añadido a una concentración final de 15% 0,4

(8) HEPES -KOH -G: 325 mOsm HEPES eratitula con 325 mOsm KOH a pH 7,0.
Cuarenta por ciento HEPES-KOH, 40% de glucosa 325 mOsm, y 20% de yema de
huevo se mezclaron y se procesó como descrito para CEG. Se añadió glicerol a una
final concentración de 6%.

TÉCNICA DE CONGELACIÓN
Cada medio crioprotector se añadió gota a soltar a una porción de semen agrupados a
una dilución 1: 1 a excepción de glicerol, que se añadió en forma de gotas de
7,5% con semen. Las muestras fueron luego lentamente enfría a una tasa de ofO.5 ° C
/ minuto a 4 ° C por inmersión en un baño de agua C 22 °, que era entonces colocado
en un refrigerador de C 4 °. Cuando el baño de agua alcanzó 4 ° C, las muestras se
envasan en 0,5 ml pajillas francesas (IMV, Minneapolis, MN) a 4 ° C.
Después de 1,5 horas, las pajitas se congelaron singularmente en un estante
horizontal situado a 4 cm por encima del líquido nitrógeno (congelación del vapor
estática). Después de 12 minutos, las pajuelas se sumergen en nitrógeno líquido para
su almacenamiento a - 196 ° C. Las pajas fueron descongeladas en un baño de agua
a 37 ° durante 30 segundos.

FINES DE ANÁLISIS SPERM

Las muestras de semen se analizaron para determinar el porcentaje progresivo la
motilidad por un experimentado observar. Las estimaciones se realizaron por
triplicado, y un promedio.
Fue obtenido para el mismo. Semen fresco fue examinado antes utilizar, y los
espermatozoides criopreservados fueron examinados en
0, 1, 2, y 4 horas después de la descongelación a 37 ° C durante determinación de la
longevidad.
Para el análisis estadístico, motilidad individual
Las puntuaciones para cada muestra se normalizaron a la
Progresivamente porcentaje de espermatozoides móviles en el
Que el semen dulce Piscina para el juicio. Los datos de todas las repeticiones
Fueron sometidos a análisis de varianza. significativodiferencias entre les significa el
agrupamiento se determinaron por el procedimiento de mínima diferencia significativa
where appropriate.

RESULTADOS
La motilidad progresiva y la longevidad de criopreservados esperma congelado de
cada ocho tampones diferentes sistemas se presentan en la Figura 1. TEST-C-I y
PRUEBA DE-C-II mantiene el tiempo de la motilidad más alta de inmediato después
de la descongelación, el 83% y el 78%, respectivement, prefreeze de la motilidad
progresiva. Glicerol y TEST-C-III (medio sin glicerol) HAD la más baja motilidad
progresiva después de los tiempos inmediatamente descongelación, 31% y 21%
mantuvo, respectivement.
El, otros sistemas tampón horno (CEG, TEST-leche,
HSPM, y HEPES-KOH-G) resultaron en O-hora puntuaciones de deshielo de la
motilidad de correos en el rango medio (49% de
61%) y no difirieron entre sí. PRUEBA ~ C-I
Tenía la longevidad más alta, con un 63% prefreezemotilidad mantuvo a 1 hora
después de la descongelación, 49% a las 2 horas, y 41% a las 4 horas. La puntuación
más tarde
Fue significativamente mayor que eso. De esperma congelado en glicerol, CEG,
PRUEBA DE-C-III, GPSP, oro
HEPES-KOH-G (P <0,01). Aunque la motilidad con C-TEST ~ Siempre estaba
ligeramente más alto que con TEST-C-II, esta diferencia no fue significativa.
Además, el puesto de 1, 2 y 4 horas motilidad deshielo de TEST-leche no fue
significativamente menos de TEST ~ C-1.

Figura 1
GLYCEROL CEG PRUEBA DE LECHE-TEST TEST-CI-CII-TEST cm GPSP HEPES-
KOH-G motilidad progresiva de los espermatozoides congelado en ocho crioprotector
tampones inmediatamente 1, 2, y 4 horas después de la descongelación en
37 ° C. Los resultados se expresan como porcentaje motilidad progresiva mantenido
después de la descongelación, en comparación con el prefreeze valor. Cada barra
representa la media ± norma de error de seis ensayos. Grupos se compararon con
cada otras en puntos de tiempo similares: a, P <0,01, en comparación con
PRUEBA DE-C-III; b, p <0,01, en comparación con glicerol y
PRUEBA DE-C-III; C, P <0,01, comparado con glicerol, CEG, y TEST-C-III; d, p <0,01,
en comparación con glicerol, CEG, PRUEBA DE-C-III, y GPSP; E, P <0,01, en
comparación con glicerol, CEG, TEST-CIII, HSPM, y HEPESTIME (HR) de KOH-G.

DISCUSIÓN
Los presentes datos indican que de los muchos recomienda cryobuffers examinados,
el TEST-citrate- tampones de yema de huevo con glicerol (TEST-C-I y
PRUEBA DE-C-II) proporcionan la mejor recuperación después de la descongelación
para el esperma humano. Las proporciones de la persona componentes no parecen
ser críticos, porque PRUEBA DE-C-I y TEST-C-II producido equivalente los resultados
a pesar de que cada uno tenía un diferente relación de todos los componentes,
incluidos glicerol. La sustitución de la leche para una porción de TEST y citrato dio
lugar a una disminución de la motilidad inicial después de la descongelación con la
longevidad equivalente sobre un período de 4 horas. Debido a que este sistema no
ofrece ninguna ventaja sobre TEST-C-I y TEST-C-II, y está más complejo en la
preparación, estos últimos tampones son los preferidos. La marcada diferencia entre el
PRUEBA tampones antes mencionados y de prueba "C-III,que no contenía glicerol,
indica que la inclusión de glicerol como crioprotector en este medio es crucial para
cryosurvival adecuada. Recuperación mejorada observada con el zwitterión tampones
de pruebas con iones es probablemente el resultado de su capacidad para recoger los
iones de hidrógeno en los alrededores medios de comunicación, ayudando de este
modo la deshidratación proceso. Otro tampón de ión zwitterión probado en este
investigación, HEPES-KOH-glicerol, también aumentó viabilidad sobre la observada
con glicerol solo; Sin embargo, no fue tan eficiente para los humanos espermatozoides
como los sistemas de prueba con glicerol utilizados en esta. Tampones Zwitter han
demostrado que difieren en la capacidad protectora para el esperma bovino como
well.2 al igual que en informes anteriores, 3, 4, 6 y CEG HSPM fueron más eficaces
como cryobuffers que el uso de glicerol solo. Sin embargo, en una comparación directa
con los sistemas de prueba con glicerol, estos dos medios poseía la recuperación de
espermatozoides reducida. el significativa mejora en la longevidad de más de 4 horas
con el uso de los tampones de ensayo cuando se compara con glicerol, CEG, HSPM,
y HEPES-KOH-G puede ser importante clínicamente. Criopreservados
espermatozoides se inseminaron intracervical y debe sin embargo, viajar a través del
tracto reproductor femenino y capacitar antes de fertilizar un óvulo, una proceso que
puede requerir varias horas. Un reciente informe indica que el uso de criopreservados
esperma congelado en el medio de ensayo tamponado era tan eficaces como el
semen fresco en relación con el embarazo resulta.7 Esto puede estar relacionado con
esperma adecuada longevidad, que se observó en el presente documento cuando este
se utilizó cryobuffer.

RESUMEN
Varios medios crioprotectores actualmente en uso para la crioconservación de
esperma humano han sido directamente comparación entre sí mediante el uso de un
estático vapor de la técnica de congelación. El TEST-citrato-yema tampones con
glicerol como resultado la más alta motilidad y la longevidad después de la
descongelación; por lo tanto, su uso es recomendado.