Materiales y procedimiento

Materiales
Tubos eppendorf de 1.5 ml autoclavados, Caja de puntas para micropipetas de 10 ul, 100ul,
1000 ul, Parafilm, Micropipetas (0,5-10; 10-100;100-1000), Carrusel para micropipetas,
Papel Aluminio Papel Toalla, Botella tapa azul de 500ml, Hot plate Amarillo, Marcador
para vidrio, Cuchillos, Tabla para cortar, Espátulas, Agitador magnético y guantes.
Reactivos: Agua peptonada tamponada Difco, Agua destilada, Etanol absolute, High Pure
PCR Template Preparation Kit Roche, Etanol 70% y Aspersor con etanol 70%. Equipos:
Incubadora, Microcentrífuga, Termobloque, phmetro, Autoclave, Cámara de flujo laminar,
Vórtex y Congeladora.

Procedimiento

Para la preparación de la muestra, se procede al pre-enriquecimiento de los

microorganismos presentes en agua peptonada tamponada (Difco). Esto se lo realiza con el
fin de recuperar las células dañadas debido a los diversos procesos a los cuales el alimento
ha sido sometido. Para la preparación del Agua peptonada tamponada se disolvió 5,1 g de
polvo (Agua peptonada tamponada Difco) en agua purificada. Luego, se calentó la solución
hasta que se haya disuelto completamente, ajustando el pH de la solución a 7,2 ±0,2.
Etiquetar correctamente el frasco con la fecha de preparación, tipo de muestra y nombre.

Posterior a ello se lo llevó a autoclave a 121 ºC durante 15 minutos. Una vez transcurrido
este tipo, se procedió a realizar la siembra de pre-enriquecimiento del alimento, con 25 g de
alimento en 255 ml de agua peptonada tamponada y se incubó de manera aeróbica de 35 a
37ºC durante 24 - 48 horas.

Al cabo de dos días, se realizó la purificación de ADN. Para ello se utilizó un tubo de micro
centrífuga de 1.5 ml libre de nucleasas. A este se le agregó 200 µl del material de muestra,
200 µl de Lysis Buffer, 200 µl de Buffer de Unión y 40 µl de Proteinasa K, se homogenizo
la solución y se la incubo a 70ºC por 10 minutos. Transcurrido los 10 minutos, se agregó
100 µl de Isopropanol (o Etanol absoluto) y se mezcló completamente.

Para transferir la muestra a un Tubo de Purificación, se insertó un tubo de filtración, en un

Tubo de colecta, para ello se pipeteó la muestra completa en la parte superior del depósito
del buffer en el tubo de filtración y se lo introdujo el conjunto del tubo de filtración en una
centrífuga de sobremesa estándar, por un minuto a 8000 x g. Después de la centrifugación
se retiró el tubo de filtración del tubo de colecta; se desechó el líquido presente y el tubo de
colecta.

Para la remoción de Inhibidores se agregó 500 µl del Buffer removedor de Inhibidores

sobre el depósito del conjunto del tubo de filtración, y se volvió a centrifugar a 8000 x g
por 1 minuto y desechar el líquido y el tubo de colectar. Finalizado, esta etapa, se reinsertó
el tubo de filtración en un nuevo tubo de colecta.

Por otro lado, para el lavado de la muestra se agregó 500 µl de Buffer de lavado, sobre el
depósito del tubo de filtrado, se centrifugó, se lavó la muestra y se volvió a centrifugar,
retirando el tubo de filtración de colecta, desechando el líquido presente y el tubo de
colecta.

Además, se volvió a repetir el paso de lavado y centrifugado de la misma manera;

desechando el líquido restante. Después de realizar lo anterior se hizo girar el filtro del tubo
de colecta del conjunto durante 10 segundos en velocidad máxima para eliminar el tampón
de lavado residual.

Para la elución del ácido nucleico, se agregó 200 µl de Buffer de elución precalentado
(70ºC) al tubo de filtrado, se centrifugó el conjunto por 1 minuto a 8000 x g. Para esta
instancia el tubo de micro centrífuga contiene el ácido nucleico eluido, almacenarlo a
-20ºC, para análisis posteriores.