Libro MICROBIOLOGÍA 2017 PDF

GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS
TALLER DE MICROBIOLOGÍA 2017
9-13 enero 2017

Santiago, Chile
Programa de Microbiología y Micología, ICBM

Facultad de Medicina
Universidad de Chile
1
MICROBIOLOGÍA DEL SIGLO XXI
CONCEPTO GENERAL
Los microorganismos son seres sociales que viven en comunidad en su ambiente
natural y que interactúan con otros seres vivos.
CONCEPTOS ESPECÍFICOS
1. La plasticidad genómica de los microorganismos ha generado su biodiversidad y les ha
permitido colonizar diferentes ambientes.
2. Los procesos que originan la variabilidad genética de los microorganismos son
principalmente mutaciones y transferencia horizontal de genes.
3. Los microorganismos se comunican y coordinan la expresión de genes en función de su
densidad poblacional.
4. Los microorganismos son actores principales en el campo de la salud y la biotecnología.
COORDINADOR
Juan Carlos Salazar: Programa de Microbiología y Micología, ICBM, Facultad de Medicina, U. de Chile
DOCENTES PARTICIPANTES
Felipe Del Canto: Programa de Microbiología y Micología, ICBM, Facultad de Medicina, U. de Chile
María Cristina Díaz: Programa de Microbiología y Micología, ICBM, Facultad de Medicina, U. de Chile
Nicolas Guilliani: Depto. Biología, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile
Claudia Lefimil: Área Bioquímica, ICOD, Facultad de Odontología, Universidad de Chile
Antonio Said: Depto. de Biología, Facultad de Ciencias Básicas, UMCE
Juan Carlos Salazar: Programa de Microbiología y Micología, ICBM, Facultad de Medicina, U. de Chile
Cecilia Toro: Programa de Microbiología y Micología, ICBM, Facultad de Medicina, U. de Chile
María Teresa Ulloa: Programa de Microbiología y Micología, ICBM, Facultad de Medicina, U. de Chile
METODOLOGÍA: Este curso será impartido mediante clases teóricas y actividades prácticas.
LUGAR: Auditórium Hernán Romero y Laboratorios de Salud Pública, Salas de trabajo

práctico 1-4 (Zócalo). Sector K, Facultad de Medicina, Campus Norte, Universidad
de Chile. Avda. Independencia N° 1027, Santiago, Chile.
FECHA Y HORARIO: 09 al 13 de Enero de 2017 - 40 hrs totales

Lunes a Viernes, de 9:00 a 13:00hrs (Teórico-Práctico) y de
14:30 a 18:00hrs (Teórico-Práctico).
EVALUACION: Se evaluará con 1 prueba escrita, modalidad de selección múltiple.
REQUISITOS DE CERTIFICACIÓN: Asistencia mínima 80%.

Aprobación nota mínima 4,0 (escala de 1,0 a 7,0).
2
Taller Microbiología del siglo XXI
Calendario de clases teóricas y prácticas
Fecha Hora Actividad Profesor Sala
encargado
La plasticidad genómica de los microorganismos ha generado su biodiversidad y les ha permitido
colonizar diferentes ambientes
Lunes 9 9:00-9:30 CT1 El Mundo Microbiano JCSalazar Hernán
Romero
9:30-10:30 CT2 Aspectos básicos de las bacterias: morfología, JCSalazar Hernán
estructura, fisiología y reproducción Romero
10:30-11:00 CAFÉ
11:00-12:00 CT3 Generalidades de hongos levaduriformes y hongos MCDíaz Hernán
filamentosos Romero
12:00-13:00 TP1 Observar el mundo microbiano mediante JCSalazar, Salas de
microscopía al fresco y tinciones de bacterias y hongos. ASaid, TP Salud
MCDíaz, Pública
CeToro Zócalo
13:00-14:30 Almuerzo
14:30-16:00 TP2 Observar la biodiversidad microbiana ambiental y JCSalazar, Salas de
humana, mediante cultivo en medios nutritivos. ASaid, TP Salud
CLefimil, Pública
MTUlloa, Zócalo
16:00-16:30 Descanso
16:30-18:00 Observar la resistencia a antimicrobianos mediante: JCSalazar, Salas de
TP3 Estudio de susceptibilidad in vitro. ASaid, TP Salud
MTUlloa, Pública
TP4 Selección de mutaciones espontáneas que
CeToro Zócalo
confieren resistencia a antibióticos.
Los procesos que originan la variabilidad genética de los microorganismos son principalmente
mutaciones y transferencia horizontal de genes
Martes 10 9:00-10:00 CT4 Genomas microbianos: mutaciones espontáneas y CeToro Hernán
Transferencia Horizontal de Genes Romero
10:00-11:00 CT5 Impacto de la Transferencia Horizontal de Genes CeToro Hernán
en los microorganismos Romero
11:00-11:30 CAFÉ
11:30-13:00 TP5 Evidenciar la transferencia horizontal de genes JCSalazar, Salas de
mediante ensayos de transformación. CeToro, TP Salud
ASaid, Pública
MTUlloa Zócalo
14:30-16:00 TP2 Cont. Observar la biodiversidad microbiana JCSalazar, Salas de
ambiental y humana analizando el crecimiento de ASaid, TP Salud
colonias en medios nutritivos y Tinción de Gram. CLefimil, Pública
MTUlloa, Zócalo
TP4 Cont. Observar la resistencia a antimicrobianos
mediante la selección de mutantes espontáneas.
16:30-18:00 TP3 Cont. Observar e interpretar la resistencia a MTUlloa, Salas de
antimicrobianos mediante lectura y análisis del estudio CeToro, TP Salud
de susceptibilidad. ASaid, Pública
JCSalazar Zócalo
3
Los microorganismos se comunican y coordinan la expresión de genes
en función de su densidad poblacional
Miércoles 9:00-10:00 CT6 Comunicación entre los microorganismos NGuilliani Hernán
11 Romero
10:00-11:30 TP4 Cont. Observar la resistencia a antimicrobianos JCSalazar, Salas de
mediante selección de mutantes espontáneas. CeToro, TP Salud
ASaid, Pública
TP5 Cont. Evidenciar la transferencia horizontal de
CLefimil, Zócalo
genes mediante la observación de adquisición de un
fenotipo nuevo por transformación.
TP6 Observar la comunicación bacteria-bacteria
mediante incubación del sobrenadante de la cepa
productora de autoinductor con una cepa reportera.
11:30-11:45 CAFÉ
11:45-13:00 CT7 Formación de Biopelículas CLefimil Hernán
Romero
14:30-16:00 TP5 Cont. Evidenciar la transferencia horizontal de JCSalazar, Salas de
genes mediante la observación de la adquisición de un CeToro, TP Salud
nuevo plásmido utilizando geles de agarosa. ASaid, Pública
Zócalo
16:30-18:00 TP6 Cont. Observar la comunicación bacteria-bacteria JCSalazar, Salas de
mediante la producción de luz por una cepa reportera. NGuilliani, TP Salud
CLefimil, Pública
TP7 Evidenciar la formación de biopelículas en perlas
CeToro Zócalo
de azufre mediante la tinción con cristal violeta o PCR
de cepas de Acidithiobacillus crecidas previamente.
TP8 Evidenciar la formación de biopelículas sobre la
dentadura, mediante el uso del colorante caristop
dualtone.
Los microorganismos son actores principales en el campo de la salud y la biotecnología
Jueves 12 9:00-10:00 CT8 Interacción de los microorganismos con sus FDelCanto Hernán
hospederos Romero
10:00-10:30 CT9 Probióticos: ejemplo de microorganismos FDelCanto Hernán
beneficiosos Romero
10:30-11:15 TP9 Observar la presencia o ausencia de genes de JCSalazar, Salas de
virulencia mediante PCR de genes específicos de E. coli ASaid, TP Salud
diarreogénicos. CLefimil Pública
Zócalo
11:15-11:45 CAFÉ
11:45-13:00 CT10 Microorganismos patógenos para el hombre MTUlloa Hernán
Romero
14:30-16:00 TP9 Cont. Observar la presencia o ausencia de genes JCSalazar, Salas de
de virulencia mediante electroforesis en geles de ASaid, TP Salud
agarosa de los productos amplificados. CLefimil Pública
Zócalo
16:30-18:00 TP10 Comparar in silico genomas de especies FDelCanto Hernán
bacterianas beneficiosas y patógenas. Romero
4
Capítulo de cierre del taller Microbiología del siglo XXI
Viernes 13 9:00-10:30 Discusión general de los temas tratados en el taller de Mesa Hernán
Microbiología 2017 Redonda Romero
10:30-11:00 CAFÉ
11:00-13:00 Evaluación del Taller JCSalazar, Hernán
MCDíaz Romero
15:00-17:00 Discusión y revisión de todos los 5 cursos realizados en Todos los Lorenzo
Santiago. participante Sazie
s
Día 1 Día 2 Día 3 Día 4

lun 09 mar 10 mie 11 jue 12
AM PM AM PM AM PM AM PM
TP1 X
TP2 X X
TP3 X X
TP4 X X X
TP5 X X X
TP6 X X
TP7 X
TP8 X
TP9 X X
TP10 X
Flujograma de trabajos prácticos
5
Contenido
CONCEPTO GENERAL ......................................................................................................... 2
CONCEPTOS ESPECÍFICOS ................................................................................................... 2
Calendario de clases teóricas y prácticas ............................................................................ 3
Flujograma de trabajos prácticos ...................................................................................... 5
NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN LOS TRABAJOS PRÁCTICOS DE MICROBIOLOGÍA ............... 7
TRABAJO PRÁCTICO Nº 1 ................................................................................................... 8
Observar el mundo microbiano mediante microscopía al fresco y tinciones de bacterias y
hongos ............................................................................................................................. 8
TRABAJO PRÁCTICO Nº 2 ................................................................................................. 10
Observar la biodiversidad microbiana ambiental y humana mediante cultivo en medios
nutritivos ....................................................................................................................... 10
A) MICROBIOTA AMBIENTAL ....................................................................................... 11
B) MICROBIOTA NORMAL............................................................................................ 13
Observar la resistencia a antimicrobianos mediante lectura y análisis del estudio de
susceptibilidad ............................................................................................................... 16
Seleccionar mutaciones espontáneas que confieren resistencia a antibióticos ................ 18
Evidenciar la transferencia horizontal de genes mediante ensayos de transformación de
cepas resistentes a antimicrobianos ............................................................................... 22
Observar la comunicación bacteria-bacteria mediante incubación del sobrenadante de
una cepa productora de autoinductor con una cepa reportera ........................................ 25
Evidenciar la formación de biopelículas en perlas de azufre por bacterias extremófilas
biomineras mediante la tinción con cristal violeta .......................................................... 27
Evidenciar la formación de biopelículas sobre la dentadura mediante el uso del colorante
caristop dualtone ........................................................................................................... 31
Observar la presencia o ausencia de genes de virulencia mediante PCR de genes
específicos de E. coli diarreogénicos ............................................................................... 32
TRABAJO PRÁCTICO Nº 10 ............................................................................................... 38
Comparar in silico genomas de especies bacterianas beneficiosas y patógenas ............... 38
ANEXOS ........................................................................................................................... 39
6
NORMAS DE BIOSEGURIDAD
EN LOS TRABAJOS PRÁCTICOS DE MICROBIOLOGÍA
En el Laboratorio de Microbiología es necesario mantener una serie de normas de

bioseguridad, cuyo propósito fundamental es la preservación de la salud del alumno, sus
familiares y la comunidad en general.
Estas normas son las siguientes:

1. Al ingresar y antes de abandonar el Laboratorio el alumno debe lavarse
prolijamente las manos.
2. Cada alumno debe usar delantal blanco con el fin de preservar su vestimenta
personal (se recomienda envolverlo en una bolsa plástica).
3. Se prohíbe comer, beber, fumar o llevar cualquier tipo de objeto a la boca por existir
gran posibilidad de contagio.
4. Las pipetas Pasteur y las asas (de requerirse) se deben esterilizar en la llama del
mechero, antes y después de su uso, dejándolas en el soporte correspondiente, por
ningún motivo sobre el mesón. En ambos casos, se deben enfriar antes de
introducirlas a las placas a fin de evitar salpicaduras, microgotas o aerosoles que
pueden contener elementos contagiosos.
5. Las pipetas Pasteur deben depositarse en contenedores para deshecho de material
de vidrio y cortopunzantes después de haber sido utilizadas.
6. Las placas de Petri deben abrirse solamente en el momento de la siembra y a una
distancia no superior a 30 cm del mechero encendido.
7. Los tubos deben ser flameados en el mechero antes y después de extraer o depositar
un inóculo.
8. Frente al derrame de un medio de cultivo o muestra, informe inmediatamente al
docente para que éste resuelva el problema según protocolo. Recomendamos igual
procedimiento con respecto a cualquier tipo de accidente como quemaduras,
cortaduras, aspiración o contacto con el material contaminado.
9. Es de primordial importancia el cuidado del microscopio. Una vez usado el lente de
inmersión debe limpiarse con la solución destinada para tal fin. Encienda la
ampolleta sólo en el momento de la observación.
7
TRABAJO PRÁCTICO Nº 1
Observar el mundo microbiano mediante microscopía al fresco y
tinciones de bacterias y hongos
INTRODUCCIÓN
La observación microscópica directa de los microorganismos, provenientes desde
una muestra permite visualizar características tales como morfología celular, agrupaciones
celulares, propiedades tintoriales y evidenciar rasgos fisiológicos, bioquímicos y estructurales,
entregando información fundamental a considerar durante la identificación de un agente
bacteriano o fúngico.
OBJETIVOS
1. Conocer los fundamentos teóricos de la tinción de Gram y clasificar las bacterias como
Gram (+) y Gram (-).
2. Reconocer las diversas morfologías y agrupaciones microbianas que pueden

presentar algunas especies bacterianas.
3. Visualizar las estructuras macro y microscópicas de algunos hongos levaduriformes

y algunos hongos filamentosos.
ACTIVIDADES
DÍA 1
1.- Analizar conceptos básicos de bioseguridad y normas del laboratorio.

2.- Discutir los fundamentos de la tinción de Gram y su relación con la clasificación de algunas
bacterias y hongos, tanto ambientales como de importancia médica.
3.- Observar al microscopio la morfología, agrupación y propiedades tintoriales de los
principales grupos de microorganismos. Completar la planilla (microteca).
- Cocácea Gram Positivo en cadenas - Bacilo Gram Positivo

- Cocácea Gram Positivo en racimos - Bacilo Gram Negativo
- Cocácea Gram Negativo en pares - Espiroquetas
4.- Observar movilidad al fresco de una muestra de Proteus o Pseudomonas.

5.- Observar biodiversidad de microorganismos mediante examen al fresco de una muestra
de agua de charco.
6.- Observar crecimiento en medio sólido de levaduras y hongos filamentosos.
7.- Observar características microscópicas de preparaciones fijadas de levaduras (Candida
albicans), hongos filamentosos septados (Penicillium, Aspergillus), filamentosos
aseptados (Mucor, Rhizopus) filamentosos pigmentados (Alternaria).
8
Tinción: Tinción:
Forma: Forma:
Agrupación: Agrupación:
Tinción: Tinción:
Forma: Forma:
Agrupación: Agrupación:
Para hongos
9
Observar la biodiversidad microbiana ambiental y humana
mediante cultivo en medios nutritivos
INTRODUCCIÓN
MICROBIODIVERSIDAD (o DIVERSIDAD MICROBIANA)
En la naturaleza, los microorganismos viven asociados a otros en conjuntos mayores
denominados poblaciones. Tales poblaciones se componen de células relacionadas entre sí y
generalmente, derivan de una única célula parental. El lugar físico donde vive una población
microbiana se denomina hábitat.
Los microorganismos son miembros esenciales de la biosfera. Se encuentran presentes
en diversos ambientes, desde aquellos que presentan condiciones ideales para su crecimiento y
reproducción, como aquellos que están casi al límite de las condiciones abióticas. Esta propiedad
de ubicuidad de los microorganismos es consecuencia tanto del ámbito más amplio de
potencialidades fisiológicas y bioquímicas que presentan en su conjunto respecto a los demás
organismos vivos, como de su reducido tamaño y capacidad para adaptarse y resistir condiciones
ambientales extremas.
Los microorganismos se encuentran por ejemplo en el aire que respiramos, en los
alimentos que consumimos, sobre objetos inanimados (paredes, piso, suelos, etc.). Incluso
algunos pueden habitar en ambientes tan hostiles como fuentes hidrotermales terrestres o
marinas a temperaturas sobre los 100ºC. Algunos microorganismos se encuentran presentes en
diversas partes del cuerpo de los animales, constituyendo lo que se denomina la microbiota
normal o nativa de ese organismo. Esta colonización microbiana del cuerpo, que se inicia
durante el nacimiento y persiste hasta la muerte del organismo, se presenta en diversas partes
tales como, boca, garganta, intestino, etc., en general en piel y mucosas. Pero, la gran mayoría
de los microorganismos se encuentra presente en ambientes naturales, tales como, el aire, el
suelo y el agua.
Considerando, la diversidad microbiana presente en estos ambientes naturales, la
microbiología ha desarrollado un conjunto de técnicas y procedimientos de laboratorio que
permiten aislar y caracterizar aquellos microorganismos capaces de crecer en estas condiciones,
obteniendo cultivos puros. Para ello, se deben obtener muestras representativas de cada
ambiente natural y proceder a su aislamiento y caracterización citológica y fisiológica o
bioquímica.
La obtención de cultivos puros se realiza empleando soluciones nutritivas que contienen
todos los elementos nutricionales adecuados para el desarrollo del microorganismo (medios de
cultivo). Mediante observación microscópica del microorganismo teñido adecuadamente, se
puede lograr la caracterización morfológica del microorganismo en estudio, y mediante ensayos
de medición de actividades enzimáticas se puede caracterizar bioquímicamente.
10
OBJETIVOS:
1.- Visualizar la diversidad y ubicuidad de los distintos microorganismos que componen la
microbiota ambiental en muestras procedentes de suelo, aire y aguas contaminadas.
2.- Conocer y visualizar la microbiota normal del cuerpo humano.
ACTIVIDADES
A) MICROBIOTA AMBIENTAL
Realizar siembra de muestras ambientales en medios de cultivos enriquecidos.
DÍA 1
a. Muestra de aire
- Exponer al ambiente una placa de agar sangre y otra de agar Sabouraud, retirando la
tapa superior de ambas y manteniéndolas abiertas durante toda la sesión. Utilizar placas de
cada medio de cultivo sin abrir, como control. Cerrar las placas, rotularlas correctamente e
incubar por 12-24 horas a 37ºC las placas de agar sangre y a 30ºC las placas de agar
Sabouraud. Las placas se incuban en la estufa en posición invertida (contratapa de la
placa conteniendo el medio de cultivo hacia arriba).
b. Muestra de suelo
- Usted dispondrá de una muestra de suelo de jardín (5 gramos), en un recipiente de
vidrio limpio y estéril. Depositar la muestra, de manera aséptica, en un matraz
conteniendo 45 ml de suero fisiológico estéril. Agitar el matraz hasta lograr la máxima
disolución de la muestra. Ésta será la dilución 10-1. Dejar la suspensión en reposo
durante 3-4 min en la superficie del mesón de trabajo.
- A partir de esta solución, realizar una dilución seriada de la muestra, en tubos de

ensayo conteniendo 9 ml de suero fisiológico estéril (diluciones 10-2 a 10-5). De la fase
líquida de la muestra del matraz (parte media) tomar 1 ml, con una pipeta estéril y
transferirla al tubo rotulado con la dilución 10-2. Homogenizar completamente el
contenido del tubo y repetir el procedimiento, hasta completar la dilución 10-5 (Figura 1).
- Observar la turbidez de las diferentes diluciones. Seleccionar una de ellas para ser
sembrada en los medios de cultivo. Pipetear 0,1 ml de dicha dilución y depositarla al
centro de una placa de agar TSA (agar tripticasa soya). Distribuir la muestra por toda la
superficie de la placa (siembra en césped) con la ayuda de un asa en rastrillo,
previamente esterilizada a la llama del mechero (el docente del equipo hará una
demostración previa). Dejar las placas cerradas sobre el mesón durante unos 5 min para
que el exceso de líquido se absorba en el medio de cultivo. Invertir las placas,
previamente rotuladas, e incubarlas a 37ºC durante 18 a 24 h.
11
c. Muestra de agua contaminada
- Repetir el procedimiento anterior a partir de una muestra de agua contaminada (agua
estancada de charco). De acuerdo al grado de turbidez de la muestra, discutir la
necesidad de realizar la dilución seriada antes de sembrar el medio de cultivo. Deberá
sembrar dos placas de agar TSA e incubarlas en las mismas condiciones de temperatura y
tiempo que las placas de las muestras de suelo.
DÍA 2
- Observar los resultados de cada una de las actividades anteriores en la siguiente
sesión. Interpretar.
Figura 1. Esquema de trabajo para la dilución de las muestras ambientales.
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B) MICROBIOTA NORMAL
DÍA 1
1.- Discutir sobre los conceptos de microbiota normal, colonización e infección y su relación
con la presencia de microorganismos en el ambiente.
2.- Detectar la presencia de microorganismos (COMUNIDADES) en el ser humano
(microbiota normal): piel, mucosas, saliva. Realizar siembra de muestras en medios
selectivos y diferenciales. Para ello:
a) Tomar una muestra microbiológica desde la mucosa de la fosa nasal anterior con una
tórula estéril previamente humedecida con suero fisiológico y sembrar la muestra en una
placa de agar manitol- sal. Luego diseminar la muestra sobre la placa con pipeta Pasteur
para aislar colonias. Incubar a 37ºC por 24 hrs en atmósfera normal.
b) Tomar otra muestra de microbiota, con tórula estéril, desde cualquiera de los
siguientes sitios anatómicos: manos, oído, pelo, dientes, encías etc. Humedecer
previamente la tórula en suero fisiológico estéril y luego pasar la tórula por el sitio
elegido. Sembrar la muestra en 1 placa de agar sangre. Incubar a 37ºC por 24 hrs en
atmósfera normal.
3.- Revisar los resultados al día siguiente, en relación al crecimiento de microorganismos en
las placas sembradas. Discutir y comparar los resultados con sus compañeros.
DÍA 2
Tinción de Gram
Escoger una colonia proveniente de alguna de las placas sembradas el día anterior para
realizar la tinción de Gram, según el siguiente protocolo:
a) Fijar la muestra bacteriana en un portaobjetos, tomando la colonia y suspendiéndola en
una gota de agua sobre el portaobjeto. Seque la muestra mediante flameado suave con
mechero, evitando la exposición prolongada al calor.
b) Colocar el portaobjetos sobre una superficie apropiada y aplicar solución cristal violeta.
c) Teñir un minuto y lavar el portaobjeto con agua destilada o agua potable.
d) Aplicar solución yodada (lugol) por un minuto y lavar nuevamente con agua.
e) Descolorar mediante la aplicación de una mezcla alcohol-acetona por 30 segundos y lavar
nuevamente con agua.
f) Realizar una contratinción con safranina o similar (fucsina) por un minuto. Lave con agua
potable.
g) Secar a temperatura ambiente y luego observar al microscopio con lente de inmersión.
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DÍA 2
Observación y caracterización de colonias microbianas
Observar detenidamente las colonias obtenidas sobre el medio sólido de cada una de las
muestras, que fueron incubadas en diferentes medios de cultivo y a distintas temperaturas.
Analizar la morfología de las distintas colonias. Para ello, se recomienda el uso de una lupa.
Registre en su cuaderno la siguiente información:
 Forma, superficie, borde (margen) y elevación
Figura 2. Caracterización de la morfología de colonias bacterianas
Además, se pueden visualizar otras características, como:

 Tamaño (mm): determinar el diámetro de la colonia. Si es inferior a 1 mm se dice que es
una colonia puntiforme (en forma de alfiler).
 Cromogénesis: determinar color de la colonia.
 Consistencia: especificar si es de tipo mucosa, viscosa o granular. Para ello, presionar
suavemente la colonia con un asa estéril.
 Producción de hemolisinas: en agar sangre se puede detectar la producción de hemolisinas
(enzimas bacterianas que provocan la lisis de glóbulos rojos). Existen 3 tipos de hemólisis:
Beta (β) (hemólisis total), Alfa (α) (hemólisis parcial) y Gamma (γ) (no hemólisis).
Elabore, en su grupo de trabajo, una ficha estandarizada que le permita caracterizar e

identificar las diferentes colonias de microorganismos obtenidas de las diversas muestras
ambientales (suelo, aire, etc.). La ficha deberá contener, a lo menos las características
señaladas en el punto anterior.
14
FICHA ESTANDARIZADA PARA LA CARACTERIZACIÓN DE COLONIAS
Fecha de la observación :
Condiciones experimentales
1.- Medio de cultivo :

2.- Tipo de muestra :
3.- Dilución de la muestra :
4.- Temperatura de incubación :
5.- Tiempo de incubación :
COLONIA FORMA ELEVACION MARGEN COLOR TEXTURA TAMAÑO

(número) (mm)
1
15
Observar la resistencia a antimicrobianos
mediante lectura y análisis del estudio de susceptibilidad
INTRODUCCIÓN
La resistencia de las bacterias a los antimicrobianos se puede detectar mediante el estudio de
susceptibilidad in vitro, que determina el comportamiento de las bacterias frente a los
agentes antimicrobianos, bajo condiciones de laboratorio específicas y estandarizadas.
Uno de los métodos más utilizados corresponde al método de susceptibilidad por difusión,
conocido también como método de Kirby-Bauer. Éste permite categorizar las bacterias como
sensibles o resistentes a los antimicrobianos de una manera cualitativa, mediante el uso de
discos de papel filtro impregnados con una cantidad determinada de antimicrobiano y
aplicados sobre la superficie de un agar que ha sido inoculado previamente con la bacteria en
estudio.
En microbiología clínica, este estudio se realiza para proveer al clínico orientación sobre la
terapia que puede ser más apropiada en pacientes con una infección específica. Permite
seguir la evolución de las resistencias bacterianas a los antimicrobianos; revisar regularmente
el comportamiento de los antibióticos para adaptar la antibioterapia empírica o usar los datos
para adoptar ciertas medidas de intervención de salud pública.
ACTIVIDADES
Cada grupo realizará dos antibiogramas, uno para Staphylococcus aureus y otro para Escherichia
coli.
DÍA 1
1. Preparar un inóculo de la bacteria a estudiar, suspendiendo 2-3 colonias en caldo Müller

Hinton, a partir de un cultivo puro.
2. Ajustar la densidad óptica del cultivo a Mac Farland 0,5 (esta densidad equivale a 1,5 X 108
UFC/ml). Nota: Cada alumno recibirá el inóculo preparado previamente.
3. Sembrar esta suspensión (cultivo de S. aureus o de E. coli) en placa de agar MH con una
tórula estéril en tres direcciones rotando la placa en 60° cada vez, para formar un tapiz
homogéneo.
4. Luego de 5 min, colocar en forma ordenada y equidistante los sensidiscos correspondientes
(filtros de papel conteniendo cada antibiótico) según la cepa en estudio, con una pinza,
presionándolos suavemente sobre el agar que ya contiene el tapiz bacteriano.
5. Incubar las placas a 35ºC en estufa de cultivo por 18-24 horas, en aerobiosis.
16
DÍA 2
6. Observar los resultados en la próxima sesión. Para ello, medir el diámetro del halo de
inhibición que se genera alrededor del disco, utilizando una regla. Se registra el resultado en
milímetros.
Lectura e interpretación:
Interpretar los resultados catalogados como sensible,
medianamente sensible y resistente, de acuerdo a las
tablas de referencia. (Las tablas del centro de
referencia Clinical and Laboratory Standards Institute
(CLSI) estarán disponibles en su mesón de trabajo).
RESULTADOS
S. aureus
Lectura del halo Interpretación
Antimicrobiano
(mm) S,I, R
Cefoxitina
Ciprofloxacino
Clindamicina
Eritromicina
Trimetoprim-sulfametoxazol
E. coli
Lectura del halo Interpretación
Antimicrobiano
(mm) S,I, R
Ampicilina
Ciprofloxacino
Gentamicina
Nitrofurantoína
Trimetoprim-sulfametoxazol
17
Seleccionar mutaciones espontáneas que confieren resistencia a antibióticos
Aislamiento de mutantes espontáneos de resistencia a rifampicina mediante la técnica de

siembra en césped
INTRODUCCIÓN
Mutación es una alteración o cambio en la información genética (genotipo) de un ser vivo, lo
cual puede o no expresarse como un cambio en el fenotipo del mismo.
En el caso del ser humano pueden afectar a células que forman parte del cuerpo o “soma” del
individuo (mutaciones somáticas) las cuales no son heredables. En cambio, mutaciones que se
producen a nivel de las células reproductoras del cuerpo (óvulo o espermatozoide), son de
tipo heredable (mutaciones hereditarias).
En el caso de los microorganismos y, de manera particular en bacterias, si no afectan su
viabilidad y no son reparadas por los diversos sistemas de reparación genética, pueden
transmitirse a las células hijas o descendencia, a través del proceso de división celular.
Las mutaciones pueden alterar el fenotipo de un microorganismo de diversas maneras.
Pueden afectar la morfología celular o colonial (mutaciones morfológicas); las vías de
biosíntesis (anabolismo) o de degradación de moléculas orgánicas (catabolismo) (mutantes
bioquímicas); la resistencia a ciertas drogas que impiden su crecimiento y reproducción
(mutantes de resistencia), entre otros tipos de mutantes.
Desde el punto de vista de la extensión de las mutaciones algunas de ellas se originan por la
alteración de un simple par de nucleótidos y de la inserción o deleción de uno o dos
nucleótidos en la región codogénica del gen. Estos cambios pequeños en el DNA se llaman
microlesiones, siendo el más pequeño de estos cambios las mutaciones de punto o puntuales
(afectan sólo a un par de bases en el DNA). Existen, además, mutaciones mayores o
macrolesiones, tales como grandes inserciones, deleciones, inversiones, duplicaciones y
translocaciones de secuencias nucleotídicas.
De acuerdo al origen de las mutaciones, existen dos tipos: mutaciones espontáneas y
mutaciones inducidas.
a. Mutaciones espontáneas
Se originan ocasionalmente en cualquier tipo de célula sin que se conozca, de manera
específica, el agente causal de la misma. La probabilidad de ocurrencia de este tipo de
mutación (tasa de mutación) es del orden de 10−7 en células haploides y 10−14 en células
diploides.
Las principales causas de las mutaciones que se producen de forma natural o normal en las
poblaciones son tres:
- Errores durante la replicación del DNA
- Lesiones o daños fortuitos en el DNA
- Movilización en el genoma de elementos genéticos transponibles
18
b. Mutaciones inducidas
Son producto de la acción de un agente mutagénico, de naturaleza física, química o biológica.
Mutágenos químicos:
- Análogos de bases del DNA (2-aminopurina).
- Agentes alquilantes (nitrosoguanidina).
- Agentes intercalantes (acridinas).
Mutágenos biológicos:
Se puede considerar la presencia de transposones y de virus (o bacteriófagos) capaces
de integrarse en el genoma.
Mutágenos físicos:
- Radiaciones ionizantes (rayos X, rayos cósmicos y rayos gamma): Estas radiaciones
originan radicales libres que reaccionan con el DNA, inactivándolo.
- Radiaciones no ionizantes (radiación ultravioleta): Provocan la formación de dímeros
de pirimidina en el DNA (unión covalente de dos bases pirimídicas adyacentes), que
tiene como consecuencia la aparición de mutaciones
Para aislar mutantes espontáneos en bacterias se debe definir el tipo de mutante que se
desea aislar y, en lo posible, la tasa de mutación específica. Lo anterior, permitirá definir el
tipo de medio de cultivo y las condiciones físico-químicas que permitirán su crecimiento.
En esta actividad se utilizará un medio de cultivo que contiene el antibiótico Rifampicina, que
permitirá aislar mutantes espontáneos de Escherichia coli rifampicina-resistente (RifR). Este
antibiótico interfiere con el proceso de transcripción génica, al unirse a la subunidad β de la
enzima RNA polimerasa.
OBJETIVO
Seleccionar mutantes espontáneas de Escherichia coli resistentes a Rifampicina.
Materiales
a. Material biológico:
Cultivo de Escherichia coli DH5α.
b. Antibióticos:
- Rifampicina:
Solución stock 1,5% en metanol puro; solución de trabajo: 75 µg/ml de medio
c. Medios de cultivo:
Agar y caldo LB (Luria-Bertani), LB suplementado con ácido nalidíxico 15 µg/ml (LBNal)
19
Condiciones de incubación:
Activación de cepa: 37°C / con agitación constante/ 14-16 hrs.
ACTIVIDADES
DÍA 0:
- Activar cultivo de E. coli DH5α: Hacer siembra en pentágono de la cepa en agar LBNal. Incubar
a 37°C/24 hrs.
DÍA 1:
- Cultivo en masa: Inocular una colonia de la cepa en matraz conteniendo 20 ml de caldo LBNal.
Incubar a 37°C/14-16 hrs, con agitación constante.
NOTA: Las actividades de los Días 0 y 1 serán realizadas por el equipo académico y usted
recibirá un matraz conteniendo el cultivo en masa de la bacteria para su trabajo
experimental, el Día 2.
DÍA 2:
- Siembra en césped: Colocar 250 µl del cultivo en masa, en la superficie de una placa
conteniendo Agar LBNal-Rif.. Sembrar en césped con ayuda de un rastrillo de vidrio. Dejar sobre
el mesón algunos minutos (absorber líquido). Invertir e incubar a 37°C/24 hrs.
DÍA 3:
- Seleccionar colonias que crecen en el medio conteniendo agar LBNal-Rif. Incubar a 37°C. En el
caso de haber sembrado una colonia resistente a rifampicina, se observará crecimiento al
cabo de unas 8 hrs.
Resultados obtenidos
20
Conclusiones.
21
Evidenciar la transferencia horizontal de genes mediante ensayos de transformación
de cepas resistentes a antimicrobianos
INTRODUCCIÓN
El material genético bacteriano puede ser transferido desde una bacteria a otra por 3
mecanismos: conjugación, transducción o transformación. Así, la transferencia horizontal de
genes contribuye a la adaptación y diversificación de organismos, teniendo un impacto
significativo en la plasticidad y evolución genómica, la diseminación de factores de virulencia,
la formación de nuevas vías catabólicas y la resistencia a antibióticos. Los genes de resistencia
a antibióticos se han encontrado asociados a algunos elementos genéticos como plasmidios,
transposones e integrones, los cuales permiten la diseminación del fenotipo de resistencia.
Estos elementos otorgan una gran variabilidad a las bacterias, permitiéndoles sobrevivir en un
medio donde el uso intensivo de antibióticos es habitual. En este trabajo práctico se estudiará
la movilidad de genes de resistencia a antibióticos por transformación.
Éste es un mecanismo de transferencia de información genética basado en la captura de
plasmidios desde el ambiente por una cepa receptora
OBJETIVO
Determinar la capacidad de algunas bacterias de transferir genes de resistencia a antibióticos
a otras que son sensibles a ese marcador.
ACTIVIDADES
ENSAYO DE TRANSFORMACIÓN
DÍA 2
Preparación de células químicamente competentes para uso en transformación por choque

térmico (adaptación del método de Inoue: Inoue et al., 1990 Gene 96:23)
1. A partir de un inóculo previo, cultivar en matraz células de Escherichia coli en medio
LB a 37º C con agitación (180-250 rpm), hasta una OD600 ~ 0,3 (u óptimamente,
cultivar a 23 º C hasta una OD600 de 0,4 – 0,6). El volumen del inóculo no debe superar
el 1% del volumen total del cultivo.
2. Al alcanzar la OD deseada, dejar el matraz en hielo por al menos 10 min. Colectar las
células por centrifugación (a 4ºC, por 10 min a 3000 RPM). El freno de la centrífuga
debe ser lo más bajo (o sea, la disminución de velocidad debe ser la más lenta), para
disminuir la posibilidad de estrés en las células.
22
3. Eliminar el sobrenadante y lavar el pellet, resuspendiéndolo suavemente en 40 ml de
solución de Inoue (preenfriada) por cada 40 ml de cultivo. Después de dejar 10
minutos en hielo, se centrifuga igual que en el paso anterior.
4. Eliminar el sobrenadante y resuspender por cada pellet de 40 ml de cultivo en 4 ml de
solución de Inoue.
5. Mantener los tubos por 30 minutos (mínimo) en hielo.
6. Agregar 70 µl de DMSO/ ml de suspensión de células y mezclar suavemente. Dejar en
hielo por al menos 10 min.
7. Repartir en alícuotas de 200 a 300 µl en tupos Eppendorf estériles, previamente
enfriados (esto se puede hacer encerrando el recipiente de tubos cerrado en el freezer
por al menos 2 horas).
8. Opcional: utilizar un baño de etanol + hielo seco para congelar rápidamente las
alícuotas de cada tubo. Si no se tiene hielo seco, una papilla de agua y etanol
guardadas en el refrigerador a -80º C puede servir bien.
9. Guardar las alícuotas a -80º C. En almacenamiento pueden permanecer por meses sin
perder significativamente la competencia.
NOTAS
 Si las células se descongelan y vuelven a congelarse a -80ºC, la eficiencia de
transformación disminuye notablemente.
 Asegúrese que los materiales que se usarán para preparar las células estén libres de
detergente.
 Todos los pasos deben hacerse en estricta esterilidad.
 Es importante que el tratamiento de las células sea suave (por ejemplo, evitar el
pipeteo al resuspenderlas en la solución de Inoue)
Solución de Inoue: 10mM HEPES; 75mM CaCl2; 250mM KCl. Se ajusta pH hasta 6,7 con KOH o
HCl y luego agregar una solución MnCl2 (lo suficiente hasta una concentración 55mM) con
jeringa y filtro de 0,45 µm, y ajustar con agua (lo más pura posible) hasta el volumen final
planificado. La solución se guarda a 4º C.
Para transformar
1. Se descongela una alícuota de 100-200 µl de células en hielo.
2. Se agrega un volumen máximo de 5 µl de DNA, se mezcla suavemente y se deja 30 min
en hielo.
3. Luego, se incuba 45 segundos sin agitación en baño de agua a 42º C, para iniciar el
choque térmico.
4. Se transfiere el tubo a un recipiente con hielo por 2 minutos sin agitación.
23
5. Luego, se agrega 900 µl de caldo SOC (LB) y se deja 1 hora a 37ºC con agitación y
aeración, para permitir que las bacterias se recuperen del choque.
6. Se siembra 100 µl en placa de LB más el antibiótico de selección, previamente
incubada por 1 hora a 37º C. Del remanente del cultivo, se toman 500 µl, se
centrifugan, se elimina el sobrenadante y con el líquido restante se resuspenden las
bacterias y se siembran en otra placa de LB+ antibiótico. Si se usa ampicilina, el tiempo
de incubación de las placas no debe superar las 18 horas, a fin de evitar el crecimiento
de colonias satélite.
DÍA 3
1. Analizar los resultados. Estimar la eficiencia de la transformación.
2. Tomar colonias aisladas de la cepa previa a la transformación y cepas
transformantes para detección del plasmidio transformante, mediante lisis por calor
y electroforesis en gel de agarosa.
24
Observar la comunicación bacteria-bacteria mediante incubación del sobrenadante de una
cepa productora de autoinductor con una cepa reportera
INTRODUCCIÓN
Comunicación bacteria-bacteria mediante quorum sensing
Los microorganismos son capaces de comunicarse entre sí a través de una variedad de

moléculas químicas. Esta comunicación intercelular les permite coordinar la expresión de
genes y actuar como una comunidad, y puede darse entre bacterias de una misma especie o
de especies y géneros diferentes.
Una de las formas en que las bacterias se comunican entre ellas es a través del fenómeno
conocido como quorum sensing, que involucra la producción y secreción de una molécula
señal conocida como autoinductor por parte de algunos microorganismos y la detección de
esta molécula por parte de otros. El quorum sensing puede regular un amplio rango de
actividades bacterianas, entre las que se cuentan la virulencia, competencia, conjugación,
producción de antibióticos, movilidad, esporulación y formación de biopelículas. A la fecha se
han descrito 3 sistemas de quorum sensing, mediados por diferentes tipos de moléculas
autoinductoras. En este trabajo práctico analizaremos la comunicación mediada por
autoinductor-2.
Para este ensayo utilizaremos una cepa de la bacteria Vibrio harveyi BB170, que es capaz de
producir luz cuando se encuentra en presencia de autoinductor-2. Esta bacteria, que
llamaremos de ahora en adelante cepa reportera, será crecida durante 16 hrs a 30°C en
medio de cultivo AB (toda la noche). Al otro día, las células serán lavadas centrifugando a
6000 rpm y resuspendiendo en medio AB fresco, hasta obtener una DO600=0,5.
Por otra parte, otro microorganismo, en este caso Lactobacillus casei, será crecido en un
cultivo independiente, a 37°C por 16 hrs en medio de cultivo MRS. Este microorganismo se
caracteriza por producir autoinductor-2 para comunicarse con sus células vecinas.
OBJETIVO
Visualizar el fenómeno de comunicación celular mediada por quorum sensing entre dos
bacterias de diferentes especies.
25
ACTIVIDADES
DÍA 3
1. Tomar 5 ml del cultivo de la cepa reportera y colocar en un tubo cónico de 15 ml. Repetir
el procedimiento una vez más.
2. Agregar 1 ml del medio de cultivo MRS, donde creció la bacteria Lactobacillus casei a uno
de los tubos cónicos con cepa reportera. Este medio debe estar libre de bacterias por ello
se debe filtrar, usando filtros de 0,22µm de diámetro de poro. Al otro tubo, agregar 1 ml
de medio de cultivo MRS sin la bacteria Lactobacillus casei.
3. Incubar ambas mezclas (de 6 ml en total cada una) por aproximadamente 4 horas a 30°C.
Éste es el tiempo requerido para que la cepa reportera pueda detectar la molécula de
autoinductor-2 y desencadene las señales necesarias para producir luz.
4. Luego de transcurridas las 4 horas de incubación, observar ambos tubos en oscuridad.
Nota: se les entregará el cultivo de la cepa reportera y el sobrenadante de la cepa productora
de autoinductor ya filtrado
26
Evidenciar la formación de biopelículas en perlas de azufre por bacterias extremófilas
biomineras mediante la tinción con cristal violeta
OBJETIVO
El objetivo de este trabajo práctico es evidenciar la capacidad que tienen las células bacterianas
de adherirse a sustrato sólido formando así una biopelícula (“Biofilm”). Se utilizará como
modelo bacteriano especies bacterianas pertenecientes al género Acidithiobacillus las cuales
son capaces de formar biopelículas sobre minerales.
Este modelo bacteriano concita un gran interés biotecnológico en el mundo y en Chile en
particular, ya que estas especies son actores fundamentales de la biolixiviación, proceso
industrial minero utilizado para la extracción de cobre y de otros valores metálicos de interés
comerciales como el oro y el uranio entre otros.
En el marco de este trabajo práctico estudiaremos la cinética de formación de biopelículas de
Acidithiobacillus caldus, At. ferrooxidans y At. thiooxidans.
Materiales
a- Cultivos bacterianos
* Matraces de cultivo de 500 ml (1 por cultivo + 1 control sin bacterias).
* Mechero para generar zona de esterilidad microbiana en el mesón de trabajo.
* Botellones de 500 ml para preparar medio (400 ml por botellón).
* Olla de presión para esterilizar solución “stock” de medio.
* Incubador orbital con agitación 30ºC o Baño María con agitación y temperatura
controladas.
* Medio (sales minerales1; azufre elemental; agua destilada; pH 3,5).
* Balón de vidrio con “hoyito”.
* Calentador eléctrico para solubilizar azufre elemental en polvo.
* Agitador magnético.
* Ácido Sulfúrico (H2SO4).
* Phmetro.
* Unidad de Filtración (jeringa + filtro; sistema con vacío y filtro)
b- Pre-cultivos bacterianos Acidithiobacillus ferrooxidans, Acidithiobacillus

thioooxidans y Acidithiobacillus caldus.
c- Tinción2
* Cristal Violeta al 0,05 %.
* Agua ácida pH 2 (acidificada con H2SO4).
1
Ver composición del medio en hoja adjunta.
2
Espejo R.T., Romero P. (1987). Growth of Thiobacillus ferrooxidans on Elemental Sulfur. Applied and
Environmental Microbiology. p. 1907-1912.
27
* Agua destilada.
* Ácido Sulfúrico (H2SO4).
* Recipiente para teñir perlas (Placas de Petri 5 ml)
ACTIVIDADES
1. Inocular el medio fresco al 10 % (10 ml de precultivo + 90 ml de medio fresco). Para el

control utilizar 100 ml de medio fresco.
2. Incubar 7, 4 o 2 días a 30ºC (At. ferrooxidans; At. thiooxidans) o 42ºC (At. caldus).
3. Eliminar sobrenadante (si se quiere usar sobrenadante para re-inocular realizar este paso
en condiciones estériles).
4. Recolectar perlas de azufre con precauciones (evitar golpes, roces y contaminaciones
cruzadas) y lavar 2 veces con agua ácida pH 2.
5. Lavar una vez con agua destilada para eliminar exceso de ácido.
6. Incubar con 10-15 ml de una solución al 0,05 % de Cristal Violeta durante 15 min.
7. Lavar varias veces con agua destilada para eliminar el exceso de Cristal Violeta.
8. Dejar secar.
9. Observar presencia de tinción violeta comparando las perlas de azufre que provienen de
los cultivos con bacterias y aquéllas que provienen del medio abiótico (Figura 3).
Figura 3. Perlas de azufre incubadas con bacterias capaces de utilizar el sustrato y adherirse a
él. La tinción con cristal violeta evidencia la adherencia bacteriana.
Al inicio de la actividad se proyectará una película explicativa sobre formación de perlas de azufre y
preparación de los cultivos.
1 Se entregarán cultivos inoculados en distintos momentos [día 1; el día 3 (en duplicado); el día 5].
28
Medio de cultivo en azufre para Acidithiobacillus
Na2SO4 x 10 H2O 0,150 g/l 0,5 mM

(NH4)2SO4 0,450 g/l 3,4 mM
KCl 0,050 g/l 0,7 mM
MgSO4 x 7 H2O 0,500 g/l 2,0 mM
KH2PO4 0,050 g/l 0,4 mM
Ca(NO3)2 x 4 H2O 0,014 g/l 59,3 µM
FeSO4 x 7 H2O 0,028 g/l 0,1 mM
ZnSO4 x 7 H2O 0,010 g/l 34,8 µM
CuSO4 x 5 H2O 0,001 g/l 4,0 µM
MnSO4 x 4 H2O 0,001 g/l 4,5 µM
CoCl2 x 6 H2O 0,85 mg/l 3,6 µM
KCr(SO4)2 x 12 H2O 0,75 mg/l 1,5 µM
H3BO3 0,60 mg/l 9,7 µM
Na2MoO4 x 2 H2O 0,50 mg/l 2,1 µM
NiCl2 x 6 H2O 0,90 mg/l 3,8 µM
Na2SeO3 x 5 H2O 0,71 mg/l 2,7 µM
Na2WO4 x 2 H2O 0,10 mg/l 0,3 µM
KBr 0,10 mg/l 0,8 µM
KI 0,10 mg/l 0,6 µM
NaVO3 0,10 mg/l 0,8 µM
S (perlas) 50 g/l 5 % p/V
1- Combine los ingredientes con excepción del sulfato ferroso y el azufre en agua
destilada, ajuste el pH a 3,5 con H2SO4 y esterilice por autoclave (121 °C, 15-20
min).
2- Esterilice las perlas de azufre separadamente adicionándolas al matraz de cultivo
e hirviéndolas en medio de cultivo por 10-15 minutos. Alternativamente, las
perlas pueden ser esterilizadas en el matraz de cultivo con el medio sin sulfato
ferroso por autoclave a 110 °C por 30 min.
3- Una vez que el medio está frío añadir el sulfato ferroso a partir de una solución
stock 1 M ajustada a pH 1,8 con H2SO4 y esterilizada por filtración.
4- Referencia. Johnson, D. B. (1995) Selective solid media for isolating and
enumerating acidophilic bacteria. Journal of Microbiological Methods 23:205-218.
29
Producción de las Perlas de Azufre elemental
(sustrato energético sólido)
Poner el azufre dentro de un balón de aforo que posee un agujero en el fondo.

1. Derretir el azufre dentro del balón utilizando una placa calefactora que pueda llegar a
unos 180-200 °C (precaución: si se calienta demasiado, el azufre puede inflamarse).
Para mejorar la conducción de calor, utilizar papel aluminio para la creación de un
soporte para el balón.
2. En un vaso precipitado de 2 litros, colocar unos 800 ml de agua destilada y un agitador
magnético. Colocar sobre una placa agitadora.
3. Una vez que el azufre está completamente derretido, verter lentamente a través del
agujero inferior en el agua agitada. Para favorecer la formación de perlas pequeñas, el
balón debe estar a unos 10-15 cm sobre el vaso con agua.
4. Recuperar las perlas y dejar secar antes de utilizarlas (50 g /l).
30
Evidenciar la formación de biopelículas sobre la dentadura
mediante el uso del colorante caristop dualtone
Según describe la biblioteca nacional de medicina de los Estados Unidos (MedLine

Plus) las caries dentales pueden afectar a personas de todas las edades. Una de las causas de
la aparición de éstas es por el efecto de bacterias que colonizan nuestra boca. Estas bacterias
por su metabolismo, convierten los alimentos, especialmente los azúcares y almidones, en
ácidos. Las bacterias, el ácido, los pedazos de comida y la saliva se combinan en la boca para
formar una sustancia pegajosa llamada placa. La placa se pega a los dientes, justo encima de
la línea de la encía en todos los dientes y en los bordes de las obturaciones. La placa que no se
elimina de los dientes se convierte en una sustancia llamada sarro o cálculo. La placa y el
sarro irritan las encías, produciendo gingivitis y periodontitis. Esta placa bacteriana comienza
a acumularse en los dientes al cabo de 20 minutos después de comer. Si ésta no se quita,
comenzará a presentar caries que corresponden a perforaciones en los dientes. Las caries se
producen por desmineralización de la dentadura producto de los ácidos producidos por las
bacterias presentes en la placa dañando el esmalte que cubre los dientes y crean orificios en
los dientes llamados caries. Las caries generalmente no duelen, a menos que se
comprometan y afecten los nervios o causen una fractura del diente. La caries dental que no
se trata también destruye el interior del diente (pulpa), lo cual requiere un tratamiento más
extenso o, en el peor de los casos, la extracción del diente.
Los carbohidratos (azúcares y almidones) aumentan el riesgo de caries dentales, los

refrigerios azucarados aumentan el tiempo en que los ácidos están en contacto con la
superficie del diente, por ello un buen aseo dental disminuirá la posibilidad de obtención de
caries.
OBJETIVO
El objetivo de este trabajo práctico es evidenciar la capacidad que tienen las células bacterianas
de nuestra dentadura, en adherirse a sustrato sólido como es el diente formando así una
biopelícula (“Biofilm”) o placa bacteriana, siendo un elemento importante para la generación de
caries en nuestra dentadura.
Actividad.
La actividad consiste en aplicar en la boca una pastilla del colorante caristop dual tone (también
existe un producto que es líquido), juagar la boca y luego observar la presencia de la placa como
una superficie de color rosado o azul, dependiendo de los colorantes utilizados en el producto.
Posteriormente se procede a lavar con su cepillo de dientes para remover el colorante junto
con la placa bacteriana y se enjuaga. Se ser necesario se repite el procedimiento de cepillado.
31
Observar la presencia o ausencia de genes de virulencia mediante PCR
de genes específicos de E. coli diarreogénicos
INTRODUCCIÓN A LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR

(https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-pcr-electrophoresis/a/polymerase-chain-
reaction-pcr)
Una técnica utilizada para amplificar, o hacer muchas copias de, una región de DNA blanco en
específico.
Puntos más importantes:
 La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, es una técnica in vitro de Biología Molecular

utilizada para generar en un tubo de ensayo muchas copias de una determinada región de
DNA de interés.
 La PCR se realiza utilizando una DNA polimerasa termoestable, la Taq DNA polimerasa, y
requiere de partidores de DNA diseñados específicamente para la región de DNA de interés.
 En la PCR, la reacción se somete repetidamente a un ciclo de cambios de temperatura que
permiten la producción de muchas copias de la región blanco.
 La PCR tiene muchas aplicaciones en la investigación y en la práctica. Se utiliza de forma
rutinaria en la clonación de DNA, el diagnóstico médico y el análisis forense de DNA.
¿Qué es la PCR?
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio común utilizada para
hacer muchas copias (¡millones o miles de millones!) de una región particular de DNA. Esta región de
DNA puede codificar a una proteína le interese al investigador o puede ser una región del genoma de
interés. Por ejemplo, podría ser un gen cuya función quiere entender un investigador o un marcador
genético usado por científicos forenses para relacionar el DNA de la escena del crimen con los
sospechosos.
Por lo general, el objetivo de la PCR es producir suficiente DNA de la región blanco para que pueda
analizarse o usarse de alguna otra manera. Por ejemplo, el DNA amplificado por PCR se puede
secuenciar, visualizar por electroforesis en gel o clonar en un plásmido para otros experimentos.
La PCR se utiliza en muchas áreas de la biología y la medicina, como la investigación en biología
molecular, el diagnóstico médico e incluso algunas ramas de la ecología.
La Taq polimerasa
Al igual que la replicación de DNA en un organismo, la PCR requiere de una enzima DNA polimerasa
que produzca nuevas cadenas de DNA mediante el uso de las cadenas existentes como molde. La DNA
polimerasa que normalmente se utiliza en la PCR se llama Taq DNA polimerasa, sintetizada por la
bacteria tolerante al calor de la que se aisló (Thermus aquaticus).
T. aquaticus vive en aguas termales y fuentes hidrotermales. Su DNA polimerasa es muy termoestable
y su mayor actividad se presenta cerca de los 70°C (temperatura a la que la DNA polimerasa de ser
humano o de E. coli no funcionaría). La Taq polimerasa es ideal para la PCR gracias a esta estabilidad
térmica. Como veremos, la PCR utiliza altas temperaturas repetidamente para desnaturalizar el molde
de DNA o separar sus cadenas.
32
Partidores para PCR
Al igual que otras DNA polimerasas, la Taq polimerasa solo puede hacer DNA si hay un partidor, una
secuencia corta de unos 20-30 nucleótidos que proporciona un punto de partida para la síntesis de
DNA. En una reacción de PCR, la región de DNA que será copiada, o amplificada, se determina por los
partidores que el(la) investigador(a) elija. Por lo tanto estos partidores deben ser complementarios a
la zona a amplificar y por ello se deben utilizar dos partidores para una determinada región, y dado
que la síntesis de DNA es siempre 5' a 3', los partidores deben permitir la polimerización dejando un
extremo 3’ OH disponible para que la Taq DNA polimerasa pueda sintetizar DNA en esa dirección (5' a
3').
Los pasos de la PCR
Los ingredientes clave para una reacción de PCR son Taq polimerasa, partidores, DNA molde y
nucleótidos (los bloques básicos del DNA). Los ingredientes se colocan en un tubo, junto a la solución
amortiguadora con algunos cofactores que necesite la enzima, y se someten a ciclos repetidos de
calentamiento y enfriamiento que permiten la síntesis del DNA.
Los pasos básicos son:
1. Desnaturalización (96°C): la reacción se calienta bastante para separar, o desnaturalizar, las

cadenas de DNA. Esto proporciona los moldes de cadena sencilla para el siguiente paso.
2. Alineamiento (55 - 65°C): la reacción se enfría para que los partidores puedan unirse a sus
secuencias complementarias en el molde de DNA de cadena sencilla.
3. Extensión (72°C): la temperatura de la reacción se eleva para que la Taq polimerasa extienda
los partidores y sintetice así nuevas cadenas de DNA.
Este ciclo se repite 25 - 35 veces en una reacción de PCR típica, que generalmente tarda 2 - 4 horas,
según la longitud de la región de DNA que se copia. Si la reacción es eficiente, puede producir miles de
millones de copias a partir de una o unas cuantas moléculas de la región blanco. Como se observa en
la figura se realiza amplificación del gen blanco, dado que no solo el DNA inicial se utiliza como molde
sino que el producto de cada ciclo de amplificación.
El siguiente es un link es una explicación de la técnica: http://www.dnatube.com/video/1397/The-
polymerase-chain-reaction-PCR
Figura Amplificación de una región de interés mediante PCR. La región de interés está flanqueada por
los partidores rojo y verde.
33
INTRODUCCIÓN
Considerando los postulados moleculares de Koch, se han diseñado estrategias que permiten la
identificación del agente causal de la enfermedad utilizando técnicas moleculares. Ello se basa en que
los agentes patógenos deben poseer uno o más genes específicos y propios del agente, que están
ausentes en los agentes no patógenos. En esta actividad se pretende realizar la detección de
genes de virulencia presente en diferentes bacterias de la especie Escherichia coli.
Escherichia coli diarreogénicos

La bacteria Escherichia coli fue descrita por primera vez en 1885 por Theodore von
Escheric, de quien recibió su nombre. Hoy sabemos que esta bacteria forma parte de nuestra
microbiota normal intestinal y también está presente en otros hospederos. Como parte de la
microbiota normal, su presencia es beneficiosa para el hombre, sin embargo, algunas cepas
pueden producir infecciones debido a la adquisición de genes de virulencia, permitiendo que
la bacteria se convierta en un patógeno. Así en el ser humano pueden provocar infecciones a
nivel del sistema urinario, sepsis/meningitis y enfermedades gastrointestinales. La diarrea
aguda en el ser humano es una enfermedad intestinal infecciosa y autolimitada, que consiste
en más de tres evacuaciones líquidas por día (24 horas). Dentro de los agentes causales de
esta enfermedad se encuentran las E. coli diarreogénicas, un conjunto de bacterias que se
pueden clasificar en 6 grupos o patotipos:
1) Escherichia coli enterohemorrágica (ECEH)
2) Escherichia coli enteropatogénica (ECEP)
3) Escherichia coli enterotoxigénica (ECET)
4) Escherichia coli enteroagregativa (ECEAgg)
5) Escherichia coli difusamente adherente (ECDA)
6) Escherichia coli enteroinvasiva (ECEI)
OBJETIVO
Identificar diferentes E. coli diarreogénicas mediante amplificación de los genes de virulencia
propios de cada patotipo.
34
ACTIVIDADES
Extracción de DNA: (este paso ya estará listo, se le entregará DNA)

1. Homogenizar 5 colonias medianas lactosa positivo en 200 µl de Triton X100 al 1% en un
tubo eppendorf de 0,5 ml.
2. Hervir las bacterias por 10 min a 100 °C, someter a vortex.
3. Hervir nuevamente 10 min a 100 °C.
4. Centrifugar a 8000 rpm por 5 min
5. Tomar el sobrenadante y guardar (el DNA que se liberó por la lisis bacteriana está en el
sobrenadante).
6. Realizar la reacción de PCR inmediatamente o congelar -20 °C (si se congela, repetir el
paso 4).
Amplificación de genes de virulencia presentes en cepas de E. coli diarreogénicas:

1. Preparar una solución que contenga el DNA templado, los partidores específicos, y la
enzima DNA polimerasa termorresistente, de acuerdo al siguiente protocolo
Solución 1X (µl) 10X
LP30 (stx1) 0,2 2
LP31 (stx1) 0,2 2
LP43 (stx2) 0,2 2
LP44 (stx2) 0,2 2
eaeF 0,2 2
eaeR 0,2 2
stiF 0,2 2
stiR 0,2 2
LTF 0,2 2
LTRE 0,2 2
Aaf1F 0,2 2
Aaf1R 0,2 2
Aaf2F 0,2 2
Aaf2R 0,2 2
virFF 0,2 2
virFR 0,2 2
ipaHF 0,2 2
ipaHR 0,2 2
daaAF 0,2 2
daaAR 0,2 2
dNTPs 0,5 5
H2O 13,875 138,75
Buffer Taq 5x 5 50
Taq DNA pol 0,125 1,25
DNA* 2
Vol final 25 250
* DNA que se debe agregar a cada tubo de PCR
35
2. Una vez preparados los tubos con 25 µl de la reacción, incubar los tubos en un
termociclador, de acuerdo al siguiente protocolo de Multiplex PCR utilizando el programa
específico:
1.- 94°C 1min 30 seg

2.- 58°C 1 min 15 seg
3.- 72°C 1 min
4.- Repetir 35 veces los pasos 1 al 3
5.- 72°C 7 min
6.- 4°C infinito
3. Para visualizar la amplificación se debe realizar un gel a agarosa al 2 % cargando 10 µl de

cada reacción en el pocillo del amplificado. Para estimar el tamaño de los fragmentos
amplificados, se incluye en el gel un marcador de tamaño molecular. La electroforesis se
corre a 70 volts por 60 min. Se aplicará el colorante Safer view para visualizar la
presencia del DNA.
Tamaños esperados de los amplificados:

Cepa de Gen Tamaño Secuencia partidores
E. coli amplificado esperado (pb)
5’----3’ dirección
ECEH o stx1 348 CAGTTAATGTGGTGGCGAAGG Directo (F)
STEC CACCAGACAATGTAACCGCTG Reverso (R)
stx2 584 ATCCTATTCCCGGGAGTTTACG Directo (F)
GCGTCATCGTATACACAGGAGC Reverso (R)
ECEP eae 482 TCAATGCAGTTCCGTTATCAGTT Directo (F)
GTAAAGTCCGTTACCCCAACCTG Reverso (R)
ECET lt 218 GCACACGGAGCTCCTCAGTC Directo (F)
TCCTTCATCCTTTCAATGGCTTT Reverso (R)
stII 129 AAAGGAGAGCTTCGTCACATTTT Directo (F)
AATGTCCGTCTTGCGTTAGGAC Reverso (R)
ECEAgg aafII 378 CACAGGCAACTGAAATAAGTCTGG Directo (F)
ATTCCCATGATGTCAAGCACTTC Reverso (R)
ECDA daaA(E) 542 GAACGTTGGTTAATGTGGGGTAA Directo (F)
TATTCACCGGTCGGTTATCAGT Reverso (R)
ECEI virF 618 AGCTCAGGCAATGAAACTTTGAC Directo (F)
TGGGCTTGATATTCCGATAAGTC Reverso (R)
ipaH 933 CTCGGCACGTTTTAATAGTCTGG Directo (F)
GTGGAGAGCTGAAGTTTCTCTGC Reverso (R)
36
Soluciones:
Triton X100 1%: 1 ml de Tritón en 100 ml de solvente (agua destilada o solución
amortiguadora TE pH 8.0 estéril), almacenar a temperatura ambiente.
dNTPs: para 200 µl de volumen final, tomar 20 µl de cada uno y agregar 120 µl de agua estéril
para PCR.
Partidores: desde los stock preparados 0,5 mM, diluirlos a una concentración de 5 µM (2 µl de
partidor en 200 µl de agua PCR), excepto para partidores ST (R y F) que deben diluirse a 10
µM (4µl de partidor en 200 µl de agua PCR).
TAE 1X: 40 ml de TAE 50X en 2000 ml de agua destilada
Marcador de tamaño molecular: 10 µl desde stock (gene ruler fermentas 100pb DNA ladder),
10 µl de solución amortiguadora de carga y 40 µl de agua.
Figura 4. Movilidad electroforética de los fragmentos de DNA amplificados. L: DNA Ladder

1Kb, 1: ECEH (stx2, eae, stx1), 2: ECEP, 3: ECET, 4:ECEAgg, 5: ECDA, 6: ECEI
37
Comparar in silico genomas de especies bacterianas
beneficiosas y patógenas
En los últimos años se han desarrollado tecnologías que han permitido obtener de forma
rápida la secuencia de todo el contenido genético (genoma) de organismos vivientes. Por lo
tanto, la cantidad de información disponible, en términos de números de genomas, ha
crecido exponencialmente, abriendo múltiples posibilidades en el estudio de las
características biológicas de estos organismos. A su vez, este desarrollo ha generado el
desafío de implementar plataformas y metodologías que permitan analizar de forma
adecuada esta gran cantidad de información. En este escenario, el uso de la informática cobra
una vital importancia.
La aplicación de informática al estudio y resolución de problemáticas biológicas es lo que
se conoce como bioinformática. En términos más específicos, la bioinformática se puede
definir como la investigación, desarrollo o aplicación de herramientas y estrategias
computacionales para expandir el uso de datos biológicos, médicos, de comportamiento, o de
salud pública. Incluye las herramientas y estrategias necesarias para adquirir, almacenar,
organizar, archivar, analizar o visualizar tales datos.
El estudio de los microorganismos no es la excepción y la aplicación de bioinformática ha
permitido dilucidar información valiosa acerca de su metabolismo, ciclos de vida o
determinantes de patogenicidad, por mencionar solo algunos ejemplos. Incluso, actualmente
se aplican metodologías de bioinformática para conocer la composición y estructura de
comunidades microbianas complejas, como la microbiota humana.
Muchas de las herramientas bioinformáticas actuales permiten hacer predicciones acerca
del comportamiento biológico de los microorganismos, en base su contenido genético, las
que luego pueden ser comprobadas experimentalmente en el laboratorio o en pruebas de
campo. En este escenario, una de las ramas de la bioinformática que ha sido más utilizada en
el último tiempo es la genómica comparativa, que, como su nombre lo indica, permite
comparar el contenido genético completo de distintos organismos.
En este trabajo práctico demostrativo se realizará un análisis bioinformático, en base a
genómica comparativa, de predicción de proteínas que puedan ser utilizadas en el desarrollo
de vacunas. Específicamente, se utilizará la herramienta Vaxign, que está disponible de
manera gratuita en la web (http://www.violinet.org/vaxign/). Vaxign permite analizar
comparativamente genomas microbianos para la identificación de proteínas que comparten
similitud de secuencia entre distintos organismos (ortólogos). En base a una serie de
predicciones de propiedades biológicas de estas proteínas, el software permite seleccionar
candidatos a ser incluidos en una vacuna. Este tipo de estrategia se conoce como
“Vacunología reversa” y ha permitido el desarrollo de la vacuna contra el meningococo
(Neisseria meningitidis) del serogrupo B, que hasta hace algunos años no estaba cubierto por
las vacunas disponibles.
En ANEXOS se muestra en etapas, paso a paso, el procedimiento que se seguirá en la
demostración práctica.
38
ANEXOS
A. MORFOLOGIA BACTERIANA
Las células bacterianas presentan una morfología típica que facilita

su identificación. Se reconocen al microscopio óptico tres formas básicas:
cocos, bacilos y espirilos. Además, algunas bacterias poseen una
agrupación característica.
1. Cocos: Presentan forma esférica o aproximadamente esféricas (arriñonadas, lanceoladas,

levemente ovoides) y según su agrupación se pueden clasificar como:
Agrupación Característica Ejemplo
Diplococos Se dividen solamente en Neisseria

un plano y permanecen gonorrhoeae
unidos formando pares
de células
Cadenas Se dividen en planos Streptococcus

paralelos y quedan pyogenes
unidos formando
cadenas cortas o largas
Racimos Se dividen en tres planos Staphylococcus

irregulares formando aureus
racimos
Tétradas Se dividen formando Cocos del género

grupos de cuatro células Gaffkys comunes en
(un cuadrado) el suelo
Paquetes Se dividen en tres planos Sarcina

perpendiculares Microrganismos del
generando suelo, bacterias
agrupamientos metanogénicas
cuboidales (sarcinas)
2. Bacilos: Presentan una forma alargada. La mayoría de los bacilos no

forma agrupaciones y se presentan aislados.
39
Sin embargo, existen excepciones:
Agrupación Ejemplo
Letras Chinas Corynebacterium spp.
Empalizada Corynebacterium spp.
Cadenas Bacillus cereus
3. Espirilos: Bacterias que presentan una forma alargada en forma de espiral o tirabuzón. Por
ejemplo: Treponema pallidum
Existen bacilos que pueden presentar una morfología específica, como por ejemplo:
Cocobacilos : Acinetobacter baumannii
Bacilos fusiformes : Fusobacterium spp.
Bacilos filamentosos : Actinomyces spp.
Bacilos curvos : Vibrio cholerae
Bacilos helicoidales : Campylobacter, Helicobacter
Rectangulares : Bacillus anthracis
40
B. TÉCNICAS DE VISUALIZACIÓN MICROSCÓPICA DE BACTERIAS Y HONGOS
.
La observación microscópica permite conocer algunas características de las bacterias
tales como forma, agrupación, presencia o ausencia de cápsula, flagelos y movilidad entre
otras. El examen microscópico de las bacterias se puede hacer de dos maneras:
1) Examen al fresco
Se emplea para el estudio de algunas características de los microorganismos, movilidad,
aglutinación, yemación, etc. Es un examen de gran utilidad en la observación de muestra de
aguas obtenidas del ambiente, o sedimentos urinarios y secreciones vaginales en muestras
clínicas para ver la presencia de leucocitos, glóbulos de pus, bacterias, células epiteliales, entre
otros. Tiene la limitante que por el pequeño tamaño de los microorganismos y por su índice de
refracción similar al del medio, se dificulta la observación de su forma.
Otra utilidad de la observación al fresco es que permite observar el movimiento celular. En este
sentido, es posible observar tres tipos de movimientos:
Movimiento Browniano: No existe desplazamiento de la célula, sino que ésta vibra en el
sitio en que se encuentra girando sobre sí misma.
Movimiento de Corrientes: Existe un desplazamiento uniforme de todas las bacterias en un
solo sentido, producto de las corrientes de líquido generadas en la preparación.
Movimiento de Traslación: Desplazamiento al azar de las células bacterianas dentro de la
preparación. Si se observa este movimiento se puede decir que se trata de un microorganismo
móvil.
2) Examen de frotis fijado y tinciones

Con el objeto de obtener un mayor contraste entre las células bacterianas y su entorno, que
facilite su visualización al microscopio, se ha hecho necesario el empleo de tinciones. Para
ello, se fija una suspensión de bacterias al vidrio. El frotis que se obtiene es la base para la
realización de cualquier proceso de tinción, permitiendo el estudio en detalle de la
morfología de las bacterias y su agrupación. El frotis se puede preparar a partir de una
muestra clínica directa, o a partir de un cultivo bacteriano puro.
Los métodos de tinción más empleados en Bacteriología son:

 Tinción Simple: se denomina simple ya que no establece diferencias tintoriales entre
los grupos bacterianos observados y sólo permite definir forma y agrupación. Esta
tinción permite observar muy bien la presencia de microorganismos intracelulares
como Neisseria.
 Coloración doble por el método de Gram: Esta tinción diferencial fue descrita y
desarrollada por el bacteriólogo danés Christian Gram en el año 1884. Permite agrupar
las bacterias en bacterias Gram positivo y Gram negativo, de acuerdo a su diferente
afinidad por los colorantes usados. Este proceso significa someter secuencialmente un
frotis fijado, a las siguientes etapas (Figura 5).
41
1) Tinción con cristal violeta
2) Fijación de la tinción con lugol (formación de un complejo)
3) Descoloración con alcohol-acetona (etapa clave del proceso que evidencia la
presencia o ausencia de membrana externa) y
4) Tinción con el colorante de contraste (safranina o fucsina).
La tinción de Gram es uno de los primeros pasos que se realiza para cualquier
identificación bacteriana. Permite clasificar las bacterias en dos grupos:
Bacterias Gram positivo: se observan de color azul violeta oscuro y

Bacterias Gram negativo: se observan de color rosado (Figura 4, Tabla 1).
Figura 5. Diagrama de flujo mostrando las etapas de la tinción de Gram.
Fundamento: El cristal violeta es un colorante que penetra la pared celular de bacterias

Gram positivo y Gram negativo. Posteriormente se agrega el lugol, que es un mordiente o
fijador y que forma un complejo con el cristal violeta. Durante el proceso de descoloración
con alcohol-acetona, la gruesa pared de los Gram positivo impide la salida del colorante,
manteniendo la coloración violeta. En cambio, por el alto contenido lipídico de la pared de
los Gram negativo, el alcohol-acetona genera poros, por los cuales escapa el cristal violeta, la
bacteria se descolora y para visualizarla al microscopio es necesario teñirla con un colorante
de contraste, de color rojo (safranina o fucsina).
42
Tabla 4: Morfología y propiedad tintorial de algunas bacterias de importancia clínica *
Morfología Gram Aerobios y anaerobios facultativos Anaerobios estrictos
Cocos Gram Staphylococcus, Streptococcus, Peptococcus,

(+) Micrococcus, Enterococcus Peptoestreptococcus
Gram (-) Neisseria Veillonella
Bacilos Gram Esporulados: Bacillus Clostridium

(+)
No Esporulados: Corynebacterium, Propionibacterium,

Listeria, Lactobacillus Eubacterium,
Bifidobacterium, etc.
Enterobacterias: Escherichia, Bacteroides, Prevotella,

Gram (-) Klebsiella, Salmonella, Shigella. Porphyromonas,
Fusobacterium
No Fermentadores: Pseudomonas,
Acinetobacter, Stenotrophomonas,
Burkholderia.
Fastidiosos: Haemophilus,
Bordetella,
Brucella. Pasteurella.
* Esta Tabla no incluye a otras bacterias de importancia clínica para las cuales la Tinción de
Gram no es aplicable (micobacterias, micoplasmas, clamidias, espiroquetas, etc.).
 Coloración doble por el método de Ziehl–Neelsen: Tinción diferencial que se emplea

preferentemente para bacilos de la Tuberculosis (Mycobacterium) y otros similares, que
por el alto contenido de material lipídico de sus paredes, difícilmente se pueden teñir
con Gram. Estos microorganismos resisten la descoloración con alcohol-ácido y se
observan teñidos de color rojo (fucsina de Ziehl), por ello se denominan bacilos alcohol-
ácido resistentes (BAAR). El colorante de contraste utilizado es azul de metileno.
Figura 6. Diagrama de flujo mostrando las etapas de la tinción de Ziehl–Neelsen.
43
Observación microscópica de los hongos:
1.- Tinción de Gram: útil en la observación microscópica de levaduras. Permite observar:

forma y tamaño de las levaduras, tipo de reproducción: fisión, gemación unipolar, bipolar o
multipolar, ausencia o presencia de artroconidios, blastoconidios, pseudohifas e hifas
verdaderas.
2.- Observación de hongos filamentosos: Se prepara una emulsión tomando una porción de
la colonia con una gota de agua destilada o lactofenol con o sin colorante y se prepara el
frotis. De esta manera se pueden observar hifas hialinas, pigmentadas, septadas , aseptadas,
forma y tipo de conidio, etc.
3.- Microcultivos en lámina: se obtienen preparaciones permanentes al cultivar el hongo en

una lámina de vidrio.
44
C. MICROBIOTA NORMAL HUMANA
Muchos microorganismos viven gran parte de sus vidas en relación estrecha con otras
especies de seres vivos. Este tipo de relación se denomina simbiosis (derivado del griego sym:
junto con, y bios: vida) y los seres vivos que la realizan simbiontes.
Existen tres tipos principales de relaciones simbióticas: comensalismo, mutualismo y
parasitismo.
Comensalismo: El comensalismo (derivado del latín com: junto y mensa: mesa) es una
relación simbiótica en la cual un organismo, el denominado comensal, se beneficia de la
relación mientras el hospedero no es afectado ni positiva ni negativamente.
Mutualismo: Designa la relación en la cual ambos participantes reciben un beneficio. Si
ambos organismos conservan la facultad de poder vivir en forma independiente, la relación se
denomina protocooperación (subtipo de mutualismo). En el caso que la relación sea esencial
para ambos participantes, la denominamos mutualismo propiamente tal (algunos autores
utilizan para este subtipo de relación el término simbiosis, sin embargo, si recordamos la
etimología de esta palabra, su significado corresponde más bien a una relación biológica
estrecha, sin considerar el tipo de relación que se establece). En estos casos el mutualista y el
hospedero son metabólicamente interdependientes. Existen varios ejemplos de este tipo de
relación: protozoo flagelado que vive en intestino de termitas y produce celulasas que
degradan la madera; líquenes (relación entre hongos ascomicetos y algas verdes o
cianobacterias); microorganismos del rumen de animales herbívoros; etc.
Parasitismo: Describe la situación en la cual uno de los participantes recibe un daño en la
interacción. Los patógenos clásicos del ser humano se comportan de esta forma.
Una gran diversidad de microorganismos está asociada a la piel y membranas mucosas
del ser humano, desde su nacimiento hasta su muerte. Esta población de microorganismos
constituye la microbiota normal del individuo.
La microbiota normal en humanos es relativamente estable, con géneros específicos
colonizando varias regiones del cuerpo humano, durante períodos particulares de la vida de un
individuo. Usualmente se desarrolla en una secuencia ordenada, o sucesión, después del
nacimiento, terminando en el establecimiento de poblaciones bacterianas relativamente
constantes en el individuo adulto. El principal factor que determina la composición de la
microbiota normal en una región del cuerpo es la naturaleza del ambiente local, el cual es
determinado por el pH, temperatura, potencial redox, oxígeno, agua, y niveles de nutrientes.
Otros factores, tales como, peristaltismo, saliva, secreción de lisozima, y secreción de
inmunoglobulinas también juegan un rol en el control de la microbiota normal. Es importante
destacar que la terapia antimicrobiana contra un patógeno bacteriano también afecta
negativamente a la microbiota normal, cada vez que ésta se enfrente a un antibiótico.
Existe una inmensa diversidad en las especies bacterianas que conforman la microbiota
normal, estimándose que existirían más de 1000 especies diferentes sólo en la microbiota del
sistema digestivo.
La microbiota normal humana, incorrectamente denominada flora normal (las bacterias
no pertenecen al reino vegetal), comprende todos los microorganismos simbióticos que se
45
encuentran normalmente asociados a sistemas anatómicos como la piel, tracto gastrointestinal,
sistema respiratorio superior, sistema urogenital y conjuntiva. La mayoría de los
microorganismos que pertenecen a la microbiota normal están en una relación comensal con el
hospedero, sin embargo, algunos pueden estar en una relación mutualista (los productores de
sustancias beneficiosas para el hospedero, por ejemplo).
El estudio de animales libres de microorganismos (axénicos) ha permitido entender el rol
fundamental que desempeña la microbiota normal en relación al hospedero. Por ejemplo, se ha
establecido que animales experimentales axénicos tienen un promedio de vida cercano al doble
del valor encontrado en animales normales, sólo si se mantienen en condiciones de esterilidad.
Sin embargo, en presencia de microorganismos patógenos la sobrevida de éstos animales es
menor que los animales con microbiota normal. Además, se ha descubierto que los animales
libres de microorganismos presentan características anatómicas, fisiológicas e inmunológicas,
diferentes a las de los animales normales (fundamentalmente a nivel de la mucosa intestinal).
Los principales beneficios que la microbiota normal entrega al ser humano son:
1. Interferencia bacteriana: Se conoce con este nombre a la capacidad de las bacterias de la
microbiota normal de interferir o desplazar el crecimiento de patógenos, porque ocupan un
espacio físico (mediante su unión a receptores celulares), lo que disminuye los receptores
específicos disponibles para la interacción entre bacterias patógenas y el hospedero.
Además, las bacterias de la microbiota normal inhiben el crecimiento de algunos patógenos,
evitando por esta vía la infección del hospedero, debido a la producción de compuestos
tóxicos, como bacteriocinas (ver Figura 7). También la competencia por nutrientes y algunos
minerales limitantes en el hospedero, como el hierro, explican la interferencia bacteriana.
Figura 7. Mecanismos por los cuales la microbiota normal compite con patógenos invasores.
46
2. Activación basal y desarrollo del sistema inmune: Los estudios más importantes se refieren
al sistema digestivo. La microbiota normal intestinal mantiene en un estado basal de
activación al sistema inmune del hospedero (por ejemplo: en seres humanos se encuentran
normalmente anticuerpos séricos e inmunoglobulinas tipo A en la mucosa intestinal que
reaccionan contra componentes de la microbiota normal; por otra parte, los niveles y tipos
linfocitarios en la mucosa intestinal aumentan en forma importante debido a la colonización
de la microbiota). La microbiota normal podría participar además en la estructuración
espacial del sistema inmune intestinal (diferentes tipos de subpoblaciones linfocitarias en
diferentes sitios anatómicos) e indirectamente en la microanatomía del tubo digestivo. Todos
estos factores ayudarán finalmente al hospedero a mantener una adecuada defensa contra
microorganismos potencialmente patógenos.
3. Producción de nutrientes: Vitaminas del complejo B y vitamina K.
4. Participación en ciclos metabólicos: Reciclaje de la urea y sales biliares.
Aunque la microbiota normal que habita la piel humana, ojos, orofaringe, genitales y
tracto gastrointestinal son inocuos en individuos sanos, éstos pueden transformarse en
patógenos para hospederos inmunocomprometidos.
47
D. CONTROL DE MICROORGANISMOS
ANTIMICROBIANOS
El término antimicrobiano se refiere a una sustancia química capaz de interferir sobre el

crecimiento microbiano, inhibiendo la proliferación de cualquier microorganismo. Dentro de los
antimicrobianos, se encuentran los antibióticos, los cuales comprenden productos químicos
elaborados naturalmente por microorganismos, u otra sustancia similar elaborada de forma
total o parcial por síntesis química, los cuales en bajas concentraciones inhiben el desarrollo
específicamente de bacterias.
CLASIFICACIÓN DE LOS ANTIBIÓTICOS
Los antibióticos se pueden clasificar de acuerdo a diversos criterios.

 De acuerdo a su mecanismo de acción, se pueden clasificar en:
a.- Inhibidores de la síntesis de la pared bacteriana.

b.- Inhibidores de la función de la membrana citoplasmática.
c.- Inhibidores de la síntesis proteica (actúan sobre ribosomas bacterianos).
d.- Inhibidores que actúan a nivel de la síntesis de ácidos nucleicos.
e.- Antimetabolitos que actúan sobre vías metabólicas esenciales para la bacteria.
Figura 8. Esquema de los sitios blancos para diferentes antibióticos.
48
 De acuerdo al tipo o grado de acción antimicrobiana se clasifican en:
Bacteriostáticos: Son aquéllos que producen inhibición del crecimiento microbiano, efecto
que desaparece cuando dejan de actuar sobre el microorganismo. Por lo
tanto, su acción es reversible.
Bactericidas: Causan una acción letal irreversible sobre los microorganismos.
MÉTODOS DE ESTUDIO DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA IN VITRO
1. Método de susceptibilidad por difusión
Este método, conocido también como método de Kirby-Bauer, permite categorizar las
bacterias como sensibles o resistentes a los antimicrobianos, de una manera cualitativa,
mediante el uso de discos de papel filtro impregnados con una cantidad determinada de
antimicrobiano y aplicados sobre la superficie de un agar que ha sido inoculado previamente con
la bacteria en estudio.
Figura 9. Esquema representando un antibiograma
49
2. Métodos de susceptibilidad por dilución
Se usan para determinar la concentración mínima exacta del antimicrobiano que inhibe
el crecimiento (CIM) para un determinado microorganismo. Es por lo tanto un método
cuantitativo. Para ello, se realizan diluciones seriadas del antimicrobiano, se inoculan con
microorganismos y se incuban.
La CIM es la concentración más baja del antimicrobiano en la cual no hay crecimiento
microbiano aparente. Esta técnica se puede hacer en medio líquido (tubos) o en medio sólido
(placas).
También, mediante este procedimiento se puede determinar la CBM (Concentración
Bactericida Mínima), que es la concentración mínima de antibiótico necesaria para matar el
99.9% de las bacterias en un cultivo.
Además, se puede confirmar sensibilidad o resistencia en cepas que presentan
sensibilidad intermedia por el método de difusión en agar, o resultados variables por otros
métodos.
Test de macrodilución en caldo. En los tubos donde hay menor concentración del antibiótico
aparece turbidez indicadora de crecimiento bacteriano. La concentración de 8 µg/ml
corresponde a la CIM.
Test de microdilución en caldo. Corresponde a un método cuantitativo, que al utilizar estas

microplacas de 96 pocillos, permite analizar una cepa frente a 10 antibióticos distintos en 8
diluciones, o 10 cepas distintas frente al mismo antibiótico.
50
3. E-TEST
Ésta es una técnica cuantitativa (CIM), que combina los principios básicos de los métodos
de estudio de susceptibilidad por difusión y dilución en agar, antes mencionados.
En el E-test, el inóculo estandarizado se disemina en una placa de agar para formar un
césped homogéneo. Sobre este inóculo, se deposita una tira impregnada con el antimicrobiano a
estudiar dispuesto como una gradiente de concentración. El agente antimicrobiano difunde
sobre el agar generando un halo elíptico y la CIM corresponde al punto de intersección entre la
inhibición del crecimiento bacteriano y la concentración del antimicrobiano.
Utilidad y rendimiento de las pruebas de susceptibilidad in vitro
El laboratorio proporciona información a través de métodos estandarizados in vitro de la

actividad de los antimicrobianos frente al microorganismo patógeno aislado. Sin embargo, el
clínico debe seleccionar el antimicrobiano a usar considerando esta información más todos los
otros factores que inciden en el comportamiento del fármaco in vivo (Ej: insuficiencia renal,
alergias, etc.).
51
Comparar in silico genomas de especies bacterianas beneficiosas y
patógenas
52
53
54
55
56
57
58
59
¿Qué sigue luego de la predicción y selección con Vaxign?
60

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GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS

TALLER DE MICROBIOLOGÍA 2017

9-13 enero 2017

Programa de Microbiología y Micología, ICBM

LUGAR: Auditórium Hernán Romero y Laboratorios de Salud Pública, Salas de trabajo

FECHA Y HORARIO: 09 al 13 de Enero de 2017 - 40 hrs totales

EVALUACION: Se evaluará con 1 prueba escrita, modalidad de selección múltiple.

REQUISITOS DE CERTIFICACIÓN: Asistencia mínima 80%.

Día 1 Día 2 Día 3 Día 4

En el Laboratorio de Microbiología es necesario mantener una serie de normas de

Estas normas son las siguientes:

2. Reconocer las diversas morfologías y agrupaciones microbianas que pueden

3. Visualizar las estructuras macro y microscópicas de algunos hongos levaduriformes

1.- Analizar conceptos básicos de bioseguridad y normas del laboratorio.

- Cocácea Gram Positivo en cadenas - Bacilo Gram Positivo

4.- Observar movilidad al fresco de una muestra de Proteus o Pseudomonas.

Realizar siembra de muestras ambientales en medios de cultivos enriquecidos.

- A partir de esta solución, realizar una dilución seriada de la muestra, en tubos de

Figura 1. Esquema de trabajo para la dilución de las muestras ambientales.

Figura 2. Caracterización de la morfología de colonias bacterianas

Además, se pueden visualizar otras características, como:

Elabore, en su grupo de trabajo, una ficha estandarizada que le permita caracterizar e

1.- Medio de cultivo :

COLONIA FORMA ELEVACION MARGEN COLOR TEXTURA TAMAÑO

1. Preparar un inóculo de la bacteria a estudiar, suspendiendo 2-3 colonias en caldo Müller

Aislamiento de mutantes espontáneos de resistencia a rifampicina mediante la técnica de

Preparación de células químicamente competentes para uso en transformación por choque

Comunicación bacteria-bacteria mediante quorum sensing

Los microorganismos son capaces de comunicarse entre sí a través de una variedad de

b- Pre-cultivos bacterianos Acidithiobacillus ferrooxidans, Acidithiobacillus

1. Inocular el medio fresco al 10 % (10 ml de precultivo + 90 ml de medio fresco). Para el

Na2SO4 x 10 H2O 0,150 g/l 0,5 mM

Poner el azufre dentro de un balón de aforo que posee un agujero en el fondo.

Según describe la biblioteca nacional de medicina de los Estados Unidos (MedLine

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INTRODUCCIÓN A LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR

Puntos más importantes:

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Los pasos de la PCR

1. Desnaturalización (96°C): la reacción se calienta bastante para separar, o desnaturalizar, las

Escherichia coli diarreogénicos

Extracción de DNA: (este paso ya estará listo, se le entregará DNA)

Amplificación de genes de virulencia presentes en cepas de E. coli diarreogénicas:

1.- 94°C 1min 30 seg

3. Para visualizar la amplificación se debe realizar un gel a agarosa al 2 % cargando 10 µl de

Tamaños esperados de los amplificados:

Figura 4. Movilidad electroforética de los fragmentos de DNA amplificados. L: DNA Ladder

Las células bacterianas presentan una morfología típica que facilita

1. Cocos: Presentan forma esférica o aproximadamente esféricas (arriñonadas, lanceoladas,

Agrupación Característica Ejemplo

Diplococos Se dividen solamente en Neisseria

Cadenas Se dividen en planos Streptococcus

Racimos Se dividen en tres planos Staphylococcus

Tétradas Se dividen formando Cocos del género

Paquetes Se dividen en tres planos Sarcina

2. Bacilos: Presentan una forma alargada. La mayoría de los bacilos no

Letras Chinas Corynebacterium spp.

Empalizada Corynebacterium spp.

Cadenas Bacillus cereus

2) Examen de frotis fijado y tinciones

Los métodos de tinción más empleados en Bacteriología son:

Bacterias Gram positivo: se observan de color azul violeta oscuro y

Figura 5. Diagrama de flujo mostrando las etapas de la tinción de Gram.