Un polimorfismo de un solo nucleótido causa un tamaño de grano más pequeño y la pérdida de

semillas que se rompen durante la domesticación del arroz africano

Wenguang Wu1 †, Xiaoyun Liu1 †, Muhua Wang2 † ‡, Rachel S. Meyer 3, Xiaojin Luo 4,
Marie-Noelle Ndjiondjop5, Lubin Tan1, Jianwei Zhang2, Jianzhong Wu6, Hongwei Cai1,
Chuanqing Sun1,7, Xiangkun Wang1, Rod A Wing2,8 * y Zuofeng Zhu1 *
 
El tamaño de grano es uno de los componentes más importantes del rendimiento de grano y la
selección de semillas grandes ha sido un objetivo principal durante la domesticación de la planta.
Sorprendentemente, el grano de arroz africano cultivado (Oryza glaberrima Steud .) Es
típicamente más pequeño que el de su progenitor, Oryza barthii. Aquí informamos la clonación y
caracterización de un locus de rasgo cuantitativo, GL4, que controla la longitud del grano en el
cromosoma 4 en el arroz africano, que regula el alargamiento celular longitudinal de las glumas
externas e internas. Curiosamente, GL4 también controla el fenotipo de destrucción de semillas
como su ortólogo Gen SH4 en arroz asiático. Nuestros datos muestran que una mutación de
polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en el gen GL4 resultó en un codón de parada
prematuro y condujo a pequeñas semillas y pérdida de rotura de semillas durante la
domesticación del arroz africano. Estos resultados proporcionan nuevos conocimientos sobre las
diversas prácticas de domesticación en el arroz africano, y también allanan el camino para
mejorar el rendimiento de los cultivos para enfrentar el desafío de la demanda de cereales en
África occidental.
Se estima que la población del África subsahariana superará los 1.500 millones en 20501. Es
fundamental aumentar la productividad de los cultivos para satisfacer las demandas alimentarias
de una población en rápido crecimiento2. Los cultivos nativos africanos son especies valiosas
para satisfacer esta demanda: muchos son de rápido crecimiento, nutritivos, de bajos insumos y
tienen una gran importancia histórica y cultural. En África occidental, un arroz cultivado
localmente (O. glaberrima Steud .) Fue domesticado hace miles de años de su progenitor
silvestre O. barthii3–6. Si bien el desarrollo del arroz asiático ( Oryza sativa L.) para la
agricultura comercial en África occidental ha desplazado en gran medida los cultivos nativos, los
pequeños agricultores han mantenido las variedades locales de arroz africano y su potencial
como cultivos preparados para el clima está ganando cada vez más atención7,8, por ejemplo,
como una mejora objetivo y para crear híbridos interespecíficos resistentes como New Rice for
Africa (NERICA). En las áreas con las condiciones ecológicas más adversas, O. glaberrima es
favorecida por los agricultores por su adaptabilidad y resistencia a múltiples restricciones9 , 10 .
El tamaño del grano es uno de los factores más importantes que determinan el rendimiento del
grano y se ha propuesto que se encuentre entre los primeros rasgos seleccionados en el proceso
de domesticación de los cultivos de cereales11 , 12 . El trigo, el sorgo y el arroz asiático tienen
semillas más grandes que sus parientes silvestres13–15. Hasta ahora, varios genes para el tamaño
de grano, como GW2, qSW5, GS5, GW8, GS2 / GL2, GS3 y GL7 / GW7, se han identificado en
el arroz asiático16–26. Sin embargo, a diferencia de la tendencia a aumentar el tamaño del grano
en otros cultivos, la semilla de O. glaberrima generalmente es más corta y más pequeña que la de
su progenitor O. barthii27 (Figura complementaria 1). Por lo tanto, revelar la base genética
molecular de la selección de semillas pequeñas durante la domesticación de O. glaberrima
contribuirá a mejorar el rendimiento de grano de O. glaberrima . En un intento por identificar los
genes que controlan el tamaño de grano en el arroz africano, construimos un conjunto de líneas
de introgresión utilizando la accesion del arroz silvestre africano W1411 (IRGC101248, O.
barthii ) como donante, y un cultivar de arroz africano cultivado (IRGC102305, O. glaberrima )
como destinatario. Obtuvimos una línea de introgresión (GIL25) que muestra un tamaño de
grano más largo y más grande que el padre receptor IRGC102305 (Fig. 1a), que albergaba dos
segmentos cromosómicos en los cromosomas 4 y 10 de O. barthii (W1411) (Fig. 1b y Tabla
complementaria 1 ) En comparación con IRGC102305, la longitud de grano y el peso de 1,000
granos de GIL25 aumentaron en 13.6 y 16.8%, respectivamente, lo que finalmente resultó en un
aumento dramático del rendimiento de grano por planta (+ 14.3%) (Fig. 1c – f y Fig.
Suplementaria 2) . La observación adicional de las glumas externas e internas mediante
microscopía electrónica de barrido descubrió que GIL25 tiene células epidérmicas más largas
que las de IRGC102305 (Fig. 1g- i ), lo que causa un grano más largo. Para identificar factores
genéticos para el tamaño de grano en el arroz africano, desarrollamos una población de F2 que
contiene 186 individuos separados de un cruce entre GIL25 e IRGC102305, y detectamos un
locus que controla la longitud del grano (denominado GL4) entre los marcadores RM3335 y
RM5608 en el cromosoma 4, con el alelo derivado de O. barthii contribuyendo al aumento de la
longitud del grano (Fig. 2a). Para mapear el locus GL4 con precisión, analizamos otras 6.500
plantas utilizando marcadores recientemente desarrollados entre RM3335 y RM5608. Una
prueba de progenie de segregantes homocigotos redujo aún más el locus de GL4 a una región de
5,9 kb entre los marcadores M3 y M4 (Fig. 2b). En esta región, solo había un gen anotado
ORGLA04G0254300 según la información de anotación del genoma de O. glaberrima
IRGC96717 (var. CG14) (http://ensembl.gramene.org/Oryza_glaberrima/). Utilizando la
reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT – PCR),
encontramos que ORGLA04G0254300 se expresa principalmente en la panícula joven y se
expresa débilmente en el tallo, pero no se expresa en la hoja y la raíz (Figura complementaria 3).
Por lo tanto, propusimos que ORGLA04G0254300 era un gen candidato para GL4. Para verificar
esta hipótesis, generamos una construcción (pGL4) colocando un fragmento genómico de 4.8 kb
de GIL25, que cubre todo el gen ORGLA04G0254300, en el vector pCAMBIA1300, e
introdujimos esta construcción en IRGC102305. Las 12 líneas transgénicas independientes
mostraron granos más largos y más grandes que los controles (Fig. 2c-h), lo que demuestra que
ORGLA04G0254300 era el gen GL4, y que la mutación en el gen GL4 causó el tamaño de grano
pequeño en el arroz IRGC102305 cultivado en África. Para identificar las mutaciones causales,
descubrimos cinco mutaciones en las secuencias de codificación GL4 entre los padres de mapeo
GIL25 e IRGC102305 (Fig. 3a y Fig. Suplementaria 4). Estos incluyeron tres mutaciones en el
primer exón, incluida una sustitución de 1 pb (SNP1, G294A), una inserción / deleción de 6 pb
( indel ) y una sustitución de 1 pb (SNP2, C760T) que resultó en un codón de parada prematuro
del alelo IRGC102305, y dos mutaciones SNP (SNP3 y SNP4) en el intrón. Secuenciamos los
genes GL4 de 16 accesiones de O. barthii y 67 diversos O. glaberrima cultivaron arroz de 13
países de África occidental (Tabla complementaria 2) y analizamos sus haplotipos. Encontramos
que las 16 accesiones de arroz silvestre se agruparon en cinco haplotipos (H1 a H4) y las 67 O.
glaberrima solo se agruparon en dos haplotipos (H4 y H5) (Fig. 3b). Una prueba de asociación
con longitud de grano y polimorfismo de nucleótidos reveló que la señal más fuerte estaba
presente en el sitio SNP2 (Fig. 3b , c ). Se detectó una señal media en el sitio SNP3, que estaba
en desequilibrio de enlace alto con el sitio SNP2 (r2> 0.8) (Fig. 3d). Otras comparaciones de
secuencias demostraron que el nucleótido en el sitio SNP2 de las 16 accesiones de O. barthii era
C, y el de 62 O. glaberrima las accesiones fueron T. Además, se realizó una mutación puntual en
el sitio SNP2 en el alelo GL4 de IRGC102305 para desarrollar otra construcción genómica
(pGL4-2) sustituyendo el nucleótido T con C, que corrige la mutación y produce una proteína
intacta. Introdujimos esta construcción en IRGC102305. La observación del tamaño de grano
encontró que las 15 líneas transgénicas independientes mostraron complementación de la
longitud y el peso del grano.
(Fig. 3e – g). Estos resultados reflejaron que la mutación SNP2 (C760T) en GL4 podría explicar
la diferencia en la longitud del grano entre W1411 e IRGC102305. Se predijo que el alelo GL4
de GIL25 codificaría un polipéptido de 387 residuos. El análisis utilizando el programa
PredictNLS encontró que la proteína GL4 tenía una señal de localización nuclear (NLS) en 302-
306 aminoácidos. El codón de parada prematuro causado por la mutación SNP2 (C760T) en GL4
condujo al truncamiento de 253 residuos de aminoácidos sin el NLS (Figura complementaria 5).
Para verificar el impacto de la eliminación de NLS en la proteína GL4, fusionamos una proteína
verde fluorescente (GFP) con alelos GL4 de GIL25 e IRGC102305 para hacer vectores de
expresión transitoria GL4Ob – GFP y GL4Og – GFP, respectivamente, bajo el control de
Promotor CaMV35S. Las dos construcciones se introdujeron en las células epidérmicas de
cebolla. La observación de señales de fluorescencia encontró que la proteína de fusión GL4Ob-
GFP se localizaba en el núcleo, pero la proteína de fusión GL4Og-GFP se localizaba tanto en el
citoplasma como en el núcleo (Figura complementaria 6). Estos resultados sugirieron que la
interrupción prematura de la traducción de la proteína GL4 en O. glaberrima podría causar la
disfunción de su localización nuclear. En particular, el análisis BLASTP
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST) mostró que la proteína GL4 tiene una alta identidad con
SH4 / SHA1, su gen ortólogo en el arroz salvaje asiático. Una búsqueda de dominio de GL4 en
las bases de datos Pfam y PROSITE encontró un dominio Myblike en su secuencia, lo que indica
que GL4 es una proteína similar a Myb como SH4 / SHA1 en O. sativa. El árbol genético
Ensembl (http: // ensembl.gramene.org/ Oryza_glaberrima / Gene / Compara_Tree? Db = core ;
g = ORGLA04G0254300; r = 4: 25150788-25152622; t = ORGLA04 G0254300.1) muestra que
este gen se conserva en el género Oryza y otras especies de cultivos principales, lo que indica
que tiene una restricción funcional durante la evolución. Anteriormente se informó que SH4
controlaba la transición de la rotura a la no rotura durante la domesticación del arroz asiático
cultivado O. sativa seleccionando otra mutación SNP (G237T ) 28,29 . Por lo tanto, evaluamos
más la rotura de granos entre GIL25, IRGC102305 y plantas transgénicas. Los resultados
mostraron que GIL25 mostró una característica de rotura de grano con
Figura 1 | Caracterización de los rasgos de granos entre el arroz africano cultivado IRGC102305
y la línea de introgresión GIL25. a , Granos del arroz africano cultivado IRGC102305 y línea de
introgresión GIL25. Barra de escala, 5 mm. b, Genotipos gráficos de GIL25 e IRGC102305. c – f
, Comparación de los rasgos de grano entre GIL25 e IRGC102305: longitud de grano (c); ancho
de grano (d); 1,000 peso de grano (e); rendimiento de grano por planta (f). g , Imágenes de
microscopio electrónico de barrido de la gluma externa (arriba) y las células epidérmicas internas
de la lemma (abajo). Barras de escala, 100 µm. h, Comparación del número promedio de células
a lo largo del eje longitudinal entre los granos IRGC102305 y GIL25. i , longitud de celda. n =
10 inc, d, h ; n = 3 ine, f, i . Todos los datos son medios ± sd **
Figura 2 | Clonación basada en mapas de GL4. a , el locus TheGL4 se localizó entre el marcador
RM3335 y RM5608 en el cromosoma 4. b , el locus TheGL4 se redujo a un intervalo de 5,9 kb
entre los marcadores M3 y M4 utilizando 6.500 plantas. El número de recombinantes entre GL4
y marcadores se muestra en el cromosoma. R1 – R6, seis líneas recombinantes. c , El fenotipo de
grano del control y la planta transgénica de IRGC102305 que expresa pGL4. Las plantas de
control eran una línea transgénica que llevaba un vector vacío. d , Imágenes de microscopio
electrónico de barrido de las células epidérmicas internas de la lemma. Barras de escala, 100 µm.
e – h, Comparación de los rasgos relacionados con el grano entre el control y la planta
transgénica de IRGC102305 que expresa pGL4: longitud del grano (e); ancho de grano (f);
espesor de grano (g); 1000 granos de peso (h). n = 10 ine –g yn = 3 inh . Todos los datos son
medios ± sd ** P <0.01. Se utilizó la prueba t de Student.
Una zona de abscisión completa entre el tren y el pedicelo (Fig. 4a). Sin embargo, la semilla de
IRGC102305 permaneció en las plantas en la madurez y mostró una deficiencia en el desarrollo
de la zona de abscisión cerca del haz vascular (Fig. 4b). La planta transgénica que expresaba el
alelo GL4 de GIL25 recuperó una zona de abscisión completa y exhibió características de rotura
de semillas (Fig. 4 y Suplementario de Cochinos 7 y 8). Estos resultados indicaron que GL4 /
ObSH4 también controlaba la destrucción de las semillas en el arroz salvaje africano; La
mutación SNP2 en el GL4 resultó en la pérdida de la destrucción de las semillas en
IRGC102305. Para comparar el efecto genético tanto en el tamaño de grano como en la
destrucción entre los dos alelos mutantes, desarrollamos dos líneas casi isogénicas (NIL-GL4Or
y NIL-GL4Og) bajo el arroz de cultivo asiático O. sativa var. Antecedentes genéticos de Teqing
(NIL-GL4Os), que contenían una región GL4 muy pequeña de arroz silvestre asiático ( Oryza
rufogon Griff .) Y arroz africano cultivado O. glaberrima , respectivamente (Figuras
suplementarias 9 y 10). El NIL-GL4Or mostró un fenotipo que rompe el grano con una zona de
abscisión completa entre el grano y el pedicelo (Fig. 4d). Tanto NIL-GL4Os como NIL-GL4Og
perdieron el rasgo devastador. La semilla de NIL-GL4Og fue mucho más difícil de eliminar que
la de NIL-GL4Os, lo que es consistente con la deficiencia dramática en el desarrollo de la zona
de abscisión en NIL-GL4Og en comparación con la de NIL-GL4Os (Fig. 4e , f y Fig.
Suplementaria 11). Al mismo tiempo, tanto la longitud como el peso del grano no fueron
significativamente diferentes entre NIL-GL4Os y NIL-GL4Or, lo que implica que la selección
del alelo de mutación Ossh4 no cambió el tamaño del grano durante la domesticación del arroz
asiático. Sin embargo, la semilla de NIL-GL4Og fue más pequeña que la de NIL-GL4Os, lo que
sugiere que el alelo mutante Oggl4 condujo a un grano más pequeño (Fig. 4g-k).
Figura 3 | Identificación de la mutación causante del gen GL4. a , Las variaciones en la región de
codificación GL4 entre GIL25 e IRGC102305. b , Análisis de haplotipos del gen GL4 en 16
accesiones de arroz silvestre y 67 accesiones de arroz africano domesticado utilizando los cinco
sitios de mutación entre GIL25 e IRGC102305. c , Prueba de asociación de cinco variantes en el
GL4. Puntos negros, cuatro variaciones; punto rojo, mutación causal propuesta (SNP2). d ,
matriz triangular del desequilibrio de enlace por pares. e , El fenotipo de grano del control y la
planta transgénica de IRGC102305 que expresa pGL4-2. Barra de escala, 5 mm. f , g ,
Comparación de la longitud del grano y el peso del grano entre el control y la planta transgénica
de IRGC102305 que expresa pGL4-2: longitud del grano (f); 1,000 granos de peso (g). Las
plantas de control eran una línea transgénica que llevaba un vector vacío. n = 10 inf yn = 3ing.
Todos los datos son medios ± sd ** P <0.01. Se utilizó la prueba t de Student.
Para dilucidar la trayectoria evolutiva de GL4 durante domesticación arroz africano, se volvieron
a analizar 93 O. glaberrima y 94 O. barthii adhesiones utilizando publicados anteriormente
resequencing datos que abarcan las especies ranges5 , 6 . El análisis de componentes principales
(PCA) de las variaciones genéticas de 5 kb aguas arriba y aguas abajo de GL4 separa las
accesiones de 11 O. glaberrima que llevan el alelo ancestral (C) en SNP2 (cromosoma 4,
25152034) de las accesiones de O. glaberrima que llevan el alelo derivado (T), indicando dos
haplotipos de GL4 segregado en O. glaberrima (figura complementaria 12 y tabla
complementaria 3). La homocigosidad extendida del haplotipo (EHH) se calculó para los alelos
ancestrales y derivados aguas arriba y aguas abajo de SNP2 en O. glaberrima (Fig. 5a). La
descomposición de EHH para los alelos derivados es mucho más lenta que para los alelos
ancestrales, lo que sugiere que el haplotipo que portaba T pero no el que portaba C fue
seleccionado durante la domesticación. Además, se detectó una reducción de la diversidad de
nucleótidos (π) INO . accesiones de glaberrima que llevan T en SNP2 en comparación con O.
barthii
(Figura complementaria 13). Juntos, estos análisis muestran que GL4 estaba bajo selección
durante la domesticación de O. glaberrima . Curiosamente, la variación en GL4 está restringida
espacialmente a un área en el rango de bosque del suroeste (SO), lo que agrega evidencia que
respalda las raíces profundas y separadas de las prácticas de domesticación en el oeste frente al
rango de cultivo oriental5. Las accesiones que llevan C en SNP2 se recogieron de Guinea,
Liberia o Sierra Leona (Fig. 5b y Tabla complementaria 4), y se agruparon en PCA (Fig.
Suplementaria 14). La falta de fijación en GL4 en la región SW conduce a dos posibles
explicaciones: o bien otros loci podrían haber estado involucrados en la selección del tamaño de
grano pequeño durante el proceso de domesticación gradual en esa región geográficamente
distinta, o la selección de granos pequeños que no se rompen comenzó en ese lugar, y la
variación observada se debe a la persistencia de haplotipos ancestrales en las variedades locales.
Solo aquellos con el fenotipo de grano pequeño y que no se rompen habrían sido sacados de la
región después del inicio de la domesticación.
Figura 4 | Comparación de los efectos de diferentes alelos GL4. a – f , imágenes de fluorescencia
de una sección longitudinal de la unión de la flor y el pedicelo. Flechas blancas, capa de
abscisión. Barras de escala, 50 µm. a, línea parental GIL25 de la población de mapeo, con una
capa de abscisión completa (indicada por una flecha). b , línea parental IRGC102305 de la
población de mapeo, con una capa de abscisión incompleta. c , plantas transgénicas de
IRGC102305 que expresan pGL4-2, con una capa de abscisión completa. d , líneas casi
isogénicas GL4 NIL-GL4Or (que contiene una región GL4 muy pequeña de arroz salvaje
asiático en un fondo genético Teqing ), con una capa de abscisión completa. e , Teqing de arroz
cultivado asiático (NIL-GL4Os), con una capa de abscisión incompleta. f , líneas casi isogénicas
GL4 NIL-GL4Og (que contiene una región GL4 muy pequeña de arroz africano cultivado en un
entorno genético Teqing ), con una capa de abscisión severamente incompleta. g , El fenotipo de
grano de las líneas GL4 casi isogénicas NIL-GL4Or, NIL-GL4Og y Teqing (NIL-GL4Os). Barra
de escala, 5 mm. h – k, Comparación de la forma del grano entre NIL-GL4Or, NIL-GL4Os y
NIL-GL4Og: longitud de grano (h ); ancho de grano ( i ); espesor de grano (j); Peso de 1,000
granos (k). n = 10 inh –j; n = 3 tintas. Todos los datos son medios ± sd ** P <0.01. Se utilizó la
prueba t de Student.
Tomados en conjunto, en el presente estudio demostramos que GL4 / SH4 es un gen de
domesticación clave con efectos pleiotrópicos que controlan tanto el tamaño de grano como la
destrucción del arroz. Durante la domesticación del cultivo, la reducción de la destrucción de las
semillas y el aumento del tamaño de la semilla fueron dos objetivos principales de selección en
la mayoría de los granos, pero parece que en África occidental, la selección se realizó de una
forma diferente que condujo a una disminución del tamaño de la semilla. Aunque diferentes
alelos mutantes (Ossh4 y Ogsh4) que resultaron en la pérdida de la característica de rotura de
grano fueron seleccionados en paralelo durante la domesticación del arroz africano y asiático, ya
sea intencional o inconscientemente, la selección de la mutación Ossh4 no cambió el tamaño de
la semilla en Asia arroz cultivado, pero la selección de Ogsh4 dio lugar a pequeñas semillas en
arroz cultivado africano. ¿Por qué este alelo Ogsh4, que reduce el tamaño de la semilla e
inevitablemente da como resultado un menor rendimiento, seleccionado durante la
domesticación del arroz africano? Puede haber dos posibilidades: en primer lugar, es posible que
la alta toxicidad del hierro en gran parte de África occidental, que puede aumentar el alojamiento
en el cultivo de O. glaberrima que ya es propenso al alojamiento , pueda haber llevado a los
agricultores a favorecer los granos más pequeños; segundo, podría no haber otras mutaciones
funcionales disponibles para la selección que afecten la función del gen SH4 en el grupo
genético limitado en el arroz de África. Además, la arquitectura genética del rasgo del tamaño de
la semilla es compleja, involucra más de 400 genes30 y, por lo tanto, debe estar bastante
canalizada, lo que sugiere que las mutaciones genéticas en otros genes y reguladores, como los
microARN, solo tendrán un efecto minúsculo31. Además, parece que algunos genes importantes
para el tamaño de la semilla de arroz asiática pueden estar ausentes o no tener importancia en
otros Oryza (por ejemplo, GS332), lo que limita la capacidad de aprovechar los hallazgos en una
especie para catalizar el descubrimiento en otra. Sin embargo, dada la preferencia contemporánea
por un tamaño de grano más grande y la necesidad de aumentar el rendimiento del cultivo,
argumentamos que reemplazar el alelo Ogsh4 con el alelo Ossh4 mejoraría el rendimiento de
grano de O. glaberrima en la práctica de la raza y lo haría un cultivo más valioso para seguridad
alimentaria futura Con una mejora, el rendimiento de O. glaberrima puede igualar o incluso
superar el arroz asiático cultivado, y los criadores pueden aprovechar las combinaciones de
rasgos locales adaptadas a la miríada de entornos, capacidades y prácticas de cultivo en África
occidental33–35. Para satisfacer las demandas alimentarias de una población en rápido
crecimiento en África, la ampliación del cultivo resistente de cultivos nativos es uno de los
objetivos más importantes para un futuro con seguridad alimentaria. Sugerimos una selección
para aumentar el tamaño de grano en O. glaberrima y explotar sus requisitos de bajos insumos y
adaptaciones a muchos paisajes marginales de África occidental. Esto mejorará la seguridad
alimentaria del África subsahariana, preservará el patrimonio cultural y proporcionará un arroz
más nutritivo y con mejor sabor para la creciente población.
Figura 5 | Análisis evolutivo de GL4 / SH4. a , Análisis de homocigosidad de haplotipo
extendido (EHH) de GL4. El SNP focal (SNP2) del análisis se indica mediante una línea de
puntos. b , Análisis biogeográfico de la variación genética de SNP2. Los puntos en el mapa
representan sitios de recolección de accesiones de O. glaberrima utilizadas en el análisis. Las
accesiones de O. glaberrima que llevan C en SNP2 son rojas; las accesiones que llevan T en
SNP2 de la población del sudoeste son azules; las accesiones que llevan T en SNP2 de otras
poblaciones son negras. El área sombreada en el mapa indica los países donde se recogieron las
accesiones de O. glaberrima que llevan C en la posición SNP2.
Métodos Materiales vegetales. La línea de introgresión GIL25 fue generada por la progenie de
retrocruzamiento repetitivo derivado de un cruce entre W1411 (O. barthii ) × IRGC102305 (O.
glaberrima ) con IRGC102305 como el padre recurrente utilizando marcador asistido
selección . Se alberga un segmento en el locus GL4 y otro segmento en el cromosoma 10. las
plantas NIL-GL4Or El NIL-GL4Og y tienen diferentes alelos GL4 de O. glaberrima y YJWCR,
respectivamente, bajo el mismo fondo de Teqing (O. sativa L. ssp . indica variedad). Las
secuencias de cebadores para los ensayos de genotipado se proporcionan en la Tabla
complementaria 1. Otros cultivares y accesiones de arroz silvestre utilizados para las pruebas de
haplotipo en este estudio se enumeran en la Tabla complementaria 2.
Condiciones de cultivo y medición de rasgos. Las plantas de arroz se cultivaron en Sanya ,
provincia de Hainan, China, en condiciones de campo con un espacio entre plantas de 15 × 15
cm2 para el trasplante. Para el análisis de rendimiento de grano por planta, se cultivaron un total
de 50 plantas para cada línea en un campo de arroz con tres bloques completamente al azar. El
peso de 1,000 granos, el número de macollas por planta y el rendimiento de grano por planta se
midieron usando 30 plantas de tres bloques completamente al azar. El número de granos por
panícula se investigó utilizando la panícula principal del tallo. Se seleccionaron y midieron
treinta granos completamente llenos mediante un calibrador electrónico Vernier con pantalla
digital para obtener la longitud, el ancho y el grosor del grano. El casco entero espiguilla,
incluyendo la lema y palea , se incluyó en estas mediciones. Se midieron tres panículas por línea
para determinar la resistencia a la rotura del grano de arroz a los 35 días después de la partida. Se
observaron números de células de longitud de grano bajo un estereoscopio (Zeiss) cuando los
granos estaban completamente maduros.
Análisis histológico Se obtuvieron panículas en la etapa de floración; Se logró una sección
longitudinal cortando a mano el grano y la unión del pedicelo. Las secciones se tiñeron con
naranja de acridina y se observaron bajo un microscopio de escaneo láser Olympus FV1000. Se
utilizaron una línea láser de 488 nm y una de 543 nm.
Microscopía electrónica de barrido. La superficie externa y las células epidérmicas internas de la
lemma de semillas maduras se chaparon en oro y se observaron utilizando un microscopio
electrónico de barrido Hitachi S-2460 a 15 K. El número de células se calculó a lo largo del eje
longitudinal. La longitud de la celda se midió usando el software Image J. Las espiguillas a ∼ 35
días después del encabezado se recolectaron para escanear la sección de separación entre el
grano y el pedicelo como se indicó anteriormente.
Extracción de ARN, cuantitativa RT-PCR. El ARN total se extrajo de varios tejidos de arroz y se
transcribió inversamente usando el kit de transcriptasa inversa M-MLV ( Promega ). La RT-PCR
cuantitativa se llevó a cabo utilizando la mezcla SYBR Green QPCR (Bio-Rad), y el gen actina1
se usó como un control endógeno para normalizar la expresión del gen detectado. Las
condiciones del ciclo incluyeron incubación durante 30 s a 95 ° C seguido de 40 ciclos de
amplificación (95 ° C durante 5 sy 60 ° C durante 30 s). Todas las muestras se repitieron al
menos tres veces. Los cebadores se dan en la Tabla 1 suplementaria.
Construcción de vectores y prueba de complementación. Para generar el vector complementario
pGL4, se amplificó una longitud total de fragmentos de ADN de 4,8 kb que contenían 2,2 kb
aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción GL4 y 0,5 kb aguas abajo de su sitio de
terminación desde W1411 para colocarlos en un vector pCAMBIA1300. La región de 3,1 kb
aguas arriba del SNP2 y 1,7 kb aguas abajo del SNP se amplificó a partir de IRGC102305,
respectivamente. El SNP2 se cambió en el primerand se colocó en pCAMBIA1300 mediante
recombinación homóloga para construir el vector pGL4-2. Obtuvimos 12 para pGL4 y 15 para
plantas transgénicas independientes de pGL4-2, respectivamente. Los cebadores utilizados se
enumeran en la Tabla complementaria 1.
Localización subcelular. Las secuencias de codificación del gen GL4 se amplificaron de W1411
e IRGC102305 para generar los vectores p35S :: GL4 – GFP y p35S :: Oggl4 – GFP. Los dos
vectores fueron bombardeados en células epidérmicas de cebolla usando un dispositivo biolístico
de helio (Bio-Rad PDS-1000). Se usó 4'-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para indicar los
núcleos bajo un microscopio de fluorescencia Olympus FV1000.
Análisis evolutivo de GL4. Las lecturas de resecuenciación de 93 O. glaberrima y 94 O. barthii
se descargaron de la base de datos de NCBI Short Read Archive (SRA). The Burrows – Wheeler
Aligner (BWA) V0.7.10 (ref. 36). se usó para mapear las lecturas crudas del extremo del par en
el cromosoma 4 del ensamblaje del genoma O. glaberrima CG145. Las llamadas y el filtrado de
SNP se realizaron utilizando el Genome Analysis Toolkit (GATK) V3.4 (ref. 37). En total,
680,362 SNPs fueron identificados y utilizados en el siguiente análisis. Se realizó un PCA de
variaciones genéticas 5 kb aguas arriba y aguas abajo de GL4 utilizando el programa smartpca
implementado en el paquete EIGENSOFT V6.0.1 (ref. 38). Los genotipos de las accesiones de
O. glaberrima fueron escalonados e imputados utilizando Beagle 4.1 (referencias 39 , 40 ). El
EHH se calculó utilizando el paquete R REHH 2.0 (ref. 41) con SNP2 (cromosoma 4, 25152034)
como SNP focal . Como las accesiones del grupo V O. barthii descritas anteriormente5 están
genéticamente cerradas a O. glaberrima , el estado ancestral se infirió como el alelo principal en
las accesiones del grupo I a IV O. barthii en cada posición de SNP. La diversidad de nucleótidos
(π) OFO . Las accesiones de Glaberrima que transportan T en los SNP y todas las accesiones de
O. barthii se calcularon utilizando VCFtools V0.1.14 (ref. 42). El resultado de PCA usando
variaciones genéticas de todo el genoma de 93 accesiones de O. glaberrima se descargó de
Meyer et al.6 y se graficó con las accesiones de O. glaberrima que portaban C en la posición
SNP2 resaltada en rojo (Fig. Suplementaria 14). Dos accesiones de O. glaberrima (IRRI_103993
e IRRI_104573) con llamadas perdidas en la posición SNP2 se excluyeron del análisis
biogeográfico de GL4. Las coordenadas GPS de 91 O. glaberrima se descargaron de Meyer et
al.6. El mapa de análisis biogeográfico se dibujó usando R.
Disponibilidad de datos. Los autores declaran que los datos que respaldan los resultados de este
estudio están disponibles en el documento y en la Información complementaria. Secuencias
genéticas de GL4 se han depositado en el GenBank con los siguientes códigos de acceso:
KY427262 (GL4 en W1411), KY427263 (GL4 en IRGC102305).