Titulo

1. Problema

El ácido cítrico es un producto valioso a nivel comercial e industrial, requiriéndose una

producción industrial de 2.1 millones de toneladas al año en 2016 (Kirimura & Yoshioka,
2019). Esto es debido a que es muy utilizados como acidulante y conservante en
alimentos, material de partida para síntesis de nuevos grupos funcionales de gran
importancia a nivel industrial, es un ingrediente relevante en la industria farmacéutica, se
utiliza como agente complejante en la metalurgia y como ablandador de agua (Soccol,
Vandenberghe, Rodrigues, & Pandey, 2006) es por eso, que se han realizado numerosas
investigaciones en busca de nuevos sustratos para su producción y metodologías para la
mejora del proceso de producción que permitan optimizar, disminuir costos y aumentar la
eficiencia de producción. El ácido cítrico es producido principalmente por fermentación
aeróbica con hongos filamentosos Aspergillus niger usando como sustrato carbohidratos
(glucosa, fructusa y sacarosa principalmente) o residuos agroindustriales ricos en
carbohidratos ya sea por procesos de fermentación sumergida, superficiales o sólidas.

Una fuente rica en glucosa y fructosa es el banano maduro, del cual, en Colombia cerca de
un 10% no clasifica como apto para ser exportado. Desde el año 2015, la producción anual
de banano se ha mantenido en casi 2,1 millones de toneladas, de los cuales, se exportan
cerca de 1,9 millones de toneladas (Agronegocios, 2019), por tanto, hay una cantidad de
producto (0,2 millones de toneladas por año) que no tiene un valor comercial significativo.
Desechos agroindustriales como la pulpa de café son eliminados en gran parte por
vertimiento en la naturaleza causando problemas ambientales serios en suelo y fuentes de
agua, es por ello que se han realizado distintos estudios para usar la pulpa de café como
fuente de producción de alto valor agregado como saborizantes, enzimas, compuestos
aromáticos y ácidos orgánicos (Murthy & Madhava Naidu, 2012). Según el informe del a
FNC, la cosecha de café llegó a 14,8 millones de sacos de café verde en 2019 (cerca de 880
millones de toneladas de café) (Revista Semana, 2019), teniendo en cuenta que la pulpa
de café representa el 40% del fruto, se estarían produciendo alrededor de 350 millones de
toneladas de desechos de pulpa de café al año, lo cual, puede estar generando un efecto
adverso en el medio ambiente. Por ello, es de importancia realizar investigaciones que
permitan procesar la pulpa de café y banano no apto para la exportación para obtener
compuestos de alto valor y con una alta demanda en el mercado como lo es el ácido
cítrico, aprovechando, su alto contenido de carbohidratos.

2. Justificación
El banano maduro contiene cerca 63% en base seca de carbohidratos, en los que
principalmente se encuentra constituido por fructosa y glucosa. Mientras que la pulpa de
café contiene en peso seco alrededor del 50% de carbohidratos (Pandey et al., 2000)
siendo estos materiales una buena fuente para la obtención de ácido cítrico a través de
fermentación. De esta forma, utilizar desechos agroindustriales o productos de bajo valor
en la producción de ácido cítrico, permitiría que lo productores de café y banano en
Colombia obtuvieran mayores ingresos al producir un producto con un alto valor agregado
o como una oportunidad de negocio rentable. El hongo filamentoso Aspergillus niger es un
microorganismo adecuado para la obtención de ácido cítrico con un alto rendimiento
reportado (mayor 70%) a partir de una alta concentración de carbohidratos como glucosa,
fructosa y sacarosa que podría estar entre 100 y 200 g/L (Yoshioka, Kobayashi, &
Kirimura, 2019), por ello, la producción a nivel mundial de ácido cítrico se respalda por la
fermentación de carbohidratos usando Aspergillus niger siendo un proceso
biotecnológico confiable y muy bien estudiado que, permite evaluar diferentes fuentes de
carbohidratos que pueden ser aprovechados para la producción a nivel industrial de ácido
cítrico permitiendo así, tener una nueva fuente de producción que ayude a suplir la
demanda de este compuesto.

Para la evaluación de una nueva fuente de carbohidratos es necesario la evaluación de

factores que influyan en la composición del medio, ya que afecta la acumulación de acido
cítrico durante la fermentación. Se ha demostrado que los factores que afectan
principalmente la fermentación cítrica son el tipo y la concentración de la fuente de
carbono, limitación de fuente de nitrógeno y fosfato, valor de pH, concentración de
oxígeno, concentración de oligoelementos y morfología del microorganismo productos
(Max et al., 2010) factores que, en gran parte pueden ser evaluados a nivel de laboratorio
para optimizar la producción.

3. Objetivos

- En base a la literatura reportada, evaluar la pulpa de café y banano maduro como

posible materia prima para la producción de ácido cítrico usando el hongo
filamentoso Aspergillus niger.

- Estudiar los parámetros necesarios que permitirían optimizar el proceso de

producción de pacido cítrico durante la fermentación usando Aspergillus niger
usando pulpa de café y banano maduro como potenciales fuentes de
carbohidratos.
 - En base a la teoría y reportes realizados en artículos científicos, describir el
procedimiento y los resultados esperados para la obtención de ácido cítrico a
partir de pulpa de café y banano maduro.

4. Estado del arte (8 artículos sobre el tema del 2010 en adelante)

En los estudios para la producción de ácido cítrico por medio de fermentación se han
usado gran variedad de microorganismos, entre ellos, están: Hongo - Aspergillus niger , A.
awamori , Penicillium janthinelum ; levadura - Yarrowia lipolytica , Candida
tropicalis , Candida oleophila , Candida guilliermondii ; y bacterias: Bacillus
licheniformis , Arthrobacter paraffinens , Corynebacterium sp. De los cuales, se destaca el
Aspergillus niger debido a sus grandes ventajas que presenta como fácil manejo durante la
producción, altos rendimientos y principalmente su capacidad de fermentar una variedad
grande de materias primas de bajo costo (Betiku & Adesina, 2013). Esto ha permitido
realizar diversos estudios con el fin de usar como materia prima productos de muy bajo
costo y residuos agroindustriales para darles un valor agregado y a la vez, reducir
problemas ambientales que generen estos residuos agrícolas. Singh-Dhillon (Singh
Dhillon, Kaur Brar, Verma, & Dayal Tyagi, 2011) en su investigación encontró que el orujo
de manzana demostró ser un excelente sustrato para la producción de ácido cítrico por
Aspergillus niger NRRL 567 durante un tiempo de 72 horas de incubación con una tasa de
producción de 9.0 g/L por fermentación sumergida demostrando ser una buena fuente
para la obtención de ácido cítrico. Olubukola-Kuforiji (Kuforiji, Kuboye, & Odunfa, 2010)
usó como como sustrato desechos de pulpa de naranja y de piña usando la cepas de
Aspergillus niger NRRL 567 y 328 obteniendo una eficiencia de 57,6% y 55,4%
respectivamente para residuos de naranja y rendimiento de 46,4% y 45,4% utilizando
residuos de piña dando como conclusión que la fuente de carbono como parámetro a
evaluar tiene afecta significativamente la eficiencia de producción durante la
fermentación. Entre las investigaciones más recientes, se ha estudiado la optimización de
la producción de ácido cítrico utilizando aguas residuales del proceso de obtención de
aceite a partir de aceitunas verdes Aspergillus niger B60 (Papadaki & Th Mantzouridou,
2019), para ello requirieron enriquecer con azucares usando orujo de uva blanca para
mantener las condiciones de concentración de sustrato adecuadas obteniendo un
rendimiento máximo de 56% con una concentración de 11,5 g/L de una mezcla equimolar
de glucosa y fructosa.

Como se ha mencionado antes, además de la morfología del microorganismo, tipo y

concentración de la fuente de carbono, la eficiencia es afectada también por factores
como pH del medio que disminuye al aumentar la concentración de producto, y
concentración de oxígeno que se consume en el medio por ser un proceso aeróbico. Es
por eso, que algunas investigaciones se enfocan en mantener condiciones adecuadas a
medida que aumenta la concentración de acido cítrico. Weiliang – Hou (Hou & Bao, 2018)
utilizó un biorreactor con impulsores para una aireación constante para la sacarificación
(hidrolisis enzimática) y fermentación simultanea de materiales lignocelulósicos que
permite una transferencia rápida de oxigeno desde la fase de aire hacia la fase liquida
donde se encuentra el hidrolizado mejorando significativamente la producción de ácido
cítrico, debido a que la tasa de transferencia de oxigeno entre estas dos fases es uno de
los pasos limitantes de la velocidad del proceso.

En otros estudios, se enfocan en una optimización en las que tienen en cuenta varios
factores (concentración de la fuente de carbono, (NH 4)2 HPO4, KH2PO4, tiempo de
fermentación y cambio de pH con respecto a la concentración de producto. En una
evaluación de optimización de todos los parámetros usando como materia prima
hidrolizado de almidón de batata, realizaron un enfoque estadístico para realizar un
diseño experimental como la metodología de superficie de respuesta (RSM) (Betiku &
Adesina, 2013). De esta forma, el autor obtuvo un diseño experimental de 50 experimento
con un modelado matemático de segundo orden obteniendo valores teóricos de
concentración de ácido cítrico en función de 5 parámetros resultados que en las
condiciones mas optimas se obtuvo un valor de 83,00 g/L de concentración de producto
durante la experimentación, valor que confirmó la validez al comprarlo con el valor
teórico (83,01 g/L).

No se encontraron reportes sobre el uso de pulpa de café para la obtención de ácido

cítrico por fermentación. Sin embargo, hay estudios en los que se estima el potencial
biotecnológico de este residuo agroindustrial como, por ejemplo, la fermentación
alcohólica con Saccharomyces cerevisiae de pulpa de café obteniendo extractos con un
alto valor en el mercado (Santos Da Silveira et al., 2020). En otros avances recientes,
eliminaron de la pulpa de café la cafeína y taninos (los cuales los son toxicos al librarse en
grandes cantidades en la naturaleza) a través de un proceso biotecnológico llamado
biodetoxificación por fermentación en estado sólido usando esporas de Rhizopus oryzae
(Londo et al., 2020) para así la posibilidad de usarse en aprovechamientos agroquímicos o
como materia prima en otros proceso.

El banano maduro se ha evaluado como materia prima en la fermentación cítrica

(CALDERÓN, 2015), en donde realizaron un diseño experimental con un modelo
estadístico factorial 2x2, evaluando concentración de oxígeno disuelto, pH y
concentración de sustrato con respecto al tiempo. Determinaron la concentración de
producto utilizando el método de Polivinil polipinolidona encontrando una concentración
de 21,12g/L después de 168 horas del proceso. Estos resultados podrían ser utilizados
para comprar datos obtenidos en experimentaciones futuras.

5. Metodología

Preparación de inóculo

Las esporas de A. niger se producirán en agar de papa dextrosa (PDA) durante 5–7 días a
30 ° C. Para el inóculo, las esporas se transferirán asépticamente de las placas PDA a un
matraz de 250 mL que contendrá 100 mL de agua destilada estéril. Los matraces
inoculados se agitarán continuamente en un agitador de incubadora controlado por el
medio ambiente a 3,3 Hz y 30 ° C durante 1 h antes de empezar la fermentación. (Betiku
& Adesina, 2013)

Tratamiento previo de materia prima como fuente de carbohidratos

De acuerdo al procedimiento descrito por Calderón-Silverio (CALDERÓN, 2015) para
muestras de banano maduro, se mezclará pulpa de banano en agua en una entre 40 y 50%
de banano, una vez diluido, se filtrará al vacío para eliminar solidos suspendidos.
Finalmente, el jarabe de banano se someterá a un proceso de pasteurización a 105 °C
durante 3 minutos y luego bajando la temperatura hasta 37 °C utilizando agua helada.

Para usar pulpa de café, se realizará una hidrolisis ácida de una suspensión de pulpa al
16,6% de acuerdo a la metodología realizada por Pleissner- Daniel (Pleissner et al., 2016).
Se adicionará a la suspensión 0,18 mol/L de ácido sulfúrico para llevar a cabo una hidrólisis
durante 30 minutos a 121 °C, luego, se ajustará el pH a 5 adicionando gota a gota NaOH al
20%. Para una hidrolisis más efectiva, se podría llevar a cabo un segundo paso usando
Accellerase 1500 para hacer hidrólisis enzimática a 50 °C durante 24 h y en agitación a 150
rpm. También podría evaluarse pulpa de café sin hidrolizarse para determinar el efecto de
la hidrolisis sobre la eficiencia de producción de ácido cítrico.

Medio de fermentación

La composición del medio proceso de fermentación se realizará de acuerdo a la

metodología descrita por Bin-Yu (Yu et al., 2018). Materia prima como fuente de
carbohidratos que aporte entre 100 y 200g/L de glucosa, 2 g /L de NH 4SO4, 1 g/L de
NaNO3, 0.5 g/L de KH2PO4 y 0.3 g de MgSO4·7H2O. El medio se esterilizará a 115 ° C
durante 20 min.

Proceso de fermentación.
Los matraces con el medio de fermentación se inocularán con una fracción en volumen
del 2 y 5% de la suspensión de esporas. Se mantendrá a 35 °C con agitación a 300 rpm
durante el tiempo suficiente para obtener el máximo rendimiento.  La solución de
fermentación que contendrá ácido cítrico se centrifugará a 8000 g a 4 ° C durante 10
minutos, y el sobrenadante se usará para análisis posteriores.

Determinación de concentración de ácido cítrico

Basándose en la metodología de Gurpreet-Singh (Singh Dhillon et al., 2011), se tomarán 1

mL de la solución obtenida después de centrifugar, se diluirán a un volumen de 100 mL
con agua destilada y se determinará la concentración utilizando el método
espectrofotométrico piridina-anhidrido acético. Se toma´ra 1 mL de la solución anterior y
se adicionará a un tubo de ensayo se añadirá 1,3 mL de piridina mezclando manualmente
se añadirá 5,7 ml de anhidrido acético y se colocará en baño de agua a 22 °C para incubar
durante 30 minutos. Se medirá en un espectrofotómetro uv-vis a 420 nm usando agua
como blanco de reactivo y realizando una curva de calibración entre 80 y 200 mg/L.

Determinación de biomasa

El precipitado obtenido por centrifugación se lavará con agua destilada y secará durante
24 horas a 100°C y se pesará el sólido para determinar la cantidad de biomasa.

Determinación de pH y oxígeno disuelto

Los valores de pH se midieron con pH-metro tanto en experimentos donde se usará

solución tampón y en los que no cada 5 minutos para determinar el cambio de pH con
respecto al tiempo. Se determinará usando una sonda para oxigeno disuelto extrayendo
una alícuota de sistema de reacción para evitar contaminación.

Determinación del contenido total de azúcar soluble.

El azúcar soluble total se estimará en todas las muestras del proceso de fermentación y a
las materias primas después de su pretratamiento mediante espectrofotometría por el
método del ácido fenol-sulfúrico de acuerdo a la metodología descrita por Papadaki
-Eugenia (Papadaki & Th Mantzouridou, 2019).

6. Resultados esperados

Es de tenerse en cuenta que, la producción de ácido cítrico por fermentación con

Aspergillus niger es alta cuando varios nutrientes están presentes en altas
concentraciones, es decir, azucares como sustrato, oxígeno disuelto, nitrógeno y fosfatos.
Es probable que muchos eventos bioquímicos contribuyan conjuntamente a una alta
producción. En vista de la naturaleza de la bioquímica de producción, la influencia de los
factores individuales no siempre se puede evaluar sin influir en los otros factores. La
evaluación de banano maduro y pulpa de café en este estudio, bajo la metodología
establecida permitirá obtener resultados que permitan tomar decisiones y ajustes previos
a un estudio mas profundo en donde se busque optimizar parámetros a través de un
diseño experimental complejo.

La fuente de carbono es uno de los parámetros más evaluados, encontrándose en muchos

estudios que los azucares que son rápidamente asimilables por el microorganismo
permitirán un alto rendimiento de producción de ácido cítrico. Por lo anterior, se
esperaría la evaluación de producción de acido cítrico con respecto a la fuente de carbono
fuera mayor al usar banano maduro que pulpa de café debido que el banano contiene
azucares libres y disacáridos que serían fácilmente metabolizados por el microorganismo.
sin embargo, el rendimiento para pulpa de café dependerá en gran medida del grado de
hidrólisis que se logre en el pretratamiento, es de esperarse que al realizar una hidrolisis
acida seguido de una hidrolisis enzimática en las mejores condiciones posibles, se logres
resultados comparables con los obtenidos usando banano.

Evaluar la concentración inicial de sustrato también es importante en estos procesos. El

rendimiento final de obtención de ácido cítrico aumenta con la concentración inicial de
azucares disponibles en el medio tal como se muestra en el siguiente ejemplo:

Figura 1. Comparación de la cantidad producto obtenido a concentraciones iniciales de

sustrato e inoculo diferentes usando como materia prima banano maduro. Tomado de
(CALDERÓN, 2015).
Donde también se observa que una mayor concentración de inoculo permite desde luego
un aumento en la producción de ácido cítrico.

El valor de pH del medio de fermentación es un parámetro crucial en dos etapas del

proceso. En la primera etapa, durante la germinación se requiere un pH> 5, luego se da
una absorción de amoniaco como fuente de nitrógeno que a la vez provoca una liberación
de iones hidronio al medio reduciendo el valor de pH y favoreciendo la producción de
ácido cítrico permitiendo a la vez, la reducción de contaminación por la reproducción de
otros microorganismos que podrían llevar al a formación de otros ácidos orgánicos no
deseados como ácido oxálico y acido glucónico. Por tanto, es de esperarse que a medida
que pase el tiempo en el proceso de fermentación, el valor de pH reduzca continuamente
indicando que la producción de ácido cítrico si se estaría llevando a cabo.

Esta fermentación al ser aeróbica, es fundamental el monitoreo de oxigeno disuelto en el

medio de fermentación y de un proceso que permita una aireación continua del medio
debido a que una tasa de aireación baja podría tener efectos adversos sobre el
rendimiento. Por el contrario, si la tasa de aireación es muy alta, la concentración de CO 2
disuelto puede descender rápidamente y se conoce que el dióxido de carbono es
fundamental como sustrato para la enzima piruvato carboxilasa que repone el suministro
de oxalacetato para la citrato sintasa; aunque en el mecanismo catalizado por la piruvato
descarboxilasa produce suficiente dióxido de carbono, una aireación excesiva conduce a
perdidas. De acuerdo a la bibliografía consultada, es de esperarse que una agitación
continua a 300 rpm es adecuada para mantener las concentraciones de CO 2 y O2
adecuadas.

Como en todos los procesos fermentativos microbianos, se espera que la concentración

de ácido cítrico (producto) y de biomasa aumente con respecto al tiempo a medida que la
concentración de azúcar soluble total evaluado disminuya al igual que el valor de pH como
se muestra en el siguiente ejemplo:
Figura 2. Evolución del contenido de ácido cítrico (g / L), contenido de biomasa seca (g / L),
contenido de azúcar soluble total (g / L) y pH en aguas residuales estériles de
procesamiento de aceitunas verdes al estilo español enriquecidas con Aspergillus niger.
Tomado de (Papadaki & Th Mantzouridou, 2019).

Finalmente se llega a un punto donde la concentración de producto y biomasa se

mantienen estables debido a la terminación de sustrato en el medio o de algún producto
esencial.

La determinación de ácido cítrico se garantizará al usar una técnica espectroscópica,

donde como método colorimétrico, donde una reacción del ácido cítrico con piridina y
anhidrido acético genera un producto coloreado, reacción que se da sin interferencia por
otros ácidos orgánicos presentes en el medio.

7. Cronograma

Actividad día 1 día 2 día 3 día día 5 día 6

4

Revisión bibliográfica X X X X X X

Preparación de materiales X

Pretratamiento materia prima X X

Fermentación y evaluación de
X X X
parámetros

Análisis de los resultados X X X

 8. Bibliografía

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